CN1165551C - 调节血脂的孔石莼多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调节血脂的孔石莼多糖及其制备方法，该多糖的活性基团-OSO₃ ^-基的含量为：15.94-19.20%，总糖含量为：49.30-60.8%，特性粘度为：6.2-49.3。本孔石莼多糖作为制备调节血脂的海洋药物的应用是本发明的重要发明点。该多糖在调血脂、增强免疫力、抗凝血等方面显示出的活性，是其中的活性基团硫酸基的作用。本孔石莼多糖的制备方法简单易行，操作成本低，污染少，效率高。

Description

调节血脂的孔石莼多糖及其制备方法

(一)技术领域

本发明涉及海洋药物的研究与开发，具体讲是一种调节人体血液血脂含量的海洋药物——孔石莼多糖及其制备方法，其属于海洋生物技术领域。

(二)背景技术

现有技术中对孔石莼的化学组分分析结果是：孔石莼的化学组分主要有多糖、脂类、蛋白质、氨基酸、维生素以及无机矿物元素等。目前对于孔石莼的应用除了传统上的少量食用外，多用于饲料和肥料，与鱼、虾混养，可明显提高鱼类的抗病能力，作饲料可促真鲷、鲍鱼、海参的生长，降低饵料系数，节约成本，用于肥料可改良土壤。孔石莼的高活性组分和医药方面的潜在作用，已引起了科学工作者的注意，它的应用研究开发前景广阔。

高血脂症(hyperlipaemia)是一种常见的代谢性疾病，表现为体内血浆中不同脂质异常堆积。主要的脂质包括胆固醇和甘油酸三脂。LDL和HDL均在肝脏中合成，但LDL较HDL含有的胆固醇量要多很多，比较而言HDL则含有更多的磷脂，颗粒大密度小，不易在血管壁等处阻滞粘附。故LDL-C含量越高，HDL-C含量越低，胆固醇在血清中含量越高，越易诱发各种高血脂症和心血管疾病。动脉粥样硬化的形成和发展与类脂特别是胆固醇代谢紊乱有关，血清中胆固醇水平增高常使动脉粥样硬化的发病率增高(沈同等，1991)，并有可能引发冠心病。严重威胁着人类的生命健康。血清中胆固醇的来源主要为食物直接摄取和体内生物合成，有些降血脂药(如氯苯丁酯)通过调节与胆固醇合成有关酶的活性，抑制胆固醇在体内合成的速度，从而达到降低血清中胆固醇水平的效果(潘贤等，1998)。另一种降血脂的途径是参与血脂的代谢过程。正常情况下，胆酸从肝和胆囊分泌进入肠道，对食物中的脂肪起乳化作用，促进脂肪的吸收，大部分胆酸又经过肠肝循环被重新吸收。某些药物(消胆胺，甲壳胺等)在肠道中与胆酸结合形成复合物从粪便中排出，从而阻断了胆酸的肠肝循环。由于胆酸不断被结合排出，导致了胆酸的前体—胆固醇不断地被氧化成胆酸，使血清中的胆固醇水平下降；与之相似，亚油酸等不饱和脂肪酸可与胆固醇结合成酯，使之较易转运、代谢和排泄，并改变体内胆固醇的分布，使胆固醇较多的存在于血管以外，减少在血管壁的沉积，从而减少血清中的胆固醇含量(潘贤等，1998)。但部分药物(安妥明等)在加速胆固醇排泄、参与其代谢的过程中对肝脏有损，导致转氨酶水平的升高，毒副作用明显(陈奇等，1998)。

(三)技术内容

本发明的目的是要提供一种调脂的海洋药材，即一种调节血脂的孔石莼多糖及其制备方法。由于孔石莼是一种可食用的大型绿藻，其中的多糖组分有降血脂、抗凝、提高机体免疫等多种药用活性，且对人体无毒副作用。因此，本发明试图通过现代科学技术的研究去了解孔石莼调血脂的有效成分以及有效成分的提取。本发明有望在深层次研究后被开发利用，为人类造福。

本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种调节血脂的孔石莼多糖，该多糖的典型结构式为：

或

其中m，n为聚合度；该多糖的活性基团—OSO₃ ^-基的含量为：15.94——19.20％，总糖含量为：49.30——60.8％，特性粘度为：6.2——49.3。

本发明调节血脂的孔石莼多糖的制备方法，所述的该多糖的制备步骤如下：

(1)称取定量的自然阴干的孔石莼绿藻，粉碎；

(2)加30重量倍的蒸馏水，提取1小时；

(3)将上述提取液过滤，滤渣再加30重量倍的蒸馏水重复提取两次，合并三次滤液；

(4)将上述合并的滤液用透析袋透析，取透析液；

(5)将上述透析液用硅藻土助滤过滤；

(6)将上述滤液经减压浓缩至1/3体积；

(7)将上述浓缩液中加入95％的乙醇液，使该浓缩液的乙醇浓度至75％；

(8)取上述乙醇浓缩液中的沉淀物干燥后粉碎，得提纯的白色粉末状孔石莼多糖。

本发明调节血脂的孔石莼多糖的制备方法，所述的(2)中的提取温度是在80-100℃下提取。

本发明调节血脂的孔石莼多糖的制备方法，所述的(4)中的用透析袋透析，是先在自来水中透析24小时，然后在蒸馏水中透析24小时。

本发明调节血脂的孔石莼多糖的制备方法，所述的(6)中的减压浓缩，是在9.8×10⁴Pa下，温度50——60℃下进行。

本发明的孔石莼多糖作为制备调节血脂的海洋药物的应用是本发明的重要发明点。其实验效果如下：

孔石莼多糖的调血脂实验I：

1).实验动物

ICR小鼠，♂，体重20～24g，由云南省天然药物药理重点实验室提供，合格证号：滇实动证9806号。

2).主要药品试剂及设备

胆固醇为Merck公司产品，胆酸钠为上海化学试剂公司进口分装(批号980720)，丙基硫氧嘧啶为德国进口。血脂康为北京北大维信生物科技有限公司生产，批号991113。CL-770型临床分光光度计为日本岛津公司生产。

3).实验分组及高脂血症造型

ICR小鼠80只，随机分为8组：高脂对照组，多糖低剂量组(250mg/kg/d)，多糖中剂量组(500mg/kg/d)，多糖高剂量组(1000mg/kg/d)，以及阳性对照组(血脂康1.2g/kg/d)。全部动物正常分组饲养观察三天后改喂高脂肪、高胆固醇饲料进行实验性高脂血症造型。高脂饲料配方(W∶W)为：胆固醇2.0％、猪油7.5％、胆酸钠0.3％、丙基硫氧嘧啶0.075％，其余为基础饲料。在给高脂饲料的同时，各实验组以相应剂量的供试样品生理盐水悬液灌胃，高脂对照组灌胃相同体积生理盐水，灌胃容积为0.25ml/10g体重，造型给药七天。

4).血脂测定

造型给药七天后，禁食12h以上，摘眼球取血测血脂，血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定用酶法，采用北京中生生物高技术公司生产酶试剂盒进行(产品编号分别为000501、000709和000701)，用Friedewald公式计算血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度，实验数据用t检验进行组间比较。

5).试验结果，见表1。

表1：孔石莼多糖对实验性高脂血症小鼠血脂水平的影响

                                                        (n＝10，x±s)

                    TC          HDL-C     LDL-C    

      TG

                    (mmol/L     (mmol/L)  (mmol/L)              (mmol/L)

高脂对照组

                    17.25       1.98      15.04       0.122      1.16

                    ±3.43      ±0.92    ±3.73      ±0.062    ±0.24

海藻多糖组          13.44^*     1.66      11.59       0.132      0.94^*

250mg·kg^-1·d^-1  ±3.30      ±0.53    ±3.41      ±0.053    ±0.12

                    12.04^**    1.82      10.04^**    0.165      0.93^*

500mg·kg^-1·d^-1

                    ±2.58      ±0.69    ±2.95      ±0.099    ±0.16

                    8.95^**     2.44      6.35^**     0.303^*    0.84^**

1000mg·kg^-1·d^-1

                    ±2.52      ±0.86    ±3.12      ±0.169    ±0.13

血脂康组            11.34^**    1.72      9.48^**     0.160      0.68^**

1.2g·kg^-1·d^-1   ±2.37      ±0.72    ±2.68      ±0.080    ±0.14

与高脂对照组比^*P＜0.05，^**P＜0.01

TC-总胆固醇，HDL-C-高密度脂蛋白胆固醇

TG-甘油酸三酯，LDL-C-低密度脂蛋白胆固醇

从上表可以看出，孔石莼多糖低剂量、中剂量、高剂量及阳性对照组与高脂对照组相比较，总胆固醇(TC)分别降低了22.1％，30.2％，48.1％，34.3％，甘油三酯(TG)分别降低了19.0％，19.8％，27.6％，41.4％，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)分别降低了22.9％，33.2％，57.8％，37.0％，而高密度脂蛋白胆固醇与总胆固醇的比值(HDL-C/TC)则分别升高了8.2％，35.2％，148.4％，31.2％。与阳性对照组相比，高剂量组除甘油三酯(TG)稍低外，其它各项如：总胆固醇(TC)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇与总胆固醇的比值(HDL-C/TC)的作用都优于阳性对照组，特别是HDL-C/TC的作用，效果特别明显。

众所周知，高脂血症是动脉粥样硬化(Atherosclerosis)主要危险因素之一，HDL-C尤其是HDL-C/TC的比值与动脉粥样硬化发病呈负相关性，因此，孔石莼多糖对血脂的有益影响对防治动脉粥样硬化及其所导致的缺血情性心、脑血管疾病有积极的意义。

孔石莼多糖调血脂实验II：

1).实验动物：ICR小鼠♂，体重18-20g。由云南省天然药物药理重点实验室实验动物室提供，合格证号：云动管99019号。

2).实验分组及高脂血症造型：选ICR小鼠50只，随机分为五组：高脂对照组(I组)，孔石莼多糖低剂量组(II组，125mg·kg^-1·d^-1)孔石莼多糖中剂量组(III组，250mg·kg^-1·d^-1)，孔石莼多糖高剂量组(IV组，500mg·kg^-1·d^-1)和烟酸肌醇对照组(V组，烟酸肌醇，500mg·kg^-1·d^-1)。全部动物以普通饲料饲养观察三天后改喂高脂饲料进行实验性高脂血症造型。高脂饲料配方：胆固醇2％、猪油8％、胆酸钠0.3％、基础饲料89.7％，在喂高脂饲料的同时，各给药组以相应剂量的孔石莼多糖或烟酸肌醇水溶液灌胃、高脂对照组等体积蒸馏水灌胃。

3).血脂测定：造型7天后，禁食12小时以上，摘眼球取血测血清总胆固醇(TC)、甘油酸三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及HDL-C/TC的比值，进行组间比较。血清TC、TG、HDL-C测定用酶法，采用北京中生生物高技术公司生产酶试剂盒进行，用Friedewald公式计算LDL-C含量(Friedewald WT et al.1972)。实验数据用t检验进行统计学处理。结果见表2：

表2：孔石莼多糖对高脂血症造型小鼠血脂水平的影响

Table 14.Effect of ulvan on mice’s hyperlipaemia

                                                        (n＝10，x±s)

                   TC           HDL-C      

     LDL-C         TG

                   (mmol/L)     (mmol/L)                (mmol/L)      (mmol/L)

高脂对照组

                   9.41±               0.83±                0.089±                8.39±                 0.96±

                   1.19         0.36         0.039         1.08          0.14

孔石莼多糖组       9.71±               1.09±                0.121±                8.49±                  0.63^**±

125mg/kg^-1·d^-1  0.23         0.028        0.054         2.37          0.09

                   6.67^**±          1.00±                0.152^**±         5.61^**±            0.73^**±

250mg/kg^-1·d^-1

                   0.98         0.30         0.054         1.08          0.14

                   7.07^**±         1.49^**±          0.215^**±          5.43^**±            0.74^**±

500mg/kg^-1·d^-1

                   1.11         0.38         0.059         1.08          0.10

烟酸肌醇           6.80^**±         1.44^**±          0.214^**±          5.63^**±            0.64^**±

500mg/kg^-1·d^-1  1.43         0.42         0.056         1.19          0.07

注：**与高脂空白对照组比P＜0.01

TC-总胆固醇

HDL-C-高密度脂蛋白胆固醇

LDL-C-低密度脂蛋白胆固醇

TG-甘油酸三脂

从实验结果来看：

(1)低剂量(125mg·kg^-1·d^-1)给药组降低小鼠血清中的甘油酸三脂(TG)与空白对照组有显著差异；

(2)中剂量(250mg·kg^-1·d^-1)给药组降低小鼠血清中的总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油酸三脂(TG)和升高HDL-C/TC比值与空白对照组有显著差异；

(3)高剂量(500mg·kg^-1·d^-1)给药组降低小鼠血清中的总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油酸三脂(TG)、升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和HDL-C/TC比值与空白对照组有显著差异；

(4)中、高剂量(250～500mg·kg^-1·d^-1)两给药组有显著降低小鼠血清中总胆固醇(TC)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)从而增加HDL-C/TC比值的作用；

(5)三个剂量的孔石莼多糖样品均有显著降低小鼠血清甘油酸三脂的作用。

在实验过程中未发现小鼠有食欲不振、毛色不正常、体重下降等毒性表现。

实验样品各剂量组和烟酸肌醇阳性对照组较高脂空白对照组对观测指标的治疗改善结果见表3。

表3：孔石莼多糖对高脂血症造型小鼠血脂水平的改善

Improving Effect of ulvan on mice’s hyperlipaemia

                                                          (n＝10，X±S)

各给药组           TC             HDL-C            LDL-C      TG

孔石莼多糖组

II         组

125mg/kg·d^-1     -              31.3％      36.0％       -           34.4％

III        组      29.2％^**      20.5％      70.8％^**    33.1％^**   24.0％^**

250mg/kg·^-1

IV         组      24.9％^**      79.5％^**   141.6％^**   35.3％^**   22.9％^**

500mg/kg·d^-1

烟酸肌醇

V          组

500mg/kg·d^-1     27.7％^**      73.5％^**   140.4％^**   32.9％^**   33.3％^**

注：**与高脂对照组相比P＜0.01

TC-总胆固醇

HDL-C-高密度脂蛋白胆固醇

LDL-C-低密度脂蛋白胆固醇

TG-甘油酸三酯

从上表可以看出，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和HDL-C/TC比值随着样品剂量的加大而增大，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)随剂量的增大而减小，都有很明显的剂量依赖性；中剂量样品组(III组)降总胆固醇水平最明显，且优于实验剂量的阳性对照组(V组)；降甘油酸三脂作用最明显的为低剂量样品组(II组)，效果亦优于实验剂量的阳性对照组；中、高剂量样品组在降甘油脂作用方面效果相差不大(24.0％和22.9％)。

综合所有观测指标的实验结果，高剂量样品组(IV组，500mg·kg^-1·d^-1)的药效活性最强，与相同剂量的阳性对照药烟酸肌醇相比，药效更佳。

孔石莼多糖具有显著的调血脂作用，推测其作用机理可能是多糖与血清中的类脂物质结合，作为一种载体参与胆固醇、脂蛋白代谢活动，使血清中的类脂物质比较容易地转运和排泄，影响其代谢途径。孔石莼多糖因其连接结构比较特殊，不易被体内的结肠菌降解(B.Ray & M.Lahaye，1995b)，分子量较胆固醇、脂蛋白及他们的衍生物大得多，与血脂形成的结合体在小肠内不易破坏，分子量的改变可能影响了胆汁酸等的重吸收，促使胆固醇更多更快地氧化成胆汁酸；含有较多硫酸基活性基团的孔石莼多糖可能影响着低密度脂蛋白受体的数量，间接起到了调节低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平的作用，从而升高总胆固醇中高密度脂蛋白胆固醇的含量，改善病理状况下血脂的含量及分布。

孔石莼多糖在降血脂、增强免疫力、抗凝血等方面显示出的活性，一般认为是其中的活性基团硫酸基的作用；并认为在一定的范围内随着活性基团含量的增加，活性也增强。同时，活性的强弱也受到多糖分子量大小的影响：在一定范围内分子量越小，活性越强。

(三)附图及其实施例：本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中。

图1为孔石莼多糖的红外光谱图。

图2为孔石莼多糖的¹³C-NMR图谱。

图3为孔石莼多糖的¹H-NMR图谱。

本发明调节血脂的海洋药物—孔石莼多糖的提取方法如下：

原料孔石莼于1999年3月采自青岛太平角，自来水清洗，除去泥砂和其他杂草，样品自然阴干，塑料袋封口室温下保存。取自然阴干的三份孔石莼绿藻各100克，粉碎；分别用30倍的蒸馏水于80——100℃提取一小时；过滤，滤渣重复提取两次，合并三次滤液；滤液用透析袋先在自来水中透析一天，然后在蒸馏水中透析两次；用硅藻土作助滤剂过滤透析液；滤液经减压在9.8×10⁴Pa下，温度50——60℃下进行浓缩至1/3体积；加入95％乙醇至溶液浓度为75％，所得三份沉淀；经干燥后得到提纯的多糖样品，重15克、15.7克、14.4克，得率平均为15％。该多糖的制备方法简单易行，操作成本低，污染少，效率高。提纯的孔石莼多糖的理化特性见表4。

表4，提纯的孔石莼多糖的理化特性：

孔石莼多糖的图谱分析：

(1)孔石莼多糖的红外光谱图分析结果：

图谱的主要吸收峰都很相似，说明各实验样品中的单糖组分和主要官能团种类没有太大差别。3425-3445cm^-1系多糖上的羟基以及样品中含有的少量水分的吸收峰；饱和碳氢伸缩振动γ_C-H在2935cm^-1左右；糖醛酸残基中羧基的吸收峰出现在1640cm^-1附近，各样品的吸收峰位置略有差异；1050-1113cm^-1之间的强宽吸收带为多糖各糖残基之间糖苷键C-O-C的振动峰，由于各糖残基连接方式及顺序不一而导致糖苷键之间的差异，导致这个宽吸收带峰形不规则，主峰位置随糖苷键之间比例的不同略有变化；1225-1265cm^-1的强峰和840cm^-1、782-786cm^-1两尖峰是硫酸基的吸收信号。

(2)孔石莼多糖¹³C-NMR光谱分析结果：

                                        化学位移(ppm)

                  C₁       C₂       C₃     C₄      C₅      C₆

GA(葡萄糖醛酸)    102.91    75.66     77.89    78.56    73.62    175.11

R(鼠李糖残基)     97.32     71.23     70.18    78.56    73.62    16.58

X(木糖残基)       99.59               73.62    77.89    67.53

G(葡萄糖残基)     100.80    71.23     73.62    78.56    70.18    60.33/57.18

(3)孔石莼多糖¹H-NMR光谱分析结果：

       H1        H2           H2        H4           H5           H6

R      5.38      4.18         4.75      3.80/3.74    3.96         1.29

GA     4.75      3.46/3.42    3.65      3.62         3.80/3.14

X      4.75      3.21         3.59      3.74         3.32

Claims (4)

1、一种调节血脂的孔石莼多糖，该多糖的典型结构式为：

或 其中m，n为聚合度，其特征在于：该多糖的活性基团-OSO₃ ^-基的含量为：15.94--19.20％，糖含量为：49.30--60.8％，特性粘度为：6.2--49.3。

2、根据权利要求1所述调节血脂的孔石莼多糖的制备方法，其特征在于：所述的该多糖的制备步骤如下：

(1)称取定量的自然阴干的孔石莼绿藻，粉碎；

(2)加30重量倍的蒸馏水，在80-100℃的提取温度下，提取1小时；

(3)将上述提取液过滤，滤渣再加30倍重量的蒸馏水重复提取两次，合并三次滤液；

(4)将上述合并的滤液用透析袋透析，取透析液；

(5)将上述透析液用硅藻土助滤过滤；

(6)将上述滤液经减压浓缩至1/3体积；

(7)将上述浓缩液中加入体积比为95％的乙醇液，终使该浓缩液的乙醇体积比浓度至75％；

(8)取上述乙醇浓缩液中的沉淀物干燥后粉碎，得提纯的白色粉末状孔石莼多糖。

3、根据权利要求2所述调节血脂的孔石莼多糖的制备方法，其特征在于：所述的(4)中的用透析袋透析，是先在自来水中透析24小时，然后在蒸馏水中透析24小时。

4、根据权利要求2所述调节血脂的孔石莼多糖的制备方法，其特征在于：所述的(6)中的减压浓缩，是在9.8×10⁴Pa下，温度50--60℃下进行。

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