BR112016011157B1

BR112016011157B1 - usos de um extrato de algas

Info

Publication number: BR112016011157B1
Application number: BR112016011157-5A
Authority: BR
Inventors: Hervé Demais; Pi Nyvall Collèn; Matthieu LE GOFF; Isabelle Le Cheviller
Original assignee: Amadeite
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2014-11-18
Publication date: 2021-01-05
Also published as: RU2016119154A3; CN105873596A; EP3071212B1; RU2016119154A; ES2790678T3; MX2016006189A; EP3071212A1; FR3013222B1; US10912805B2; HUE048949T2; WO2015071497A1; DK3071212T3; RU2687498C2; JP6644002B2; FR3013222A1; JP2016539184A; US20160287648A1

Abstract

EXTRATOS DE ALGAS E USOS NÃO TERAPÊUTICOS DE UM EXTRATO DE ALGAS A presente invenção trata de um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas verdes de tipo Ulva, para seu uso para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal, em particular para estimular a resposta imunológica às infecções. Ela trata igualmente do uso não terapêutico de um extrato de algas verdes de tipo Ulva para modular a resposta imunológica.

Description

[001] A presente invenção trata de um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas vertes de tipo Ulva, para seu uso para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal, em particular para estimular a resposta imunológica às infecções. Ela trata igualmente do uso não terapêutico de um extrato de algas vertes de tipo Ulva para modular a resposta imunológica em um ser humano ou animal.

[002] A modulação da resposta imunológica é um eixo de tratamento importante para de numerosas doenças. De fato, é, por exemplo, importante melhorar a resposta imunológica nos pacientes acometidos de infecções.

[003] A estimulação da resposta imunológica é, além disso, um mecanismo importante em muitos aspectos. É sabido, por exemplo, que o leite materno é rico em IgAs, anticorpos que vão permitir a proteção do recém- nascido um certo número de infecções. As células intestinais, em particular suas células epiteliais, estão expostas a diversos agentes patogênicos contra os quais são produzidos anticorpos. Esses anticorpos vão em seguida migrar até a glândula mamária e passam a estar presentes no leite materno, conferindo assim uma proteção ao lactente. Existe sempre uma necessidade de identificar novas substâncias capazes de estimular essa reação imunológica. Em particular, as células epiteliais intestinas constituem um sítio privilegiado nas quais substâncias imunoestimuladoras administras por via oral possam agir. Existe ainda uma necessidade de identificar novas substâncias capazes de aumentar a resposta à vacinação, estimulando a resposta imunológica, em particular através de uma administração complementar à vacinação. As espécies de ulvas (Ulvales, Chlorophyta) são algas abundantes encontradas na zona intertidal ou faixa litorânea submergível. Elas colonizam os substratos duras, ancoradas por um disco de fixas, mas certas espécies podem igualmente dar origem a formas vivas livres, à deriva. As ulvas são algas de crescimento rápido e oportunista quanto ao espaço e à absorção dos nutrimentos. Seu crescimento na coluna de água é particularmente observado nas águas costeiras eutrofizadas e nas lagunas nas quais Ulva sp. prolifera na forma de "marés verdes" (Fletcher, 1996). Disso resulta frequentemente uma produção de massa e encalhes maciços que produzem gases nocivos quando há acúmulo (Morand e Briand, 1996). Até agora, essa biomassa possui um baixíssimo valor agregado e os meios de utilizá-las fora do adubo (Mazé et al. 1993, Cuomo et al. 1995), da produção de metano (Briand e Morand, 1997), do consumo alimentar humano (Pérez, 1997) ou como base de papel (Nicolucci e Monegato 1993) poderiam permitir tirar partido de suas propriedades específicas.

[004] Os inventores da presente invenção constataram, de modo surpreendente, que um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas vertes de tipo Ulva, possuía propriedades imunomoduladoras.

[005] Assim, a presente invenção trata de um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas vertes de tipo Ulva, que compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 50 kDa, para seu uso para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal.

[006] Ela trata igualmente do uso não terapêutico de um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas de tipo Ulva, que compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 50 kDa, para modular a resposta imunológica em um ser humano ou animal.

[007] Em particular, a presente invenção trata de um extrato de algas para seu uso tal como definido acima, ou o uso não terapêutico de um extrato de algas tal como definido acima, na qual os polissacarídeos compreendem manose e/ou de arabinose, preferencialmente manose. Mais particularmente ainda, os referidos polissacarídeos compreendem pelo menos 0,005% de manose e/ou pelo menos 0,005% de arabinose, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, preferencialmente pelo menos 0,005% de manose. Ainda mais particularmente, os referidos polissacarídeos compreendem manose em uma quantidade que varia de 0,005 a 0.5%, por exemplo de 0,005 a 0,20% ou de 0,15 a 0,5% e/ou arabinose em uma quantidade que varia de 0,005 a 0,5%, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, preferencialmente manose em uma quantidade que varia de 0,005 a 0,5%, por exemplo de 0,005 a 0,20% ou de 0,15 a 0,5% em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[008] A presente invenção trata mais particularmente ainda de um extrato de algas para seu uso tal como definido acima, ou o uso não terapêutico de um extrato algas tal como definido acima, no qual os referidos polissacarídeos compreendem ainda: - galactose; e/ou - glicose; e/ou - ramnose; e/ou - xilose; e/ou - ácido glucurônico.

[009] Plus particularmente, os referidos polissacarídeos compreendem: - de 0,05 a 0,5% de galactose; e/ou - de 0,005 a 0,5% de glicose, em particular de 0,005 a 0,05% ou de 0,05 a 0,5%; e/ou; - de 2 a 15 % de ramnose; e/ou - de 0,1 a 1% de xilose; e/ou - e 1 a 7% de acide glucurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas. A presente invenção trata igualmente de um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular extrato de algas de tipo Ulva, suscetível de ser obtido por um processo de preparação no qual: a) as algas são lavadas e desareadas; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado em uma membrana de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e depois secado; para seu uso para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal.

[010] Ela trata igualmente do uso não terapêutico de um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular de um extrato de algas de tipo Ulva, suscetível de ser obtido por um processo de preparação no qual: a) as algas são lavadas e desareadas; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado em uma membrana de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e depois secado; para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal.

[011] Em particular, a presente invenção trata de um extrato de algas para seu uso tal como mencionado acima, ou o uso não terapêutico de um extrato de algas tal como indicado acima, para estimular a resposta imunológica em um ser humano ou animal, em particular no sistema imunológica intestinal. No contexto da presente invenção, entende-se por propriedades “imunomoduladoras” ou que permitem a “modulação da resposta imunológica”, o significado habitualmente conferido a esses termos e bem conhecido do técnico no assunto, em particular toda propriedade que permite estimular ou frear as reações imunológicas do corpo humano ou animal.

[012] Em particular, o extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção, ou o uso não terapêutico do extrato de algas de acordo com a presente invenção, permite induzir a expressão de moléculas de adesão e de quimiocinas, em particular as IL8 e/ou IL-1α e/ou IL1-β e/ou IL6 e/ou TNF- α e/ou CCL20.

[013] Assim, o extrato de algas tal como no contexto da presente invenção é útil no tratamento e/ou na prevenção das patologias infecciosas, em particular as patologias infecciosas porcinas escolhidas entre: parvovirose, erisipela, rinite infecciosa, gripe (influenza), circovirose porcina, micoplasmose e colibacilose; as patologias infecciosas aviárias escolhidas entre: doença de Marek, doença de Newcastle, bronquite infecciosa, doença de Gumboro, varíola aviária, micoplasmose, anemia infecciosa aviária, laringotranqueíte infecciosa, EDS e gripe aviária; as patologias infecciosas bovinas escolhidas entre: BVD (diarreias virais bovinas), broncopneumonia enzoótica, IBR, herpes virose, clostridiose, colibacilose, febre catarral, coronavirose, rotavirose e rinotraqueíte; e as patologias infecciosas aquícolas escolhidas entre: necrose hemapoiética, vibriose, furonculose, necrose pancreática infecciosa e anemia infecciosa.

[014] A presente invenção trata, portanto, igualmente um extrato de algas tal como descrito no contexto da presente invenção para seu uso no tratamento e/ou a prevenção de uma patologia infecciosa tais como as mencionadas acima.

[015] Em particular, o extrato de algas tal como definido no contexto da presente invenção é útil no contexto de uma profilaxia vacinal, como complemento de vacinação.

[016] Mais particularmente, a presente invenção trata de um extrato de algas para seu uso tal como indicado acima, no qual o extrato de algas é utilizado em uma composição farmacêutica para uma administração oral.

[017] De acordo com outro modo de realização da presente invenção, o extrato de algas para seu uso tal como indicado acima, é utilizado em uma composição farmacêutica por via parenteral.

[018] A presente invenção trata igualmente do uso não terapêutico de um extrato de algas tal como indicado acima, no qual o extrato de algas é utilizado em um complemento alimentar para uma administração oral.

[019] Um extrato de algas tal como descrito no contexto da presente invenção está descrito, em particular, no pedido de patente FR1261909.

[020] Tal como indicado acima, um extrato de algas tal como descrito no contexto da presente invenção trata de um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas de tipo Ulva, que compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 50 kDa. Mais particularmente, o extrato de algas compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior a 40, 30, 20 ou 15 kDa. Mais particularmente ainda, os polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados do extrato de algas possuem um tamanho inferior ou igual a 15 kDa.

[021] De acordo com um modo de realização da presente invenção, o extrato de algas tal como descrito no contexto da presente invenção compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 50 kDa, com exclusão de polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é superior a 50 kDa.

[022] De acordo com outro modo de realização da presente invenção, o extrato de algas tal como descrito no contexto da presente invenção compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 15 kDa, com exclusão de polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é superior a 15 kDa.

[023] Um dálton (Da) é uma unidade mássica definida como sendo igual a um doze avos da massa de um átomo de carbono 12, massa que será em seguida estimada a partir de uma mistura de vários isótopos (principalmente carbono 12 e carbono 13, que possui respectivamente 6 e 7 nêutrons além dos 6 prótons de todo átomo de carbono). Um dálton é, com uma precisão razoavelmente boa, a massa de um átomo de hidrogênio, e o valor exato é 1,00794 uma (unidade de massa atômica). O kilodálton (kDa) é igual a 1000 Da.

[024] No contexto da presente invenção, as massas mencionadas em kDa são determinadas por qualquer método habitualmente empregado pelo técnico no assunto, em particular as massas dos polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados dos extratos de algas poderão ser discriminadas por ultrafiltração em membranas que deixam filtrar unicamente moléculas de tamanhos predeterminados.

[025] Em particular, e tal como mencionado anteriormente, os polissacarídeos do extrato de algas descritos no contexto da presente invenção compreendem manose e/ou arabinose, de preferência manose. Mais particularmente, os referidos polissacarídeos compreendem pelo menos 0,005% de manose e/ou pelo menos 0,005% de arabinose, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, em pelo menos 0,01 % de manose e/ou pelo menos 0,01 % de arabinose. Mais particularmente ainda, os referidos polissacarídeos compreendem manose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,50%, por exemplo, de 0,01 a 0,20% ou de 0,20 a 0,5% e/ou arabinose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,5%, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, em particular manose em uma quantidade que varia de 0,03 a 0.45%, por exemplo de 0,03 a 0,15% ou de 0,15 a 0,45% e/ou arabinose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,2%.

[026] Preferencialmente, os referidos polissacarídeos compreendem manose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,50%, por exemplo de 0,01 a 0,20% ou de 0,20 a 0,5%, em particular manose em uma quantidade que varia de 0,03 a 0,45%, por exemplo de 0,03 a 0,15% ou de 0,15 a 0,45%.

[027] De modo particular, e tal como mencionado anteriormente, os referidos polissacarídeos compreendem ainda: - galactose; e/ou - glicose; e/ou - ramnose; e/ou - xilose; e/ou - ácido glucurônico.

[028] Mais particularmente ainda, os referidos polissacarídeos compreendem: - de 0,05 a 0,5% de galactose, em particular de 0,1 a 0,4%; e/ou - de 0,005 a 0,5% de glicose, em particular de 0,005 a 0,05%, em particular de 0,01 a 0,03%, ou de 0,05 a 0,5%; %; e/ou - de 2 a 15 % de ramnose, em particular de 5 a 10%; e/ou de 0,1 a 1% de xilose, em particular de 0,3 a 0,7%; e/ou - de 1 a 7% de ácido glucurônico, em particular de 1 a 5%; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[029] Assim, é possível citar, por exemplo, um extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção que compreende: - manose; e/ou - arabinose; e/ou - galactose; e/ou - glicose; e/ou - ramnose; e/ou - xilose; e/ou - ácido glucurônico.

[030] Pode ser citado mais particularmente, por exemplo, um extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção que compreende: - de 0,01 a 0,50% de manose, por exemplo de 0,01 a 0,20%, em particular de 0,03 a 0,15% ou de 0,20 a 0,5%; e/ou - de 0,01 a 0,5% de arabinose, em particular de 0,01 a 0,2%; e/ou - de 0,05 a 0,5% de galactose, em particular de 0,1 a 0,4%; e/ou - de 0,005 a 0,5% de glicose, em particular de 0,005 a 0,05%, em particular de 0,01 a 0,03%, ou de 0,05 a 0,5%; e/ou - de 2 a 15 % de ramnose, em particular de 5 a 10%; e/ou - de 0,1 a 1% de xilose, em particular de 0,3 a 0,7%; e/ou - de 1 a 7% de ácido glucurônico, em particular de 1 a 5%; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[031] Pode ser citado mais particularmente ainda, por exemplo, um extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção que compreende: - 0,09% de manose; e/ou - 0,1% de arabinose; e/ou - 0,3% de galactose; e/ou - 0,02% de glicose; e/ou - 8,1% de ramnose; e/ou - 0,5% de xilose; e/ou - 2,6% de ácido glucurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[032] Pode igualmente ser citado, por exemplo, um extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção que compreende: - 0,3% de manose; e/ou - 0,2% de galactose; e/ou - 0,4% de glicose; e/ou - 7,9% de ramnose; e/ou 0,5% de xilose; e/ou 4,9% de ácido glucurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[033] A presente invenção trata igualmente, portanto, do uso não terapêutico de um extrato de algas de acordo com a presente invenção, no qual o extrato de algas compreende: - manose; e/ou - arabinose; e/ou - galactose; e/ou - glicose; e/ou - ramnose; e/ou - xilose; e/ou - ácido glucurônico, e mais particularmente: - de 0,01 a 0,50% de manose, por exemplo de 0,01 a 0,20%, em particular de 0,03 a 0,15% ou de 0,20 a 0,5%; e/ou - de 0,01 a 0,5% de arabinose, em particular de 0,01 a 0,2%; e/ou - de 0,05 a 0,5% de galactose, em particular de 0,1 a 0,4%; e/ou - de 0,005 a 0,5% de glicose, em particular de 0,005 a 0,05%, em particular de 0,01 a 0,03%, ou de 0,05 a 0,5%; e/ou - de 2 a 15 % de ramnose, em particular de 5 a 10%; e/ou - de 0,1 a 1% de xilose, em particular de 0,3 a 0,7%; e/ou - de 1 a 7% de ácido glucurônico, em particular de 1 a 5%; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, e mais particularmente ainda que compreende: - 0,09% de manose; e/ou - 0,1% de arabinose; e/ou - 0,3% de galactose; e/ou - 0,02% de glicose; e/ou - 8,1% de ramnose; e/ou - 0,5% de xilose; e/ou - 2,6% de ácido glucurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, ou que compreende: - 0,3% de manose; e/ou - 0,2% de galactose; e/ou - 0,4% de glicose; e/ou - 7,9% de ramnose; e/ou - 0,5% de xilose; e/ou 4,9% de ácido glucurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[034] Tal como indicado acima, o extrato de algas tal como descrito no contexto da presente invenção é um extrato de algas da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas de tipo Ulva, suscetível de ser obtido por um processo de preparação no qual: a) as algas são lavadas e desareadas; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado em uma membrana de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e depois secado.

[035] De acordo com um modo de realização da presente invenção, o extrato de algas compreende: - de 10 a 50 % de carbono; - de 1 a 10% de hidrogênio; - de 1 a 5 % de nitrogênio; de 20 a 50 % de oxigênio; e de 1 a 15 % de enxofre; em porcentagem mássica da matéria seca total do extrato de algas.

[036] Mais particularmente ainda, o extrato de algas compreende: - de 15 a 30 % de carbono; - de 3 a 6% de hidrogênio; - de 1 a 3 % de nitrogênio; - de 25 a 40 % de oxigênio; e - de 2,5 a 10 % de enxofre; - em porcentagem mássica da matéria seca total do extrato de algas.

[037] De acordo com outro modo de realização da presente invenção, o extrato de algas compreende: - de 10 a 50 % de carbono; - de 1 a 10% de hidrogênio; - de 0,5 a 5 % de nitrogênio; - de 20 a 60 % de oxigênio; e - de 1 a 15 % de enxofre; em porcentagem mássica da matéria seca total do extrato de algas.

[038] Os outros elementos químicos presentes na matéria seca do extrato são, em particular, representados pelos minerais (Ca, K, Na, Mg, Al, Cl, I, P, Fe, etc).

[039] Mais particularmente, o extrato de algas tal como descrito no contexto da presente invenção é caracterizado pelo espectro RMN 1H apresentado na Figura 1.

[040] Esse espectro RMN 1H foi registrado a 298 K em um espectrômetro Bruker Avance 500 equipados de uma sonda criogênica inversa 5 mm 1H/13C/15N TCI. Antes da análise, as amostras foram dissolvidas em 99,97% de átomo de D2O. Os deslocamentos químicos são expressos em ppm em relação a um padrão externo (ácido trimetilsililpropiônico). Não foi realizada nenhuma supressão do sinal HOD.

[041] De acordo com um modo de realização da presente invenção, o extrato de algas que compreende, em particular, polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 50 kDa é suscetível de ser obtido por um processo de preparação no qual: a) as algas são lavadas e desareadas; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado em uma membrana de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e depois secado.

[042] Em particular, para a implementação do processo tal como indicado no contexto da presente invenção, em sua etapa a), as algas são lavadas com água doce.

[043] Elas podem ser desaeradas por qualquer meio posto à disposição do técnico no assunto.

[044] As referidas algas são em seguida trituradas, em particular por meio de um triturador, como por exemplo um afinador ou um cortador.

[045] Em seguida, a fase sólida do triturado, o bagaço, é separada de sua fase líquida, o suco, por prensagem do triturado, por exemplo por meio de uma prensa de correias ou de pratos, ou por centrifugação.

[046] Por “suco”, entende-se o suco citoplásmico que inclui a estrutura parietal da estrutura dupla das células das algas.

[047] A fase líquida obtida é depois clarificada, por exemplo com um clarificador de discos, ou por centrifugação, decantação ou filtração (por exemplo com tigelasa ou com placa).

[048] O suco obtido é ultrafiltrado em seguir.

[049] De acordo com um modo de realização para a implementação do processo tal como indicado no contexto da presente invenção, a ultrafiltração é realizada em uma membrana de 50 kDa ou menos, em particular em uma membrana de 40, 30, 20 ou 15 kDa. Mais particularmente, a membrana será uma membrana de 15 kDa ou menos.

[050] Essa membrana pode ser, por exemplo, uma membrana de cerâmica ou uma membrana orgânica. Mais particularmente, a membrana é uma membrana de cerâmica.

[051] O suco de filtração obtido pode ser concentrado em seguida, por exemplo por osmose inversa, evaporação ou precipitação, e depois secado por exemplo por lioflilização ou atomização.

[052] Opcionalmente, o extrato obtido poderá em seguida ser triturado novamente, a fim de obter um pó homogêneo em termos de granulometria.

[053] De acordo com um desses aspectos, o processo se desenvolve em parte à temperatura ambiente. Por temperatura ambiente, entende-se uma temperatura compreendida entre 5 e 25°C.

[054] De acordo com outro desses aspectos, o processo se desenvolve em parte a uma temperatura compreendida entre 4 e 10°C, a fim de evitar os desenvolvimentos microbianos.

[055] De acordo com um modo de realização para a implementação do processo tal como indicado no contexto da presente invenção, o extrato de algas obtido na etapa f) do processo supracitada é purificado, por exemplo por ultrafiltração, em particular em uma cassete de ultrafiltração, em particular a fim de eliminar a parte mineral.

[056] De acordo com outro desses aspectos, o extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção é obtido pelo processo tal como descrito anteriormente.

[057] Esse processo difere da maior parte dos processos descritos na arte anterior devido à ausência de uma etapa que implica uma precipitação do extrato de algas. Ele se distingue igualmente dos processos anteriores de extração pela ausência de uso de solventes, em particular orgânicos, o que representa um trunfo essencial do ponto de vista ecológico.

[058] Por “algas de tipo Ulva” entendem-se as algas agrupadas no gênero Ulva, da família das Ulvaceae, da ordem das ulvales. Podem ser citadas, em particular, as seguintes espécies e subespécies: Ulva acanthophora, Ulva anandii, Ulva angusta, Ulva arasakii, Ulva armoricana, Ulva atroviridis, Ulva attenuata, Ulva beytensis, Ulva bifrons, Ulva brevistipitata, Ulva bulbosa, Ulva burmanica, Ulva byssoides, Ulva californica, Ulva chaetomorphoides, Ulva clathrata, Ulva coccinea, Ulva compressa, Ulva conglobata, Ulva cornucopiae, Ulva cornuta, Ulva covelongensis, Ulva crassa, Ulva crassimembrana, Ulva curvata, Ulva dactylifera, Ulva denticulata, Ulva elegans, Ulva elminthoides, Ulva enteromorpha, Ulva erecta, Ulva expansa, Ulva fasciata, Ulva fenestrata, Ulva flexuosa, Ulva gelatinosa, Ulva geminoidea, Ulva gigantea, Ulva grandis, Ulva hendayensis, Ulva hookeriana, Ulva hopkirkii, Ulva indica, Ulva intestinalis, Ulva intestinaloides, Ulva intricata, Ulva intybacea, Ulva javanica, Ulva kylinii, Ulva lactuca, Ulva lactucaefolia, Ulva laetevirens, Ulva laingii, Ulva linearis, Ulva lingulata, Ulva linkiana, Ulva linza, Ulva lippii, Ulva litoralis, Ulva littorea, Ulva lobata, Ulva lubrica, Ulva marginata, Ulva micrococca, Ulva myriotrema, Ulva neapolitana, Ulva nematoidea, Ulva ohnoi, Ulva olivacea, Ulva olivaceum, Ulva pacifica, Ulva papenfussii, Ulva paradoxa, Ulva parva, Ulva parvula, Ulva patengensis, Ulva percursa, Ulva pertusa, Ulva phyllosa, Ulva popenguinensis, Ulva porrifolia, Ulva procera, Ulva profunda, Ulva prolifera, Ulva pseudocurvata, Ulva pseudolinza, Ulva pulchra, Ulva purpurascens, Ulva quilonensis, Ulva radiata, Ulva ralfsii, Ulva ranunculata, Ulva reticulata, Ulva rhacodes, Ulva rigida, Ulva rotundata, Ulva rubens, Ulva saifullahii, Ulva scagelii, Ulva scandinavica, Ulva sericea, Ulva serrata, Ulva simplex, Ulva sorensenii, Ulva spinulosa, Ulva stenophylla, Ulva stipitata, Ulva sublittoralis, Ulva subulata, Ulva taeniata, Ulva tenera, Ulva tetragona, Ulva torta, Ulva tuberosa, Ulva umbilicata, Ulva uncialis, Ulva uncinata, Ulva usneoides, Ulva utricularis, Ulva utriculosa, Ulva uvoides, Ulva ventricosa.

[059] Assim, um extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção pode ser utilizados em aplicações veterinárias, e estar compreendido em um medicamento ou uma composição farmacêutica, para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal, em particular para estimular a resposta imunológica em um ser humano ou animal, e mais particularmente para prevenir e/ou tratar uma patologia infecciosa tais como as mencionadas acima, mais particularmente ainda no contexto de uma profilaxia vacinal, como complemento de vacinação.

[060] Assim, a presente invenção trata igualmente um extrato de algas para seu uso tal como mencionado anteriormente, no qual o extrato de algas está compreendido em uma composição farmacêutica ou em um medicamento.

[061] O uso não terapêutico de um extrato de algas de acordo com a presente invenção pode por sua vez visar aplicações destinadas ao ser humano ou ao animal, por exemplo, através de complementos alimentares focados na saúde sem efeitos secundários para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal, em particular para estimular a resposta imunológica em um ser humano ou animal.

[062] Assim, a presente invenção trata igualmente do uso não terapêutico de um extrato de algas tal como mencionado anteriormente, no qual o extrato de algas está compreendido em uma composição alimentar.

[063] Em particular, a composição alimentar é útil como complemento de vacinação.

[064] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis utilizados para a preparação de um medicamento ou de uma composição farmacêutica que compreendem um extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção são escolhidos de acordo com a forma farmacêutica e o modo de administração desejado, entre os excipientes habituais que são conhecidos do técnico no assunto.

[065] Na presente invenção para a administração oral, sublingual, subcutânea, intramuscular, intravenosa tópica, local, intratraqueal, intranasal, transdérmica ou retal, o extrato de algas tal como definido acima, pode ser administrado em forma de doses unitárias, em mistura com excipientes farmacêuticos clássicos, nos animais e nos seres humanos, para modular a resposta imunológica, em particular para prevenir e/ou o tratar patologias infecciosas tais como as supramencionadas.

[066] As formas de administração apropriadas compreendem as formas por via oral tais como os comprimidos, as gélulas moles ou duras, os pós, os grânulos e as soluções ou suspensões orais, as formas de administração sublingual, bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal, por inalação, as formas de administração tópica, parenteral tais como transdérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa, as formas de administração retal e os implantes. Para a aplicação tópica, podem ser utilizados os extratos de algas para seu uso de acordo com a presente invenção em cremes, géis, pomadas ou loções.

[067] Quando uma composição sólida em forma de comprimidos é preparada, o principal ingrediente ativo pode ser misturado com um veículo farmacêutico, tal como a gelatina, o amido, a lactose, o estearato de magnésio, o talco, a goma arábica ou análogos.

[068] Os comprimidos podem igualmente ser revestidos com sacarose, um derivado celulósico, ou de outras matérias apropriadas ou podem, ainda, ser tratados de forma a ter uma atividade prolongada ou retardada e a liberar de uma forma contínua uma quantidade predeterminada de princípio ativo.

[069] Uma preparação em forma de gélulas pode, por exemplo, ser obtida misturando o ingrediente ativo com um diluente e vertendo a mistura obtida em gélulas moles ou duras.

[070] Em um modo de realização particular, o extrato de algas, o medicamento ou a composição farmacêutica para seu uso de acordo com a presente invenção se destina a uma administração oral. Em outro modo de realização, o extrato de algas, o medicamento ou a composição farmacêutica para seu uso de acordo com a presente invenção se destina a uma administração parenteral.

[071] Os medicamentos ou as composições farmacêuticas que compreendem um extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção, podem também ser apresentar em forma líquida, por exemplo, em forma de soluções, de emulsões, de suspensões ou de xaropes, e em particular em uma forma apropriada para uma administração oral ou intranasal, por exemplo. Os suportes líquidos apropriados podem ser, por exemplo, água, solventes orgânicos tais como o glicerol ou os glicóis, bem como suas misturas, em proporções variadas, na água.

[072] Uma preparação em forma de xarope ou de elixir ou para a administração em forma de gotas pode igualmente conter o ingrediente ativo conjuntamente com um edulcorante, acalórico por exemplo, metilparabeno e do propilparabeno como antisséptico, bem como um agente para conferir sabor e um colorante apropriado.

[073] Os pós ou os grânulos dispersíveis na água podem, por exemplo, conter o ingrediente ativo em mistura com agentes de dispersão ou agentes molhantes, ou agentes de suspensão, como a polivinilpirrolidona, bem como edulcorantes ou corretores de sabor.

[074] Em geral, no contexto da presente invenção, a dose diária do extrato de algas será a dose eficaz a mais baixa do extrato de algas capaz de produzir um efeito imunoestimulador.

[075] Por “dose eficaz”, entende-se toda quantidade de uma composição que permite observer o efeito desejado, nesse caso um efeito imunoestimulador.

[076] De acordo com um de seus aspectos, um extrato de algas para seu uso de acordo com a presente invenção é utilizado em uma composição tal como mencionada acima para uma administração a uma dose no ser humano compreendida entre 0,1 e 100 mg/kg, mais particularmente ainda entre 0,5 e 60 mg/kg, por exemplo entre 1 e 20 mg/kg ou entre 5 e 30 mg/kg, ou a uma dose no animal compreendida entre 1 e 200 mg/kg, mais particularmente entre 1 e 100 mg/kg, mais particularmente ainda entre 2 e 45 mg/kg ou entre 10 e 60 mg/kg.

[077] De acordo com outro de seus aspectos, no contexto do uso não terapêutico de um extrato de algas de acordo com a presente invenção, esse extrato pode ser utilizado em uma composição alimentar.

[078] Por “composição alimentar”, entende-se, por exemplo, qualquer tipo de alicamento, de produtos alimentares na forma de iogurte ou bebida láctea em particular, qualquer tipo de matéria ativa, aditivo ou auxiliar tecnológico, em forma de pré-misturas, medicamentosas ou não, destinados a ser incorporados em alimentos, qualquer tipo de alimentos integrais ou complementares, destinados ao homem ou ao animal.

[079] De acordo com um de seus aspectos, no contexto do uso não terapêutico de um extrato de algas em uma composição alimentar, esse extrato é utilizado para uma administração em uma dose no ser humano compreendida entre 0,1 e 100 mg/kg, mais particularmente ainda entre 0,5 e 60mg/kg, por exemplo entre 1 e 20 mg/kg ou entre 5 e 30 mg/kg, ou a uma dose no animal compreendida entre 1 e 200 mg/kg, mais particularmente entre 1 e 100 mg/kg, mais particularmente ainda entre 2 e 45 mg/kg ou entre 10 e 60 mg/kg.

[080] A presente invenção, de acordo com outro desses aspectos, trata igualmente de um método para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal, em particular para estimular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal que compreende a administração, em um ser humano ou um animal, de uma dose eficaz de um extrato de algas de acordo com a presente invenção.

[081] Mais particularmente o método de acordo com a presente invenção estimula a resposta imunológica em um ser humano ou um animal, em particular no sistema imunológica intestinal.

[082] Mais particularmente ainda, o método de acordo com a presente invenção induz a expressão de moléculas de adesão e de quimiocinas, em particular as IL8 e/ou IL-1α e/ou IL1-β e/ou IL6 e/ou TNF- α e/ou CCL20.

[083] O extrato de algas administrado no contexto de o método de acordo com a presente invenção pode estar compreendido em um medicamento, uma composição farmacêutica ou uma composição alimentar, tal como mencionado acima.

[084] Ele pode ser administrado de acordo com os modos de administração mencionados acima.

[085] De acordo com um modo de realização para a implementação do método de acordo com a presente invenção, o extrato de algas de acordo com a presente invenção est administrado em uma composição farmacêutica.

[086] Em particular, o referido método é útil para a prevenção e/ou o tratamento de uma patologia infecciosa tal como as mencionadas acima.

[087] De acordo com outro modo de realização para a implementação do método de acordo com a presente invenção, o extrato de algas de acordo com a presente invenção é administrado em uma composição alimentar.

[088] Em particular, a presente invenção trata igualmente de um método tal como mencionado acima que compreende a administração, em um ser humano ou um animal, de uma dose eficaz de um extrato de algas de acordo com a presente invenção durante uma período de 3 a 30 dias, em particular de 10 a 20 dias ou de 3 a 10 dias, em uma dose no ser humano compreendida entre 0,1 e 100 mg/kg, mais particularmente entre 0,5 e 60 mg/kg, mais particularmente ainda entre 1 e 20 mg/kg ou entre 5 e 30 mg/kg, ou a uma dose no animal compreendida entre 1 e 200 mg/kg, mais particularmente entre 1 e 100 mg/kg, mais particularmente ainda entre 2 e 45 mg/kg ou entre 10 e 60 mg/kg.

[089] De acordo com um modo de realização para a implementação do método de acordo com a presente invenção, no fim do período de tempo mencionado acima, a administração do extrato de algas pode ser renovada para um período equivalente.

[090] De acordo com um desses aspectos, a presente invenção trata igualmente de um método tal como mencionado acima que compreende: a) a preparação de um extrato de algas de acordo com a presente invenção pelo seguinte processo: - lavagem e desaeração das algas; - trituração das referidas algas; - separação da fase sólida do triturado de sua fase líquida; - clarificação da referida fase líquida; - ultrafiltração do suco obtido na etapa anterior em uma membrana de 50 kDa ou menos, por exemplo de 15 kDa ou menos; e - concentração e depois secagem do suco de filtração obtido na etapa anterior; seguida opcionalmente de uma etapa de ultrafiltração, por exemplo em uma cassete de ultrafiltração; e b) a administração, em um ser humano ou um animal, de uma dose eficaz de um extrato de algas de acordo com a presente invenção, em particular durante um período de 3 a 30 dias, mais particularmente de 10 a 20 dias ou de 3 a 10 dias, em um dose no ser humano compreendida entre 0,1 e 100 mg/kg, mais particularmente ainda entre 0,5 e 60 mg/kg, por exemplo entre 1 e 20 mg/kg ou entre 5 e 30 mg/kg, ou em um dose no animal compreendida entre 1 e 200 mg/kg, mais particularmente entre 1 e 100 mg/kg, mais particularmente ainda entre 2 e 45 mg/kg ou entre 10 e 60 mg/kg. c)

[091] A presente invenção será ilustrada mais detalhadamente pelas figuras e exemplos a seguir que não limitam seu alcance. FIGURAS - Figura 1: Espectro RMN 1H de um extrato de algas de acordo com a presente invenção - Figura 2: Cromatograma obtido com um extrato de algas de acordo com a presente invenção separa em duas colunas shodex 802 e 803 - Figura 3: Cromatograma obtido após a análise de derivados trimetilsililados da amostra de um extrato de algas de acordo com a presente invenção por cromatografia em fase gasosa. Com Ara: Arabinose; Gal: Galactose; Glc: Glicose; Xyl: Xilose; Man: Manose; Rha: Ramnose, GlcA: Ácido Glucurônico - Figura 4: Avaliação da dose máxima não tóxica do extrato de algas EA1 de acordo com a presente invenção - Figura 5: Avaliação da dose máxima não tóxica do extrato de algas EA2 de acordo com a presente invenção - Figura 6: Avaliação da dose máxima não tóxica do extrato de algas EA3 de acordo com a presente invenção - Figura 7: Efeitos dos extratos de algas EA1, EA2 e EA3 de acordo com a presente invenção sobre a expressão de iL8 (medidos por qPCR) - Figura 8: Efeitos dos extratos de algas EA1, EA2 e EA3 de acordo com a presente invenção sobre a expressão de TNF-α (medidos por qPCR) - Figura 9: Efeitos dos extratos de algas EA1, EA2 e EA3 de acordo com a presente invenção sobre a expressão de CCL20 (medidos por qPCR) - Figura 10: Efeitos do extrato de algas EA1 de acordo com a presente invenção sobre a expressão de iL6 (medidos por qPCR) - Figura 11: Efeitos do extrato de algas EA1 de acordo com a presente invenção sobre a expressão de iL1 α (medidos por qPCR) - Figura 12: Efeitos do extrato de algas EA1 de acordo com a presente invenção sobre a expressão de iL1 β (medidos por qPCR) - Figura 13: Efeitos do extrato de algas EA1 de acordo com a presente invenção sobre a expressão de PPARY (medidos por qPCR) - Figura 14: Efeitos do extrato de algas EA1 de acordo com a presente invenção sobre a expressão de iL12p35 (medidos por qPCR) - Figura 15: Efeitos dos extratos de algas EA1 e EA3 de acordo com a presente invenção medidos por ELISA sobre a expressão de TNF-α - Figura 16: Efeitos dos extratos de algas EA1 e EA3 de acordo com a presente invenção medidos por ELISA sobre a expressão de IL-8.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE ALGAS DE ACORDO COM A INVENÇÃO

[092] Uma tonelada de algas de tipo Ulva, frescas, brutas, são lavadas com água doce e desaeradas por meio de uma máquina a lavar as algas.

[093] Salvo indicações contrárias, as etapas do processo são realizadas à temperatura ambiente.

[094] As algas (1 tonelada de algas escorridas a 8% de matéria seca) são depois trituradas em finas partículas por meio de um afinador industrial (marca Inotec tipo "I175CDI-75D"). Por “finas partículas”, entendem-se partículas cujo tamanho está compreendida entre 50 e 1000 nm, com duas populações, a primeira cujos tamanhos estão compreendidos entre 50 e 200 nm, uma segunda cujos tamanhos estão compreendidos entre 600 e 1000 nm.

[095] O triturado é depois prensado por meio de uma prensa de correias industrial de marca Flottweg tipo "B FRU 800 HK" a uma vazão de aproximadamente 1 tonelada/hora.

[096] Essa etapa permite a separação da fase sólida (bagaço) da fase líquida (suco). O rendimento de suco obtido é de 75%.

[097] Os 750 kg de suco bruto obtidos são depois clarificados por meio de um clarificador de discos de marca Flottweg tipo "AC 2000".

[098] São obtidos assim 710 kg de um suco claro a 3.10% de massa seca (95 a 98% de rendimento de massa) e um creme (2 a 5% em massa).

[099] Em seguida, o suco claro é ultrafiltrado em uma membrana cerâmica (Tami Industries) de 15 KDa.

[0100] São obtidos um permeado e um retentado. O permeado é conservado até a obtenção de 640 kg de suco de filtração (91% de rendimento de volume) a 2,2% de matéria seca.

[0101] O suco de filtração (permeado) é então secado por lioflilização após concentração por evaporação.

[0102] A concentração é realizada em um evaporador de efeito simples (EVA 1000, Pignat) com os seguintes parâmetros: recirculação forçada, vazão de alimentação 10L/h, pressão de vapor de 1 bar, pressão de vácuo de 0,3 bar e temperatura de evaporação de 90°C.

[0103] Uma primeira concentração é realizada com uma vazão de água evaporada de 8 L/h e o °brix sobe de 5.5 (igual a uma concentração de matéria seca de 4,5%) a 14.7.

[0104] Essa solução é depois concentrada uma segunda vez com uma vazão de água evaporada de 5-6 L/h e o °brix sobe até a 34. A concentração de matéria seca da solução é determinada a 38,4%.

[0105] A lioflilização é em seguida realizada por meio de um aparelho Bioblock scientific (modelo CHRIST alpha 1-4 LSC) a uma temperatura de congelamento de -80°C que é igualmente a temperatura mínima durante essa etapa.

[0106] O pó obtido é depois triturado com um triturador planetário MiniMill de marca Philips. O produto foi introduzido em tigelas de trituração (10 g de produto em cada tigela de trituração com 4 esferas de zircônia). O conjunto foi colocado em rotação durante 15 minutos à velocidade 10.

[0107] São obtidos assim 14 kg de pó de extrato de algas. EXEMPLO 2 DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DOS POLISSACARÍDEOS POLIANIÔNICOS SULFATADOS E NÃO SULFATADOS DE UM EXTRATO DE ALGAS DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO POR GPC (GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY)

[0108] O extrato de algas de acordo com a presente invenção e preparado de acordo com o exemplo 1 é ultrafiltrado em uma membrana de 1000 Da e é dissolvido a uma concentração de 0,5 g/L em água. Ele é depois injetado em duas colunas shodex 802 e 803 colocadas em série (domínio de fracionamento da coluna 802: 4.103 Da e da coluna 803: 1.7.105 Da). O eluente utilizado é o nitrato de sódio 0,1 M com azoteto de sódio 0,2% a uma vazão de 0,5 ml/min. A detecção é realizada por um refratômetro Wyatt e um detector de difusão da luz 18 ângulos Wyatt. Os dn/dc são considerados iguais a 0,150 mL/g.

[0109] O cromatograma detectado pelo refratômetro é apresentado na figura 2.

[0110] É obtido uma tamanho médio polissacarídeos de um extrato de algas de acordo com a presente invenção de 4.4 KDa. EXEMPLO 3 DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE UM EXTRATO DE ALGAS DE ACORDO COM A INVENÇÃO

[0111] O extrato de algas de acordo com a presente invenção e preparado de acordo com o exemplo 1 é purificado por ultrafiltração frontal em células amicon que funcionam sob agitação. Uma membrana de celulose regenerada de limiar de corte de 1000 Da é utilizada. 572,1 mg de amostra do extrato de algas de acordo com a presente invenção são dissolvidos em 150 ml de água ultrapura milli-Q. Cinco litros de água são utilizados para eliminar todas as moléculas de massa inferior a 1000 Da. O retentado é liofilizado. 117 mg de amostra são pesados. O rendimento da ultrafiltração é, portanto, de 20,5% (p/p). Foram efetuadas as seguintes análises nas amostras ultrafiltradas. A razão dos monossacarídeos constitutivos dos polissacarídeos do extrato de algas de acordo com a presente invenção é determinada de acordo com o método de Kamerling (Kamerling et al., 1975) modifiée por Montreuil (Montreuil et al., 1986). A identificação e a dosagem dos monossacarídeos requerem uma hidrólise por metanólise do polímero, de forma a obter apenas monômeros. Os resíduos glicosídicos são em seguida trimetilsililados a fim de se tornar voláteis. Eles são assim identificados e dosados por cromatografia em fase gasosa em forma de metilglicosídeos O-trimetilsililados.

[0112] São utilizados os seguintes reagentes: - Solução de metanol/HCI 3N (Supelco); - Carbonato de prata; - Mioinositol; - Piridina; - Reagente Sylon BFT (BSTFA +TMCS 99:1) (Supelco); e - Diclorometano.

[0113] O modo operatório é o seguinte: 400 μg do extrato de algas de acordo com a presente invenção preparado tal como mencionado acima e 50 μg de mio-inositol são colocados em um banho seco em presença de 500 μl de uma mistura metanol/ácido clorídrico 3 N (Supelco) durante 4 horas a 100°C. Após resfriamento à temperatura ambiente, o metanolizadp é neutralizado por meio de carbonato de prata. As amostras são centrifugadas 15 minutos a 3000 rpm e o sobrenadante é evaporado sob jato de nitrogênio. Os compostos são depois dissolvidos em 80 μl de piridina e incubados durante 25 minutos a 80°C com 80 μl de sylon (BSTFA: TMCS, 99:1, Supelco). Após evaporação lenta dos reagentes em excesso sob jato de nitrogênio, os metilglicosídeos trimetilsililados são recuperados(retomados) em 500 μl de diclorometano e depois injetados em cromatografia em fase gasosa (injeção in-coluna, detector FID: ionização de chama). O gás vetor é o nitrogênio. A coluna, de tipo HP-5MS (30 m, 0,25 mm de diâmetro interno), é apolar. O programa de elevação de temperatura é o seguinte: 120°C mantidos durante 1 minuto, e depois um gradiente de 1,5°C/min até a 180°C, seguido de um gradiente de 2°C/min até a 200°C.

[0114] Cada monossacarídeo é identificado por comparação de seus tempos de retenção relativos em relação ao padrão interno, com os dos monossacarídeos puros tratados nas mesmas condições. Um coeficiente de resposta é calculado para cada monossacarídeo em relação ao padrão interno a fim de definir a proporção de cada monossacarídeo no interior dos polissacarídeos do extrato de algas de acordo com a presente invenção.

[0115] Os resultados são apresentados na tabela 1 abaixo e na figura 3. TABELA 1

[0116] Composição do extrato de algas de acordo com a presente invenção obtida após a análise de derivados trimetilsililados por cromatografia em fase gasosa, expressa em peso em relação ao peso total do extrato de algas; com Ara: Arabinose; Gal: Galactose; Glc: Glicose; Xyl: Xilose; Man: Manose; Rha: Ramnose, GlcA: Ácido Glucurônico.

EXEMPLO 4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DO EXTRATO DE ALGAS DE ACORDO COM A INVENÇÃO PARA SUA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA

[0117] Os efeitos do extrato de algas de acordo com a presente invenção são testados em células epiteliais porcinas diferenciadas IPEC-1.

[0118] As células epiteliais intestinais porcinas (Intestinal Porcine Epithelial Cell-1, IPEC-1) são células jejunais de leitão transformadas espontaneamente.

[0119] Previamente, a quantidade ótima de células IPEC-1 a ser depositada nos poços de um frasco P6 para atingir a confluência em 3 dias é determinada. A dose de 0,2 105 células/cm2 é adotada como sendo essa dose ótima.

[0120] A dose máxima não tóxica do extrato de algas de acordo com a presente invenção é em seguida estudada a fim de determinar a dose máxima que não inibe a proliferação celular das células IPEC-1.

[0121] Dois extratos de algas de acordo com a presente invenção são preparados de acordo com o exemplo 1 (denominados respectivamente EA1 e EA2).

[0122] Um terceiro extrato de algas EA3, igualmente preparado de acordo com o exemplo 1, mas tendo sido submetido a uma etapa de purificação ulterior é preparado.

[0123] Para a purificação, o extrato EA3 é ultrafiltrado em uma cassete PALL mínima de limiar de corte 1KDa. Esse extrato é em seguida liolifilizado.

[0124] Os três extratos são dissolvidos em 28 mL de meio DMEM/F12 completo. 50 mL de solução a 1% são preparados em seguida, ou seja, 0,5 g recuperados(retomados) em 50 mL. Uma esterilização por filtração a 0,2 μm é depois efetuada.

[0125] Diluições em tubo Falcon 50 mL são depois realizadas para testar diferentes concentrações de extrato de algas, como indicado na tabela 2 a seguir. TABELA 2

[0126] As células são em seguida preparadas de acordo com o seguinte protocolo: 1. preparação de 28 ml de suspensão celular a 0,07 106 células/mL para cada dose a ser testada, ou seja, 1,96 106 células/dose, 2. tripsinização, 3. as células são enxaguadas com PBS sem Ca-Mg, 4. depósito de Tripsina ATV (2 mL/F175, ou 0,4 mL/poço P6) para dissociar e descolar as células, 5. incubação 5 minutos a 37°C, 6. recuperação(retomada) em meio de cultura, 7. numeração com azul tripano, 8. preparação de 6 tubos Falcon de 15 mL com 2,23 mL, 9. centrifugação, e 10. recuperação(retomada) do sedimento de células de cada tubo em 28 mL de cada solução de extrato a ser testado e transferência para um tubo Falcon de 50 mL.

[0127] A cultura é efetuada depositando 3 ml/poço de cada suspensão nas placas e depois incubando a 37°C durante 24, 48 e 72h.

[0128] A tabela 3 resume o conteúdo dos diferentes poços. TABELA 3

[0129] As culturas são em seguida observadas e fotos são eventualmente tiradas.

[0130] As células são coletadas e enumeradas de acordo com o seguinte protocolo: 1. pegar um frasco de 6 poços, 2. retirar o sobrenadante, 3. enxaguar com 1 mL de PBS sem Ca-Mg, 4. depositar 0,4 mL/poço de tripsina ATV, 5. incubar 5 min a 37°C até o descolamento das células, 6. adicionar 0,6 ml de meio de cultura, 7. misturar bem, e 8. utilizar Azul Tripano 0,4%, (50μL de células + 50 μL de Azul Tripano 0,4%), e depois contar as células em hemacímetro de Malassez em um total de 100 retângulos.

[0131] Os resultados das figuras 4 a 6 demonstram que a dose máxima não tóxica é de 0,1% para EA1 e EA2 e de 0,5% para EA3.

[0132] A estimulação das células IPEC-1 diferenciadas pelos extratos de algas de acordo com a presente invenção EA1, EA2 e EA3 é testada 4h a 37°C (aproximadamente 10 dias após a confluência) a J15(D15).

[0133] Três doses (DM (dose máxima), DM/10, DM/100) são testadas em comparação com LPS bacteriano (controle positivo) e com meio de diferenciação (controle negativo).

[0134] As soluções de extrato de algas de acordo com a presente invenção EA1, EA2 e EA3 obtidas pelo processo indicado no exemplo 1 são preparadas a 0,1 % em DMEM/F12 completo. Para isso, 0,02g são recuperados(retomados) em 20 mL e uma esterilização por filtração 0,2 μm é efetuada. Diluições sucessivas são depois operadas como indicado na tabela 4 a seguir. TABELA 4

[0135] A quantidade de extratos de algas por célula está indicada na tabela 5 a seguir. TABELA 5

[0136] A solução de LPS (SIGMA O111:B4) é preparada em seguia (dose: 50 ng/105 células).

[0137] 200ng de LPS/poço sob um volume de 2 mL são depositados. A tabela 6 a seguir indica as diferentes concentrações preparadas. TABELA 6

[0138] Nas placas, são depositados 2 mL de meio a ser testado sobre cada filtro e 3 mL abaixo. O todo é depois incubado durante 4h a 37°C sob 5% de CO2.

[0139] As células IPEC-1 tratadas são depois coletadas para análise de acordo com o seguinte protocolo: 1. os poços são lavados duas a três vezes com 1 mL de água fisiológica tamponada, 2. as células são recuperadas(retomadas) em 350 μl de Buffer RA1 (kit Macherey-Nagel), e 3. uma transferência para tubos Eppendorf, numeradas de 1 a 15 é efetuada.

[0140] Os ARN são depois extraídos seguindo as instruções do fabricante do kit Macherey-Nagel NucleoSpin RNA II, Ref 740955.250, Lot 1211/004.

[0141] Os ARNs obtidos são depois transcritos em ADN por transcrição reversa de acordo com o seguinte protocolo: 1. para cada amostra, calcular o volume a ser tomado(utilizado) para tratar 1 μg, 2. depositar esse volume em cada poço de uma barra colocada em um bloco refrigerado, 3. adicionar o volume de água necessário QSP 9 μLl, 4. adicionar 1,3 μL de oligo dT_ancorado 100 μM Sample 3154325 Eurogentec, 5. incubar 10 minutos a 65°C em GeneAmp PCR System 9700 (USER Khalid), 6. durante a incubação preparar o mix em um tubo cônico 1,5 mL (para uma amostra) sobre gelo: i. 4 μL de tampão 5X ii. 2 μL de dNTP 20 mM (Eurogentec) iii. 1,9 μL de água milliQ iv. no último momento adicionar 0,8 μL de enzimas MuMLV 25 U/μl (ME-0125-400) (Eurogentec) 7. em cada amostra adicionar 8,7 μL de mix para um volume final de 20 μL, 8. colocar a barra em bloco refrigerado, 9. incubar por 90 minutos a 37°C para a polimerização e 5 minutos a 93°C para inativar a enzima no fim da reação em GeneAmp PCR System 9700, e 10. congelar a -20°C em uma caixa ADN(1)MO.

[0142] As amostras são depois analisadas em qPCR (testes one way [um fator] ANOVA, diferenças testadas por não paramétricos Dunnet).

[0143] O efeito do extrato EA1 sobre a expressão de iL8, de TNF-α, de CCL20, de iL6, de iL1 α, de iL1 β, de PPARY e de iL12p35 é testado.

[0144] O efeito dos extratos EA2 e EA3 sobre a expressão de iL8, de TNF-α e de CCL20 é testado. Os resultados estão indicados nas figuras 7 a 14.

[0145] Eles mostram um crescimento da expressão do ARNm das diferentes citocinas testadas.

[0146] A atividade imunoestimuladora de um extrato de algas de acordo com a presente invenção é igualmente avaliada estudando a estimulação dos fatores da imunidade por ELISA em células IPEC-1 diferenciadas.

[0147] Os dois kits comerciais são o Kit Duo set porcino CXCL8/IL8 (ref: DY535) e o Kit Duo set porcino TNF-α (ref: DY690B) fornecidos pela empresa R&D Systems. Os dois kits seguem o mesmo protocolo utilizando um anticorpo de captura, um anticorpo e um sistema de detecção e das proteínas padrão específicas a cada interleucina. CULTURA CELULAR E INCUBAÇÃO COM OS EXTRATOS EA1 E EA3 PARA A PRODUÇÃO DAS CITOCINAS

[0148] As células IPEC-1 (0,25x105 células/cm2) são cultivas em insertos de cultura durante 3 dias até a obtenção de uma confluência celular. Em seguida, o soro de bezerro fetal é substituído por dexametasona a 10-7M para diferenciar as células durante um período de 10-14 dias. Três poços de cultura são incubados durante 24h a 37°C em presença dos extratos EA1 e EA3. Os controles são constituídos de culturas celulares sem extratos de algas. Os sobrenadantes de cultura acima e abaixo dos insertos são coletados e armazenados a - 80°C em tube Eppendorf até a sua dosagem.

[0149] Dosagem de iL8 e de TNF- α por ELISA.

[0150] Os anticorpos de captura (anti IL-8 ou anti TNF-α de camundongo), diluídos 1/180 em PBS, são imobilizados à razão de 100 μL/poço durante a noite à temperatura ambiente. Três lavagens são efetuadas para eliminar os anticorpos não fixados com 400 μL/poço de PBS que contém 0,05% de Tween (tampão de lavagem). Em seguida, uma etapa de saturação é realizada para bloquear os sítios de fixação não específicos e evitar assim que as proteínas a ser testadas não se fixem no plástico. Para isso, 300 μL/poço de tampão PBS que contém 1% de Soro Albumina Bovina (BSA) são adicionados. As placas são incubadas durante 1 h à temperatura ambiente e depois lavadas três vezes com 400 uL/poço de tampão de lavagem. As proteínas padrão (IL8 e TNF-α recombinantes) são diluídas com sua concentração reduzida pela metade em um tampão PBS que contém 1% de BSA ter concentrações da ordem de 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125 pg/ml. Um volume de 100 μL de amostra de sobrenadante puro e de proteínas padrão são depositados por poços e depois incubados durante 2h a temperatura ambiente. Após uma etapa de três lavagens com 400 uL/poço de tampão, as placas são incubadas em presença de 100 uL/poço de anticorpos de detecção acoplado à biotina diluído a 1/180 com do tampão de diluição que contém 2% de soro de cabra descoplementado. Após uma incubação de 2h a temperatura ambiente, as placas são lavadas três vezes com tampão de lavagem e incubadas com 100 μL de conjugado Streptavidine- HRP durante 20 minutos à temperatura ambiente longe da luz. Após três lavagens com tampão de lavagem, os poços são incubados com 100 μL de substrato (v/v reagente A e B) durante 20 minutos a temperatura ambiente na escuridão. A reação HRP-substrato é interrompida com 50 uL/poço de uma solução stop e a leitura da DO (densidade ótica) é efetuada a 450 nm com um leitor ELISA Labsystems Multiskan RC.

[0151] Os resultados estão indicados nas figuras 15 e 16.

[0152] Elas mostram um crescimento da expressão proteica das diferentes citocinas testadas.

CONCLUSÃO

[0153] A administração de um extrato de algas de acordo com a presente invenção demonstra assim um efeito imunoestimulador do produto.

Claims

1. USO DE UM EXTRATO DE ALGAS da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas verdes do tipo Ulva, compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é inferior ou igual a 50 kDa, excluindo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo tamanho é superior a 50kDa, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem manose e/ou arabinose, em particular manose.

3. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem pelo menos 0,005% de manose e/ou pelo menos 0,005% de arabinose, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

4. USO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem manose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,50% e/ou arabinose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,5%, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem ainda: - galactose; - glicose; - ramnose; - xilose; e - ácido glucurônico.

6. USO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelos referidos polissacarídeos compreenderem: - de 0,05 a 0,5% de galactose em peso em relação ao peso do total da matéria seca do extrato de alga; - de 0,005 a 0,5% de glicose em peso em relação ao peso do total da matéria seca do extrato de alga; - de 2 a 15 % de ramnose em peso em relação ao peso do total da matéria seca do extrato de alga; - de 0,1 a 1% de xilose em peso em relação ao peso total da matéria seca do extrato de algas; e - de 1 a 7% de ácido glucurônico em peso em relação ao peso total da matéria seca do extrato de alga.

7. USO DE UM EXTRATO DE ALGAS da ordem das ulvales, em particular um extrato de algas verdes do tipo Ulva, que pode ser obtido por um método de preparação no qual: a) as algas são lavadas e desareadas (cleared of sand); b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do material triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado em uma membrana de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e depois secado; caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para modular a resposta imunológica em um ser humano ou um animal.

8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para estimular a resposta imunológica em um ser humano ou animal, em particular no sistema imunológico intestinal.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo extrato de algas induzir a expressão de moléculas de adesão e de quimiocinas, em particular as IL-8 e/ou IL-1α e/ou IL1-β e/ou IL-6 e/ou TNF- α e/ou CCL20.

10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por ser como complemento de vacinação.

11. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ser para o tratamento e/ou a prevenção das patologias infecciosas, em particular as patologias infecciosas porcinas escolhidas entre: parvovirose, Erisipela rhusiopathiae, rinite infecciosa, gripe (influenza), circovirose porcina, micoplasmose e colibacilose; as patologias infecciosas aviárias escolhidas entre: doença de Marek, doença de Newcastle, bronquite infecciosa, doença de Gumboro, varíola aviária, micoplasmose, anemia infecciosa aviária, laringotranqueíte infecciosa, EDS e gripe aviária; as patologias infecciosas bovinas escolhidas entre: BVD (diarreias virais bovinas), broncopneumonia enzoótica, IBR, herpes virótica, clostridiose, colibacilose, febre catarral, coronavirose, rotavirose e rinotraqueíte; e as patologias infecciosas aquícolas escolhidas entre: necrose hemapoiética, vibriose, furonculose, necrose pancreática infecciosa e anemia infecciosa.

12. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo extrato de algas estar compreendido em uma composição farmacêutica.

13. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo extrato de algas estar compreendido em uma composição alimentar.

14. USO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo extrato de algas ser administrado em uma dose no ser humano compreendida entre 0,1 e 100 mg/kg ou em uma dose no animal compreendida entre 1 e 200 mg/kg.

15. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelos polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados possuírem um tamanho inferior ou igual a 15 kDa.

16. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo referido extrato de algas ser suscetível de ser obtido por um método de preparação no qual: a) as algas são lavadas e desareadas; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do material triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado em uma membrana de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e depois secado.

17. USO, de acordo com uma das reivindicações 7 ou 16 caracterizado pelo suco obtido na etapa d) do método de preparação ser ultrafiltrado em uma membrana de 15 kDa ou menos.

18. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 ou 17 caracterizado pelo extrato de algas obtido na etapa f) do método de preparação ser purificado, particularmente por ultrafiltração.