BR112021007506A2

BR112021007506A2 - uso de um extrato de algas da ordem ulvales

Info

Publication number: BR112021007506A2
Application number: BR112021007506-2A
Authority: BR
Inventors: Karim Asehnoune; Cédric Jacqueline; Marwan Bouras; Antoine Roquilly; Pi Nyvall-Collén; Hervé Demais; Hervé Balusson
Original assignee: Amadeite
Priority date: 2018-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2021-07-27
Also published as: KR20210114921A; CA3116952A1; AU2019364677A1; WO2020083931A1; FR3087338A1; JP2022508900A; FR3087338B1; EP3870198A1; CN113347984A; IL282511A; US20210386808A1

Abstract

USO DE UM EXTRATO DE ALGAS DA ORDEM ULVALES. A presente invenção se refere a um extrato de algas da ordem Ulvales, compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa, para uso na prevenção e/ou tratamento de complicações causadas por imunossupressão pós-traumática.

Description

“USO DE UM EXTRATO DE ALGAS DA ORDEM ULVALES”

[001] A presente invenção refere-se a um extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa, para uso na prevenção e/ou tratamento de complicações induzidas por imunossupressão pós-traumática.

[002] O politrauma (trauma múltiplo) ou trauma grave é acompanhado por uma síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) causada pela liberação de componentes intracelulares denominados “padrões moleculares associados ao perigo” (DAMPs). Esses DAMPs irão estimular diretamente receptores específicos, os “receptores de reconhecimento de padrões”, Presente nas células do sistema imunológico, causando assim a liberação de mediadores da inflamação (mediadores inflamatórios). A fim de evitar complicações sistêmicas de SIRS descontrolada, o corpo desenvolve uma síndrome da resposta anti-inflamatória compensatória (CARS) sistêmica precoce. A CARS leva à imunossupressão pós-traumática que varia em duração e magnitude. No início, essa imunossupressão é “fisiológica” e está presente em todos os pacientes. A imunossupressão torna-se patológica se persistir, levando a infecções pós-traumáticas (principalmente pneumopatias) que são a principal causa de complicações em cuidados intensivos (Roquilly et al., 2015, Réanimation [Intensive Care Medicine], 24: S285-S290).

[003] O trauma craniano (ou trauma da cabeça) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade, com uma taxa de mortalidade geral para vítimas variando entre 5 e 25 por 100.000 pacientes. Cerca de um terço dos fatores de morbidade e mortalidade são complicações evitáveis que ocorrem em terapia intensiva (infecções, eventos tromboembólicos), principalmente devido a complicações respiratórias. A morbidade e os custos com a saúde decorrentes da pneumonia adquirida em ventilação mecânica, ou seja, a pneumonia associada à ventilação mecânica (VAPs), a tornam uma das complicações mais relacionadas à assistência prestada. Entre 40 e 60% dos pacientes com trauma craniano grave hospitalizados em unidades de terapia intensiva terão VAP, sendo cerca de 50% dos casos causados por Staphyloccocus aureus suscetível à meticilina (MSSA). Durante sua internação em terapia intensiva, um paciente com traumatismo craniano que sofre de VAP terá mais lesões cerebrais de origem sistêmica (febre, hipotensão, hipóxia, hipercapnia); o tempo de ventilação mecânica também será estendido, assim como a permanência em terapia intensiva. Todos esses fatores contribuem, por um lado, para o surgimento de novas lesões cerebrais isquêmicas hipóxicas e, por outro, a um retardo no manejo de cuidados pós-intensivos (reabilitação e semelhantes). O desenvolvimento de uma VAP em um paciente com traumatismo craniano é, portanto, um fator independente de risco de resultados neurológicos indesejáveis em longo prazo. A suscetibilidade dos pacientes com traumatismo craniano às infecções nosocomiais e, em particular, à VAP deve-se ao aparecimento de imunossupressão pós-traumática.

[004] No nível celular, essa imunossupressão pós-traumática ocorre em vários níveis:

1. Diminuição da capacidade de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos (APCs), principalmente células dendríticas (DCs) e monócitos. As DCs desempenham um papel central na captura e apresentação do antígeno, bem como na ativação dos linfócitos (T e NK) por meio da secreção de citocinas pró-inflamatórias (Interleucina-12).

2. Uma diminuição na capacidade de secretar citocinas pró- inflamatórias. A cooperação entre APCs e linfócitos em caso de lesões pulmonares agudas é essencial. Assim, uma alteração na produção de IL-12, uma consequência do trauma craniano, irá induzir uma diminuição na secreção de citocinas pró-inflamatórias, como IFN γ, pelas células linfoides (Spolarics et al., 2003, Crit. Care Med.; 31 (6): 1722-9). Por outro lado, o aumento da secreção de citocinas anti-inflamatórias (IL-10) via hiperativação simpática contribui para o aprofundamento desse estado de imunossupressão (Roquilly et al., 2014, Crit.

Care Med., 42 (12): 752-61). A alteração desse “loop” da resposta imune inata, portanto, causa uma diminuição na capacidade do corpo de combater infecções secundárias.

3. Esgotamento de linfócitos T (“esgotamento de células T”), fenômeno também encontrado na imunossupressão pós-séptica. Esse esgotamento corresponde à perda progressiva das funções pró-inflamatórias dos linfócitos na presença de uma alta carga de antígenos. Esse fenômeno serviria para explicar em parte a alta incidência de VAP em pacientes com traumatismo craniano. Este fenômeno de “esgotamento” e a linfopenia resultante é um fator de risco de mortalidade em pacientes politraumatizados (trauma múltiplo) (Heffernan et al., 2012, Crit. Care., 20; 16 (1): R12). Na maioria dos pacientes, essa linfopenia persiste além de 6 meses.

[005] Com o objetivo de corrigir essa imunossupressão pós- traumática, muitas terapias têm sido testadas nos últimos anos. O objetivo era limitar a SIRS inicial (e, portanto, a CARS), em particular por meio do uso de glicocorticóides em baixas doses; ou restaurando a capacidade de apresentação de antígenos ou capacidade de secreção de citocinas por meio do uso de glucanas, IFNy, GM-CSF ou interleucina 12.

[006] Os “receptores toll-like” (TLRs) estão envolvidos no reconhecimento das moléculas associadas ao perigo (DAMPs). Esses receptores estão localizados na superfície das células do sistema imune inato (células imunes inatas). Dez diferentes TLRs foram identificados em humanos, com cada um deles reconhecendo uma ou mais DAMPs. Após o reconhecimento com seu ligante, o receptor TLR pode ativar duas principais vias de sinalização intracelular resultando na ativação i) do fator de transcrição Fator Nuclear Kappa

B (NF-κB, fator de diferenciação mieloide 88 ou via dependente de MyD88) levando à ligação ao promotor dos genes de citocinas pró-inflamatórias (Interleucina 12 [IL-12], fator de necrose tumoral alfa [TNFα]); e ii) fatores de transcrição nuclear da família de IRFs (fator regulador de interferon [IRF], via dependente de interferon-β [TRIF] de indução de adaptador contendo domínio TIR). Os receptores mais estudados são o TLR4, envolvido no reconhecimento do lipopolissacarídeo (LPS) que compõe a parede dos bacilos gram-negativos, e o TLR2, que reconhece o ácido lipoteicóico das bactérias gram-positivas.

[007] Os agonistas de TLR foram sugeridos como uma possível via de pesquisa com o objetivo de restaurar as funções imunológicas que estão “paralisadas” por trauma e combater infecções secundárias (Hedayat et al., 2011, Lancet Infect Dis.; 11 (9): 702 -12).

[008] Foi demonstrado que a administração de monofosforil lipídeo A (MPLA), um derivado não tóxico de LPS conhecido por ter atividade agonista de TLR4, evitou a mortalidade em um modelo de camundongo de pneumonia pós-hemorragia derivada de camundongos imunossuprimidos induzidos por hemorragia (Roquilly et al. 2010, PLoS One 7; 5 (10): e13228; pedido de patente internacional WO 2011/080126). No entanto, o mecanismo de ação efetivamente envolvido nisso não foi elucidado. Neste modelo de camundongo de pneumonia pós-hemorragia derivada de camundongos imunossuprimidos induzidos por hemorragia, também foi demonstrado que o MPLA restaura parcialmente a função das células dendríticas (DCs); evita a superexpressão de mRNA de IL- 10 em células NK; e que a estimulação direta por MPLA de DCs diminui a mortalidade, enquanto a estimulação direta de células NK parece, no entanto, ser dispensável nesta resposta imune contra pneumonia (Roquilly et al., 2013, Eur Respir J.; 42 (5): 1365-78). Como admitido pelos próprios autores, entretanto, não foi demonstrado que esse efeito do MPLA seja mediado por TLR4, em particular por receptores TLR4 expressos na superfície de DCs ou células NK.

[009] Compostos à base de algas marinhas são usados em vários campos, desde a indústria farmacêutica até o campo da microbiologia. Seus componentes biologicamente ativos são compostos principalmente de peptídeos, ácidos graxos poliinsaturados e polissacarídeos. As paredes celulares das algas marinhas são ricas em polissacarídeos sulfatados, como ulvanos em algas verdes. Recentemente, foi demonstrado que uma fração purificada de ulvanos extraída de uma alga verde do tipo Ulva tem atividade imunomoduladora, em particular in vitro em células epiteliais de suíno intestinal IPEC-1 (pedido de patente WO 2015/071497). Nesta linhagem celular IPEC-1, o extrato de algas estimula a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL1 β, IL-6, IL-8, TNFα e semelhantes) in vitro (Berri et al., 2016, Journal of Applied Phycology, 28 (5): 2999-3008), através da via TLR4/ NF-κB (Berri et al., 2017, Algal Research, 28, 39-47).

[0010] Os inventores buscaram determinar se um extrato de algas da ordem Ulvales, em particular algas verdes do tipo Ulva, compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa, poderia prevenir ou ser eficaz no tratamento da imunossupressão pós-traumática, em particular das complicações respiratórias da mesma. Os efeitos deste extrato na imunidade da mucosa pulmonar foram avaliados em particular em um modelo de rato de trauma craniano (cabeça) (Flierl et al., 2009, Nat Protoc.; 4 (9): 1328-37), seguido por pneumonia induzida por Staphylococcus aureus sensível à meticilina (MSSA).

[0011] Assim, foi demonstrado que, no modelo murino de infecção bacteriana pulmonar pós-traumática, o extrato de algas: - limita a disseminação bacteriana sistêmica (esplênica), sem que esse efeito se mostre vinculado a uma ação antibacteriana direta do extrato, indicando assim uma restauração das funções imunológicas paralisadas pelo trauma; - não aumenta a proporção de células imunes inatas que produzem citocinas pró-inflamatórias no pulmão (DCs produtoras de IL-12, macrófagos produtores de TNFα, NKs produtoras de interferon gama (IFN γ) ou TLs de linfócitos T); - aumenta o número de células NK totais e o número de células NK produtoras de IFN γ, sem aumentar a porcentagem de células NK IFN γ+, no pulmão (local da infecção), mas não no baço. Este efeito, portanto, compensa a diminuição no número de células NK totais e células NK IFN γ+ no pulmão, induzida pelo trauma craniano; - não tem efeito na disseminação bacteriana sistêmica quando o camundongo sofreu depleção de células NK (> 95% de depleção de células NK pulmonares); - não induz, nos pulmões, qualquer aumento no nível de quimiocinas envolvidas na quimiotaxia das células NK

[0012] Quando a infecção bacteriana pulmonar em camundongos é induzida na ausência de trauma craniano (e, portanto, sem imunossupressão), o extrato de algas não induz estimulação de células imunes inatas, seja via estimulação da secreção de IL-12 por DCs, de TNFα por macrófagos, ou de IFN γ por células NKs ou linfócitos T (TLs); ou via estimulação da expressão da membrana do complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II) por DCs; e também não limita a propagação bacteriana.

[0013] Além disso, a estimulação direta in vitro de células NK pulmonares de camundongos naïve ou sujeitos a trauma, com o extrato de alga não induz qualquer aumento na produção de interferon γ ou do receptor da subfamília G membro 1 (KLRG1) do tipo lectina da célula assassina marcadora para ativação de células NK.

[0014] Estes resultados, portanto, demonstram o valor de utilidade de um extrato de algas da ordem Ulvales, em particular algas verdes do tipo Ulva, compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com peso molecular menor ou igual a 50 kDa, para prevenção ou tratamento de imunossupressão pós-traumática.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0015] A invenção se refere a um extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa, para uso na prevenção e/ou tratamento de complicações induzidas por imunossupressão pós-traumática.

[0016] De acordo com uma forma de realização, a complicação induzida é uma complicação séptica associada à imunossupressão pós- traumática. De acordo com certas formas de realização, a complicação séptica é uma infecção nosocomial, em particular uma infecção nosocomial selecionada a partir do grupo que consiste em pneumopatias, pneumonia adquirida sob ventilação mecânica, ou seja, pneumonia associada ao ventilador (VAPs), infecções do trato urinário, infecções de cateteres venosos centrais, infecções bacterianas cerebromeníngeas, como empiema, meningite e abcesso cerebral.

[0017] De acordo com uma forma de realização, a imunossupressão pós-traumática ocorre como consequência de um ou mais traumas graves, em particular um trauma craniano grave (traumatismo craniano).

[0018] O extrato de algas da ordem Ulvales é preferencialmente um extrato de algas verdes do tipo Ulva.

[0019] De acordo com uma forma de realização, os referidos polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa, têm um peso molecular que é menor que 15 kDa e, de preferência, maior que 500 Da. De preferência, o extrato de algas não compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados ou não sulfatados com um peso molecular superior a 15 kDa.

[0020] De acordo com uma forma de realização, o extrato de algas compreende: - manose; e/ou - arabinose; e/ou - galactose; e/ou - glicose; e/ou - ramnose; e/ou - xilose; e/ou - ácido glucurônico.

[0021] De acordo com uma forma de realização, o extrato de alga compreende: - de 10 a 50% de carbono; - de 1 a 10% de hidrogênio; - de 1 a 5% de nitrogênio; - de 20 a 50% de oxigênio; e - de 1 a 15% de enxofre; em uma percentagem em massa da matéria seca total (peso seco) do extrato de algas.

[0022] De acordo com uma outra forma de realização, o extrato de alga é obtido por meio de um método de preparação em que: a) as algas são lavadas e a areia é retirada; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do material triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado através de uma membrana com tamanho de poro de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e, em seguida, seco.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0023] De acordo com um aspecto, a invenção se refere a um extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa, para uso na prevenção e/ou tratamento de complicações induzidas pela imunossupressão pós-traumática.

[0024] De acordo com um aspecto, a invenção se refere a um método de tratamento para tratamento profilático ou terapêutico de complicações induzidas por imunossupressão pós-traumática em um sujeito que requer o mesmo, o método compreendendo a administração ao referido sujeito de uma quantidade eficaz de um extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa.

EXTRATO DE ALGAS DA ORDEM ULVALES

[0025] Um extrato de algas compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com peso molecular menor ou igual a 50 kDa foi em particular descrito no pedido de patente WO 2015/071497.

[0026] O extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com peso molecular inferior ou igual a 50 kDa é, em particular, um extrato de algas verdes do tipo Ulva.

[0027] O termo “algas verdes do tipo Ulva” é entendido como referindo-se às algas verdes agrupadas no gênero Ulva, da família das Ulvaceae, da ordem Ulvales. Menção pode em particular ser feita das seguintes espécies e subespécies: Ulva acanthophora, Ulva anandii, Ulva angusta, Ulva arasakii, Ulva armoricana, Ulva atroviridis, Ulva attenuata, Ulva beytensis, Ulva bifrons, Ulva brevistipitata, Ulva bulbosa, Ulva burmanica, Ulva byssoides, Ulva californica, Ulva chaetomorphoides, Ulva clathrata, Ulva coccinea, Ulva compressa, Ulva conglobata, Ulva cornucopiae, Ulva cornuta, Ulva covelongensis, Ulva crassa, Ulva crassimembrana, Ulva curvata, Ulva dactylifera, Ulva denticulata, Ulva elegans, Ulva elminthoides, Ulva enteromorpha, Ulva erecta, Ulva expansa, Ulva fasciata, Ulva fenestrata, Ulva flexuosa, Ulva gelatinosa, Ulva geminoidea, Ulva gigantea, Ulva grandis, Ulva hendayensis, Ulva hookeriana, Ulva hopkirkii, Ulva indica, Ulva intestinalis, Ulva intestinaloides, Ulva intricata, Ulva intybacea, Ulva javanica, Ulva kylinii, Ulva lactuca, Ulva lactucaefolia, Ulva laetevirens, Ulva laingii, Ulva linearis, Ulva lingulata, Ulva linkiana, Ulva linza, Ulva lippii, Ulva litoralis, Ulva littorea, Ulva lobata, Ulva lubrica, Ulva marginata, Ulva micrococca, Ulva myriotrema, Ulva neapolitana, Ulva nematoidea, Ulva ohnoi, Ulva olivacea, Ulva olivaceum, Ulva pacifica, Ulva papenfussii, Ulva paradoxa, Ulva parva, Ulva parvula, Ulva patengensis, Ulva percursa, Ulva pertusa, Ulva phyllosa, Ulva popenguinensis, Ulva porrifolia, Ulva procera, Ulva profunda, Ulva prolifera, Ulva pseudocurvata, Ulva pseudolinza, Ulva pulchra, Ulva purpurascens, Ulva quilonensis, Ulva radiata, Ulva ralfsii, Ulva ranunculata, Ulva reticulata, Ulva rhacodes, Ulva rigida, Ulva rotundata, Ulva rubens, Ulva saifullahii, Ulva scagelii, Ulva scandinavica, Ulva sericea, Ulva serrata, Ulva simplex, Ulva sorensenii, Ulva spinulosa, Ulva stenophylla, Ulva stipitata, Ulva sublittoralis, Ulva subulata, Ulva taeniata, Ulva tenera, Ulva tetragona, Ulva torta, Ulva tuberosa, Ulva umbilicata, Ulva uncialis, Ulva uncinata, Ulva usneoides, Ulva utricularis, Ulva utriculosa, Ulva uvoides, Ulva ventricosa.

[0028] O extrato de algas mencionado acima compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa. Mais particularmente, o extrato de algas compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com peso molecular igual ou inferior a 50 kDa, dos quais o peso molecular é inferior a 40, 30, 20 ou

15 kDa. Mais particularmente, os polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados do extrato de algas têm um peso molecular que é menor ou igual a 15 kDa. De preferência, os polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados do extrato de algas têm um peso molecular superior a 500 Da, de preferência superior a 750 Da.

[0029] De acordo com uma forma de realização da invenção, o extrato de algas não compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados ou não sulfatados com peso molecular superior a 50 kDa (ou superior a 40, 30, 20 ou 15 kDa quando os polissacarídeos sulfatados e não sulfatados são definidos por um peso molecular inferior a 40, 30, 20 ou 15 kDa, respectivamente). Assim, de acordo com uma forma de realização, quando o extrato de algas compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com um peso molecular que é menor ou igual a 15 kDa, o extrato de algas não compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com um peso molecular que é maior do que 15 kDa.

[0030] Um dalton (Da) é uma unidade de massa definida como sendo igual a um duodécimo da massa de um átomo de carbono-12 não ligado, uma massa que posteriormente será mostrada como sendo estimada a partir de uma mistura de vários isótopos (principalmente carbono-12 e carbono-13, tendo 6 e 7 nêutrons, respectivamente, além dos 6 prótons de qualquer átomo de carbono). Um dalton é, com um grau de precisão razoavelmente bom, a massa de um átomo de hidrogênio, o valor exato sendo 1,00794 amu (unidade de massa atômica). A unidade de quilodalton (kDa) é igual a 1000 Da. No contexto da presente invenção, as massas mencionadas em kDa são determinadas por qualquer método apropriado geralmente usado pelo técnico no assunto, em particular as massas de polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados dos extratos de algas podem ser seletivamente separadas por ultrafiltração em membranas que permitem que apenas moléculas de tamanhos predeterminados sejam filtradas.

[0031] De acordo com uma forma de realização, os polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com um peso molecular que é inferior a 50 kDa, como descrito aqui acima, têm um grau de polimerização superior a unidades de 5 -ose.

[0032] No extrato de algas conforme definido aqui acima, os polissacarídeos incluem manose e/ou arabinose, de preferência manose. Mais particularmente ainda, o extrato de algas compreende pelo menos 0,005% de manose e/ou pelo menos 0,005% de arabinose, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas, em particular pelo menos 0,01% de manose e/ou pelo menos 0,01% de arabinose. De preferência, o extrato de algas compreende pelo menos 0,005% de manose.

[0033] Ainda mais particularmente, o extrato de algas compreende manose em uma quantidade que varia de 0,005 a 0,5%, por exemplo, de 0,005 a 0,2%, ou de 0,15 a 0,5%; e/ou arabinose em uma quantidade que varia de 0,005 a 0,5%, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas; preferencialmente manose em uma quantidade que varia de 0,005 a 0,5%, por exemplo de 0,005 a 0,2% ou 0,15 a 0,5%, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[0034] Ainda mais particularmente, o extrato de algas compreende manose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,5%, por exemplo, de 0,01 a 0,2%, ou de 0,2 a 0,5%; e/ou arabinose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,5%, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas; em particular manose em uma quantidade que varia de 0,03 a 0,45%, por exemplo de 0,03 a 0,15%, ou de 0,15 a 0,45%; e/ou arabinose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,2%.

[0035] De preferência, o extrato de algas compreende manose em uma quantidade que varia de 0,01 a 0,50%, por exemplo de 0,01 a 0,20%, ou de

0,20 a 0,5%, em particular manose em uma quantidade que varia de 0,03 a 0,45%, por exemplo de 0,03 a 0,15%, ou de 0,15 a 0,45%, em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[0036] De acordo com uma forma de realização, o extrato de algas compreende: - galactose; e/ou - glicose; e/ou - ramnose; e/ou - xilose; e/ou - ácido glucurônico.

[0037] Mais particularmente, o extrato de algas compreende: - de 0,05 a 0,5% de galactose, em particular de 0,1 a 0,4%; e/ou - de 0,005 a 0,5% de glicose, em particular de 0,005 a 0,05%, em particular de 0,01 a 0,03%, ou de 0,05 a 0,5%; e/ou - de 2 a 15% de ramnose, em particular de 5 a 10%; e/ou - de 0,1 a 1% de xilose, em particular de 0,3 a 0,7%; e/ou - de 1 a 7% de ácido glucurônico, em particular de 1 a 5%; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[0038] Assim, de acordo com uma forma de realização, o extrato de algas compreende: - manose; e/ou - arabinose; e/ou - galactose; e/ou - glicose; e/ou - ramnose; e/ou - xilose; e/ou

- ácido glucurônico.

[0039] Mais particularmente, pode ser feita menção, por exemplo, ao extrato de algas que compreende: - de 0,01 a 0,5% de manose, por exemplo de 0,01 a 0,2%, em particular de 0,03 a 0,15%, ou de 0,2 a 0,5%; e/ou - de 0,01 a 0,5% de arabinose, em particular de 0,01 a 0,2%; e/ou - de 0,05 a 0,5% de galactose, em particular de 0,1 a 0,4%; e/ou - de 0,005 a 0,5% de glicose, em particular de 0,005 a 0,05%, em particular de 0,01 a 0,03%, ou de 0,05 a 0,5%; e/ou - de 2 a 15% de ramnose, em particular de 5 a 10%; e/ou - de 0,1 a 1% de xilose, em particular de 0,3 a 0,7%; e/ou - de 1 a 7% de ácido glucurônico, em particular de 1 a 5%; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[0040] Na verdade, ainda mais particularmente, pode ser feita menção, por exemplo, ao extrato de algas que compreende: - 0,09% de manose; e/ou - 0,1% de arabinose; e/ou - 0,3% de galactose; e/ou - 0,02% de glicose; e/ou - 8,1% de ramnose; e/ou - 0,5% de xilose; e/ou - 2,6% de ácido glucurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[0041] Também pode ser feita menção, por exemplo, ao extrato de algas que compreende: - 0,3% de manose; e/ou - 0,2% de galactose; e/ou - 0,4% de glicose; e/ou - 7,9% de ramnose; e/ou - 0,5% de xilose; e/ou - 4,9% de ácido glucurônico; em peso em relação ao peso da matéria seca total do extrato de algas.

[0042] De acordo com uma forma de realização, o extrato de algas compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com um peso molecular que é menor ou igual a 50 kDa, como descrito aqui acima, compreende: - de 10 a 50% de carbono; - de 1 a 10% de hidrogênio; - de 1 a 5% de nitrogênio; - de 20 a 50% de oxigênio; e - de 1 a 15% de enxofre; como uma porcentagem em massa da matéria seca total do extrato de algas.

[0043] Na verdade, ainda mais particularmente, o extrato de algas compreende: - de 15 a 30% de carbono; - de 3 a 6% de hidrogênio; - de 1 a 3% de nitrogênio; - de 25 a 40% de oxigênio; e - de 2,5 a 10% de enxofre; como uma porcentagem em massa da matéria seca total do extrato de algas.

[0044] De acordo com uma outra forma de realização da invenção, o extrato de algas compreende: - de 10 a 50% de carbono; - de 1 a 10% de hidrogênio; - de 0,5 a 5% de nitrogênio; - de 20 a 60% de oxigênio; e - de 1 a 15% de enxofre; como uma porcentagem em massa da matéria seca total do extrato de algas.

[0045] Os outros elementos químicos presentes na matéria seca do extrato são, em particular, representados pelos minerais (Ca, K, Na, Mg, Al, Cl, I, P, Fe, etc.).

[0046] Mais particularmente, o extrato de algas conforme descrito no contexto da presente invenção é caracterizado pelo espectro de 1H NMR apresentado na Figura 1.

[0047] Este espectro de 1H NMR foi registrado a 298 K em um espectrômetro Bruker Avance 500 equipado com uma sonda criogênica de TCI inversa de 5 mm1 H/13C/15N. Antes da análise, as amostras foram dissolvidas em 99,97% de D2O Os desvios químicos são expressos em ppm em relação a um padrão externo (ácido trimetilsilil propiônico). Nenhuma supressão de sinal HOD foi realizada.

[0048] O extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com um peso molecular que é menor ou igual a 50 kDa, como descrito aqui acima, é capaz de ser obtido, ou é obtido, por meio de um método de preparação na qual: a) as algas são lavadas e a areia é retirada; b) as referidas algas são trituradas;

c) a fase sólida do material triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado através de uma membrana com tamanho de poro de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e, em seguida, seco.

[0049] De acordo com uma forma de realização, o método de preparação inclui, além disso, uma etapa de congelamento seguida por um processo de descongelamento, entre a etapa a) de lavagem/ remoção de areia e a etapa b) de trituração.

[0050] Em particular, para a implementação do método conforme indicado no contexto da presente invenção, na etapa a) do mesmo, as algas são lavadas com água doce.

[0051] Eles podem ter a areia removida por qualquer meio que esteja disponível para os técnicos no assunto.

[0052] As referidas algas são então trituradas, nomeadamente por meio de um moinho, como por exemplo um refinador ou um cortador.

[0053] Em seguida, a fase sólida do material triturado, o bagaço, é separada da sua fase líquida, o suco, por prensagem do material triturado, por exemplo, usando uma correia ou prensa de placas, ou por centrifugação.

[0054] O termo “suco” é entendido como se referindo ao suco citoplasmático que inclui a estrutura parietal da estrutura de membrana dupla das células de algas.

[0055] A fase líquida obtida é então clarificada, por exemplo, com um clarificador de pilha de discos, ou por centrifugação, decantação ou filtração (por exemplo, com filtro de saco ou placa).

[0056] O suco obtido é ultrafiltrado.

[0057] De acordo com uma forma de realização para implementar o método conforme indicado no contexto da presente invenção, a ultrafiltração é realizada em uma membrana com tamanho de poro (ou limite de peso molecular nominal NMWL) de 50 kDa ou menos, em particular em uma membrana com tamanho de poro de 40, 30, 20 ou 15 kDa. Mais particularmente, a membrana é uma membrana com tamanho de poro de 15 kDa ou menos.

[0058] Esta membrana pode ser, por exemplo, uma membrana cerâmica ou uma membrana orgânica. Mais particularmente, a membrana é uma membrana cerâmica.

[0059] O suco de filtração obtido pode depois ser concentrado, por exemplo, por osmose reversa, evaporação ou precipitação, e depois seco, por exemplo, por liofilização ou atomização.

[0060] Opcionalmente, a etapa de concentração pode ser precedida por uma etapa de desmineralização, em particular em uma membrana com um tamanho entre 150 e 1000 Da.

[0061] Opcionalmente, o extrato obtido pode então ser triturado novamente, a fim de se obter um pó homogêneo em termos de tamanho de partícula.

[0062] De acordo com um desses aspectos, o método é realizado em parte à temperatura ambiente. O termo “temperatura ambiente” é entendido como indicando uma temperatura entre 5 e 25 °C.

[0063] De acordo com outro destes aspectos, o método é realizado em parte a uma temperatura entre 4 e 10 °C, sendo isto para prevenir o desenvolvimento e crescimento microbiano.

[0064] De acordo com uma forma de realização para implementar o método conforme indicado no contexto da presente invenção, o extrato de algas obtido na etapa f) do método acima mencionado é purificado, por exemplo, por ultrafiltração, em particular em uma cassete de ultrafiltração, em particular a fim de remover a parte mineral. De acordo com uma forma de realização alternativa, esta purificação também pode ser realizada antes da etapa de concentração f) ou durante a etapa de concentração f).

[0065] O método de preparação para a preparação do extrato de algas como descrito acima não usa solventes, em particular solventes orgânicos, e mais particularmente solventes que não sejam água.

[0066] De preferência, o extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com peso molecular menor ou igual a 50 kDa exibe um ou mais dos seguintes efeitos: - limita a disseminação bacteriana sistêmica, preferencialmente por um mecanismo mediado por células NK; - aumenta o número de células NK totais e o número de células NK produtoras de IFN γ, preferencialmente sem aumentar a porcentagem de células NK IFN γ+, no local da infecção; - não aumenta a proporção de células imunes inatas produtoras de citocinas pró-inflamatórias no local da infecção (em particular DCs produtoras de IL-12 e/ou macrófagos produtores de TNFα e/ou NKs ou TLs produtoras de IFN γ); - não tem efeito antibacteriano direto, em particular no Staphyloccocus aureus suscetível à meticilina; - não induz um aumento na produção de interferon γ pelas células NK, por estimulação direta in vitro; - não induz um aumento da expressão do marcador KLRG1 em células NK, por estimulação direta in vitro; - não induz um aumento do nível de quimiocina CXCL-1 e/ou CXCL-2 no local da infecção.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[0067] O extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com peso molecular menor ou igual a 50 kDa é preferencialmente formulado em uma composição farmacêutica ou um medicamento.

[0068] Uma composição farmacêutica ou medicamento para a implementação da invenção inclui tipicamente o extrato de algas da ordem Ulvales compreendendo polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados com peso molecular menor ou igual a 50 kDa e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0069] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis usados para a preparação de um medicamento ou uma composição farmacêutica compreendendo um extrato de algas para uso do mesmo de acordo com a invenção são selecionados com base na forma farmacêutica e no modo de administração desejado, entre os excipientes usuais que são conhecidos pelos técnicos no assunto.

[0070] Para administração oral, sublingual, subcutânea, intramuscular, intravenosa, tópica, local, intraperitoneal, intratraqueal, intranasal, transdérmica ou retal, o extrato de algas como definido aqui acima pode ser administrado na forma de doses unitárias, em mistura com excipientes farmacêuticos convencionais.

[0071] As formas apropriadas para administração incluem formas por via oral, tais como comprimidos, cápsulas moles ou duras, pós, grânulos e soluções ou suspensões orais; formas para administração sublingual, bucal, intratraqueal, intraocular, intranasal e administração por inalação; formas para administração tópica, parenteral, tais como transdérmica, intraperitoneal, intratraqueal, subcutânea, intramuscular ou intravenosa; formas para administração retal e implantes.

[0072] Quando uma composição sólida na forma de comprimidos é preparada, o ingrediente ativo principal pode estar em mistura com um veículo farmacêutico, como gelatina, amido, lactose, estearato de magnésio, talco, goma arábica ou semelhantes.

[0073] Os comprimidos também podem ser revestidos com sacarose, um derivado de celulose ou outros materiais apropriados ou, na verdade, podem ser tratados de forma apropriada de modo a garantir que tenham uma atividade prolongada ou retardada e que liberem continuamente uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo.

[0074] Uma preparação na forma de cápsulas pode ser obtida, por exemplo, misturando o ingrediente ativo com um diluente e vertendo a mistura obtida em cápsulas moles ou duras.

[0075] Em uma forma de realização, o extrato de algas, o medicamento ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a presente invenção se destina a administração oral. Em uma outra forma de realização, o extrato de algas, o medicamento ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a presente invenção se destina a administração parenteral. Em uma outra forma de realização, o extrato de algas, o medicamento ou a composição farmacêutica para uso de acordo com a presente invenção se destina a administração intraperitoneal.

[0076] Os medicamentos ou composições farmacêuticas compreendendo um extrato de algas para uso de acordo com a invenção podem também ser apresentados na forma líquida, por exemplo, na forma de soluções, emulsões, suspensões ou xaropes; e em particular em uma forma adequada para administração oral ou intranasal, por exemplo. Os veículos líquidos apropriados podem ser, por exemplo, água, solventes orgânicos tais como glicerol ou glicóis, bem como suas misturas, em proporções variáveis, em água.

[0077] Uma preparação na forma de um xarope ou elixir ou para administração na forma de gotas também pode conter o ingrediente ativo juntamente com um adoçante, tendo nenhuma ou baixas calorias, por exemplo,

metilparabeno e propilparabeno como um antisséptico, bem como um agente aromatizante e um agente corante apropriado.

[0078] Os pós ou grânulos que são dispersíveis em água podem, por exemplo, conter o ingrediente ativo em mistura com agentes dispersantes ou agentes umectantes, ou agentes de suspensão, tais como polivinilpirrolidona, bem como com adoçantes ou corretores de sabor.

[0079] Em geral, no contexto da presente invenção, a dose diária do extrato de algas será a menor dose eficaz do extrato de algas que é capaz de produzir um efeito profilático e/ou terapêutico na imunossupressão pós- traumática.

[0080] O termo “dose eficaz” é entendido como referindo-se a qualquer quantidade de uma composição que torna possível obter o efeito desejado observado, neste caso um efeito imunoestimulador.

[0081] De acordo com um dos seus aspectos, um extrato de algas para uso de acordo com a invenção é usado em uma composição como mencionada acima para administração em uma dose em/ para humanos entre 0,1 e 300 mg/kg, por exemplo, entre 0,1 e 100 mg/kg, ainda mais particularmente entre 0,5 e 60 mg/kg, por exemplo entre 1 e 20 mg/kg, ou entre 5 e 30 mg/kg, ou a uma dose em animais entre 1 e 300 mg/kg, ou entre 1 e 200 mg/kg, mais particularmente entre 1 e 100 mg/kg, na verdade ainda mais particularmente entre 2 e 45 mg/kg, ou entre 10 e 60 mg/kg.

[0082] De acordo com um dos seus aspectos, um extrato de algas para uso de acordo com a invenção é usado em uma composição como mencionada acima para administração por via oral em uma dose em humanos entre 100 e 300 mg/kg, por exemplo, entre 50 e 100 mg/kg, ou em uma dose em animais entre 100 e 300 mg/kg, ou entre 100 e 200 mg/kg.

TRATAMENTO PROFILÁTICO OU TERAPÊUTICO DE COMPLICAÇÕES INDUZIDAS POR IMUNOSSUPRESSÃO PÓS-TRAUMÁTICA

[0083] No contexto da invenção, os termos “tratar” ou “tratamento” são entendidos como referindo-se a suprimir, aliviar ou prevenir a progressão de um distúrbio ou de um ou mais sintomas relacionados a este distúrbio. Um tratamento “profilático” ou “preventivo” refere-se à prevenção da ocorrência de tal distúrbio ou de um ou mais sintomas relacionados a esse distúrbio.

[0084] Um sujeito para o tratamento profilático ou terapêutico de acordo com a invenção é um animal, de preferência um mamífero, por exemplo, um roedor, um canino, um felino, um bovino, um equino ou um primata. Um sujeito é em particular um humano, seja homem, mulher ou criança.

[0085] O sujeito apresenta imunossupressão pós-traumática.

Geralmente, uma imunossupressão pós-traumática ocorre como consequência de um ou mais traumas graves no sujeito, como um traumatismo craniano, em particular um traumatismo craniano com ou sem politrauma (trauma múltiplo), uma grande cirurgia ou uma infecção grave.

[0086] De acordo com uma forma de realização, o sujeito em questão com trauma grave apresenta pelo menos duas lesões traumáticas (politrauma (trauma múltiplo)) das quais pelo menos uma lesão pode ameaçar a sobrevivência. O sujeito é geralmente hospitalizado, por exemplo, em uma unidade de terapia intensiva de um hospital. O sujeito pode mais particularmente ser colocado sob ventilação artificial, em particular com intubação.

[0087] De acordo com uma forma de realização, o sujeito com trauma grave tem uma “Pontuação de Gravidade de Lesão” (ou ISS) de pelo menos 16. Para traumas muito graves, o ISS é de pelo menos 25. O cálculo do ISS leva em consideração os danos causados a várias regiões do corpo do paciente (cabeça e pescoço; face; tórax; abdômen e pelve; cintura pélvica e membros; pele e tecido subcutâneo). O dano a cada região é classificado de 1 a

6, dependendo de sua gravidade (1: comprometimento menor, 6: comprometimento crítico). O ISS é então calculado ao elevar ao quadrado a pontuação das três regiões mais prejudicadas (por exemplo, se as pontuações de cada região forem respectivamente as seguintes: cabeça 4, abdômen 3, tórax 2, outras regiões 1, então o ISS será igual para 42 + 32 + 22 = 16 + 9 + 4 = 29 (Baker et al., 1974, J Trauma. 14: 187-196).

[0088] De acordo com uma forma de realização, o sujeito com trauma grave apresenta um trauma craniano grave definido por uma pontuação da Escala de Coma de Glasgow (GCS) inferior a 8. A determinação da GCS é um método que fornece os meios para avaliar a profundidade de um coma por estudar a variabilidade de 3 critérios clínicos muito precisos como segue: 1) abertura dos olhos (classificado de 1: ‘sem abertura dos olhos’ a 4: ‘olhos abrindo espontaneamente’); 2) capacidade de motilidade (habilidade de se mover), ou como pode ser preferido, a melhor resposta motora (avaliada de 1: ‘sem resposta motora’ a 6: ‘obedece comandos’); e 3) resposta às questões colocadas (respostas verbais, avaliadas de 1: ‘sem resposta verbal’ a 5: ‘resposta orientada’). A GCS é a soma dos resultados obtidos com os três critérios clínicos mencionados acima. Portanto, as pontuações variam de um mínimo de 3 a um máximo de 15 (Teasdale et al. 1974, Lancet 2: 81-84).

[0089] A imunossupressão pós-traumática é preferencialmente caracterizada por: a) uma queda no nível de produção ex vivo de citocinas pró- inflamatórias induzida por leucócitos sanguíneos após estimulação com LPS de bacilos Gram-negativos, por exemplo Escherichia coli, em comparação com o nível de produção observado para um indivíduo saudável; e/ou b) uma queda no nível de expressão de HLA-DR (Antígeno Leucocitário Humano – isotipo DR) nas células apresentadoras de antígeno do paciente, em comparação com o nível de expressão observado para um indivíduo saudável.

[0090] A diminuição observada no nível de produção de citocinas (expressa por exemplo em picogramas/ml) é relatada contra voluntários saudáveis cujo nível de produção de citocinas representa o valor 100%. As citocinas são tipicamente medidas em hemoculturas estimuladas por LPS (de Escherichia coli em geral). A expressão de HLA-DR é relatada contra voluntários saudáveis, seja em número de moléculas HLA-DR expressas na superfície das células (MFI para “intensidade média de fluorescência”), ou em termos percentuais, o valor 100% representando o nível de expressão de HLA-DR em voluntários saudáveis. Em particular, se considerada em termos percentuais, a queda em a) e/ou b) acima é de pelo menos aproximadamente 20%. É de preferência pelo menos aproximadamente 25%, mais preferencialmente pelo menos aproximadamente 30, 35, 40, 45% e mais preferencialmente pelo menos aproximadamente 50, 55, 60% ou ainda mais.

[0091] Mais preferencialmente, a imunossupressão pós-traumática observada no paciente com trauma grave é tal que o nível de expressão de HLA- DR nos monócitos do referido paciente dentro de 24 horas após um ou mais trauma(s) (de D0 a D1) é reduzido em comparação com o nível de expressão observado para um indivíduo saudável. Além disso, esta redução inicial pode permitir, na prática, prever o risco de complicações sépticas (ou infecções secundárias). Assim, um baixo nível de expressão de HLA-DR em monócitos no primeiro dia após um ou mais traumas graves (D1), por exemplo, uma redução de 50%, é preditivo de um alto risco do paciente contrair uma infecção secundária. A expressão de HLA-DR é relatada contra voluntários saudáveis, seja em número de moléculas HLA-DR expressas na superfície das células (MFI para “intensidade média de fluorescência”), ou em termos percentuais, o valor 100% representando o nível de expressão de HLA-DR em voluntários saudáveis.

Em particular, se levado em consideração em termos percentuais, a diminuição no nível de expressão de HLA-DR é de pelo menos aproximadamente 20%, de preferência pelo menos aproximadamente 25%, mais preferencialmente pelo menos aproximadamente 30, 35, 40, 45% e mais preferencialmente pelo menos aproximadamente 50, 55, 60% ou até mais.

[0092] De acordo com uma forma de realização, a prevenção e/ou tratamento da imunossupressão pós-traumática leva à prevenção e/ou tratamento de uma complicação séptica associada à imunossupressão pós- traumática.

[0093] As complicações sépticas (ou infecções secundárias) associadas à imunossupressão pós-traumática são mais particularmente infecções nosocomiais, em particular infecções bacterianas ou fúngicas ou virais.

Em particular, as infecções nosocomiais em questão são selecionadas a partir do grupo que consiste em pneumopatias, como pneumonia adquirida sob ventilação mecânica, isto é, pneumonia associada à ventilação (VAPs), infecções do trato urinário, infecções de cateteres venosos centrais, infecções bacterianas cerebromeníngeas, como empiema, meningite e abscesso cerebral.

Mais particularmente ainda, as pneumopatias são devidas a bactérias patogênicas selecionadas a partir de estafilococos, preferencialmente Staphylococcus aureus, mais preferencialmente Staphyloccocus aureus suscetível à meticilina, Haemophilus sp., preferencialmente H. influenza; pneumococos; enterobactérias, Pseudomonas sp., em particular P. aeruginosa.

As bactérias que causam as pneumopatias também podem pertencer a outros gêneros ou espécies bacterianas (por exemplo, bacilos Gram-negativos e cocos Gram-positivos). Além disso, eles podem ser resistentes aos antibióticos. No caso de infecções que não sejam pneumopatias, as bactérias ou leveduras responsáveis podem ser, por exemplo, bacilos Gram negativos (por exemplo, E. coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa) e cocos Gram positivos (por exemplo, S. aureus) para infecções do trato urinário; Bacilos Gram-negativos

(por exemplo, E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa), cocos Gram-positivos (por exemplo, S. aureus, estafilococos negativos para coagulase) e leveduras como Candida sp. para infecções de cateteres centrais; Bacilos Gram-negativos (por exemplo, E. coli, P. mirabilis, P. aeruginosa) e cocos Gram-positivos (por exemplo, S. aureus, estafilococos negativos para coagulase, Streptococcus pneumoniae) para infecções bacterianas cerebromeníngeas.

[0094] De acordo com uma forma de realização, o local da infecção (ou ponto de origem da infecção) é o pulmão.

[0095] O extrato de algas, ou a composição ou o medicamento que o contém, é preferencialmente administrado, uma ou mais vezes se necessário, dentro de um período de no máximo cerca de 1 mês, de preferência no máximo 28 dias, a partir da data de admissão dos pacientes ao hospital, em particular em uma unidade de terapia intensiva hospitalar. Em outras palavras, as complicações sépticas que se busca prevenir são passíveis de ocorrer (ou serem contraídas) em um período de no máximo cerca de 1 mês, de preferência no máximo 28 dias, a partir da data de admissão dos pacientes no hospital. Por exemplo, verificou-se que as complicações sépticas ocorreram em 40 a 50% dos pacientes com trauma grave entre D0 e D10, e em 10 a 20% dos pacientes adicionais entre D10 e D28, ou seja, 50 a 70% dos pacientes no total, havia contraído uma infecção secundária (Osborn et al., 2004 Crit. Care Med.; 32 (11): 2234-40).

[0096] Em particular, o extrato de algas, ou a composição ou o medicamento que o contém, é administrado uma ou mais vezes durante o período de intubação dos pacientes.

[0097] No presente pedido, o termo “e/ou” é uma conjunção gramatical que deve ser interpretada como englobando o fato de que um ou mais dos casos ou exemplos que ele conecta podem ocorrer. Por exemplo, a expressão “manose e/ou arabinose” na expressão “os referidos polissacarídeos incluem manose e/ou arabinose” indica que os polissacarídeos podem incluir manose ou arabinose ou manose e arabinose.

[0098] Ao longo do presente pedido de patente, o termo “compreendendo” deve ser interpretado como incluindo todos os recursos característicos especificamente mencionados, bem como características opcionais, adicionais e não especificadas. Conforme usado neste documento, o uso do termo “compreendendo” também descreve formas de realização nas quais nenhuma outra característica além das características especificamente mencionadas está presente (isto é, “consistindo em”).

[0099] A presente invenção será ilustrada em maior detalhe pelas figuras e exemplos abaixo sem, no entanto, limitar o seu escopo.

FIGURAS

[00100] Figura 1: Diagrama representando esquematicamente o protocolo experimental para as análises bacteriológicas.

[00101] Figura 2: O extrato de algas não tem efeito na perda de peso de camundongos submetidos a trauma e secundariamente infectados. Os camundongos nos grupos Sham (S) e Pneumonia sozinha (PN) receberam a incisão de 1 cm no crânio sem trauma craniano (TC). Os camundongos submetidos ao trauma e infectados, para os quais a pneumonia foi induzida 24 horas após submeter ao TC, foram divididos em grupo não tratado (TC + PN) e o grupo tratado com 6 injeções do composto (a cada 12 horas a partir de TC até eutanásia) (TC + PN + TX). A pneumonia foi induzida 24 horas após a realização de TC com os camundongos sendo sacrificados 48 horas após a pneumonia. Os resultados são derivados de 2 experimentos independentes (cada grupo n = 9).

Os resultados da % de perda de peso são fornecidos como médias ± desvio padrão. *p < 0,05 para grupos submetidos a trauma e PN (após PN) versus S, *p < 0,05 para grupos submetidos a trauma versus PN.

[00102] Figura 3: O extrato de algas limita a disseminação esplênica de bactérias em camundongos sujeitos a trauma após a indução de pneumonia por MSSA, mas não tem efeito na ausência de trauma: Os camundongos dos grupos Sham (S) e Pneumonia somente (PN) receberam o 1 cm de incisão no crânio sem TC. Os camundongos submetidos ao trauma e infectados foram divididos em grupo não tratado (TC + PN) e grupo tratado com o composto (200 μg a cada 12 horas, a partir do TC até a eutanásia) (TC + PN + TX). Os pulmões foram removidos 24 horas (A) e 48 horas (B) após a indução da pneumonia. Os baços foram removidos 24 horas (C) e 48 horas (D) após a indução da pneumonia. Os órgãos coletados foram cultivados em meio de ágar Chapman e incubados por 24 horas e depois disso as colônias foram contadas.

Os resultados derivados de 2 experimentos independentes (n = 8 ou 9 por grupo) e são fornecidos como Log10 CFU médio (unidade formadora de colônia) ± desvio padrão. ***p < 0,001. (E) e (F): Os ratos foram divididos em 3 grupos: Sham (S); pneumonia não tratada (PN); e pneumonia tratada com extrato de algas a cada 12 horas por 48 horas (sem trauma) (PN + TX). Os pulmões (E) e o baço (F) foram retirados 48 horas após a indução da pneumonia. Os resultados são de um experimento (n = 5 por grupo de interesse). Os resultados são fornecidos como média ± desvio padrão.

[00103] Figura 4: O extrato de algas não tem atividade anti-MSSA in vitro. A cinética da atividade bactericida foi desenvolvida/ determinada em meio líquido para as faixas de concentração de 50, 200 e 500 μg/ ml do composto. As cargas bacterianas foram então contadas em ágares TS e os resultados expressos em Log10 UFC/ml. Os resultados são de 2 experimentos independentes e consistentes.

[00104] Figura 5: A administração intraperitoneal do extrato de algas não induz um aumento na secreção de citocinas pró-inflamatórias em 2 horas em camundongos naïve. A injeção intraperitoneal do extrato de algas foi realizada em 3 concentrações (50, 200 e 500 μg) e foi comparada com a injeção de PBS tamponado com fosfato (Sham) e com 1 mg/kg de LPS. As secreções de IL-12 por DCs pulmonares (Figura 5A), TNFα por macrófagos alveolares (Figura 5B) e macrófagos intersticiais, bem como de IFN γ por NKs pulmonares (Figura 5C) e TLs foram avaliadas por citometria de fluxo após coloração intracelular. Nenhuma diferença foi encontrada no baço (dados não mostrados).

Os resultados são de um experimento (n = 2 por grupo) e são fornecidos como mediana ± intervalos interquartis.

[00105] Figura 6: A administração intratraqueal do extrato de algas não induz um aumento na secreção de citocinas pró-inflamatórias em 2 horas e em 12 horas em um camundongo naïve. A injeção intratraqueal do extrato de algas foi realizada na concentração de 50 μg, 12 horas (T overnight) e 2 horas (T (H-2)) antes da eutanásia. Foi comparado a camundongos saudáveis (Naïves) e à instilação de 50 μg de LPS duas horas antes da eutanásia (LPS (H-2)). As secreções de IL-12 por DCs pulmonares (Figura 7A), TNFα por macrófagos alveolares (Figura 7B) e macrófagos intersticiais, bem como de IFN γ por NKs pulmonares (Figura 7C) e TLs foram avaliadas por citometria de fluxo após coloração intracelular. Nenhuma diferença foi encontrada no baço (resultados não mostrados). Os resultados são de um experimento (n = 2 por grupo) e são fornecidos como mediana ± intervalos interquartis.

[00106] Figura 7: Diagrama que representa esquematicamente o protocolo experimental para análises de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).

[00107] Figura 8: A administração intra-peritoneal do extrato de algas em camundongos sujeitos a trauma sofrendo de pneumonia por MSSA não aumenta a proporção de células que produzem citocinas pró-inflamatórias no pulmão.

[00108] Os ratos foram divididos em 4 grupos: Sham (S); pneumonia apenas (PN); TC + pneumonia não tratada (TC + PN); e tratado com extrato de algas (TC + PN + TX). A pneumonia foi instilada 24 após ser submetido ao TC com os camundongos sendo sacrificados 12 horas após a pneumonia. Os camundongos do grupo tratado receberam 3 injeções intraperitoneais de 200 μg do extrato de algas (a cada 12 horas, a partir do TC até a eutanásia). As secreções de IL-12 por CDs (A), TNFα por macrófagos (B) e IFN γ por TLs e NKs (C) foram analisadas por citometria de fluxo após coloração intracelular. Os resultados são de 2 experimentos diferentes (n = 4 por grupo). Os resultados são fornecidos como a porcentagem média de células positivas ± intervalos interquartis. Nenhuma diferença foi encontrada no baço (resultados não mostrados).

[00109] Figura 9: A administração do extrato de algas em camundongos infectados, sujeitos a trauma, induz um aumento no número de células NK pulmonares produtoras de interferon γ. Os ratos foram divididos em 4 grupos: Sham (S); pneumonia apenas (PN); trauma craniano TC + pneumonia não tratada (TC + PN); e pneumonia tratada com extrato de algas (TC + PN + TX). A pneumonia foi instilada 24 horas após ser submetido ao TC com os camundongos sendo sacrificados 12 horas após a pneumonia. Os camundongos do grupo tratado receberam 3 injeções intraperitoneais de 200 μg do extrato de algas (a cada 12 horas, a partir do TC até a eutanásia). O número total de células NK (A), de células NK produtoras de interferon γ (B) e de TLs produtores de interferon γ (C) foram analisados por citometria de fluxo após coloração intracelular de citocinas. Os resultados são de 3 experimentos independentes (n = 9 por grupo). Os resultados são fornecidos como mediana ± intervalos interquartis. (*p < 0,05, **p < 0,01).

[00110] Figura 10: O extrato de algas não induz um aumento na secreção de IFN γ ou um aumento na expressão do fator de ativação KLRG 1 em células NK pulmonares in vitro: Os pulmões de 6 camundongos naïve e 6 camundongos submetidos a trauma foram mecanicamente triturados dois por vez 24 horas após o TC para obter 3 homogenatos pulmonares por grupo. Após serem magneticamente classificadas, as células NK foram cultivadas por 5 horas com: IL-2 (grupo controle: Ctrl); IL-2 + Alga a 500 μg/ ml (Alga); e IL-2 + acetato de miristato de forbol PMA (50 ng/ml) e lonomicina (1 μg/ml) (PMA + lono). A pureza do homogenato de células NK foi verificada por citometria de fluxo antes (A à esquerda) e depois (A à direita) da classificação magnética. A porcentagem de NKs produtoras de IFN γ (B), a expressão na membrana de KLRG 1 (C) e o número de NKs por poço após a estimulação (D) foram avaliados por citometria de fluxo. Os resultados são de um experimento (n = 3 por grupo) e fornecidos como mediana ± intervalos interquartis. **p < 0,01 em comparação com os grupos Ctrl e Alga. “Ns” em comparação com os outros 2 grupos.

[00111] Figura 11: Diagrama que representa esquematicamente o protocolo experimental para FACS e análises bacteriológicas.

[00112] Figura 12: A administração do extrato de algas em camundongos submetidos a trauma depletados de células NK não limita a disseminação bacteriana no baço 48 horas após a infecção. Os camundongos foram divididos em 3 grupos: submetidos a trauma e infectados (TBI + PN); submetidos a trauma, infectados e depletados de células NK (TBI + PN + del); submetidos a trauma, infectados, depletados de células NK e tratados com extrato de algas (TBI + PN + del + TX). A pneumonia foi instilada 24 horas após TC e a depleção de células NK foi provocada por injeção IV de Ab anti-NK1.1 2 horas e 48 horas após TC. Os camundongos do grupo tratado receberam 1 injeção intraperitoneal de 200 μg do extrato de algas a cada 12 horas, a partir do TC até a eutanásia. A eutanásia foi realizada 72 horas após o TC para análise FACS das cargas bacterianas esplênicas (Figura 12 A) e da qualidade da depleção de células NK pulmonares (Figuras 12B e C). Os resultados são de um experimento (n = 4 por grupo) e fornecidos como mediana ± intervalos interquartis. ****p < 0,0001.

[00113] Figura 13: Diagrama que representa esquematicamente o protocolo experimental para análise de quimiocinas no baço e nos pulmões usando a técnica Luminex.

[00114] Figura 14: A administração de polissacarídeo em camundongos com trauma sozinho e camundongos submetidos a trauma/ infectados induz um aumento na concentração esplênica das quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4 e CCL8. Os camundongos foram divididos em 5 grupos: Naïves (SHAM); trauma sozinho (TC); TC + tratamento com o composto (TC + TX); trauma + pneumonia (TC + PN); e trauma + pneumonia + tratamento com o composto (TC + PN + TX). A pneumonia foi induzida 24 horas após a realização de TC com os camundongos sendo sacrificados 12 horas após o início da pneumonia. Os camundongos dos grupos tratados receberam 3 injeções intraperitoneais de 200 μg do composto marinho (a cada 12 horas, a partir do TC até a eutanásia). Os baços foram retirados 12 horas após a indução da pneumonia, depois triturados e, posteriormente, o nível das quimiocinas CCL2 (A) e CCL3 (B) CCL4 (C) e CCL8 (D) foram medidos pela técnica de Luminex.

Os resultados são de um experimento (n = 5 ratos por grupo). Os resultados são fornecidos como mediana +/- intervalos interquartis ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE UM EXTRATO DE ALGAS PARA USO DE ACORDO COM A

INVENÇÃO

[00115] O extrato de algas é preparado conforme descrito no Exemplo 1 do pedido de patente internacional WO 2015/071497.

[00116] Uma tonelada de algas verdes frescas, cruas, do tipo Ulva, é lavada com água doce e a areia é retirada usando uma máquina de lavar algas.

[00117] Salvo indicação em contrário, as etapas do método são realizadas à temperatura ambiente.

[00118] As algas (1 tonelada de algas desidratadas com 8% de matéria seca) são então moídas em partículas finas por meio de um refinador industrial (marca/ modelo: Inotec “I 175CD-75D”). O termo “partículas finas” é entendido como se referindo a partículas com um tamanho que varia de 50 a 1000 nm, com duas populações, a primeira incluindo tamanhos de partícula entre 50 e 200 nm, a segunda incluindo tamanhos de partícula entre 600 e 1000 nm.

[00119] O material triturado é então prensado usando uma prensa de correia industrial da marca/ modelo Flottweg “B FRU 800 HK” a uma taxa de produção de aproximadamente 1 tonelada/ hora. Esta etapa permite a separação da fase sólida (bagaço) da fase líquida (suco). O rendimento do suco obtido é de 75%.

[00120] Os 750 kg de suco cru obtidos são então clarificados usando uma centrífuga de pilha de discos da marca/ modelo Flottweg “AC 2000”.

Isso produz 710 kg de suco transparente com 3,10% de massa seca (95 a 98% de rendimento de massa) e um creme (2 a 5% de massa).

[00121] Em seguida, o suco claro é ultrafiltrado através de uma membrana cerâmica de 15 KDa (Tami Industries). Assim, um permeado e um retentado são subsequentemente obtidos. O permeado é armazenado até a obtenção de 640 kg de suco de filtração (91% de rendimento em volume) com 2,2% de matéria seca.

[00122] O suco de filtração (permeado) é então seco por liofilização após concentração por evaporação.

[00123] O processo de concentração é realizado em evaporador de efeito único (EVA 1000, Pignat) com os seguintes parâmetros: recirculação forçada, vazão de alimentação de 10 L/h, pressão de vapor de 1 bar, pressão de vácuo de 0,3 bar e temperatura de evaporação 90 °C. Uma primeira concentração é realizada com uma vazão de água evaporada de 8 L/h e o valor Brix sobe de 5,5 (igual a uma concentração de matéria seca de 4,5%) para 14,7.

Esta solução é então concentrada uma segunda vez com uma taxa de fluxo de água evaporada de 5-6 L/h e o valor Brix aumenta para 34. A concentração de matéria seca da solução é determinada em 38,4%.

[00124] A liofilização é então realizada usando um aparelho da Bioblock Scientific (modelo: CHRIST - Alpha 1-4 LSC) a uma temperatura de congelamento de -80 °C, que é também a temperatura mínima durante esta etapa.

[00125] O pó obtido é então triturado em moinho planetário da marca Philips MiniMill. O produto foi introduzido em tigelas de trituração (10 g de produto em cada tigela de trituração com 4 bolas de zircônia). O conjunto foi operado para girar por 15 minutos na velocidade 10. Isso, portanto, rendeu 14 kg de pó de extrato de algas.

EXEMPLO 2: ESTUDO DO EFEITO DO EXTRATO DE ALGAS EM UM MODELO DE TRAUMA CRANIANO DE CAMUNDONGO (TRAUMATISMO CRANIANO) - MATERIAIS E MÉTODOS

[00126] Bem-estar animal: Todos os experimentos foram realizados de acordo com os princípios de bem-estar animal de laboratório.

Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética do Pays de la Loire e pelo MESR (Ministère de lʼEnseignement supérieur, de la Recherche et de lʼInnovation/ Ministério Francês do Ensino Superior, Pesquisa e Inovação) (no 2016121915529061). Os camundongos (machos suíços com 5 semanas, cepa RjOrl: SWISS e C57BL/ 6 machos com 6 semanas, cepa C57BL/ 6JRj pesando 24 a 28 g) foram obtidos no laboratório Janvier (Laval). Os camundongos foram mantidos em um ciclo de 12 horas dia/ noite com livre acesso a água e comida no biotério do Institut de Recherche en Santé 2 (1RS 2) [Instituto de Pesquisa em Saúde] em Nantes, França.

[00127] Extrato de algas compreendendo polissacarídeos sulfatados e não sulfatados: foi extraído e purificado da alga Ulva armoricana coletada na praia de Plestin les Grèves (Bretanha, França), de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1. A ausência de contaminação do várias frações com LPS foram avaliadas usando uma técnica disponível comercialmente (Kit E- toxate, Sigma). Nenhum LPS no extrato final foi detectado por meio deste ensaio.

As amostras utilizadas estavam na forma de solução aquosa na concentração de 1% de polissacarídeos sulfatados e não sulfatados (concentração em peso da matéria seca em relação ao volume final da solução).

[00128] Modelo de trauma craniano: O trauma craniano foi realizado com a técnica do “dispositivo de queda de peso” (Flierl et al., 2009, Nat. Protoc.; 4 (9): 1328-37). Uma injeção subcutânea de 0,1 mg/kg de buprenorfina foi administrada trinta minutos antes do procedimento e, posteriormente, os camundongos foram anestesiados por inalação contínua de isoflurano (taxa de fluxo de gás fresco 0,8L/min, fração inalada 3,5%). Uma incisão de 1 cm no topo do crânio serviu para localizar efetivamente as suturas coronal e sagital e para otimizar o procedimento. O trauma foi então liberado com a queda de um peso padronizado medindo 2,5 cm de altura, em seguida a incisão foi fechada com pontos de sutura 4,0. Não deve haver quebra do crânio. A recuperação ad integrum foi monitorada imediatamente e, em seguida, a cada 12 horas, e os camundongos receberam analgesia subcutânea com buprenorfina, se necessário. Em caso de despertar patológico, os camundongos foram sacrificados. Os desfechos foram avaliados de acordo com a Tabela I abaixo: 0 ponto 1 ponto 2 pontos 3 pontos Perda de peso < 5% 5 a 12% 13 a 20% > 20% Aparência física (pelos Ligeiramente Moderadamente Altamente espetados e Normal prejudicado debilitado debilitado curvados para trás) Altamente alterado Comportamento Ligeiramente Moderadamente Normal (isolamento (isolamento) alterado alterado permanente do resto do grupo) TABELA I: PONTOS FINAIS. OS CAMUNDONGOS FORAM SACRIFICADOS POR UMA PONTUAÇÃO MAIOR OU IGUAL A 6

[00129] Inóculo bacteriano: A cepa MSSA ATCC 29213 (hemolisina positiva, Panton Valentine leucocidina negativa) foi usada para todos os experimentos. A cepa foi incubada em caldo de coração-cérebro por 18 horas a 37 °C e depois disso foi lavada 2 vezes (1000 g por 10 minutos a 20 °C) e, finalmente, foi diluída em PBS estéril. Em seguida, o inóculo foi calibrado por nefelometria para obter 7 McFarland e finalmente concentrado 5 vezes para atingir uma concentração entre 1 e 3 x 109 UFC/ml.

[00130] Modelo de pneumonia: Uma injeção subcutânea de 0,1 mg/kg de buprenorfina foi administrada trinta minutos antes do procedimento e, posteriormente, os camundongos foram anestesiados por inalação contínua de isoflurano (taxa de fluxo de gás fresco 0,8 L/min, fração inalada 3,5%). A pneumonia foi então induzida pela inserção intratraqueal de uma cânula de gavagem calibre 24 e, em seguida, pela injeção de 75 µl de inóculo. Os camundongos foram divididos em 4 grupos: não submetidos a trauma, não infectados, camundongos Sham (S); camundongos infectados não submetidos a trauma (PN); camundongos submetidos a trauma e infectados não tratados (PN + TC); e camundongos submetidos a trauma e infectados tratados com 200 μg de composto marinho, administrado por via intraperitoneal a cada 12 horas (PN + CT + TX).

[00131] Administração do Extrato de Algas: O extrato de algas foi administrado por via intraperitoneal ou intratraqueal, nas doses de 50 μg, 200 μg e 500 μg em um volume total de 200 μl (suplementado com PBS).

[00132] Investigação de um efeito dose do extrato: O extrato de algas foi administrado por via intraperitoneal 2 horas e 12 horas antes da eutanásia em doses de 50, 200 e 500 µl em um volume total de 200 µl de PBS.

Para estimular as células do sistema imune da mucosa pulmonar in situ, o extrato de algas também foi administrado por via intratraqueal, na dose de 50 μg em 75 µl, de acordo com o mesmo procedimento da inoculação bacteriana na indução da pneumonia. Os baços e pulmões foram então removidos e, em seguida, as populações de células foram analisadas por citometria de fluxo após coloração intracelular das citocinas pró-inflamatórias (IL-12, TNFα, IFN γ).

[00133] Análise FACS de Populações de Células: As suspensões de células pulmonares e esplênicas foram obtidas por trituração mecânica manual e, em seguida, digestão com colagenase por 30 minutos (baços) ou 45 minutos (pulmões) e, posteriormente, passadas por uma tela (poros de 70 μm).

Após tratamento com solução de lise de hemácias, as suspensões celulares obtidas foram incubadas por 30 minutos a 4 °C, com os anticorpos acoplados aos fluorocromos específicos.

[00134] Para DCs: CD24-BV711 (M1/ 69, BD Horizon), CD11c- PeCy7 (NK18, Biolegend), MHC II-BV421 (M5/ 114.15.2, Biolegend); Para macrófagos: F4/ 80-Alexa647 (BM8, Biolegend), CD11b-BV605 (M1/ 70, BD Horizon), CD11c-PeCy7 (NK18, Biolegend). Para células NK e linfócitos T: NK1.1-BV421 (PK136, BD Horizon), CD3-PE (145-2C11, eBioscience) e KLRG 1-APC (2F1, eBioscience). As células foram analisadas no dispositivo BD LSR II® e, posteriormente, todos os dados foram interpretados usando o software Flowjo® (TreeStar Inc, Ashland, OR).

[00135] Coloração de citocinas intracelulares: Os camundongos foram sacrificados 12 horas após a instilação traqueal de MSSA produzindo pneumonia. Para a coloração intracelular de citocinas em DCs, macrófagos e linfócitos, as células foram incubadas por 5 horas em um meio compreendendo meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e Golgi Plug (BD Bioscience) a fim de bloquear a exocitose, lavadas duas vezes e, em seguida, rotuladas de acordo com os marcadores de membrana (veja acima). A fixação e permeabilização foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante (kit BD Cytofix/ Cytoperm, BD Bioscience). As células foram incubadas durante a noite a 4 °C em PermWash com os anticorpos anti IL12-PE (C15.6, BD Pharmingen), IFN γ- Alexa488 (XMG1.2, eBioscience) e TNFα-PE (MP6-XT22, BD Pharmingen); em seguida, as células foram lavadas duas vezes e analisadas por citometria de fluxo.

[00136] Avaliação do crescimento e propagação bacteriana: Os pulmões e baços foram pesados e depois triturados mecanicamente em condições estéreis. Os homogeneizados de órgãos foram submetidos a várias diluições (de 10-2 a 10-6 dependendo das condições) e foram incubadas a 37 ° °C.

em meio específico (Chapman) a fim de evitar o crescimento de outras bactérias.

Após um período de incubação de 24 horas, as colônias foram contadas e os resultados expressos em log10 UFC por grama de órgão.

[00137] Cinética bactericida: a cinética bactericida em meio líquido foi realizada utilizando um inóculo de MSSA ATCC 29213 a 0,5 padrão McFarland (dados nefelométricos) diluído 5 vezes em caldo Mueller Hinton (inóculo inicial = 6 x 106 UFC/ml). O controle foi comparado com várias faixas de concentração do composto sulfatado marinho (50 μg/ml, 200 μg/ml, 500 μg/ml).

50 μl foram então semeados em H0, H3, H6 e H24 em ágar TS e então incubados a 37 °C por 24 horas. As colônias foram contadas e os resultados expressos em log10 UFC/ml.

[00138] Determinação do nível de expressão de quimiocinas pulmonares e do baço pelo método Luminex. Após a remoção das amostras dos pulmões e baços, os últimos foram homogeneizados mecanicamente a 4 °C na presença de tampão de lise (1 x PBS, pH 7,4/ triton X-100 a 0,1%) contendo 1 mM de coquetel de inibidor de protease (Sigma, Isle D’Abeau Chesnes, França).

Os homogenatos foram então centrifugados a 12.000 g por 20 minutos a 4 °C, em seguida o sobrenadante foi removido e então armazenado a -80 °C até a análise. As concentrações das diferentes quimiocinas foram produzidas utilizando a plataforma CIMNA (Centre d’Immunomonitorage Nantes Atlantique/ Centro de Imunomonitoramento de Nantes Atlantique) utilizando o método Luminex® após marcação específica das diferentes quimiocinas: CCL19/ MIP-3 beta (BR19), CCL2/ MCP-1/ JE (BR18), CCL20/ MIP-3 alfa (BR48), CCL21/

6Ckine (BR72), CCL3/ MIP-1 alfa (BR46), CCL4/ MIP-1 beta (BR51), CCL8/ MCP -2 (BR38), CXCL1/ KC (BR13), CXCL10/ IP-10 (BR37), CXCL2/ MIP-2 (BR20).

[00139] Classificação Magnética de Células NK: As suspensões de células pulmonares foram obtidas de acordo com o protocolo utilizado para a análise FACS. As células foram contadas (aproximadamente 2 x 107 por pulmão) e depois centrifugadas a 300 g durante 10 minutos. As células foram suspensas em 40 μl de tampão FACS para 107 células e então marcadas com 10 μl de NK Cell Biotin-Antibody Cocktail (Miltenyi Biotec®, Alemanha) e incubadas por 5 minutos a 4 °C. Após uma nova centrifugação a 300 g por 10 minutos, as células foram incubadas por 10 minutos a 4 °C com 20 μl de Anti-Biotin MicroBeads (Miltenyi Biotec®, Alemanha) para 107 células. Por fim, a separação magnética foi realizada de acordo com as recomendações do fabricante (Miltenyi Biotec, Alemanha). Cada grupo (naïve e TC) era composto por 6 camundongos, então os pulmões foram triturados dois por vez para atingir um mínimo de 10.000 células NK por poço (para um total de aproximadamente 20 milhões de células por pulmão de camundongo). A pureza de células NK era maior que 90%.

[00140] Estimulação In Vitro de Células NK: As células NK isoladas após triagem magnética foram estimuladas in vitro por 5 horas no forno CO2 a 37 °C e em 3 condições diferentes: Controle (RPMI + FBS [soro fetal de bovino] + IL-2 a uma concentração de 3000 UI/ml), Algas (controle + Algas a 500 μg/ml) e PMA-lonomicina (controle + PMA a 50 ng/ml e lonomicina (1 μg/ml). As células também foram estimuladas 4 horas de 5 com Golgi Plug (BD Bioscience) de acordo com as recomendações do fabricante. A secreção de IFN γ, a expressão de membrana de KLRG 1 e o número de células NK foram então analisados por FACS.

[00141] Depleção de células NK In Vivo: As células NK foram depletadas in vivo por injeções IV (retro-orbital) de 10 µl de LEAF purificado anti- camundongo NK1.1 (clone PK136/ cat # 108712 – 1 mg/ml) (BioLegend) em 190 µl de PBS. As injeções foram administradas 2 h e 48 h após o trauma craniano.

A eficácia da depleção de células NK foi avaliada usando FACS por contagem do número de células NK pulmonares: NK1.1-BV421 (PK136, BD Horizon), CD3- PE (145-2C11, eBioscience).

[00142] Estatísticas: As análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPadPrism 6.0® (San Diego, CA, Estados Unidos). As variáveis contínuas não paramétricas foram expressas em medianas +/- intervalos interquartis e analisadas pelo teste de Kruskall-Wallis com uso post-hoc do teste de Dunn. As análises das populações em termos percentuais foram realizadas pelo teste de Fisher bilateral.

EXEMPLO 3: EFEITOS CLÍNICOS E BACTERIOLÓGICOS

[00143] Os camundongos foram divididos em 4 grupos: Sham (S); Pneumonia apenas (PN); Trauma Craniano + Pneumonia (TC + PN); e camundongos submetidos a trauma e infectados, tratados a cada 12 horas por injeção intraperitoneal (IP) de 200μg do composto (TC + PN + TX), iniciando 2 horas após o trauma e até a eutanásia. Os camundongos dos grupos S e PN receberam uma incisão de 1 cm do topo do crânio sem trauma. A pneumonia foi induzida 24 horas após o traumatismo craniano. A eutanásia ocorreu 24 a 48 horas após a indução da pneumonia de acordo com os critérios estudados (Figura 1).

[00144] O extrato de algas não tem efeito sobre a perda de peso em camundongos submetidos a trauma e secundariamente infectados

[00145] A pneumonia MSSA induz uma perda transitória de peso de cerca de 12% do peso corporal após 24 horas. O trauma craniano aumenta a perda de peso no estágio inicial da infecção, mas não afeta a recuperação de D + 3 em comparação com camundongos não submetidos a trauma. O tratamento não teve efeito na perda de peso nos camundongos submetidos ao trauma e infectados secundariamente (Figura 2).

[00146] O extrato de algas limita a propagação bacteriana em camundongos submetidos a trauma 48 horas após a indução de pneumonia por

MSSA

[00147] As cargas bacterianas pulmonares são semelhantes em todos os grupos infectados às 24 horas (PN, TC + PN, TC + PN + TX) (Figura 3A), bem como às 48 horas (Figura 3B) após a indução de pneumonia.

[00148] A partir da 24ª hora após a infecção pulmonar, todos os camundongos com pneumonia eram bacterêmicos MSSA (carga bacteriana esplênica > 2 log).

[00149] Os camundongos submetidos a trauma não apresentam maior disseminação bacteriana após a pneumonia em comparação com camundongos sujeitos a não trauma (PN vs TC + PN) (Figura 3C e 3D).

[00150] O tratamento não teve efeito na bacteriemia em 24 horas após a infecção (Figura 3C), mas na 48ª hora da infecção, Staphylococcus aureus foi detectado em 22% dos camundongos no grupo tratado (TC + PN + TX) versus 100% no grupo submetido a pneumonia pós-traumática não tratada (TC + NP). Os camundongos do grupo tratado com o extrato de algas apresentam, portanto, baixa carga bacteriana no baço 48 horas após a indução da pneumonia (Figura 3D). Este efeito parece estar relacionado com a frequência de administração, pois a injeção única do extrato de algas induz uma redução da bacteremia inferior à observada no caso de injeções múltiplas (resultados não apresentados).

[00151] Embora não haja diferença na carga bacteriana entre o grupo de pneumonia isolada (PN) e o grupo submetido a trauma infectado (CT + PN) (Figuras 3C e 3D), o tratamento adjuvante (injetado antes da infecção) diminui a disseminação bacteriana durante as infecções pós-traumáticas (Figura 3D), mas não na ausência de trauma (Figura 3E). Este resultado sugere que o extrato de algas melhora a resposta pulmonar a uma infecção bacteriana no caso de imunossupressão pós-traumática, mas tem pouco ou nenhum efeito em animais saudáveis durante a pneumonia.

[00152] O extrato de algas não tem atividade anti-MSSA específica in vitro.

[00153] Durante a pneumonia pós-traumática, o tratamento reduz a duração da disseminação sistêmica da infecção bacteriana (Figura 3). Este efeito terapêutico pode estar ligado a um efeito antibacteriano direto do extrato de algas ou a um efeito na imunidade do hospedeiro. A fim de estudar as potenciais propriedades antibacterianas diretas, avaliamos o efeito do extrato de algas na cepa MSSA ATCC 29213. Para isso, foi realizada avaliação in vitro dos efeitos do extrato de algas no crescimento de MSSA aplicando o método da cinética bactericida em meio líquido. Os resultados mostram que o extrato de algas não tem efeito anti-MSSA direto, independentemente da concentração testada, inclusive em doses supraterapêuticas (50, 200 e 500 μg/ml) (Figura 4).

EXEMPLO 4: INVESTIGAÇÃO DE UM EFEITO IMUNOESTIMULADOR DO EXTRATO DE

ALGAS EM CAMUNDONGOS NAÏVE

[00154] Os efeitos clínicos do extrato de algas na propagação bacteriana (Figura 3D), sua falta de efeito anti-MSSA in vitro (Figura 4), bem como sua falta de ação clínica na ausência de trauma (Figuras 3E e F) levaram à investigação de um efeito imunoestimulador do polissacarídeo. Uma relação dose-efeito do extrato na secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12 por DCs, TNFα por macrófagos e IFN γ por NKs e TLs) nos pulmões e baço foi investigada pela primeira vez em camundongos naïve. A avaliação da produção de citocinas foi realizada por citometria de fluxo após coloração intracelular. Para tanto, o extrato foi injetado múltiplas vezes (2 horas e 12 horas antes da eutanásia) por via intraperitoneal. O extrato também foi administrado por via intra-traqueal na tentativa de induzir a estimulação direta das células do sistema imunológico da mucosa pulmonar.

[00155] A administração intra-peritoneal do extrato de algas 2 horas e 12 horas antes da eutanásia não induz um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12, TNFα, IFN γ) em camundongos naïve.

[00156] O extrato de algas não induz aumento na porcentagem de DCs pulmonares produtoras de IL-12 (Figura 5A), independente da dose utilizada. Não aumenta a proporção de macrófagos produtores de TNFα (Figura 5B) ou aumenta o número de células NK (Figura 5C) ou TLs IFN γ+ no tecido pulmonar. O número total de CDs, NKs e TLs pulmonares não foi alterado pela injeção do extrato de algas nos camundongos naïve.

[00157] Os efeitos da administração do extrato de algas também foram avaliados 12 horas após a injeção intraperitoneal do composto. As mesmas dosagens foram estudadas. Às 12 horas, não houve diferença observada para a produção de citocinas pulmonares pró-inflamatórias, bem como para o número de células (dados não mostrados).

[00158] A administração intra-traqueal do extrato de algas 2 horas e 12 horas antes da eutanásia não induz um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-12, TNFα, IFN γ) em camundongos naïve.

[00159] Uma vez que a via intraperitoneal teve pouco efeito em camundongos naïve sobre as células imunes estudadas, o efeito de um tratamento administrado diretamente pela via intratraqueal foi testado. A produção de citocinas foi avaliada 2 horas (T (H-2)) e 12 horas (T (durante a noite)) após a instilação intratraqueal do extrato de algas. Nenhuma diferença evidente na secreção foi demonstrada em comparação aos camundongos controle (Naïves) e à administração de LPS, na dose de 50 μg, 2 horas antes da eutanásia (LPS (H-2)) (Figura 6).

EXEMPLO 5: INVESTIGAÇÃO DO EFEITO IMUNOESTIMULADOR DO EXTRATO DE ALGAS EM UM MODELO DE IMUNOSSUPRESSÃO PÓS-TRAUMÁTICA

[00160] A falta de efeito imunoestimulador do extrato de algas em camundongos naïve levou à investigação contínua em um modelo de camundongos submetidos a trauma e secundariamente infectados, reproduzindo o cenário observado em um ambiente clínico. O efeito imunoestimulador do extrato de algas foi então avaliado em um modelo de imunossupressão pós-traumática. O trauma craniano foi provocado em camundongos machos C57/ BI6, em seguida, o extrato de algas foi administrado por via intraperitoneal na dose de 200 μg, a partir de duas horas após o trauma e depois a cada 12 horas até a eutanásia (3 injeções no total). A pneumonia foi induzida 24 horas após o trauma craniano e, posteriormente, os camundongos foram sacrificados 12 horas após a pneumonia. Os camundongos foram divididos em 4 grupos: Sham (S); pneumonia apenas (PN); trauma craniano + pneumonia não tratada (TC + NP); e trauma craniano + pneumonia tratada com extrato de algas (TC + PN + TX) (Figura 7).

[00161] A administração do extrato de algas não aumenta a porcentagem de células imunes pulmonares inatas produtoras de citocinas pró- inflamatórias.

[00162] Em um modelo de pneumonia pós-traumática, a administração intraperitoneal do extrato de algas não aumenta a proporção de: DCs produtoras de IL-12 (Figura 8A), macrófagos produtores de TNFα (Figura 8B) ou NKs ou TLs produtoras de IFN γ (Figura 8C).

[00163] A administração do extrato de algas aumenta o número de células NK produtoras de interferon γ.

[00164] O trauma craniano induz uma diminuição, nos pulmões, no número total de células NK (Figura 9A), bem como uma diminuição nas células NK produtoras de interferon γ (p < 0,01) (Figura 9B). A administração do extrato de algas induz um aumento no número de células NK totais e células NK produtoras de interferon γ no pulmão (Figuras 9A e 9B) (p < 0,05) sem aumentar a porcentagem de células IFN γ+ (Figura 8C). Este efeito não é encontrado tão claramente para os linfócitos T, mesmo se houver uma tendência emergente (p = 0,17) (Figura 9C).

EXEMPLO 6: INVESTIGAÇÃO IN VITRO DE UM EFEITO DIRETO DO EXTRATO DE ALGAS

NAS CÉLULAS NK DE CAMUNDONGOS NAÏVE E SUBMETIDOS A TRAUMA

[00165] O extrato de algas não tem efeito in vitro na secreção de interferon γ ou na expressão do fator de ativação KLRG1 pelas células NK pulmonares.

[00166] Dado o aumento no número de células NK produtoras de interferon γ nos camundongos tratados com o extrato, e a ausência de um aumento no nível das quimiocinas CXCL-1 e CXCL-2, foi investigado se o efeito encontrado in vivo foi devido a uma ação direta do tratamento nas células NK.

Para isso, as células NK pulmonares de camundongos naïve e submetidos a trauma foram magneticamente classificadas e estimuladas in vitro por 5 horas em 3 condições: Controle (Ctrl), extrato de algas e PMA + lonomicina (PMA + lono).

[00167] Ao contrário da estimulação com PMA-lono, a estimulação in vitro com o extrato de algas não induz um aumento na produção de interferon γ (Figura 10B) ou do marcador de ativação KLRG 1 pelas células NK (Figura 10C). O número de células NK não foi diferente nos diferentes grupos após 5 horas de estimulação. (Figura 10D).

EXEMPLO 7: INVESTIGAÇÃO DO EFEITO BACTERIOLÓGICO NO CASO DE DEPLEÇÃO

DE CÉLULAS NK IN VIVO

[00168] Os camundongos foram divididos em 3 grupos: camundongos submetidos a trauma e infectados (TC + PN); camundongos submetidos a trauma, infectados e depletados de células NK (TC + PN + del); e camundongos infectados submetidos a trauma, depletados de células NK e tratados com extrato de algas (TC + PN + del + TX). A pneumonia foi induzida 24 horas após o traumatismo craniano. A eutanásia ocorreu 48 horas após a indução da pneumonia. A depleção das células NK ocorreu cerca de 2 horas e 48 horas após o trauma craniano. As cargas bacterianas do baço, bem como a eficácia da depleção de células NK pulmonares (FACS), foram analisadas 48 horas após a indução de pneumonia (Figura 11).

[00169] O extrato de algas não limita a propagação de bactérias esplênicas em camundongos depletados de células NK submetidos a trauma.

[00170] A fim de avaliar se os efeitos do extrato de algas na dispersão da bactéria esplênica foram devido ao aumento no número de células NK pulmonares, foi avaliado se esse efeito na bacteremia foi encontrado no caso de depleção de células NK in vivo.

[00171] Na ausência de células NK pulmonares (depleção superior a 95%), não há efeitos observados do extrato de algas na disseminação da bactéria esplênica em 48 horas após a infecção (TBI + PN + del vs TBI + PN + del + TX) (Figura 12).

EXEMPLO 8: ESTUDO DO EFEITO DO EXTRATO DE ALGAS NA SECREÇÃO DE

QUIMIOCINAS ESPLÊNICAS E PULMONARES

[00172] A administração do polissacarídeo sulfatado induz um aumento no número de células NK pulmonares em camundongos submetidos a traumas e infectados. A fim de determinar se esse aumento no número foi devido a um recrutamento de células NK para o pulmão pela indução de uma secreção de quimiocinas, as secreções esplênicas e pulmonares das quimiocinas CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), CCL19 (MIP-3b), CXCL2 (MIP-2), CXCL10 (IP-10), CCL8 (MCP-2), CCL3 (MIP-1a), CCL20 (MIP-3a), CCL4 (MIP-1b) e CCL21 (6Ckine) foram avaliados no Luminex. Essas quimiocinas estão envolvidas na quimioatração das células NK após a inflamação aguda.

[00173] Os camundongos foram divididos em 7 grupos: camundongos naïve (SHAM); camundongos submetidos a trauma apenas (TC); camundongos submetidos a trauma e tratados com o composto (TC + TX);

camundongos infectados apenas (PN) (apenas para estudos de quimiocinas pulmonares); camundongos infectados e tratados com extrato de algas (PN + TX) (apenas para o estudo de quimiocinas pulmonares); camundongos submetidos a traumas e infectados (TC + PN); e camundongos submetidos a traumas, infectados e tratados com extrato de algas (TC + PN + TX). A pneumonia foi induzida 24 horas após o trauma craniano. A eutanásia ocorreu 12 horas após a indução da pneumonia. Os níveis esplênicos e pulmonares das quimiocinas acima mencionadas foram analisados pela técnica Luminex (Figura 13).

[00174] O extrato de algas resulta em um aumento nos níveis de baço das quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4 e CCL8 (Figura 14). O extrato de algas não tem efeito sobre a secreção esplênica das quimiocinas CXCL1, CCL19, CXCL2, CXCL10, CCL20, CCL4, CCL21 (dados não mostrados). A injeção intraperitoneal do extrato de algas também não resulta em um aumento nos níveis de quimiocinas analisadas nos pulmões (dados não mostrados).

CONCLUSÕES

[00175] Um efeito clínico do extrato de algas foi investigado inicialmente em um modelo de infecção pulmonar bacteriana pós-traumática.

Nenhum efeito evidente foi demonstrado na carga bacteriana pulmonar, mas este tratamento limitou a disseminação bacteriana sistêmica em 48 horas após a infecção (carga bacteriana esplênica) em camundongos submetidos a trauma.

Este efeito é devido a uma restauração das funções imunológicas paralisadas pelo trauma e não devido a uma atividade antibacteriana direta, visto que o extrato de algas não tem atividade anti-MSSA in vitro e nenhum efeito na disseminação bacteriana nos camundongos não submetidos a traumas infectados.

[00176] A redução na disseminação bacteriana observada no modelo murino de pneumonia pós-traumática após o tratamento com extrato de algas, bem como os dados preliminares estabelecidos in vitro levaram à investigação in vivo em camundongos naïve de uma relação dose-efeito do extrato no sistema imune inato células do sistema (DCs, macrófagos e células linfóides NKs e TLs). As doses de 50, 200 e 500 μg/ camundongo foram selecionadas em conjunto com os dados preliminares de toxicidade estabelecidos in vivo (testes realizados pelo Laboratoire Effimune, Nantes, França). Os tempos de injeção (2 horas e 12 horas antes do sacrifício) foram selecionados de forma a demonstrar efetivamente um aumento na secreção de IL-12, TNFa e IFN γ, porém nenhum efeito foi encontrado no pulmão ou no baço.

O extrato de algas também não induziu um aumento na expressão da membrana de MHC II pelas células dendríticas (dados não mostrados). Na ausência de imunossupressão, a administração do extrato de algas não induz a estimulação das células imunes inatas. Isso corrobora os resultados bacteriológicos em que a administração do extrato de algas, na ausência de trauma (e, portanto, imunossupressão), não limita a disseminação bacteriana, ao contrário do que se observa camundongos submetidos a trauma e infectados.

[00177] Uma estimulação da secreção de citocinas pró- inflamatórias foi, portanto, investigada em um modelo de camundongos submetidos a trauma no qual a pneumonia por MSSA foi induzida 24 horas após o trauma. A injeção intraperitoneal de extrato de algas a cada 12 horas (a partir do TC até a eutanásia, ou seja, 3 no total) não aumentou a proporção de células imunes inatas produtoras de citocinas pró-inflamatórias. No entanto, o número de células NK pulmonares totais e o subgrupo produtor de IFN γ (células de interesse no contexto de uma infecção pulmonar aguda) foram aumentados no grupo de camundongos tratados com o extrato marinho. Esse aumento foi verificado apenas no local da infecção (nenhuma diferença encontrada no baço). O trauma craniano, portanto, induz uma redução significativa no número de células NK produtoras de IFN γ, redução parcialmente compensada pela administração do extrato de algas. Este efeito não foi significativo para linfócitos T.

[00178] Portanto, surgiu a questão de saber se um aumento no número de células NK pulmonares por si só é suficiente para explicar a limitação da propagação bacteriana em 48 horas após a infecção nos camundongos tratados. As células NK são essenciais para a resposta antibacteriana, principalmente na infecção pulmonar aguda. Além disso, nessa situação clínica, a ação das células NK não se limita à secreção de substâncias pró-inflamatórias, mas leva a uma coestimulação das demais células do sistema imune inato, em particular pela redução da apoptose de neutrófilos polinucleares e preservação suas capacidades funcionais. As células NK também desempenham um papel imunomodulador, destruindo DCs não ativadas e macrófagos superativados que podem causar danos aos tecidos. Nesse contexto, o efeito do extrato foi avaliado na disseminação bacteriana esplênica em um modelo de imunossupressão pós- traumática em camundongos depletados de células NK. Os efeitos do extrato na carga bacteriana do baço não foram observados no caso de depleção de células NK (mais de 95% de depleção das células NK pulmonares), confirmando o papel dessas células na ação do extrato marinho in vivo.

[00179] A secreção de quimiocinas em resposta à injeção do extrato de algas, em particular pelas células epiteliais pela via TLR4/ NF-κB, é uma das hipóteses que pode explicar o aumento do número de células NK nos locais de infecção. Assim, foram medidos os níveis pulmonares e do baço das principais quimiocinas envolvidas na quimiotaxia das células NK em caso de inflamação aguda: CXCL1 (KC), CCL2 (MCP-1), CCL19 (MIP-3b), CXCL2 (MIP- 2), CXCL10 (IP-10), CCL8 (MCP-2), CCL3 (MIP-1a), CCL20 (MIP-3a), CCL4 (MIP-1b), CCL21 (6Ckine) antes e após a injeção do extrato de algas. O estudo dessas quimiocinas pela técnica Luminex permitiu demonstrar empiricamente um aumento da secreção das quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4 e CCL8 no baço.

A injeção do extrato de algas não teve efeito na secreção de quimiocinas pulmonares no momento do estudo, nem nas outras quimiocinas do baço.

[00180] Múltiplas hipóteses são, portanto, possíveis: 1) o pico de secreção de quimiocinas pulmonares efetivamente não teria sido demonstrado, possivelmente devido à sua ocorrência mais precoce 2) outras vias de sinalização intermediárias estão envolvidas no aumento do número de células NK nos pulmões. As quimiocinas CCL2, CCL3, CCL4 e CCL8 são secretadas principalmente por células epiteliais e endoteliais e permitem o recrutamento de células imunes (neutrófilos, células NK, linfócitos) em particular após uma lesão pulmonar aguda.

[00181] Por fim, foi investigado se o extrato de algas tinha efeito direto sobre as células NK, das quais a membrana ou a expressão intracelular do receptor TLR 4 é debatida na literatura. Para tanto, as células NK pulmonares de camundongos naïve e submetidos a trauma foram isoladas por triagem magnética e estimuladas in vitro pelo extrato de algas na presença de IL-2.

Nenhum efeito foi detectado na secreção de IFN γ, expressão na membrana de KLRG1, bem como no número de células NK por poço. Os mecanismos de ação do extrato de algas, portanto, ainda precisam ser elucidados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. USO DE UM EXTRATO DE ALGAS DA ORDEM ULVALES, que compreende polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de uma complicação induzida por imunossupressão pós-traumática.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser para a prevenção e/ou tratamento de uma complicação séptica associada à imunossupressão pós-traumática.

3. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela referida complicação séptica ser uma infecção nosocomial, em particular uma infecção nosocomial selecionada a partir do grupo que consiste em pneumopatias, tais como pneumonia adquirida sob ventilação mecânica, isto é, pneumonia associada à ventilação (VAPs), infecções do trato urinário, infecções de cateteres venosos centrais, infecções bacterianas cerebromeníngeas, como empiema, meningite e abscesso cerebral.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela referida imunossupressão pós-traumática ocorrer como uma consequência de um ou mais traumas graves, em particular um traumatismo craniano grave.

5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo referido extrato de algas ser um extrato de algas verdes do tipo Ulva.

6. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos referidos polissacarídeos polianiônicos sulfatados e não sulfatados, cujo peso molecular é menor ou igual a 50 kDa, terem um peso molecular que é menor que 15 kDa, e de preferência maior que 500 Da.

7. USO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo extrato de algas ser isento de polissacarídeos polianiônicos sulfatados ou não sulfatados com um peso molecular superior a 15 kDa.

8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo extrato de algas compreender: - manose; e/ou - arabinose; e/ou - galactose; e/ou - glicose; e/ou - ramnose; e/ou - xilose; e/ou - ácido glucurônico.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo extrato de algas compreender: - de 10 a 50% de carbono; - de 1 a 10% de hidrogênio; - de 1 a 5% de nitrogênio; - de 20 a 50% de oxigênio; e - de 1 a 15% de enxofre; em porcentagem em massa da matéria seca total (peso seco) do extrato de algas.

10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo extrato de algas ser obtido por meio de um método de preparação em que: a) as algas são lavadas e a areia é retirada; b) as referidas algas são trituradas; c) a fase sólida do material triturado é separada de sua fase líquida; d) a referida fase líquida é clarificada; e) o suco obtido na etapa d) é ultrafiltrado através de uma membrana com tamanho de poro de 50 kDa ou menos; e f) o suco de filtração obtido na etapa e) é concentrado e, em seguida, seco.

Traumatismo craniano Figura 1

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 124/193 Alga PI Alga PI Alga PI Alga PI Alga PI Alga PI 1/13

Horas

Grupo 1 de eutanásia Grupo 2 de eutanásia

Infecção pulmonar

% de perda de peso

Figura 2

Cinética bactericida

Controle

Figura 4

Log CFU / g de pulmão Log CFU / g de baço Log CFU / g de pulmão

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 126/193 3/13

Log CFU / g de baço Log CFU / g de baço Log CFU / g de pulmão

Figura 3

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 127/193 % de NK INFγ+ % de CDs IL-12+ Figura 5 % de TNFα+ macrófagos alveolares 4/13

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 128/193 % de NK IFNγ+ % de IL-12+ DCs Figura 6 % de TNFα+ macrófagos alveolares 5/13

Traumatismo craniano Figura 7

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 129/193 Alga PI Alga PI Alga PI 6/13

Horas

Eutanásia

Infecção pulmonar

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 130/193 % de células IFNγ+ % IL-12+ DCs % de TNFα+ macrófagos alveolares

Figura 8 7/13

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 131/193 Número de linfócitos T IFNγ+ Número total de células NK Número de NK IFNγ+

Figura 9 8/13

% de NK IFNγ+

Figura 10 Nb de NK/ poço

% de NK KLRG1+

Traumatismo craniano Figura 11

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 133/193 Alga PI Alga PI Alga PI Alga PI Alga PI Alga PI 10/13

Horas

Eutanásia

Depleção de NK Depleção de NK

Infecção pulmonar

Número de NKs pulmonares

Figura 12 Células NK

Depleção de NK Células NK

Log CFU / g de baço

Traumatismo craniano Figura 13

Petição 870210035776, de 20/04/2021, pág. 135/193 Alga PI Alga PI Alga PI

Horas 12/13

Eutanásia

Infecção pulmonar

Figura 14