KR20050006533A - 해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법 및 그 효능에 관한 것이다. 특히 본 발명은 (a) 해조류 건조물을 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계, (b) 상기 분쇄물에 메탄올을 중량비율 1: 8 내지 10로 혼합한 다음 열수추출하여 상등액을 수득하는 단계 및 (c) 상기 상등액을 여과한 후 감압농축하고, 동결건조하는 단계를 포함하는 해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법과 그 효능에 대한 결과를 제공한다.

Description

해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법{METHOD OBTAINING EXTRACTS HAVING ANTI-CANCER EFFECT AND IMMUNE ENHANCING ACTIVITY FROM MARINE ALGAE}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항암 및 면역활성을 증가시킬 수 있는 용도로 사용가능한해조류 추출물에 관한 것이다.

[종래기술]

면역이란 생물이 항원(침입해 들어오는 이물질)의 공격에 저항하는 능력으로, 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질에 대한 생체 반응을 포괄하여 지칭한다.

면역은 크게, 태어날 때부터 지니고 있는 선천면역(innate immunity)과 후천적으로 생활 등에 적응되어 얻어지는 획득면역(acquired immunity)으로 구분된다. 선천면역은 자연면역이라고도 하며, 항원에 대해 비특이적으로 반응하며 특별한 기억작용은 없다. 선천적인 면역체계로는 항원의 침입을 차단하는 피부, 점액조직, 위산, 혈액에 존재하는 보체(complement) 등이 있다. 세포로는 식균작용을 담당하는 대식세포(macrophage)와 다형핵백혈구(polymorphonuclear leukocyte), 감염세포를 죽일 수 있는 세포 등이 있다. 획득면역은 후천면역이라고도 하며, 처음 침입한 항원에 대해 기억할 수 있고 다시 침입할 때 특이적으로 반응하여 효과적으로 항원을 제거할 수 있는 특징이 있어 선천면역을 보강하는 역할을 한다. 획득면역은 체액성 면역(humoral immunity)과 세포성 면역(cell-mediated immunity)으로 나누어 볼 수 있다.

체액면역은 B림프구가 항원을 인지한 후 분화되어 항체(antibody)를 분비, 이 항체는 주로 감염된 세균을 제거하는 기능을 보여준다. 항체는 체액에 존재하며 면역글로불린(immunoglobulin: Ig)이라는 당단백질로 이루어져 있다.

세포성 면역은 흉선(胸腺)에서 유래한 T 림프구가 항원을 인지하여림포카인(lymphokine)을 분비하거나 직접 감염된 세포를 죽이는 역할을 한다. 분비된 림포카인은 대식세포를 활성화시켜 식작용(phagocytosis)을 돕기도 한다. 이와 같은 세포성 면역은 주로 바이러스 또는 세포 내에서 자랄 수 있는 세균에 감염된 세포를 제거하는 기능을 수행한다. 획득면역은 병원체 또는 그 독소를 면역원으로 예방접종하여 얻을 수 있으며, 이와 같은 면역을 인공면역(artificial immunity)이라 한다.

이러한 면역기능이 저하되는 경우 다양한 질환이 유발될 수 있다. 대표적인 면역 질환으로는 류마티스 관절염, 아토피성 피부염, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 백혈구 감소증, 홍반성 낭창, 중증 근무력증, 위축성 위염, 자가면역성 용혈성빈혈 등이 있다. 이에 면역기능을 강화시킬 수 있는 물질 또는 화합물을 개발하고자 하는 노력들이 이루어지고 있으며 다양한 물질들이 개발된 상태이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 해조류로부터 항암활성과 면역증강활성을 가지는 추출물을 추출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 항암활성을 갖는 해조류 추출물을 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 면역증강활성을 갖는 해조류 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 해조류 추출물을 백혈암 세포에 처리하였을 때의 백혈암 세포의 생존율을 처리 농도에 따라 나타낸 그래프이고,

도 2는 해조류 추출물 처리 농도에 따른 정상세포의 증식정도를 나타낸 그래프이다.

도 3은 해조류 추출물 처리에 따른 대식세포의 활성화 정도를 질산 생성량으로 나타낸 그래프이고,

도 4는 해조류 추출물 처리 농도에 따른 비장세포의 증식정도를 나타낸 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 해조류 건조물을 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계, (b) 상기 분쇄물에 메탄올을 중량비율 1: 8 내지 10으로 혼합한 다음 열수추출하여 상등액을 수득하는 단계 및 (c) 상기 상등액을 여과한 후 감압농축하고, 동결건조하는 단계를 포함하는 해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 해조류 추출물을 제공한다.

또한 본 발명은 해조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 해조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 해조류로부터 항암활성을 가지거나, 면역반응을 강화시킬 수 있는 분획을 추출하고자 연구하던 중, 용매로 메탄올을 사용하여 해조류 추출물을 추출하는 경우 항암활성과 동시에 면역강화활성을 모두 갖는 추출물을 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 해조류는 바다에 사는 모든 종류의 조류(藻類)일 수 있으며, 녹조식물, 갈조식물, 홍식물 및 바다에 사는 남조식물 모두 해당된다. 본 발명의 바람직한 해조류는 갈파래, 파래, 미역, 김, 모자반, 톳 또는 다시마 이다.

본 발명의 해조류로부터 항암활성 및 면역활성을 가진 추출물 추출하는 방법은 용매로 메탄올을 사용함을 특징으로 하며, 보다 구체적으로는

(a) 해조류 건조물을 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계;

(b) 상기 분쇄물에 메탄올을 중량비율 1: 8 내지 10로 혼합한 다음 열수추출하여 상등액을 수득하는 단계; 및

(c) 상기 상등액을 여과한 후 감압농축하고, 동결건조하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계에서, 해조류는 통상의 방법으로 건조한 다음 분쇄하는 것으로 분쇄물의 크기는 한정되지 않으며, 다만 다음 단계인 (b) 단계에서 분쇄물의 크기가 작을 경우 해조류로부터 유효성분을 보다 효율적으로 추출할 수 있으므로, 바람직하게는 최대 18 메쉬의 크기로 분쇄물을 제조하는 것이 좋다.

상기 (b) 단계에서, 상기 메탄올은 메탄올 원액(100 % 메탄올) 또는 희석액으로, 바람직하기로는 95 내지 100 %의 메탄올이다.

상기 해조류 분쇄물에 메탄올은 1: 8 내지 10 중량비율로 혼합할 수 있으나, 상기 함량은 해조류의 종류 및 건조상태에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 그러나, 이후 단계를 보다 용이하게 실시하기 위하여 바람직하기로는 해조류 분쇄물에 메탄올을 1: 9 내지 10 중량비율로 혼합하는 것이다.

열수추출은 해조류 분쇄물이 침지된 메탄올을 60 내지 65 ℃에서 가열하는 것으로, 이때 시간은 2 내지 3 시간이 좋다.

상기 (c) 단계에서는 (b) 단계에서 수득한 상등액을 여과하고 이를 감압농축한 다음 동결건조로 분말화시키는 것이다. 여과과정은 통상의 여과지를 이용하여 실시할 수 있으며, 이때 여과지의 구멍크기는 10 내지 25 um인 것이 좋다. 감압농축은 통상적인 감압농축기로 실시할 수 있으며, 바람직하기로는 300 내지 400 mmHg로 감압농축하는 것이 좋다. 이때 온도는 통상의 실온도일 수 있으나, 바람직하기로는 60 내지 65 ℃가 좋다. 감압농축한 농축물은 다시 동결건조하여 용매를 증발시켜 고체화된 해조류 추출물을 수득하게 된다.

본 발명의 해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법으로 추출한 해조류 추출물은 일실시예에서 기재한 바와 같이, 백혈암세포의 생존율을 감소시키는 항암효과를 가지며, 이와 동시에 면역세포인 대식세포 및 비장세포를 현저히 활성화시킨다.

이에 본 발명은 상기의 해조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암조성물 또는 면역증강용 조성물을 제공한다.

상기 항암 조성물 또는 면역증강용 조성물은 해조류 추출물을 단독으로 포함하거나, 그 외 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 부형제는 해조류 추출물의 약리활성을 보다 효과적으로 전달하기 위한 물질이나, 조성물의 제형 또는 사용목적에 따라 사용할 수 있는 약리학적으로 허용가능한 물질이다. 대표적인 부형제로는 식염수, 증류수, 글리세린, 다당류가 있다. 항암 조성물 또는 면역증강용 조성물을 혼합물 형태로 제조하는 경우 총 조성물에 해조류 추출물을 0.5 내지 80 중량%로 포함하는 것이 바람직하며, 이의 함량이 0.5 중량% 미만인 경우 효과적인 약리효과를 기대하기 어려울 수 있으며, 80 중량% 초과하는 경우 비효율적일 수 있다.

본 발명의 항암 조성물 또는 면역 증강용 조성물은 경구 또는 비경구 형 제형으로 제조할 수 있으며, 이를 식품, 식품첨가제, 약제 또는 사료첨가제로 사용할수 있다. 조성물의 투여량은 사용목적, 제형, 병명, 투여중인 약물 또는 섭취자의 나이나 건강상태에 따라 적절히 조절하여 결정할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 해조류 추출물의 제조

건조되지 않은 해조류를 음지의 상온에서 완전 건조시켰다. 작은 조각으로 파쇄한 후 18메쉬를 통과시켜 건조 해조류를 제조하였다. 건조중량 200 g의 갈파래에 메탄올 2 L 가하고 60 내지 65 ℃에서 3시간 동안 가열하였다. 여과지를 이용하여 거른 여과액을 회전증발기(rotary evaporator)로 농축시키고 동결건조시켜 메탄올 성분을 완전히 제거하였다

실시예 2: 해조류 추출물의 항암효과 검증

해조류 추출물의 항암효과를 사람 백혈암세포인 U937를 이용하여 검증하였으며, 대조군으로 정상세포인 ICR 마우스 비장세포를 사용하였다.

2-1. 항암효과 검증

실험방법은 MTT 분석으로 실시하였다.

U937 사람 백혈암 세포주들을 RPMI 1640 (10 % 우태아 혈청 첨가, 1 % 항생제 포함) 배지에 현탁하여 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 배양하였다. 이때 대수기에서 성장하는 세포를 주로 실험에 사용하였다.

암세포에 대한 해조추출물의 영향정도는 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 방법에 의거하여 세포증식 분석법을 실시하였다. 대수기에서 성장하는 세포들을 수확하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척 후 웰당 10⁴-10⁵세포 수가 되도록 96 웰에 각각 접종한 후에 파래 추출물을 여러 농도로 처리하엿다. 4 일간 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 배양한 다음 배양 4 일째 되는 날 MTT 시약을 각각 웰에 가하고 4 시간 동안 배양하였다. 이후 원심분리하고 남아있는 포르마잔 결정체(formazan crystal)는 디메틸 설폭사이드를 가하여 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2-2. 정상세포 증식 및 독성 검증

ICR 마우스를 경구 탈구법에 의해 치사시킨 후 무균적으로 비장을 적출하여 100 메쉬망 위에서 분쇄하였다. 세포 부유액 수득하여 LSM 용액에 천천히 2 : 1 (v/v) 비율로 적가하고, 2000 rpm에서 20 분간 원심분리하였다. 단핵 세포 층만 조심스럽게 취하여 1500 rpm에서 5 분간 3 회 원심 세척한 다음 웰 당 1 x 10⁵세포로 각각 가하고, 시료를 일정농도로 가하여 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 하였다. 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 48 시간 배양하고, 배양 2 일째 되는 날, MTT 시약을 각 웰에 가하였다. 4간 배양한 다음 원심분리하고 남아있는 포르마잔 결정체를 디메틸 설폭사이드로 용해시키고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 1은 본 발명의 해조류 추출물을 백혈암 세포에 처리하였을 때의 백혈암 세포의 생존율을 처리 농도에 따라 나타낸 그래프이다. 도 1에서 백혈암 세포는해조류 추출물의 처리농도에 의존적인 양상으로 생존율이 감소되는 것으로 확인되어, 본 발명의 해조류 추출물이 암세포의 제거 효과를 가짐을 확인할 수 있었다. 반면에 본 발명의 해조류 추출물은 정상세포에 대해서는 어떠한 생리학적 변화를 유도하지 않았다

도 2는 정상세포에 해조류 추출물을 처리한 것으로, 정상세포는 해조류 추출물 100 ㎍/㎖이하에서 활발히 증식을 하는 것으로 나타나 정상세포에 대한 독성이 100 ㎍/㎖에서는 없는 것으로 파악되었다.

실시예 3: 해조류 추출물의 면역증강 활성 검증

실시예 1의 해조류 추출물을 마우스에 처리하여 대식세포 및 비장세포의 활성화 변화를 측정하였다.

3-1. 대식세포의 활성화

활성화된 대식세포만이 분비하는 것으로 알려진 NO(nitric oxide)의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위해 마우스 단핵구 기원의 Raw 264.7 세포주를 이용하여 NO 생성량의 변화를 측정하였다.

Raw264.7 세포주는 10 % FBS와 1 % 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 RPMI 1640 배지를 이용하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양하였다. 세포 배양용 배양판에 배양한 RAW264.7 세포를 1 % 트립신으로 처리하여 떼어낸 후, 무혈청 RPMI 1640으로 300 xg에서 5 분간, 3 회 원심 분리하여 세척하였다. 이후 세포는 2 x 10⁵cells/㎖l로 24 웰 플레이트에 분주하고, 여기에 농도별 시료를 가한 후 37 ℃,5 % CO₂배양기에서 48 시간 배양하였다. 400 xg에서 30 분간 원심분리하여 상등액 100 ㎕를 취하여 ELISA 타이터플레이트에 옮긴 후 100 ㎕ 그리즈 시약(Griess reagent)를 넣고 10 분간 실온에서 방치한 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소듐 나이트리트의 검량선으로부터 NO의 대사체인 아질산염의 농도를 계산하였다.

도 3은 해조류 추출물 처리에 따른 대식세포의 활성화 정도를 질산 생성량으로 나타낸 그래프로, 해조류 추출물의 처리 농도에 의존적으로 대식세포에서의 질산 생성량이 증가하였다. 면역작용에 있어 사이토카인과 더불어 면역 매개체(mediator)로서 중요한 역할을 수행하며 항바이러스, 항세균, 항기생체 작용을 보이는 NO가 대량 생성된 것은 해조류 추출물의 생리활성능이 우수한 것을 나타낸 것이다. 이는 해조류 추출물이 대식세포를 현저히 활성화시킴을 나타내는 것이다.

3-2. 비장세포의 활성화

ICR 마우스를 경구 탈구법에 의해 치사시킨 후 무균적으로 비장을 적출하여 100 메쉬망 위에서 분쇄하였다. 수득한 세포 부유액을 LSM 용액에 천천히 2 : 1 (v/v) 비율로 적가하고, 2000 rpm에서 20 분간 원심분리하였다. 단핵 세포 층만 조심스럽게 취하여 1500 rpm에서 5 분간 3 회 원심 세척한 다음 24 웰에 웰 당 1 x 10⁵세포를 가하고, 시료를 농도별로 가하여 최종 부피 2 ㎖로 적정하였다. 이후 37 ℃, 5 % CO₂배양기에서 48 시간 배양하rhm 배양 2 일째 원심분리하고 남아있는 세포 침전물에 p-니트로페닐 포스페이트를 포함하는 50 mM 소듐카보네이트 완충액1 ㎖를 첨가하여 37 ℃에서 1시간동안 반응시켰다. 빙냉의 0.3 N NaOH 용액 500 ㎕를 가하여 반응을 종결시키고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도를 이용한 B 임파구의 알칼라인 포스파타제 활성은 하기 계산식에 따라 산출하였다.

(계산식)

알칼라인 포스파타제 활성(p-nitrophenol umol/10⁶lymphocytes/60 min) = 1.15 x OD at 405 nm

도 4는 해조류 추출물 처리 농도에 따른 비장세포의 증식정도를 나타낸 그래프로, 해조류 추출물의 농도에 의존적으로 비장세포의 증식이 증가되는 것을 확인할 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 해조류로부터 항암활성 및 면역증강효과를 모두 갖는 추출물을 분리하는 방법을 제공하므로써, 추출한 해조류 추출물을 항암 또는 면역증강을 위한 용도로 활용가능하다.

Claims (5)

1. (a) 해조류 건조물을 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계;

   (b) 상기 분쇄물에 메탄올을 중량비율 1: 8 내지 10로 혼합한 다음 열수추출하여 상등액을 수득하는 단계; 및

   (c) 상기 상등액을 여과한 후 감압농축하고, 동결건조하는 단계;

   를 포함하는 해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 해조류는 갈파래, 파래, 미역, 김, 모자반, 톳 및 다시마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 해조류로부터 항암 및 면역활성 추출물을 추출하는 방법.
3. 제 1항 또는 2항의 방법으로 제조된 해조류 추출물
4. 제 3항의 해조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물.
5. 제 3항의 해조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물.