CN102585032B - 一种从黑木耳中提取的水溶性多糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从黑木耳中提取的水溶性多糖及其制备方法。它主链为β-(1→3)-D-葡聚糖，51~70%的主链结构单元连接(1→6)键接的葡萄糖侧基，重均分子量为40万~300万，它在水中呈伸展的刚性单链。其制法是，将干燥的黑木耳剪碎，去除脂肪，然后浸泡在乙醇/水混合溶剂中，残渣用生理盐水在70-100℃下提取，离心；上清液脱色，除去游离的蛋白质；然后透析，浓缩，冷冻干燥得黑木耳粗多糖。将粗多糖重新溶于水中，用乙醇进行沉淀分离，离心，将沉淀溶于水中，透析，冷冻干燥得到水溶性中性多糖。所得水溶性多糖在稀溶液状态具有很高的粘度，易于凝胶，可用于制备食品高效增稠剂或保健品。
Description
技术领域
本发明涉及一种从黑木耳中提取的水溶性多糖及其制备方法，属于天然高分子领域，也属于食品技术领域。
背景技术
天然多糖因其安全、具有特殊的理化性能和生物活性，在商业上具有潜在用途，例如在食品行业和医药行业中作为辅剂和添加剂。尤其一些水溶性刚性链多糖粘度高，容易形成凝胶，且对人体具有免疫调节功能，如三螺旋多糖裂褶菌葡聚糖(Schizophyllan)和香菇多糖(lentinan)。黑木耳属真菌类担子菌纲木耳科木耳属植物，是我国的特产资源。目前国内外文献中对黑木耳多糖的研究仅限于水溶性杂多糖和酸性多糖，对本发明涉及的具有更高生物活性的水溶性β-(1→3)-D-葡聚糖还未有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从黑木耳中提取的水溶性多糖及其制备方法。该水溶性多糖具有高的粘度，且制备方法简单、成本低廉。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种从黑木耳中提取的水溶性多糖，主链为β-(1→3)-D-葡聚糖，51～70％的主链结构单元连接(1→6)键接的葡萄糖侧基，重均分子量为40万～300万。
上述水溶性多糖在水溶液中呈刚性单链构象。
上述水溶性多糖分子中，C∶H∶O三元素摩尔比为1∶2∶1。
上述水溶性多糖，为纯的β-(1→3)-D-葡聚糖，25℃的特性粘数为1448～2570mL/g；零剪切粘度为5～32Pa·s(浓度为4×10-3g/mL)。
本发明还提供了上述水溶性多糖的制备方法：
将干燥的黑木耳剪碎，依次用乙酸乙酯、丙酮通过索氏提取法去除脂肪，然后浸泡在体积比70/30的乙醇/水混合溶剂中过夜，分离出残渣，浸泡在70-100℃生理盐水中，搅拌2-4小时，然后在室温下继续搅拌20-22小时，离心，收集上清液；
上清液用H2O2脱色，Sevag法除去游离的蛋白质后，分别用自来水、蒸馏水透析，浓缩，冷冻干燥得粗多糖；
将粗多糖重新溶于水中，用乙醇进行沉降分离，离心，将沉淀溶于水中，透析，冷冻干燥得到水溶性多糖。
运用流变仪检测到黑木耳多糖在很低浓度的水溶液中就具有凝胶行为，且其零剪切粘度高达5～32Pa·s，甚至超过商业用增稠剂黄原胶(xanthan)。该黑木耳多糖在此低浓度中形成的弱凝胶在5～60℃的温度范围内仍稳定存在，为工业化使用提供了有利条件。
据文献报道，真菌多糖，特别是β-(1→3)-D-葡聚糖是优良的免疫调节剂，能提高机体的免疫、防御功能，并且对正常细胞无毒副作用。本发明利用生物技术，从黑木耳子实体中分离出具有高粘度和免疫机能的黑木耳水溶性多糖，同时弄清楚它的一级和二级结构及其粘度行为之间的关系。所用方法简单易行、成本较低廉。本发明利用高分子物理理论和方法研究黑木耳水溶性多糖在溶液中的链构象；所制得的黑木耳水溶性多糖在稀溶液状态具有很高的粘度和热稳定性，易于凝胶。对黑木耳水溶性中性多糖的溶液进行流变实验结果表明，本发明黑木耳水溶性多糖具有很高的零剪切粘度，甚至超过商业食品增稠剂的值，可用于制备食品高效增稠剂或保健品。
附图说明
图1为黑木耳多糖AF1-1的红外光谱图。
图2为黑木耳多糖AF1-1的13C核磁共振谱图。
图3为黑木耳多糖AF1-1的原子力电镜照片。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案作进一步说明：
实施例1
购买市售的湖北房县产黑木耳子实体，将干燥的黑木耳碎片依次用乙酸乙酯和丙酮回流4小时脱脂，然后将此干燥的碎片浸泡在体积比70/30的乙醇/水混合溶剂中过夜。分离出残渣，浸泡在0.9wt％NaCl水溶液中，在100℃下搅拌2-4小时，然后在室温下继续搅拌20-22小时，离心，收集上清液，此步骤重复三次；上清液用30wt％H2O2脱色至浅黄色，用Sevag法除去游离的蛋白质，该法是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，将氯仿和正丁醇混合液(其体积比为5∶1)与多糖溶液混合，剧烈振摇20分钟后，离心除去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质。反复进行6-10次直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰。然后，分别用自来水、蒸馏水经再生纤维素膜透析袋(Mw cut-off8000，Union Carbide，NJ，USA)透析5天和3天，浓缩，冷冻干燥得黑木耳粗多糖。此粗多糖中包含有水溶性杂多糖、酸性多糖和我们所需要的中性水溶性多糖。为将中性多糖提取出来，我们按照它们在乙醇/水混合溶剂中的溶解能力差别来分离。将粗多糖重新溶于水中配成稀溶液，在室温下向溶液中慢速滴加乙醇，直至溶液出现浑浊，继续滴加乙醇，出现丝状沉淀物，它为中性多糖β-(1→3)-D-葡聚糖。离心，将沉淀溶于水中，透析，最后冷冻干燥得到水溶性中性多糖纯品AF1-1。
通过元素分析、红外光谱(IR)、13C核磁共振谱图(NMR)、气相色谱-质谱(GC-MS)表明，该黑木耳多糖AF1-1的结构为β-(1→3)-D-葡聚糖主链，平均每三个葡萄糖环键接两个β-(1→6)葡萄糖侧基。应用高分子溶液理论，采用激光光散射-尺寸排除色谱(LLS-SEC)、毛细管粘度法技术研究结果及原子力显微镜照片(图3)显示表明，该黑木耳多糖AF1-1分子链在水中呈伸展刚性链构象。该黑木耳多糖AF1-1可溶解于水和二甲基亚砜(DMSO)，不溶解于甲醇、乙醇和丙酮。
图1示出黑木耳多糖AF1-1红外光谱(IR)890cm-1处的吸收峰为β-吡喃环糖苷键的特征峰，AF1-1在DMSO-d6中的13C核磁共振(NMR)结果示于图2。图中103.7ppm(C1)异头碳单峰表明它只含有单一的糖残基，且为β型。其余主要的信号峰分别归属如下：86.9ppm(C3)、77.4ppm(C3)、77.0ppm(C5)、74.4ppm(C2)、70.7ppm(C4)和61.7ppm(C6)，证明其为β-(1→3)-葡聚糖，在6位上有取代。其支化度是按照侧基糖基上的C2(74.4ppm)与主链糖基上的C2(73.3ppm)的峰面积之比计算得到为70％。
该黑木耳多糖AF1-1的元素分析结果见附表1。将AF1-1完全甲基化后，再乙酰化，然后进行气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析(见表2)，可得到多糖的单糖组成及其键接方式。AF1-1的GC-MS结果表明分子链有三种键接方式，其分子链中含有以C1键接的葡萄糖端基，以及1，3-键接和1，3，6-键接的葡萄糖残基(摩尔比＝1.88∶1∶1.88)，表明AF1-1分子链是主链由β-(1，3)-葡萄糖组成，并在6位上键接有大量的葡萄糖側基。其支化度是按照C1键接的葡萄糖端基含量与1，3-键接和1，3，6-键接的葡萄糖残基含量总和之比计算得到，为65％。
该黑木耳多糖AF1-1重均分子量(Mw)、流体力学半径(Rh)、均方根旋转半径(Rg)、构象参数(ρ)和特性粘数([η])等理化性质见附表3。
该多糖AF1-1的水溶液在很低的浓度时即发生凝胶化(浓度低于4×10-3g/mL)，远高于高聚物。且其零剪切粘度高达32Pa·s，甚至超过商业用增稠剂黄原胶(xanthan)。该黑木耳多糖AF1-1在这样低浓度中形成弱凝胶，它在5～60℃的温度范围内仍稳定存在，为工业化及其应用提供了有利条件。
附表1.黑木耳多糖AF1-1元素分析结果
附表2.黑木耳多糖AF1-1甲基化衍生物气相色谱-质谱联用结果
附表3.黑木耳多糖AF1-1在水溶液和DMSO中25℃
时的特性粘数[η]和分子量Mw和构象参数。
实施例2
购买市售的湖北房县产黑木耳子实体，将干燥的黑木耳碎片依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取各4小时，然后浸泡在70vol％乙醇水溶液中过夜。残渣用0.9％NaCl水溶液在70℃下提取2-4小时，然后再室温下提取直至20-22小时，离心，收集上清液，此步骤重复三次；上清液用30wt％H2O2脱色至浅黄色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行6-10次直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰。然后，分别用自来水、蒸馏水经再生纤维素膜透析袋(Mw cut-off8000，Union Carbide，NJ，USA)透析5天和3天，浓缩，冷冻干燥得黑木耳粗多糖。此粗多糖中包含有水溶性杂多糖、酸性多糖和我们所需要的中性水溶性多糖。为将中性多糖提取出来，我们按照它们在乙醇/水混合溶剂中的溶解能力差别来分离。将粗多糖重新溶于水中配成稀溶液，在室温下向溶液中慢速滴加乙醇，直至溶液出现浑浊，继续滴加乙醇，出现丝状沉淀物，它为中性多糖β-(1→3)-D-葡聚糖。离心，将沉淀溶于水中，透析，最后冷冻干燥得到水溶性中性多糖纯品AF1-2。
通过气相色谱-质谱(GC-MS)表明，该黑木耳多糖AF1-2的结构为β-(1→3)-D-葡聚糖主链，平均每三个葡萄糖环键接两个β-(1→6)葡萄糖侧基。应用高分子溶液理论，采用激光光散射-尺寸排除色谱(LLS-SEC)、毛细管粘度法技术研究结果表明，该黑木耳多糖分子链在水中呈伸展刚性链构象。该黑木耳多糖AF1-2可溶解于水和二甲基亚砜(DMSO)，不溶解于甲醇、乙醇和丙酮。
该黑木耳多糖AF1-2的元素分析结果见附表4。将AF1-2完全甲基化后，再乙酰化，然后进行气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析(见表5)，可得到多糖的单糖组成及其键接方式。AF1-2的GC-MS结果表明分子链有三种键接方式，其分子链中含有以C1键接的葡萄糖端基，以及1，3-键接和1，3，6-键接的葡萄糖残基(摩尔比＝1.08∶1∶1.13)，表明AF1-2分子链是主链由β-(1，3)-葡萄糖组成，并在6位上键接有大量的葡萄糖側基。其支化度是按照C1键接的葡萄糖端基含量与1，3-键接和1，3，6-键接的葡萄糖残基含量总和之比计算得到，为51％。
该黑木耳多糖AF1-2重均分子量(Mw)、流体力学半径(Rh)、均方根旋转半径(Rg)、构象参数(ρ)和特性粘数([η])等理化性质见附表6。
该黑木耳多糖AF1-2的水溶液在很低的浓度时即发生凝胶化(浓度低于4×10-3g/mL)，远高于高聚物。且其零剪切粘度高达5Pa·s，甚至超过商业用增稠剂黄原胶(xanthan)。该黑木耳多糖AF1-2在这样低浓度中形成弱凝胶，它在5～60℃的温度范围内仍稳定存在，为工业化及其应用提供了有利条件。
附表4.黑木耳多糖AF1-2元素分析结果
附表5.黑木耳多糖AF1-2甲基化衍生物气相色谱-质谱联用结果
附表6.黑木耳多糖AF1-2在水溶液和DMSO中25℃
时的特性粘数[η]和分子量Mw和构象参数。
Claims (1)
1.一种从黑木耳中提取的水溶性多糖的制备方法，所述的水溶性多糖，主链为β-(1→3)-D-葡聚糖，51~70% 的主链结构单元连接(1→6)键接的葡萄糖侧基，重均分子量为40万~300万；其特征在于：
将干燥的黑木耳剪碎，依次用乙酸乙酯、丙酮通过索氏提取法去除脂肪，然后浸泡在体积比70/30的乙醇/水混合溶剂中过夜，分离出残渣，浸泡在70-100℃生理盐水中，搅拌2-4小时，然后在室温下继续搅拌20-22小时，离心，收集上清液；
上清液用H2O2脱色，Sevag法除去游离的蛋白质后，分别用自来水、蒸馏水透析，浓缩，冷冻干燥得粗多糖；
将粗多糖重新溶于水中，用乙醇进行沉降分离，离心，将沉淀溶于水中，透析，冷冻干燥得到水溶性多糖。
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