CN104327017B - 一种褐藻黄素的提取和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种褐藻黄素的提取和纯化方法。本发明利用微波辅助提取技术，乙醇作溶剂，可实现褐藻原料中褐藻黄素的快速提取；采用液-液萃取结合柱色谱层析两步法分离工艺，可将褐藻黄素与叶绿素等杂质成分有效分离。本发明低毒安全，环境友好，使用乙醇作为提取溶剂，有效降低了有毒有机溶剂的使用量；采用微波提取方法，仅需5min即可完成提取，大大缩短了提取时间。本发明方法整个提取、纯化流程简单、快速、高效，且操作方便，易于实现规模化生产，为褐藻黄素这种极具价值的天然保健食品添加剂和生物药物资源的开发和利用奠定了基础。

Description

一种褐藻黄素的提取和纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术、生物分离工程、分析化学及生物药物开发等领域，更具体涉及一种褐藻黄素的提取和纯化方法。

背景技术

褐藻黄素是从裙带菜(Undariapinnatifid)等食用褐藻中发现的一类重要的捕光色素，广泛存在于褐藻类囊体膜中，同β-胡萝卜素一样，是重要的天然类胡萝卜素之一，具有多种生物活性，在禽类水产养殖中具有广泛的用途。近年的研究也表明褐藻黄素具有很强的抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞，如神经瘤细胞、直肠癌细胞、结肠癌细胞、肝癌细胞、白血病细胞、前列腺癌细胞等肿瘤细胞株具有强烈的增殖抑制和杀伤作用。此外，褐藻黄素还具有显著的清除自由基和提高机体免疫等作用。因此，褐藻黄素是一种很有潜力的抗癌药物资源和保健及功能食品原料。

尽管目前对褐藻黄素的生物活性和功效已有初步的认识，但对这种资源的开发和利用目前还尚未广泛开展，其根源在于缺乏有效、规模化的提取和纯化方法究。在传统的藻类色素提取中，通常采用有机溶剂研磨法，如丙酮、甲醇等，但这些方法在提取过程中会将各种捕光色素如叶绿素a、c等一同提出，增加提取产物的复杂度，为后续分析和分离设置了障碍。因此，寻求合适的提取溶剂和提取工艺，降低杂质色素含量是褐藻黄素产品开发中一个关键问题。二甲基亚砜(DMSO)也曾被尝试用于褐藻黄素的提取，但DMSO沸点较高，难以直接蒸馏回收，必需在硫酸铵的作用下，利用乙酸乙酯进行萃取，因而增加了分离工艺的复杂程度和溶剂用量，不利于环境保护，同时因DMSO有一定的毒性，对产品的安全性也有一定的影响。

在常规提取工艺中，多采用机械搅拌的方式从藻体中提取色素类物质，室温搅拌仅依赖搅拌产生的机械剪切力将材料破碎，费时且效率较低。近些年发展起来超临界流体萃取、微波提取等新的提取工艺和方法，提取速度快、效率高，可最大程度地保护目的成分的结构和活性，因此在天然产物分离中的应用也越来越广泛。但这些方法在褐藻黄素的提取中尚没有得到有效的研究和利用。

对实验室分析用少量褐藻黄素的纯化，可采用活性炭脱色，进一步利用制备型高效液相色谱的方法制得，但活性炭作为一种常规吸附剂，对物质的吸附缺乏选择性，在去除叶绿素等杂质的同时，大量的褐藻黄素也同时被吸附掉，目标成分损失较大。此外也可采用丙酮提取、硅胶柱色谱纯化，进而采用制备色谱分离的方法纯化褐藻黄素。在该分离工艺中，一般须经3-4次硅胶柱色谱分离，然后再通过高效液相色谱分离才能得到纯度较高的褐藻黄素，该工艺步骤繁琐，溶剂消耗高，且制备色谱分离工艺成本高，操作困难，处理能力有限，难以扩大生产规模。

迄今为止，有关褐藻黄素提取与纯化的专利有中国公开号为CN1706836(一种从海藻中分离岩藻黄素的方法)、CN101565411(一种从褐藻黄素中分离岩藻黄素的方法)、CN102911138A(一种褐藻中岩藻黄素的提取纯化方法)等。其中CN1706836涉及用二甲亚砜在黑暗中浸提新鲜海藻20-60min，浸提2次，并采用2次硅胶柱层析法分离褐藻黄素；CN101565411是将新鲜的褐藻打浆，加入有机试剂，再加入质量千分数为0.5-1的抗氧化剂，浸提22-26小时后抽滤，得到浸提液；CN102911138A则涉及到一种利用丙酮－甲醇混合溶剂超声波3次，每次4h提取，并采用硅藻土柱层析法制备褐藻黄素的方法。这些技术中，均存在有机溶剂用量大，耗时等缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种快速、高效的褐藻黄素的提取和纯化方法，即微波辅助提取，液-液萃取结合柱色谱两步法分离工艺。本发明方法整个提取、纯化流程简单、快速、高效，且操作方便，易于实现规模化生产，为褐藻黄素这种极具价值的天然保健食品添加剂和生物药物资源的开发和利用奠定了基础。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种褐藻黄素的提取方法，包括如下步骤：

(1)褐藻原料的预处理：将干燥的褐藻材料粉碎至1-2.5mm见方的颗粒。

(2)将粉碎的褐藻原料溶到乙醇中，避光浸泡25-35min。

(3)将步骤(2)中材料置于微波炉中，调节微波功率为550-650W，控制每次微波时间为3-6s，间歇8-12s，提取80-100s。

(4)将步骤(3)得到的提取液离心，取上清液，25-45℃减压浓缩至干得到褐藻黄素提取物。

步骤(1)中所述的褐藻材料可以是人工养殖天然的海洋褐藻，如裙带菜、海带、紫菜等大型植物体，也可以是海藻养殖产业加工过程中的下脚料，如海带根等，采集后在阴凉处自然风干，或经其它合适途径低温下干燥。

步骤(2)中所述的褐藻原料与乙醇的质量体积比优选为1-2g:15-25mL。

更优选的，所述的褐藻黄素的提取方法，包括如下步骤：

(1)将干燥的褐藻材料粉碎至1mm见方的颗粒。

(2)称取粉碎的褐藻材料，加入乙醇，褐藻材料与乙醇的质量体积比为1.0g:25mL，20-25℃避光浸泡30min。

(3)将步骤(2)中材料置于微波炉中，调节微波功率为600W，控制每次微波时间为5s，间歇10s，提取90s。

(4)将步骤(3)得到的提取液于4℃、4500-6500rpm离心8-10min，取上清液，35℃减压浓缩至干得到褐藻黄素提取物。

一种褐藻黄素的纯化方法，包括如下步骤：

(1)采用上述褐藻黄素的提取方法对褐藻原料进行提取，减压浓缩至干后，用乙醇溶解褐藻黄素提取物。

(2)取步骤(1)溶解的褐藻黄素提取液，用80-100％(V/V)甲醇水溶液稀释后，加入正己烷，萃取，收集正己烷相。

(3)重复萃取分离2-4次，将得到的正己烷相合并。

(4)向甲醇/水相中加双蒸水至甲醇浓度降至60-80％，再用正己烷萃取。

(5)将每次萃取所得正己烷相和甲醇/水相分别合并，减压浓缩后，正己烷相和甲醇/水相分别用丙酮和乙醇溶解。

(6)将步骤(5)中所得正己烷相和甲醇/水相提取物过硅胶柱分离。

(7)分别用含25-35％(V/V)丙酮的正己烷和氯仿对上述正己烷相和甲醇/水相提取物进行洗脱，得脂溶性和水溶性褐藻黄素成分。

(8)收集洗脱液，减压浓缩得到纯化的褐藻黄素。

步骤(1)中溶解褐藻黄素提取物的乙醇与褐藻原料的体积质量比优选为8-12mL:10-20g。

步骤(2)中所述的褐藻黄素提取液、80-100％甲醇水溶液和正己烷的体积比优选为4-6:20-30:25-35。

步骤(4)中正己烷的体积优选为与步骤(2)中甲醇水溶液体积相同。

步骤(5)中丙酮或乙醇的体积优选为步骤(2)的褐藻黄素提取液体积的1/2-1/6。

更优选的，所述的褐藻黄素的纯化方法，包括如下步骤：

(1)称取10-20g粉碎的褐藻原料，加入150-250mL乙醇，采用上述褐藻黄素的提取方法进行提取，减压浓缩至干后，用8-12mL乙醇溶解褐藻黄素提取物。

(2)取步骤(1)溶解的褐藻黄素提取液4-6mL，用20-30mL80-100％(V/V)甲醇水溶液稀释后，加入25-35mL正己烷，萃取，收集正己烷相。

(3)重复萃取分离2-4次，将得到的正己烷相合并。

(4)向甲醇/水相中加双蒸水至甲醇浓度降至60-80％，再用20-30mL正己烷萃取。

(5)将每次萃取所得正己烷相和甲醇/水相分别合并，减压浓缩后，正己烷相和甲醇/水相分别用1-3mL丙酮和乙醇溶解。

(6)取3-5g活化硅胶，采用三氯甲烷湿法装柱，将步骤(5)中所得正己烷相和甲醇/水相提取物过硅胶柱分离。

(7)分别用含25-35％(V/V)丙酮的正己烷和氯仿180-250mL对上述正己烷相和甲醇/水相提取物进行洗脱，得脂溶性和水溶性褐藻黄素成分。

(8)收集洗脱液减压浓缩得到纯化的褐藻黄素。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：低毒安全，环境友好。由于本发明采用了亲水性乙醇作为提取溶剂，有效降低了有毒有机溶剂的使用量，使得产品安全性方面有了更好的保障，也在一定程度上降低了环境风险，同时也减少了酯溶性杂质的溶出，为后续分离纯化工作带来便利。另一方面，本发明采用微波提取方法，即使采用干燥褐藻材料，经室温浸泡后，仅需5min，即可完成提取步骤，大大缩短了提取时间，降低能耗。

附图说明

图1是裙带菜褐藻黄素提取物正己烷相在硅胶柱上的洗脱曲线。

图2是裙带菜褐藻黄素提取物正己烷相经硅胶柱分离得到的中褐藻黄素吸收光谱。

图3是裙带菜褐藻黄素提取物甲醇/水相经硅胶柱分离后的吸收光谱。

图4是裙带菜褐藻黄素提取物正己烷相经硅胶柱分离后的HPLC分析图谱。

图5是甲醇/水相紫菜色素经硅胶柱分离后得到的褐藻黄素吸收光谱。

图6是正己烷相紫菜色素经硅胶柱分离后得到的褐藻黄素吸收光谱。

图7是紫菜褐藻黄素提取物甲醇/水相经硅胶柱分离后的HPLC分析图谱，A：15％褐藻黄素标准品；B：紫菜提取物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

一种快速、高效的褐藻黄素的提取和纯化方法，即微波辅助提取，液-液萃取结合柱色谱分离两步法纯化工艺。

其中，褐藻中褐藻黄素的提取方法，包括如下步骤：

(1)褐藻原料的预处理。将用于提取的褐藻材料经粉碎至1mm见方的颗粒。用于提取的材料可以是人工养殖天然的海洋褐藻，如裙带菜、海带、紫菜等大型植物体，也可以是海藻养殖产业加工过程中的下脚料，如海带根等，采集后在阴凉处自然风干，或经其它合适途径低温下干燥。

(2)称取1.0g粉碎的褐藻材料，加入25mL乙醇，。

(3)将步骤(2)中材料置于微波炉中，调节微波功率为600W，控制每次微波时间为5s，间歇10s，提取90s。

(4)将步骤(3)得到的提取物4℃、4500-6500rpm离心8-10min，取上清液，35℃减压浓缩至干得到褐藻黄素粗提取物。

褐藻中褐藻黄素的纯化方法，包括如下步骤：

(1)将褐藻黄素粗提取物用10mL乙醇溶解，得褐藻黄素粗提取物乙醇溶液。

(2)取褐藻黄素粗提取物溶液5mL，用25mL90％甲醇稀释后，加入30mL正己烷，萃取，收集正己烷相。

(3)重复步骤(2)中萃取分离步骤3次，将收集得到的正己烷相合并。

(4)向甲醇/水相中加双蒸水至甲醇浓度降至70％，再用25mL正己烷萃取。

(5)将每次萃取所得正己烷相和甲醇/水相分别合并，35℃减压浓缩后，分别用2mL丙酮和乙醇溶解。

(6)取4g活化硅胶，采用三氯甲烷湿法装柱，将上述步骤5)中所得正己烷相和甲醇/水相提取物分别过柱分离。

(7)分别用氯仿和含30％丙酮的正己烷200mL对上述正己烷相和甲醇/水相提取物进行洗脱。

(8)收集洗脱液减压浓缩，2-6mL乙醇溶解，得脂溶性和水溶性褐藻黄素成分-20℃以下保存。

实施例1不同溶剂和提取方式对裙带菜中褐藻黄素的提取效率比较

(1)准确称取粉碎的裙带菜干粉1.0g/份于50mL三角烧瓶中，分为三组，分别加入25mL甲醇、乙醇和丙酮:甲醇(体积比7:3)，室温下避光静止浸泡30min；每组设置三个重复。

(2)采用三种提取方式进行提取，提取方法及程序见下表1。

表1不同提取方式中采用的方法及条件

(3)提取结束后，5000rpm离心5min，取上清液。

(4)沉淀加入提取溶剂后再重复步骤(2)和(3)两次；分别合并各组三次提取的上清液，减压蒸馏，浓缩至干，再分别用5mL乙醇溶解；

(5)测定各组提取物450nm的的吸光度值，根据下列公式计算褐藻黄素的含量，结果见表2。

$C(\mathrm{mg}/\mathrm{ml})=A_{\mathrm{\λ}\max }/E_{\mathrm{cm}}^{1\%}\×1000/100$ 公式①

注：式中A_λmax为样品在最大吸收波长450nm处的吸光度值；为褐藻黄素的消光系数1600。根据测定结果，计算提取效率。公式为：

提取效率＝测定褐藻黄素含量(mg)/裙带菜中褐藻黄素含量(mg)×100；其中，裙带菜中褐藻黄素含量通过以下方法获得：

取自然风干裙带菜粉碎后，准确称取1g，首先采用酸热破壁法以增进褐藻黄素的溶出率。然后采用丙酮/甲醇(7:3)混合溶剂30mL，室温避光搅拌提取30min，5000rpm离心5min，取上清液，残渣采用该方法重复提取至无色为止，合并上清液，减压浓缩后，10mL乙醇溶解，于450nm处测定吸光度值，根据公式①计算提取物中褐藻黄素的含量，测得为0.208mg/g。

表2不同溶剂和提取方式对裙带菜中褐藻黄素的提取效率

由表2中可以看出，微波提取条件下，乙醇对褐藻黄素的提取效果最佳；搅拌提取条件下，丙酮/甲醇混合溶剂的提取效率最高，但与微波提取下乙醇的提取效率相当，而微波提取所用时间远远低于搅拌提取，且乙醇无毒性，是一种理想的提取溶剂，同时，乙醇极性比甲醇小，微波提取时，体系温度升高较为缓和；在微波辅助搅拌提取的条件下，因微波时间处理短，并不能增加褐藻黄素的提取效率。综和比较，利用乙醇在微波条件下提取，既可以短时间内完成提取过程，同时可以得到相对较高的产率，乙醇本身无毒的特性也增加了产品的安全性。

实施例2紫菜中褐藻黄素的提取

(1)称取1.0g市售干紫菜饼，粉碎后加入25mL乙醇，室温下避光浸泡30min。

(2)将上述材料置于微波炉中，调节微波功率为600W，控制每次微波时间为5s，间歇10s，提取90s。

(3)将(2)中提取物5000rpm离心5min，取上清液，35℃减压浓缩至干，用5mL乙醇溶解。

(4)用分光光度计在450nm处测定提取物的吸光度值，根据公式①计算褐藻黄素的含量为0.654mg。

实施例3裙带菜中褐藻黄素的提取及萃取分离

(1)准确称取干燥粉碎的裙带菜15g，加入200mL乙醇，室温避光浸泡30min后，采用实施例1中的微波提取方法提取后，5000rpm离心5min，取上清液，减压浓缩至干后，用10mL乙醇溶解。

(2)取上述提取液5mL，用25mL90％甲醇稀释后，加入30mL正己烷，萃取，重复3次。然后向甲醇/水相中加双蒸水至甲醇浓度为70％，再用25mL正己烷萃取，进一步分离色素。为考察萃取次数对色素的分离和杂质的去除情况，取每次的萃取液和萃余液进行可见光谱扫描。并将最终得到的正己相和甲醇/水相分别合并，减压浓缩至干后，分别用丙酮和乙醇溶解，-20℃保存备用。

实验结果：粗提取物经萃取分离时，不同种类色素可在两相中重新溶解、分配，且萃取体系分层迅速，经萃取分离后，肉眼可见两相在颜色上有明显差异：正己烷相由于溶解了大部分的弱极性色素如胡萝卜素、叶黄素等和少量叶绿素等而呈浅绿色，甲醇/水相中仍含有大部分叶绿素而呈现深绿色，经3次萃取后，正己烷相中的色素含量已非常低，因此一般三次萃取即可。

实施例4硅胶柱层析法分离裙带菜褐藻黄素

(1)称取15g粉碎的褐藻原料，加入200mL乙醇，采用具体实施方式1中的微波提取方法和步骤提取褐藻黄素。最终用10mL乙醇溶解提取物，得褐藻黄素提取液。

(2)按照实施例3中萃取的步骤将裙带菜褐藻黄素提取物分离为正己烷相和甲醇/水相，在35℃减压浓缩至干后，分别用2mL丙酮和乙醇溶解。

(3)取4g活化硅胶，采用三氯甲烷湿法装柱，将上述步骤中所得正己烷相和甲醇/水相提取物分别过柱分离。

(4)正己烷相提取物用含30％丙酮的正己烷进行洗脱，甲醇/水相提取物用氯仿进行洗脱，洗脱剂用量位200mL，每10mL收集一管，并分别测定收集液在450nm、649nm和665nm的吸光度值，分别计算褐藻黄素和叶绿素含量，绘制洗脱曲线(图1)，分析色素在硅胶层析柱上的分离行为。

(5)合并含有褐藻黄素的洗脱液并减压浓缩至干，5mL乙醇溶解，分别得脂溶性和水溶性提取物。

(6)对各相洗脱组分进行可见光谱扫瞄，利用褐藻黄素在450nm和475nm的特征吸收峰来初步鉴定各组分中褐藻黄素的分布情况，结果见表3及图2和3。

(7)利用高效液相色谱法对硅胶柱分离所得的组分进行定性分析，结果见图4。

在硅胶分离柱上，加洗脱液后，几种色素条带很快即可分开，橙黄色的褐藻黄素条带最先从层析柱流出。表3列出了正己烷萃取色素在硅胶柱上的分离和洗脱情况。从表中可以看出，在硅胶柱上，褐藻黄素很快可以被洗脱下来，70-80mL时达到最大流出浓度，持续至200mL左右，此时，从分离柱上明显可见橙黄色色素基本上全部流出，而绝大部分叶绿素则仍被硅胶吸附而停留在柱子中。从表中数据也可以看出，在洗脱至150mL之前，几乎没有叶绿素流出，而此时，褐藻黄素的最大流出浓度已经出现。这说明经萃取分离后，色素在硅胶柱上的进一步分离纯化非常容易实现，只需一次柱层析分离，即可除去绝大部分的叶绿素，达到非常好的分离效果，这与其他的方法相比是非常便利的。图1即为正己烷相中褐藻黄素(Fucox.)在硅胶层析柱上分离时采用含30％丙酮的正己烷洗脱时的洗脱曲线。裙带菜中褐藻黄素主要以酯类形式存在，分布于正己烷相中，如图2显示，在450nm和475nm左右出现褐藻黄素的特征吸收峰，而在665nm附近，几乎没有叶绿素峰的分布。图3反映了甲醇/水相裙带菜提取物经硅胶柱分离后的吸收光谱，褐藻黄素特征吸收峰较弱，而在412nm附近则出现了另一个较大的吸收峰，该物质成分有待于进一步的分析确认。该结果显示，在天然裙带菜(未加工)中褐藻黄素同时以脂溶性的褐藻黄素酯和水溶性的单体或褐藻黄素醇的形式存在，但以脂溶性形态为主。

对柱层析分离后正己烷相进行的高效液相色谱分析也显示，经萃取结合硅胶柱分离后，可得到纯度高达95％以上(面积法)的裙带菜褐藻黄素酯(图4)，说明该方法是一种快速有效的褐藻黄素纯化方法。

表3不同洗脱体积中褐藻黄素和叶绿素的含量

实施例5硅胶柱层析法分离紫菜褐藻黄素

称取15g市售干紫菜，采用实施例2和3的方法提取并分离紫菜中的褐藻黄素，并对紫菜提取物正己烷相和甲醇/水相萃取物经硅胶柱分离后的洗脱组分进行可见光谱扫瞄，利用褐藻黄素在450nm和475nm的特征吸收峰来初步鉴定各组分中褐藻黄素的分布情况(结果见图5、6)。进一步利用高效液相色谱法对硅胶柱分离所得的组分进行定性分析(结果见图7)。

实验结果：紫菜中褐藻黄素主要分布在甲醇/水相中，以色素单体或褐藻黄素醇的形态存在，而正己烷相中褐藻黄素虽有分布，但含量较少，且正己烷相中仍含有大量杂质(图5，6)。这主要原因可能是采用了加工处理过的紫菜作为原料，这些加工工艺和过程可能会导致褐藻黄素酯的水解，甚至是降解。可见光扫瞄分析的结果也显示，萃取-硅胶柱分离法可有效除去紫菜提取物甲醇/水相中的叶绿素等杂质，获得纯度较高的水溶性褐藻黄素类物质。

液相色谱分析结果(图7)也同样显示，该方法可实现褐藻黄素的快速、有效分离和纯化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种褐藻黄素的纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用包括如下步骤的褐藻黄素的提取方法对褐藻原料进行提取：

1)褐藻原料的预处理：将干燥的褐藻材料经粉碎至1-2.5mm见方的颗粒；

2)将粉碎的褐藻原料溶到乙醇中，避光浸泡25-35min；

3)将步骤2)中材料置于微波炉中，调节微波功率为550-650W，控制每次微波时间为3-6s，间歇8-12s，提取80-100s；

4)将步骤3)得到的提取液离心，取上清液，25-45℃减压浓缩至干得到褐藻黄素提取物；

用乙醇溶解褐藻黄素提取物；

(2)取步骤(1)溶解的褐藻黄素提取液，用80-100％甲醇水溶液稀释后，加入正己烷，萃取，收集正己烷相；

(3)重复萃取分离2-4次，将得到的正己烷相合并；

(4)向甲醇/水相中加双蒸水至甲醇浓度降至60-80％，再用正己烷萃取；

(5)将萃取所得正己烷相和甲醇/水相分别合并，减压浓缩后，正己烷相和甲醇/水相分别用丙酮和乙醇溶解；

(6)将步骤(5)中所得正己烷相和甲醇/水相提取物过硅胶柱分离；

(7)分别用含25-35％丙酮的正己烷和氯仿对上述正己烷相和甲醇/水相提取物进行洗脱，得脂溶性和水溶性褐藻黄素成分；

(8)收集洗脱液减压浓缩得到纯化的褐藻黄素。

2.根据权利要求1所述的褐藻黄素的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中所述的褐藻材料为人工养殖天然的海洋褐藻或海藻养殖产业加工过程中的下脚料，采集后进行干燥。

3.根据权利要求1所述的褐藻黄素的纯化方法，其特征在于：步骤(1)的步骤2)中所述的褐藻原料与乙醇的质量体积比为1-2g:15-25mL。

4.根据权利要求1所述的褐藻黄素的纯化方法，其特征在于：步骤(1)为：采用包括如下步骤的褐藻黄素的提取方法对褐藻原料进行提取：

1)将干燥的褐藻材料粉碎至1mm见方的颗粒；

2)称取粉碎的褐藻材料，加入乙醇，褐藻材料与乙醇的质量体积比为1.0g:25mL，20-25℃避光浸泡30min；

3)将步骤2)中材料置于微波炉中，调节微波功率为600W，控制每次微波时间为5s，间歇10s，提取90s；

4)将步骤3)得到的提取液于4℃、4500-6500rpm离心8-10min，取上清液，35℃减压浓缩至干得到褐藻黄素提取物；

用乙醇溶解褐藻黄素提取物。

5.根据权利要求1所述的褐藻黄素的纯化方法，其特征在于：步骤(1)中溶解褐藻黄素提取物的乙醇与褐藻原料的体积质量比为8-12mL:10-20g。

6.根据权利要求1所述的褐藻黄素的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的褐藻黄素提取液、80-100％甲醇水溶液和正己烷的体积比为4-6:20-30:25-35。

7.根据权利要求1所述的褐藻黄素的纯化方法，其特征在于：步骤(4)中正己烷的体积与步骤(2)中甲醇水溶液体积相同。

8.根据权利要求1所述的褐藻黄素的纯化方法，其特征在于：步骤(5)中丙酮或乙醇的体积为步骤(2)的褐藻黄素提取液体积的1/2-1/6。

9.根据权利要求1所述的褐藻黄素的纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)称取10-20g粉碎的褐藻原料，加入150-250mL乙醇，避光浸泡25-35min；将避光浸泡后的材料置于微波炉中，调节微波功率为550-650W，控制每次微波时间为3-6s，间歇8-12s，提取80-100s；将得到的提取液离心，取上清液，25-45℃减压浓缩至干得到褐藻黄素提取物；用8-12mL乙醇溶解褐藻黄素提取物；

(2)取步骤(1)溶解的褐藻黄素提取液4-6mL，用20-30mL80-100％甲醇水溶液稀释后，加入25-35mL正己烷，萃取，收集正己烷相；

(3)重复萃取分离2-4次，将得到的正己烷相合并；

(4)向甲醇/水相中加双蒸水至甲醇浓度降至60-80％，再用20-30mL正己烷萃取；

(5)将每次萃取所得正己烷相和甲醇/水相分别合并，减压浓缩后，正己烷相和甲醇/水相分别用1-3mL丙酮和乙醇溶解；

(6)取3-5g活化硅胶，采用三氯甲烷湿法装柱，将步骤(5)中所得正己烷相和甲醇/水相提取物过硅胶柱分离；

(7)分别用含25-35％丙酮的正己烷和氯仿180-250mL对上述正己烷相和甲醇/水相提取物进行洗脱，得脂溶性和水溶性褐藻黄素成分；

(8)收集洗脱液减压浓缩得到纯化的褐藻黄素。