CN112939899B - 微藻色素及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微藻色素制备领域,公开了一种微藻色素的提取方法,该方法包括:将微藻生物质进行粉碎获得微藻粉碎物;在装有填料的层析柱中对所述微藻粉碎物进行柱层析。本发明还公开了所述微藻色素的提取方法制备得到的微藻色素。本发明所述的提取方法克服了必须先经有机溶剂提取,再进行分离纯化的技术偏见,省略了其中有机溶剂提取的步骤,大大简化了提取工艺,减少了有机溶剂的使用量,降低了生产成本,有利于工业生产。本发明所述的方法可适用于多种微藻,而且通过更简单的步骤获得了纯度更高的微藻色素。
Description
技术领域
本发明涉及微藻色素制备领域,具体地涉及一种微藻色素的提取方法以及该提取方法制备得到的微藻色素。
背景技术
微藻可通过光合作用机制代谢合成很多高附加值代谢产物,可广泛应用在食品、饲料、化妆品和服装等领域,主要包括不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素、色素等。微藻色素种类很多,如β-胡萝卜素、藻蓝素、叶黄素等,随着微藻代谢合成的色素的生物活性和抗氧化性被证实,这些色素在食品、医药、化妆品和纺织领域都将具有更广阔的应用前景。
近年来,针对微藻色素,多采用粉碎或不粉碎、有机溶剂提取、分离纯化等步骤进行提取,以获得纯度较高的微藻色素。以岩藻黄素为例,专利申请CN20121030556.3中公开了一种褐藻中岩藻黄素的提取纯化方法,包括初提样品制备、甲醇溶解,以及柱层析分离和HPLC纯化步骤。专利申请CN201310034699.9公开了一种从海洋单细胞硅藻提取分离岩藻黄素的方法,该方法包括:海洋单细胞硅藻藻泥中加入脂溶性提取液震荡混匀后,于0-10度、黑暗和无氧化条件中提取2-10分钟,离心收集上清提取液,沉淀再次经提取液反复提取,合并上清液经液相色谱法分离,即得高纯度的岩藻黄素。专利申请CN201611087538.6公开了一种大孔树脂提纯岩藻黄素的方法,包括步骤:1)使用有机溶剂溶解岩藻黄素毛油;2)稀释液流经吸附柱;3)收集流出液,加入抗氧化剂后经浓缩脱溶得到提纯后的岩藻黄素油。专利申请CN200810226391.3公开了一种纯化岩藻黄素提取物的方法,包括:获得岩藻黄素粗提取物;使用分离介质对所述岩藻黄素提取物进行吸附分离和洗脱,并同时除去岩藻黄素粗提取物中所含有的重金属。专利申请CN201510533321.2公开了一种从海藻中提取高纯度岩藻黄素的技术,该技术包括海藻的预处理,岩藻黄素的溶剂提取和岩藻黄素的纯化等步骤。
目前的现有技术中,提取得到的微藻油脂或产物中岩藻黄素含量偏低,而且需要经过两步以上的复杂分离纯化步骤才能提高含量,改善品质,因此存在工艺路线复杂,提取过程中会使用大量的有机溶剂,成本提高,难以实现工业化生产等问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的工艺路线复杂、成本高、微藻色素纯度低等问题,提供了一种微藻色素的提取方法以及该方法制备的微藻色素,该方法工艺简单,获得的色素的纯度高,且能耗低、成本低、污染少。
为了实现上述目的,本发明一方面提供一种微藻色素的提取方法,该方法包括:将微藻生物质经粉碎后获得微藻粉碎物;在装有填料的层析柱中对所述微藻粉碎物进行柱层析。
优选地,所述粉碎为超微粉碎。
本发明第二方面提供了如上所述的方法制备得到的微藻色素。
本发明所述的提取方法克服了现有技术中必须先经有机溶剂提取,再进行分离纯化的技术偏见,省略了其中有机溶剂提取的步骤,大大简化了提取工艺,减少了有机溶剂的使用量,降低了生产成本,有利于工业生产。
本发明所述的方法可适用于多种微藻,可以从多种微藻中提取多种色素,而且本发明的方法还通过更简单的步骤获得了纯度更高的微藻色素。
在本发明优选的实施方案中,使用硅胶色谱柱,以正己烷和乙酸乙酯的混合溶液对超微粉碎得到的微藻粉碎物进行柱层析,还能够显著提高微藻色素的纯度和产率。
附图说明
图1是按照本发明实施例1的方法制备得到的岩藻黄素产品在445nm下的吸收谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是,此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明,并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中,术语“超微粉碎”是指使用超微粉碎机将微藻细胞破碎的操作过程。
在本发明中,术语“极性”在化学中是指一根共价键或一个共价分子中电荷分布的不均匀性。如果电荷分布得不均匀,则称该键或分子为极性;如果均匀,则称为非极性。可以使用介电常数的大小来反应有机溶剂的极性大小。术语“非极性有机溶剂”是由非极性分子组成的溶剂,其具有介电常数低的特点。除了非极性有机溶剂外,其他有机溶剂可归为“极性有机溶剂”类别中。
本发明一方面提供了一种微藻色素的提取方法,该方法包括:将微藻生物质进行粉碎获得微藻粉碎物;在装有填料的层析柱中对所述微藻粉碎物进行柱层析。
在本发明中,所述微藻生物质可以以任意状态存在,比如可以为浆液状、藻泥状、块状或粉状。在进行粉碎前,优选地,使所述微藻生物质的含水量低于10%。例如,在微藻生物质以浆液态存在时可以进行喷雾干燥或冷冻干燥处理,使其变为粉碎物形态,使其中的含水量降低至10%以下。
在本发明中,所述微藻粉碎物的粒径可以在较宽的范围内进行选择。为了提高微藻色素的提取率,可以控制所述微藻粉碎物的粒径低于50μm,优选地,控制所述微藻粉碎物的粒径低于20μm。
在本发明中,可以通过使用不同的粉碎方法得到不同粒径的微藻粉碎物,所述粉碎可以采用本领域常规使用的方法进行处理,比如可以采用高速剪切、高压均质或超微粉碎法。根据本发明一种优选的实施方式,所述粉碎为超微粉碎。
其中,所述超微粉碎的条件可以不受特别的限制,具体可参照本领域常规技术手段进行调整。优选地,所述超微粉碎得到的微藻粉碎物可100%通过300目筛,进一步优选为可100%通过1200目筛。
在本发明中,通过柱层析的方法对所述微藻粉碎物进行分离纯化,所述柱层析的过程可以是本领域常规使用的技术手段。具体的,所述柱层析的过程可以包括:将微藻粉碎物上样到装有填料的层析柱中,使用洗脱剂进行洗脱,收集含所述微藻色素的洗脱产物。
其中,所述层析柱中的填料可以为本领域常规使用的填料,比如可以为硅胶、大孔吸附树脂、聚酰胺或离子交换树脂等,优选为硅胶。
在本发明中,所述层析柱的制备方法可以为本领域常规的制备方法。例如,可以干法装柱,也可以湿法装柱。
在本发明中,在上样前,可以使用有机溶剂对上述制备好的层析柱进行加压冲洗柱子处理,使得层析柱填料填充紧密,有利于洗脱前沿整齐。其中,加压冲洗柱子使用的有机溶剂优选与洗脱剂为同样的组成。
在本发明中,对所述微藻粉碎物进行柱层析的上样方法可以为本领域常规使用的技术手段,比如可以为湿法上样,也可以为干法上样。本领域技术人员可根据实际需要进行选择。在本发明的一个优选的技术方案中,直接把微藻粉碎物加入到装有填料的层析柱中。
其中,所述湿法上样是指用少量溶剂(可以是洗脱剂)将样品溶解后,将其沿着层析柱内壁均匀加入;然后用少量溶剂洗涤层析柱内壁和/或容器内壁后,再加入层析柱中。
其中,所述干法上样是指把待分离的样品用少量溶剂溶解后,再加入少量硅胶,拌匀后再旋去溶剂;然后把得到的粉碎物再小心加到层析柱的顶层。
在本发明中,所述柱层析的上样量可以根据实际的情况进行具体的选择。
在本发明中,使用洗脱剂对微藻粉碎物进行洗脱,所述洗脱剂可以为本领域公知的各种能够将微藻色素从层析柱上洗脱下来的有机溶剂。
本发明的发明人在研究的过程中发现,使用极性有机溶剂和非极性有机溶剂的混合溶剂作为洗脱剂进行色素的洗脱能够起到提高目标色素产品纯度的效果。可能是因为使用极性有机溶剂和非极性有机溶剂的混合溶剂洗脱时,混合溶剂对目标色素的选择性更好。
其中,所述非极性有机溶剂和极性有机溶剂的体积比可以在较宽的范围内进行选择,优选地,所述非极性有机溶剂和极性有机溶剂的体积比为1:(0.3-3),例如,可以为1:0.3、1:0.4、1:0.6、1:0.8、1:1.0、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2.0、1:2.2、1:2.4、1:2.6、1:2.8、1:3.0以及任意两个值之间组成的任意范围,本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。
根据本发明一种优选的实施方式,所述洗脱剂为极性有机溶剂和非极性有机溶剂的混合溶剂。所述极性有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇和氯仿中的至少一种,所述非极性有机溶剂可以为正己烷、液体石蜡、乙醚和石油醚中的至少一种。优选地,以硅胶层析柱提取岩藻黄素时,所述洗脱剂为正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂,在所述优选的条件下,能够进一步提高岩藻黄素的产率和纯度。
在本发明中,在所述洗脱的过程中,可根据洗脱产物颜色的变化来收集含所述微藻色素的洗脱产物。以岩藻黄素为例,含有岩藻黄素的洗脱产物的颜色为橙红色、红色或红褐色,其中,颜色越偏向红色,表明岩藻黄素的含量越高。
在本发明中,收集到含有所述微藻色素的洗脱产物后,可以使用本领域常规使用的技术手段进行后处理,所述后处理可以包括去除有机溶剂和干燥,从而得到高纯度的微藻色素。
其中,可以使用氮吹仪进行吹扫将所述上层有机溶剂层中的有机溶剂分离出来,并对分离得到的微藻油脂进行干燥处理。使用氮吹仪进行吹扫进行分离的条件可以在较宽的范围内进行选择,例如,所述氮吹仪中所述氮气的流速可以为0.5-5.0mL/min,工作温度可以为30-60℃,当所述有机溶剂和微藻油脂的混合物的体积不再有明显的变化时结束氮吹。
其中,所述干燥的条件可以在较宽的范围内进行选择,只要基本不破坏微藻油脂和微藻色素的活性即可,优选的,所述干燥在真空条件下进行室温(20-40℃)干燥,所述干燥的程度优选使得微藻油脂恒重为止。
在本发明中,根据本发明一个优选的实施方式,使用本发明所述的提取方法进行岩藻黄素的提取。其中,首先培养微藻藻种,以获得微藻生物质,所述微藻藻种可以是任意能够合成岩藻黄素的藻种,优选为硅藻;然后对得到的微藻生物质进行粉碎处理,将得到的微藻粉碎物直接加入到装有填料的层析柱中进行柱层析。
进一步地,根据本发明更优选的实施方式,从微藻生物质中提取岩藻黄素的方法具体包括:
(1)将微藻生物质使用超微粉碎法进行粉碎,使微藻粉碎物粒径低于10μm;
(2)将粉碎后的微藻粉碎物直接加入装有填料的层析柱中,加入正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂(正己烷和乙酸乙酯体积比为1:(0.3-3))进行洗脱,收集层析柱中红色洗脱液;
(3)步骤(2)所得红色洗脱液,通过氮吹法去除溶剂,得到岩藻黄素。
在本发明的另一个优选的实施方式中,以硅胶为层析柱的填料,以正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂(正己烷和乙酸乙酯体积比为1:(0.3-3))为洗脱剂。其中,柱层析的操作温度为室温(20-40℃)。
在本发明中,所述岩藻黄素的纯度的测定方法为:称取一定量的岩藻黄素待测物,质量记为M。将该待测物溶解到有机溶剂后,进行合适倍数的稀释,然后进行HPLC分析。根据HPLC测得的岩藻黄素吸收峰面积,通过岩藻黄素标准曲线计算出岩藻黄素的上样浓度,然后根据上样体积和稀释倍数,计算得到提取物M中岩藻黄素的质量m,岩藻黄素纯度即为m/M*100%。
在本发明中,所述微藻色素的种类不受特别的限制,比如可以为岩藻黄素、β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素和番茄红素中的一种。本领域技术人员可根据实际需要进行选择。
在本发明中,所述微藻的种类可以不受特别的限制,优选为富含上述微藻色素的微藻,例如为硅藻、杜氏盐藻、小球藻、金藻、微拟球藻、枝壳藻、扁藻和雨生红球藻中的一种。本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。
本发明另一方面提供了如上所述的微藻色素的提取方法制备得到的微藻色素。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中,
以岩藻黄素为例,进行本发明的技术方案的阐述。
实施例中所用硅藻为三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum GT6),为国投生物科技投资有限公司国投微藻生物科技中心自有藻种。
超微粉碎所用设备为CR600超微粉碎机;
硅胶为青岛海洋化工有限公司生产的,规格为200目;
大孔吸附树脂为天津浩聚树脂科技有限公司生产的,规格为60-16目。
岩藻黄素的纯度的测定方法为:称取一定量的岩藻黄素提取物,质量记为M。将该提取物溶解到有机溶剂后,进行合适倍数的稀释,然后进行HPLC分析。根据HPLC测得的岩藻黄素吸收峰面积,通过岩藻黄素标准曲线计算出岩藻黄素的上样浓度,然后根据上样体积和稀释倍数,计算得到提取物M中岩藻黄素的质量m,岩藻黄素纯度即为m/M*100%。
以下实施例和对比例中,每个实验进行五次平行实验。使用spss对实验所得数据进行分析,其中,以下数据均是具有显著性差异的(即p<0.05),在表1中不在体现。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的岩藻黄素的提取方法
1)取500g硅藻藻粉,使用超微粉碎机对藻粉进行粉碎处理,得到的硅藻藻粉粉碎物的粒径为0.5-10μm;
2)向硅胶层析柱中加入正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂(正己烷和乙酸乙酯体积比为1:1)使用蠕动泵高速冲洗硅胶柱;
3)将步骤1)获得的藻粉粉碎物加入层析柱中,加入正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂进行洗脱,正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:1。
4)收集层析柱中含红色组分的洗脱液,经氮吹法去除溶剂后进行真空干燥,获得色素产品;所述氮吹法的氮气流速为3.0mL/min,当洗脱液的体积不再发生明显变化时停止氮吹;所述真空干燥的温度为室温,干燥至恒重。
5)称取色素产品的质量,并通过HPLC进行定量分析测定产品中色素的纯度,结果见表1。
另外,图1中显示了色素产品在455nm下的吸收谱图。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的岩藻黄素的提取方法
1)取500g硅藻藻粉,使用超微粉碎机对藻粉进行粉碎处理,得到的硅藻藻粉粉碎物的粒径为0.5-10μm;
2)在层析柱中装入硅胶,加入正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂(正己烷和乙酸乙酯体积比为1:0.3)进行压柱;
3)将步骤1)获得的藻粉粉碎物加入层析柱中,加入正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂进行洗脱,正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:0.3。
4)收集层析柱中含红色组分的洗脱液,经氮吹法去除溶剂后进行真空干燥,获得色素产品;所述氮吹法的氮气流速为5.0mL/min,当洗脱液的体积不再发生明显变化时停止氮吹;所述真空干燥的温度为室温,干燥至恒重。
5)称取色素产品的质量,并通过HPLC进行定量分析测定产品中色素的纯度,结果见表1。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的岩藻黄素的提取方法
1)取500g硅藻藻粉,使用超微粉碎机对藻粉进行粉碎处理,得到的硅藻藻粉粉碎物的粒径为0.5-10μm;
2)在层析柱中装入硅胶,加入正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂(正己烷和乙酸乙酯体积比为1:3)进行压柱;
3)将步骤1)获得的藻粉粉碎物加入层析柱中,加入正己烷和乙酸乙酯组成的混合溶剂进行洗脱,正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:3。
4)收集层析柱中含红色组分的洗脱液,经氮吹法去除溶剂后进行真空干燥,获得色素产品;所述氮吹法的氮气流速为0.5mL/min,当洗脱液的体积不再发生明显变化时停止氮吹;所述真空干燥的温度为室温,干燥至恒重,得到色素产品。
5)称取色素产品的质量,并通过HPLC进行定量分析测定产品中色素的纯度,结果见表1。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的岩藻黄素的提取方法
实施例4-1:按照实施例1的方法进行岩藻黄素的提取,不同之处在于,所述洗脱剂为乙醇。
实施例4-2:按照实施例1的方法进行岩藻黄素的提取,不同之处在于,所述洗脱剂为正己烷。
实施例4-3:按照实施例1的方法进行岩藻黄素的提取,不同之处在于,所述洗脱剂为乙酸乙酯。
色素产品的质量和纯度的结果见表1。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的岩藻黄素的提取方法
按照实施例1的方法进行岩藻黄素的提取,不同之处在于,所述粉碎用的方法为高速剪切法,得到的硅藻藻粉粉碎物的粒径小于20μm。
色素产品的质量和纯度的结果见表1。
实施例6
本实施例用于说明本发明提供的岩藻黄素的提取方法
按照实施例1的方法进行岩藻黄素的提取,不同之处在于,所述硅胶层析柱替换为大孔吸附树脂层析柱。
色素产品的质量和纯度的结果见表1。
实施例7
本实施例用于说明本发明提供的色素的提取方法,从雨生红球藻中提取虾青素的方法
按照实施例1的方法进行虾青素的提取,不同之处在于,所述微藻为雨生红球藻,所述洗脱剂为正己烷和丙酮的混合溶剂(正己烷和丙酮的体积比为1:1)。
色素产品的质量和纯度的结果见表1。
对比例1
本对比例用于说明参比的岩藻黄素的提取方法
称取500g硅藻藻粉,分别加入3L乙醇在60℃水浴条件下进行提取3次,合并提取获得的粗提物,经硅胶柱层析,用正己烷和乙酸乙酯混合溶剂(正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:1)进行洗脱,收获岩藻黄素洗脱物。
色素产品的质量和色素纯度的结果见表1。
表1
根据表1可知,采用本发明所述的方法能够使得的目标色素产品达到很高的纯度,最高可达92%以上。
通过比较实施例1和实施例4的数据可看出,使用极性有机溶剂和非极性有机溶剂混合的搭配,能够大大提高产品的纯度。
通过比较实施例1和实施例5可看出,本发明中超微粉碎相比于常规的粉碎手段能够使得获得的色素产品的质量增加,色素的提取率增加。
通过比较实施例1和实施例6的数据可看出,在本发明优选的实施方式下,即使用硅胶层析柱进行层析,能够进一步提高岩藻黄素的纯度。
通过比较本发明的实施例和对比例1的数据可以看出,本发明所述的技术方案能够在省略有机溶剂提取藻油的步骤的情况下,保证相近的色素提取率和纯度,能够达到节能降耗、提质增效的技术效果。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型。包括各个具体技术特征以任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种微藻色素的提取方法,其特征在于,该方法包括:将微藻生物质进行粉碎获得微藻粉碎物;在装有填料的层析柱中对所述微藻粉碎物进行柱层析;
其中,所述微藻粉碎物的粒径低于20μm;
其中,所述柱层析的过程包括:将微藻粉碎物上样到装有填料的层析柱中,使用洗脱剂进行洗脱,收集含所述微藻色素的洗脱产物;
其中,所述填料为硅胶;
其中,所述洗脱剂为正己烷和乙酸乙酯的混合溶剂,正己烷和乙酸乙酯的体积比为1:(0.3-3)。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述粉碎为超微粉碎,所述超微粉碎得到的微藻粉碎物的粒径低于10μm。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述微藻色素为岩藻黄素、β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素和番茄红素中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述微藻为硅藻、杜氏盐藻、小球藻、金藻、微拟球藻、枝壳藻、扁藻和雨生红球藻中的一种。
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