CN104450537A - 一种虫草多糖的提取方法 - Google Patents

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Abstract

一种虫草多糖的提取方法，涉及一种生物多糖的提取方法，所述方法包括虫草菌培养、虫草菌培养、虫草多糖的提取；虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢（Hirsutellasinensis）,购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存；将菌丝体和培养液分离，将盛有虫草菌粉的提取液放置与超声波破碎仪的探头之下，旋转旋钮破碎，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于-25℃冷冻干燥在35℃解析至恒质量，即得冬虫夏草多糖。本发明提取方法避免了超声波破碎过程中产生的过氧化氢还原虫草多糖，保留了超声波破碎法的优势，弥补其不足，使虫草多糖的提取率明显提高。

Description

一种虫草多糖的提取方法
技术领域
    本发明涉及一种生物多糖的提取方法，特别是涉及一种虫草多糖的提取方法。
背景技术
目前随着人们生活水平的不断提高，冬虫夏草多糖逐渐走进人们的生活。虫草多糖作为主要药用成分被广泛提取并应用于众多领域。超声波法提取多糖具有提取充分，提取效率高等特点，然而在超声波破碎细胞的过程中会产生过氧化氢，过氧化氢具有氧化性，会和具有还原性的虫草多糖发生氧化还原反应，从而降低了虫草多糖的提取率。本发明在保留超声波提取方法优点的基础上，在提取液中加入一定浓度的碘化钾溶液作为保护剂，极大程度地和超声波破碎过程中产生的过氧化氢发生氧化还原反应，从而避免了过氧化氢对虫草多糖的氧化，使得所得虫草多糖的提取率明显提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虫草多糖的提取方法，该方法采取超声波破碎技术与碘化钾结合的方法提取虫草多糖，这种提取方法避免了超声波破碎过程中产生的过氧化氢还原虫草多糖，保留了超声波破碎法的优势，弥补其不足，使虫草多糖的提取率明显提高。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种虫草多糖的制备方法，步骤为：
（1）虫草菌培养基制备
虫草需要在培养基上培养，本实验需用到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基。三种培养基的具体配方分述如下：
斜面培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蚕蛹粉10g，蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O1.5g,维生素B1 10mg, 琼脂 2.0, 水1000ml，pH7-8。
种子培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000ml ，pH7-8。
发酵培养基  马铃薯200 g，蔗糖10 g，蛋白胨10g，大豆粉10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000 ml。
（2）虫草菌培养
本实验所用的虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢（Hirsutella sinensis）,购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存。
首先从经活化的斜面菌种取5～10mm2大小的菌苔4 ～6块接入种子培养基(装液量为100ml/ 250ml三角瓶)内，于24℃旋转摇床(110r/min)培养7d (种子液)。其次按10%接种量将种子液接入发酵培养基(装液量为200ml/500ml三角瓶)中，在相同的条件下发酵5d，获得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液。
（3）虫草多糖的提取将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗， 60℃条件下烘干。准确称取待测冬虫夏草样品50g，放人具塞三角瓶，按料液比1:100加人蒸馏水并加入浓度为5mg/mL的碘化钾溶液，混匀。将盛有虫草菌粉的提取液放置与超声波破碎仪的探头之下，旋转旋钮，调整烧杯和探头之间的距离，使探头没入提取液液面3cm以下，破碎时间为300s，破碎功率为500W。离心(2500rpm×20min)取上清液，50℃减压浓缩至200mL，加人4倍体积95%乙醇溶液，4℃静置12 h，3000 r/min离心15 min，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于-25℃冷冻干燥在35℃解析至恒质量，即得冬虫夏草多糖。
（4）多糖含量的测定方法
标准曲线的制作：精确称取干燥至恒重的葡萄糖10 g，加水溶解定容到1000 mL所得标准液浓度为0.01 g/mL，取7支试管，分别吸取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL，置于0、1、2、3、4、5、6号7支试管中，再分别加蒸馏水补至1mL。每支试管立即加入蒽酮试剂4.0 g，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min取出，用流水冷却，室温暗处放置10min，以零管调仪器零点。在620 nm波长下测定吸光度，以标准葡萄糖浓度(g/L)作横坐标，以吸光值作纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得葡萄糖溶液浓度(C)与吸光度值(D)关系曲线的回归方程式。
    样品多糖含量的测定：吸取1 mL提取液与4 mL蒽酮溶剂混合后如上法先在沸水中加热10 min，再在暗处放置10 min后，以蒸馏水的混合液为调零点，在620 nm波长下测定吸光度，最后把吸光度放入标准曲线中计算出多糖含量。
得率计算多糖提取率=多糖含量/蛹虫草菌丝体粉末质量×100%。
本发明与现有技术相比，采取超声波破碎技术与碘化钾结合的方法提取虫草多糖，这种提取方法避免了超声波破碎过程中产生的过氧化氢还原虫草多糖，保留了超声波破碎法的优势，弥补其不足，使虫草多糖的提取率明显提高。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详述。
实施例1：
（1）虫草菌培养基制备
    虫草需要在培养基上培养，本实验需用到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基。三种培养基的具体配方分述如下：
斜面培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蚕蛹粉10g，蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O1.5g,维生素B1 10mg, 琼脂 2.0, 水1000ml，pH7-8。
种子培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000ml ，pH7-8。
发酵培养基  马铃薯200 g，蔗糖10 g，蛋白胨10g，大豆粉10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000 ml。
（2）虫草菌培养
本实验所用的虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢（Hirsutella sinensis）,购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存。
首先从经活化的斜面菌种取5mm2大小的菌苔4块接入种子培养基(装液量为100ml三角瓶)内，于24℃旋转摇床(110r/min)培养7d (种子液)。其次按10%接种量将种子液接入发酵培养基(装液量为200ml三角瓶)中，在相同的条件下发酵5d，获得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液。
（3）虫草多糖的提取
将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗，60℃条件下烘干。准确称取待测冬虫夏草样品50g，放人具塞三角瓶，按料液比1:100加人蒸馏水并加入浓度为5mg/mL的碘化钾溶液，混匀。将盛有虫草菌粉的提取液放置与超声波破碎仪的探头之下，旋转旋钮，调整烧杯和探头之间的距离，使探头没入提取液液面3cm以下，破碎时间为300s，破碎功率为500W。混匀。置于85℃水浴浸提3h，趁热离心(2500rpm×20min)取上清液，50℃减压浓缩至200mL，加人4倍体积95%乙醇溶液，4℃静置12 h，3 000 r/min离心15 min，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于-25℃冷冻干燥在35℃解析至恒质量，即得冬虫夏草多糖。
（4）多糖含量的测定方法
标准曲线的制作：精确称取干燥至恒重的葡萄糖10 g，加水溶解定容到1000 mL所得标准液浓度为0.01 g/mL，取7支试管，分别吸取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL，置于0、1、2、3、4、5、6号7支试管中，再分别加蒸馏水补至1mL。每支试管立即加入蒽酮试剂4.0 g，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min取出，用流水冷却，室温暗处放置10min，以零管调仪器零点。在620 nm波长下测定吸光度，以标准葡萄糖浓度(g/L)作横坐标，以吸光值作纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得葡萄糖溶液浓度(C)与吸光度值(D)关系曲线的回归方程式。
    样品多糖含量的测定：吸取1 mL提取液与4 mL蒽酮溶剂混合后如上法先在沸水中加热10 min，再在暗处放置10 min后，以蒸馏水的混合液为调零点，在620 nm波长下测定吸光度，最后把吸光度放入标准曲线中计算出多糖含量。
得率计算多糖提取率=多糖含量/蛹虫草菌丝体粉末质量×100%。
实施例2：
（1）虫草菌培养基制备
      虫草需要在培养基上培养，本实验需用到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基。三种培养基的具体配方分述如下：
斜面培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蚕蛹粉10g，蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O1.5g,维生素B1 10mg, 琼脂 2.0, 水1000ml，pH7-8。
种子培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000ml ，pH7-8。
发酵培养基  马铃薯200 g，蔗糖10 g，蛋白胨10g，大豆粉10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000 ml。
（2）虫草菌培养
本实验所用的虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢（Hirsutella sinensis）,购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存。
首先从经活化的斜面菌种取10mm2大小的菌苔6块接入种子培养基(装液量为 250ml三角瓶)内，于24℃旋转摇床(110r/min)培养7d (种子液)。其次按10%接种量将种子液接入发酵培养基(装液量为500ml三角瓶)中，在相同的条件下发酵5d，获得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液。
（3）虫草多糖的提取
将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗，60℃条件下烘干。准确称取待测冬虫夏草样品50g，放人具塞三角瓶，按料液比1:100加人蒸馏水并加入浓度为0mg/mL的碘化钾溶液，混匀。将盛有虫草菌粉的提取液放置与超声波破碎仪的探头之下，旋转旋钮，调整烧杯和探头之间的距离，使探头没入提取液液面3cm以下，破碎时间为300s，破碎功率为500W。混匀。置于85℃水浴浸提3h，趁热离心(2500rpm×20min)取上清液，50℃减压浓缩至200mL，加人4倍体积95%乙醇溶液，4℃静置12 h，3000 r/min离心15 min，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于-25℃冷冻干燥在35℃解析至恒质量，即得冬虫夏草多糖。
（4）多糖含量的测定方法
标准曲线的制作：精确称取干燥至恒重的葡萄糖10 g，加水溶解定容到1000 mL所得标准液浓度为0.01 g/mL，取7支试管，分别吸取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL，置于0、1、2、3、4、5、6号7支试管中，再分别加蒸馏水补至1mL。每支试管立即加入蒽酮试剂4.0 g，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min取出，用流水冷却，室温暗处放置10min，以零管调仪器零点。在620 nm波长下测定吸光度，以标准葡萄糖浓度(g/L)作横坐标，以吸光值作纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得葡萄糖溶液浓度(C)与吸光度值(D)关系曲线的回归方程式。
    样品多糖含量的测定：吸取1 mL提取液与4 mL蒽酮溶剂混合后如上法先在沸水中加热10 min，再在暗处放置10 min后，以蒸馏水的混合液为调零点，在620 nm波长下测定吸光度，最后把吸光度放入标准曲线中计算出多糖含量。
得率计算多糖提取率=多糖含量/蛹虫草菌丝体粉末质量×100%。
实施例3
（1）虫草菌培养基制备
      虫草需要在培养基上培养，本实验需用到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基。三种培养基的具体配方分述如下：
斜面培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蚕蛹粉10g，蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O1.5g,维生素B1 10mg, 琼脂 2.0, 水1000ml，pH7-8。
种子培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000ml ，pH7-8。
发酵培养基  马铃薯200 g，蔗糖10 g，蛋白胨10g，大豆粉10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000 ml。
（2）虫草菌培养
本实验所用的虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢（Hirsutella sinensis）,购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存。
首先从经活化的斜面菌种取6mm2大小的菌苔5块接入种子培养基(装液量为250ml三角瓶)内，于24℃旋转摇床(110r/min)培养7d (种子液)。其次按10%接种量将种子液接入发酵培养基(装液量为500ml三角瓶)中，在相同的条件下发酵5d，获得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液。
（3）虫草多糖粗提
将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗，60℃条件下烘干。准确称取待测冬虫夏草样品50g，放人具塞三角瓶，按料液比1:100加人蒸馏水并加入浓度为8mg/mL的碘化钾溶液，混匀。将盛有虫草菌粉的提取液放置与超声波破碎仪的探头之下，旋转旋钮，调整烧杯和探头之间的距离，使探头没入提取液液面3cm以下，破碎时间为300s，破碎功率为500W。混匀。置于85℃水浴浸提3h，趁热离心(2500rpm×20min)取上清液，50℃减压浓缩至200mL，加人4倍体积95%乙醇溶液，4℃静置12 h，3000 r/min离心15 min，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于-25℃冷冻干燥在35℃解析至恒质量，即得冬虫夏草多糖。
（4）多糖含量的测定方法
标准曲线的制作：精确称取干燥至恒重的葡萄糖10 g，加水溶解定容到1000 mL所得标准液浓度为0.01 g/mL，取7支试管，分别吸取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL，置于0、1、2、3、4、5、6号7支试管中，再分别加蒸馏水补至1mL。每支试管立即加入蒽酮试剂4.0 g，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min取出，用流水冷却，室温暗处放置10min，以零管调仪器零点。在620 nm波长下测定吸光度，以标准葡萄糖浓度(g/L)作横坐标，以吸光值作纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得葡萄糖溶液浓度(C)与吸光度值(D)关系曲线的回归方程式。
样品多糖含量的测定：吸取1 mL提取液与4 mL蒽酮溶剂混合后如上法先在沸水中加热10 min，再在暗处放置10 min后，以蒸馏水的混合液为调零点，在620 nm波长下测定吸光度，最后把吸光度放入标准曲线中计算出多糖含量。
得率计算多糖提取率=多糖含量/蛹虫草菌丝体粉末质量×100%。

Claims (1)

1.一种虫草多糖的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下制备步骤：
（1）虫草菌培养基制备：
虫草在培养基上培养，到斜面培养基、种子培养基、发酵培养基三种培养基；三种培养基的具体配方分述如下：
斜面培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蚕蛹粉10g，蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O1.5g,维生素B1 10mg, 琼脂 2.0, 水1000ml，pH7-8；
种子培养基  马铃薯 200g, 葡萄糖 20g, 牛肉膏10g, 蛋白胨10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000ml ，pH7-8；
发酵培养基  马铃薯200 g，蔗糖10 g，蛋白胨10g，大豆粉10g, KH2PO4 3g, MgSO4·7H2O 1.5g, 维生素B1 10mg, 水1000 ml；
（2）虫草菌培养：
虫草菌为冬虫夏草菌-中国被毛孢（Hirsutella sinensis）,购于中国科学院微生物研究所，于沈阳大学重点实验室低温保存；
首先从经活化的斜面菌种取5～10mm2大小的菌苔4 ～6块接入种子培养基，装液量为100ml/ 250ml三角瓶内，于24℃旋转摇床(110r/min)培养7d 种子液；其次按10%接种量将种子液接入发酵培养基，装液量为200ml/500ml三角瓶中，在相同的条件下发酵5d，获得发酵的冬虫夏草菌丝体以及发酵液；
（3）虫草多糖的提取：
将菌丝体和培养液分离，分离后的菌丝体用去离子水冲洗， 60℃条件下烘干；准确称取待测冬虫夏草样品50g，放人具塞三角瓶，按料液比1:100加人蒸馏水并加入浓度为5mg/mL的碘化钾溶液，混匀；将盛有虫草菌粉的提取液放置与超声波破碎仪的探头之下，旋转旋钮，调整烧杯和探头之间的距离，使探头没入提取液液面3cm以下，破碎时间为300s，破碎功率为500W；离心(2500rpm×20min)取上清液，50℃减压浓缩至200mL，加人4倍体积95%乙醇溶液，4℃静置12 h，3000 r/min离心15 min，收集沉淀，依次加人少量无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤沉淀，沉淀置于-25℃冷冻干燥在35℃解析至恒质量，即得冬虫夏草多糖。
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