CN107744530B - 柯萨奇病毒a10驯化株ta151r-1感染动物模型的建立和评价 - Google Patents

柯萨奇病毒a10驯化株ta151r-1感染动物模型的建立和评价 Download PDF

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Abstract

本发明专利申请公开了一株高滴度、传代稳定的柯萨奇病毒株A10驯化株TA151R‑1，该病毒株能够感染RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC‑5细胞、Hep‑2细胞以及WI‑38细胞等多种细胞系，还可以用于制备单价或多价疫苗，制备得到的疫苗能够保护机体免受柯萨奇病毒的伤害，并且也能够完全保护其他异源病毒的攻毒，还可高效的建立感染动物模型。

Description

柯萨奇病毒A10驯化株TA151R-1感染动物模型的建立和评价
技术领域：
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及柯萨奇病毒A10驯化株TA151R-1感染动物模型的建立和评价。
背景技术：
手足口病(Hand,foot,and mouth disease，HFMD)是一种由小RNA病毒引起的肠道传染性疾病，发病者主要是5岁以下婴幼儿，主要引起粘膜疱疹、咽峡炎等轻微临床症状，也能够引起重症，导致严重的无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹等神经系统疾病。自2009年流行以来，柯萨奇病毒A组6型(A6)和10型(A10)在西太平洋地区和欧洲某些国家其发病率逐年升高，包括新加坡、泰国、日本、西班牙、法国和中国大陆及台湾地区，使其成为引发HFMD的主要病原体。作为非-EV71和非-A16，A6和A10被认为是其它型肠道病毒中引起HFMD的主要病原体，并在引发HFMD的病原体中所占比例越来越大。例如，一份最近的流行病学调查报告显示2011～2015年间重庆21615名HFMD患儿中由A6和A10所引起的比例分别为62.33％和4.79％。
目前为止，临床治疗A10重症患儿主要采取支持疗法的对症治疗，并未进行抗病毒治疗，更为关键的是还没有一种合适的A10疫苗预防接种儿童，另外，目前尚不明确A10的感染病理机制，获得一株稳定高效的A10病毒株是开发疫苗以及建立动物感染模型的关键。本发明人在之前的工作中筛选到了A6病毒株WF057R，并利用其进行了感染动物模型的建立以及抗A6药物的制备(CN106947745A、CN106867974A、CN106994182A)。
现在对柯萨奇病毒的研究较多，但是，关于A10病毒株的报道较少。庄再成等人在CN106661102A中公开了A10病毒株M2014，但是，该病毒株仅能感染HEK293细胞，而不能感染其他用于疫苗生产的细胞株，如，Vero细胞、MRC-5细胞、MDCK细胞以及CHO细胞，病毒力价最高只能到2.5×108TCID50/mL，在很大程度上限制了该病毒株的应用。我们在前期的工作中筛选得到了A10病毒株TA151R，建立了A10的乳鼠感染模型，并制备了全病毒灭活疫苗(“Protective Efficacies of Formaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine andAntivirals in a Murine Model of Coxsackievirus A10Infection”，Zhenjie Zhang等，《Journal of Virology》，2017年第91卷，e00333-17)；但是，在后续研究过程中，我们发现TA151R病毒株在传代过程中会出现滴度降低、传代不稳定的问题，影响了该病毒株在实际应用时的效率。
为了提高A10病毒株TA151R的滴度以及传代稳定性，我们对该毒株进行了驯化，筛选得到一株高滴度、传代稳定，并且能够感染多种细胞系的驯化株TA151R-1，该驯化株可高效用于疫苗的开发以及动物感染模型的建立。
发明内容：
本发明中所涉及的技术以及科学术语，如无特殊说明，均属于本领域技术人员所知的常规定义。
本发明一方面提供了一株高滴度、传代稳定的A10型柯萨奇病毒驯化株TA151R-1，该驯化株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13394，分类命名为柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A10型，病毒株编号为TA151R-1，保藏日期为2016年12月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
另一方面，本发明提供了利用TA151R-1制备得到的用于治疗和/或预防柯萨奇病毒所致疾病的产品。优选的，所述产品可以为纯化的病毒颗粒、灭活的病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物。优选的，所述疾病为手足口病。
另一方面，本发明的疫苗可以为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗；优选的，所述疫苗为灭活疫苗；更优选的，所述灭活采用加热或化学试剂处理灭活；优选的，所述化学试剂选自甲醛或/β-丙内酯；更优选的，所述化学试剂为甲醛；优选的，甲醛的终浓度为1:10000-1:100(v/v)，更优选的1:5000-1:1000(v/v)，更优选的1:4000(v/v)。
另一方面，TA151R-1病毒株还可以与其他类型的柯萨奇病毒株组合使用，从而制备用于治疗和/或预防柯萨奇病毒所致疾病的产品；优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6、EV71、A16、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A12、A14病毒株或其任意组合；更优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6、EV71、A16病毒株或其任意组合；更优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6病毒株。
另一方面，在制备用于治疗和/或预防柯萨奇病毒所致疾病的疫苗时，单独使用TA151R-1病毒株可以制备单价疫苗，同时使用TA151R-1病毒株与其他类型的病毒株时，可以得到二价疫苗、三价疫苗、四价疫苗以及其他的多价疫苗。
另一方面，本发明用于治疗和/或预防柯萨奇病毒所致疾病的产品还可以包括佐剂；优选的，所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐；优选的，所述铝盐选自氢氧化铝或磷酸铝；优选的，所述佐剂为弗氏完全佐剂；优选的，所述佐剂与病毒株的用量质量比为1:5-5:1，更优选1:2-2:1，更优选1:1。
另一方面，本发明还提供了TA151R-1病毒株在制备上述用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品中的应用。
另一方面，本发明还提供了制备上述用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品的方法，所述方法包括利用TA151R-1病毒株作为活性成分制备上述产品的步骤。
另一方面，在制备上述用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品时，包含将TA151R-1病毒株进行培养的步骤；优选的，将所述病毒株在细胞株中进行培养；更优选的，所述细胞株选自RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞、WI-38细胞或其任意组合。
另一方面，本发明还提供了利用TA151R-1制备免疫组合物的方法，包括将病毒株进行培养的步骤；具体而言，该方法包括在细胞株中培养TA151R-1并收集培养物的步骤，所述细胞株包括但不限于RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞以及WI-38细胞；利用病毒颗粒感染细胞株，将感染细胞培养一段时间后，确保可生产病毒颗粒；之后，收集培养的病毒颗粒，将其作为免疫原，即可对抗柯萨奇病毒的感染；优选的，还包括对细胞培养物进行灭活和/或纯化的步骤。
另一方面，本发明的灭活采用加热或化学试剂处理灭活，化学试剂优选甲醛或/β-丙内酯；优选的，采用甲醛，甲醛的终浓度为1:10000-1:100(v/v)，更优选的1:5000-1:1000(v/v)，更优选的1:4000(v/v)；纯化优选采用密度梯度离心。
另一方面，本发明提供了包含TA151R-1病毒株的免疫组合物；优选，灭活的病毒株；优选还包括佐剂，所述佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝盐等，所述铝盐优选氢氧化铝、磷酸铝；优选的，佐剂为弗氏完全佐剂；所述佐剂与病毒液的质量比为1:5-5:1，优选的1:2-2:1，更优选1:1。
另一方面，本发明的免疫组合物还可以包括其他类型的柯萨奇病毒株，包括但不限于A6、EV71、A16、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A12、A14；优选A6、EV71和A16；更优选的，A6病毒株；更优选的，A6病毒株的保藏编号为CGMCC No.13393；所述病毒株优选灭活的病毒株。
另一方面，本发明提供了制备抗血清的方法，包括利用病毒株感染细胞、培养、收获毒液、得到疫苗原液，用疫苗原液免疫动物，获得抗血清；所述动物优选猴、羊、兔；优选的，上述方法还包括灭活和/或纯化的步骤。
另一方面，本发明还提供了利用TA151R-1病毒株制备的疫苗，包括但不限于灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗；优选灭活疫苗；灭活优选采用加热或化学试剂处理灭活，化学试剂优选甲醛或/β-丙内酯。
另一方面，本发明的产品还可以包含药学上可接受的佐剂，所述佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝盐等，所述铝盐优选氢氧化铝、磷酸铝。
另一方面，本发明的产品可被制成各种适用于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂，优选注射剂，所述哺乳动物优选人。
另一方面，本发明提供了利用免疫组合物治疗和/或预防由柯萨奇病毒所致疾病的方法，所述疾病优选手足口病。
另一方面，本发明提供了利用TA151R-1感染动物模型的建立方法以及建立的动物模型，其能够提供稳定的动物模型，为柯萨奇病毒疫苗的研制以及抗病毒药物的筛选和A10型病毒感染机制的研究提供基础；具体而言，利用病毒培养液感染动物，从而制备动物模型；优选的，所述动物为哺乳动物，所述哺乳动物优选大鼠或小鼠。所述病毒株的感染剂量为0.1×103～2.0×103TCID50，优选0.2×103～1.2×103TCID50，更优选0.5×103TCID50。所述病毒的接种途径为腹腔接种、颅腔接种或肌肉接种，优选，腹腔接种。所述动物的日龄为3-9日龄，优选，5日龄。
另一方面，本发明的TA151R-1病毒株还可以用于评价疫苗的保护效果。
另一方面，本发明还提供了TA151R-1病毒株的驯化筛选方法，其包括由初始菌株TA151R驯化筛选得到。
另一方面，本发明还提供了利用TA151R-1病毒株和其他类型的柯萨奇病毒制备的多价疫苗，其他类型的柯萨奇病毒包括但不限于A6、EV71、A16、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A12、A14，优选A6、EV71和A16，更优选的，与A6制备成二价疫苗，更优选的A6病毒株的保藏编号为CGMCC No.13393。
另一方面，本发明还提供了包含A10病毒株TA151R-1和柯萨奇A6病毒株的病毒组合物；优选，保藏号为CGMCC No.13393的A6病毒株；A10和A6可以采用任意比例混合，优选的，A10和A6的比例可以为1:10-10:1，更优选的，A10和A6等比例混合，上述比例为病毒颗粒的比例；优选，所述病毒为灭活的病毒。
另一方面，本发明还提供了利用上述病毒组合物制备二价疫苗的用途以及制备得到的二价疫苗，优选还包含佐剂。
另一方，本发明还提供了制备二价疫苗的方法，其包括用上述病毒组合物生产疫苗的步骤；优选的还包括感染、纯化、灭活的步骤。
有益效果：本发明通过驯化筛选到一株高滴度、传代稳定的柯萨奇病毒株A10驯化株TA151R-1，该病毒株滴度可高达6.4×109TCID50/ml，能够感染RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞以及WI-38细胞等多种细胞系，具有广阔的应用前景。本发明利用TA151R-1进行了感染ICR乳鼠模型的建立和评价。与出发病毒株相比，采用低剂量的TA151R-1病毒即可建立感染乳鼠模型，乳鼠发病时间较出发株TA151R提前；感染乳鼠后，TA151R-1呈现出更高的复制效率和病毒滴度，各脏器病毒载量明显增多；此外，TA151R-1病毒感染乳鼠后，血浆细胞因子表达水平明显提高，与TA151R相比更能模拟出重症。TA151R-1在建立动物感染模型时与出发病毒株相比，具有更高的效率。
附图说明：
图1驯化株XH01-08传代结果图；XH01、XH02、XH05、XH06、XH08在传代过程中分别呈现出不同的滴度降低或者滴度不稳定的情形，而XH03、XH04、XH07在传代过程中稳定性较好。
图2驯化株XH03/XH04/XH07抗体滴度图；与TA151R相比，XH03和XH07的抗体滴度明显降低，而XH04的抗体滴度则与TA151R抗体滴度相当。
图3TA151R-1在不同条件下感染小鼠结果图
图4不同剂量TA151R-1经IM途径接种(腹腔接种)不同日龄小鼠结果图
图5TA151R-1感染乳鼠各脏器病毒载量变化情况
图6TA151R和TA151R-1感染小鼠模型血浆炎性细胞因子表达水平变化情况
图7TA151R-1感染小鼠模型组织病理学检查结果
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的描述，给出的实施例仅为阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均是本领域的常规技术方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明的“柯萨奇病毒A10”，也可称为柯萨奇病毒CVA10型，也可称为柯萨奇A10病毒，也可称为A10型柯萨奇病毒，也可称为柯萨奇CVA10病毒，也可称为柯萨奇病毒A组10型。
实施例1柯萨奇病毒A10型毒株的分离、筛选与驯化
本发明人在前期进行了大量的分离、筛选工作，于2015年从山东省一名4岁患儿的粪便样本中分离获得柯萨奇病毒A10型毒株TA151R，并利用该毒株建立了感染动物模型，制备了全病毒灭活疫苗，并研究了疫苗的免疫保护效果(“Protective Efficacies ofFormaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Modelof Coxsackievirus A10Infection”，Zhenjie Zhang等，《Journal of Virology》，2017年第91卷，e00333-17)。在后续的研究过程中，我们发现TA151R在传代过程中会出现滴度降低、传代不稳定的问题，严重制约了该毒株的应用；为了解决这一问题，我们对TA151R进行了驯化筛选。
将TA151R病毒接种于含2％胎牛血清及1％青霉素链霉素混合液的MEM维持液中的单层RD细胞(ATCC,CCL-136)上，至细胞出现致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)面积超过80％时，反复冻融3次，收集病毒液，进行连续传代驯化，筛选到了滴度增加的病毒驯化株XH01-08，各病毒株在RD细胞中的滴度如下表1所示；扩增不同代次CVA10的VP1基因，并送上海生工进行测序，测序后进行序列比对，发现传至各代次病毒VP1核苷酸与毒株TA151R同源性趋近于99.8％，氨基酸同源性由99.5％趋近于100％。
表1：TA151R病毒株与不同驯化株在RD细胞中的病毒滴度(109TCID50/mL)
毒株 TA151R XH01 XH02 XH03 XH04 XH05 XH06 XH07 XH08
滴度 0.81 2.5 2.1 4.5 6.4 4.8 4.0 4.1 8.5
实施例2高滴度驯化株XH01-08的传代稳定性
利用RD细胞对实施例1中的高滴度驯化株XH01-08进行连续传代培养，至细胞出现致细胞病变效应面积超过80％时，反复冻融3次，收集第一代病毒液，并测定病毒滴度；采用相同的方法将收获的第一代病毒连续传代30次，每代次收集病毒并测定滴度，比较不同代次病毒滴度的高低。如图1所示，XH01、XH02、XH05、XH06、XH08在传代过程中分别呈现出不同的滴度降低或者滴度不稳定的情形，而XH03、XH04、XH07在传代过程中稳定性较好且能产生高滴度的病毒。
实施例3驯化株XH03/XH04/XH07的抗血清试验
将0.4％甲醛灭活的TA151R、XH03、XH04和XH07抗原分别与完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂按体积1:1混合，超声完全乳化后，6周龄ICR小鼠(n＝6)经腹腔注射完全弗氏佐剂与抗原乳化液300ul，间隔7天后，再经腹腔注射不完全弗氏佐剂与抗原乳化液300ul，20天后从免疫小鼠眼眶静脉丛取外周血离心取血清。将免疫血清自1:8开始进行2倍系列稀释后，分别与100CCID50(Cell culture infective dose 50％)的CVA10混合，置37℃中和2h，混合液加入单层RD细胞的96孔板(1×105/孔)中，置CO2培养箱中于37℃培养48h，观察细胞CPE，以能抑制50％细胞病变的最高稀释度的倒数作为中和抗体效价。同时设病毒回滴试验，回滴值为32～320CCID50/孔时抗体滴度判为准确。
不同病毒免疫成年ICR鼠后20天后采集外周血，微量中和实验检测各组实验组中和抗体滴度，发现实验组之间抗体滴度有差异。如图2所示，与TA151R相比，XH03和XH07的抗体滴度明显降低，而XH04的抗体滴度则与TA151R抗体滴度相当。
基于上述驯化、筛选的结果，我们得到了一株高滴度、传代稳定并且抗体滴度较高的柯萨奇病毒A10型驯化株XH04，将其命名为TA151R-1，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13394。
我们对TA151R-1进行了不同细胞系感染试验，如表2所示，TA151R-1能够感染RD、HEK293、Vero、MRC-5、Hep-2以及WI-38细胞系，尤其是对RD细胞和Vero细胞表现了良好的感染效率，相对于CN106661102A中的A10病毒株M2014来说，具有更广阔的应用前景。
表2TA151R-1对不同细胞系的感染结果
细胞系 感染结果
RD细胞 ++++
HEK293细胞 ++
Vero细胞 ++++
MRC-5细胞 +
Hep-2细胞 +++
WI-38细胞 +++
注：+表示可以感染，-表示不能感染
CPE的观察记录格式：0～25％的细胞出现病变记录为“+”；25％～50％的细胞出现病变记录为“++”；50％～75％的细胞出现病变记录为“+++”；75％～100％的细胞出现病变记录为“++++”
实施例4TA151R-1感染ICR乳鼠模型的建立和评价
4.1感染及分组
为评价驯化株TA151R-1相比原型株TA151R病毒在不同条件下对乳鼠致病性的不同，参照TA151R建立乳鼠感染模型的剂量和接种两因素三水平(Zhang et al.,2017)设计驯化株TA151R-1建立新的感染模型。对于接种剂量和接种途径依赖性实验，选取3个比TA151R低的接种剂量分别为102、5×102或1.2×103TCID50/只，3种接种途径为颅腔(i.c.)、肌肉(i.m.)和腹腔(i.p.)，两因素进行组合，分别接种5日龄乳鼠。对于日龄依赖性实验，采用5×102TCID50剂量和i.m.接种途径的组合，比较3、7和9日龄乳鼠在该条件下对驯化株TA151R-1的敏感性。每组乳鼠接种病毒后连续观察12天，统计乳鼠临床表现和生存率，最终确定建立TA151R-1模型的最佳日龄、接种途径和感染剂量，并与原始毒株TA151R的感染剂量进行比较，不同感染条件组合见表3。依据Reed&Muench公式计算5日龄乳鼠的半数致死量LD50(Reed and Muench,1938)。每组均设置阴性对照组(NC)，以相同的接种途径注射等量的生理盐水。
4.2临床评分标准
为评价病毒株对乳鼠致病的严重程度，对不同的临床表现赋予不同的分值，本研究参考Mao(Mao et al.,2012)等人在建立肠道病毒CVA16乳鼠模型时所采用的临床评分标准(表4)。
表3TA151R-1感染小鼠实验设计方案
Figure GDA0001550348140000081
注:肌肉接种，IM；腹腔接种，IP；颅腔接种，IC；生理盐水，NS
表4临床标准评分
临床评分 临床表现
0 健康
1 倦怠或无神
2 身体消瘦或后肢无力
3 单后肢瘫痪
4 双后肢瘫痪
5 濒死或死亡
选取5日龄乳鼠经IM、IP和IC感染途径分别接种不同剂量(102、5×102或1.2×103TCID50)的TA151R-1。如图3所示，三种途径接种乳鼠低剂量(1.0×102TCID50)病毒后4-5天开始出现临床症状，例如活动量减少，临床得分最高为2(平均值四舍五入)，较TA151R发病提前1天左右；感染后9-10天，症状逐渐恢复，体重增加，最终生存率分别为80％、90％和100％，与该剂量的TA151R攻毒后生存率相当。经IC途径感染剂量为5×102TCID50的实验组乳鼠仅出现短暂的神经症状(单或双后肢瘫痪)，表现出一过性后肌无力，平均临床评分仅为2.25，生存率为40％，较TA151R症状明显；而在该剂量下经IM和IP途径感染的乳鼠在感染后3天开始出现症状，并逐天加重，感染后5-6天临床得分为4-5，呈现典型的神经症状。与TA151R相似的是IP途径组乳鼠个体之间临床评分差异大且分布不均。经三种途径接种高剂量(1.2×103TCID50)病毒后乳鼠发病迅速，尤其IM组乳鼠在感染后6天全部死亡，存活时间短，所以该剂量不适合用于模型建立。
采用5×102TCID50经IM途径接种不同日龄(3、7、9)小鼠后，如图4所示，3日龄小鼠虽然临床评分高，但是死亡快；7和9日龄乳鼠感染后临床得分≤3，其未全部死亡，生存率为20％和70％，所以该三个日龄乳鼠也不适合感染模型的建立。大日龄(14和21)乳鼠感染高剂量CVA10(1.2×103TCID50)未呈现明显临床症状，生存率为100％。选择5×102TCID50感染剂量经IM途径接种5日龄的乳鼠建立感染模型，经重复性实验证明在该三因素条件下感染乳鼠平均临床得分4-5，在感染后8-9天全部死亡。个体的发病时间和死亡率稳定，有非常高的可重复性。
4.3核酸提取、病毒载量检测及病毒变异检测
5日龄乳鼠接种240LD50TA151R-1剂量，感染后1、3、5天各组分别处死3只，取脑、心脏、肺脏、脾脏、后肢肌、肠道和血液，充分研磨后取0.01g上述各组织研磨物分别置于1.5mL无菌离心管中，加0.01Mol PBS至1mL，9000rpm 4℃离心10min，取离心后上清液用TRIzol法提取病毒核酸，检测各组织中病毒载量随时间的变化，初步判断病毒在小鼠体内的组织嗜性和载量变化。
TRIzol法提取病毒RNA后经反转录获取cDNA，反转录在ABI SimpliAmpTMThermalCycler PCR仪上进行，使用TAKARA PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect RealTime)，总体积为10μL，其中：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2μL，PrimeScriptRT Enzyme Mix I0.5μL，Random 6mers 1μL以及待测样本RNA 6.5μL。反转录反应条件：42℃，45min(×1)；85℃，5s(×1)；4℃，∞。通过荧光定量PCR进行病毒载量的定量，于ABI7500FAST荧光定量PCR仪上进行，反应体系总体积为25μL，其中：GoldStarTaqMan Mixture(CW2625M，康维世纪)12.5μL；CVA10荧光定量特异性上游引物CVA10-F(25μM)0.625μL；特异性下游引物CVA10-R(25μM)0.625μL；CVA10特异性探针(25μM)0.625μL；RNase-Freewater8.625μL；待测cDNA模板量2μL。荧光定量PCR反应条件：95℃，10min(×1)；95℃，15s(×40)；60℃，1min(×40)，于每个循环60℃，1min结束后检测荧光。CVA10荧光定量特异性引物和探针均参照国家CDC肠道病毒检测标准合成，其中上游引物CVA10-F序列：CCTGAATGCGGCTAATCC；下游引物CVA10-R序列：TTGTCACCATWAGCAGYCA；探针序列：5’FAM-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-3’BHQ1。CVA10核酸的PCR产物(dsDNA)与PMD18-T载体构建质粒pMD18-T-CV，检测质粒浓度作为标准品，10倍倍比稀释后备用(102to 1010copies/μl)。每次进行荧光定量PCR时载体标准品每个稀释度均设三个重复孔，取三个重复孔Ct值的平均值作为对应稀释度的最终Ct值。
如图5所示，5日龄乳鼠接种240LD50剂量病毒后检测不同时间点和不同组织中病毒载量结果表明感染后1、3和5天病毒在各组织中变化幅度差异显著(P<0.05)，总体上呈现病毒含量上升的趋势。感染后1天各组织中病毒载量相当(P>0.05)，3天血液、脑、肺脏和心脏很快升到8log10/mg，后肢肌更是高达9log10/mg，病毒载量要比同期TA151R感染高1-2log10/mg。感染后5天肺脏中病毒含量同样高达9log10/mg，病毒的快速增殖导致肺脏肺泡损伤严重和大量淋巴细胞浸润，与病毒性肺炎的病理变化相符。在感染后期，接种部位对侧骨骼肌中病毒载量远远高于其它组织，高达10log10/mg，比同时期TA151R的感染高2-3log10/μl，表明相比TA151R驯化株TA151R-1在骨骼肌中有更高的复制效率和病毒滴度，所以两病毒均在感染初期经肌肉进入血液系统，通过血液流动迅速遍布全身。高病毒载量与肌肉组织严重的病理变化相一致，表明驯化株对肌肉组织有更强的嗜性，病毒的快速增殖与感染后期出现的单双后肢瘫痪有关。虽然肠道是自然条件下CVA10的感染途径，但与TA151R相似在肠道组织中病毒载量始终低于4log10，该现象与接种途径有关。
4.4感染模型血浆炎性细胞因子表达水平变化情况
5日龄乳鼠经IM感染240LD50TA151R-1后采集1～7天外周血浆，离心后取血清，通过细胞因子ELISA检测试剂盒(联科生物，杭州)检测不同感染阶段小鼠模型外周血中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α表达量的变化，以了解上述炎性细胞因子在重症CVA10感染阶段发挥免疫病理损伤的作用。各细胞因子的检测下限分别为：IL-6(1.17pg/ml)、IL-10(1.17pg/ml)、IFN-γ(1.74pg/ml)和TNF-α(1.63pg/ml)。
如图6所示，5日龄ICR乳鼠感染致死剂量的TA151R-1后，检测不同时间点(1、2、3、4、5、6和7天)外周血中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α和细胞因子的表达。研究发现，与TA151R感染一致，四种炎性细胞因子均有不同程度的高表达。特别是IL-6呈现爆发式升高，表现出与手足口重症患儿外周血中相似的变化趋势，在感染后期IL-6表达水平接近2200pg/ml，感染后期(4-6天)峰值均高于TA151R感染组(P<0.05)；同样，TNF-α在感染后5天峰值达到105pg/ml，表达水平高于同期TA151R的感染。感染后5天IFN-γ表达量高达2090pg/ml，IL-10水平也异常升高，四种细胞因子在阴性对照组中均未检测出。有文献报道，外周血中IL-6、IFN-γ和IL-10高水平表达参与先天免疫的同时导致乳鼠免疫病理损伤，是引起严重病毒性肺炎和脑炎的主要原因(Khong et al.,2011；Wang et al.,2003)。所以相比TA151R，筛选的驯化株TA151R-1感染乳鼠后能模拟出重症，后期IL-6和IFN-γ的异常表达是引发乳鼠神经症状的主要原因，IL-10和TNF-α与免疫损伤的产生也有直接的关系。
4.5组织病理学检查(HE)
在最终确定建立驯化株TA151R-1感染模型最佳组合条件后，以此条件建立小鼠模型，选择3只得分为4或5的乳鼠将其处死，取肺脏、后肢肌、脑和心脏，10％中性福尔马林固定48h后经石蜡包埋制作石蜡切片用以进行HE染色，显微镜下检测结果。
如图7所示，通过HE染色对经肌肉注射感染TA151R-1的5日龄乳鼠的肺脏、后肢肌、脑和心脏进行病理学检查，发现各组织均出现了一定程度的损伤和炎症反应：①肺脏，HE染色发现TA151R-1感染会导致乳鼠发生病毒性肺炎，表现为弥漫性肺实质、肺泡和间质纤维化及大量淋巴细胞浸润(图7-A)，阴性对照组肺脏切片并未发现明显的病理变化(图7-B)。②骨骼肌，显示乳鼠感染病毒后骨骼肌出现淋巴细胞浸润和间质水肿，并表现出局部坏死和肌束断裂(图7-C)，阴性对照组切片并未发现明显的病理变化(图7-D)。③脑，检查显示脑局部发生明显的病理变化，镜下可见神经元变性坏死、基质炎性水肿及神经元数量减少的现象，局部筛状软化灶伴神经元减少(图7-E)，阴性对照组组织切片并未发现明显的病理变化(图7-F)。④心脏，发现乳鼠感染CVA10后5天局部出现间质水肿和脂肪变性，未呈现病毒性心肌炎病理变化(图7-G)，阴性对照组切片并未发现明显的病理变化(图7-H)。
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Claims (14)

1.一种柯萨奇病毒A10 型感染动物模型的构建方法，其特征在于，包括利用柯萨奇病毒A10 型病毒株感染动物的步骤，所述柯萨奇病毒A10 型病毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13394，分类命名为柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A10 型，病毒株编号为TA151R-1，保藏日期为2016年12月26日。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒株的感染剂量为0.1×103～2.0×103TCID50。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒株的感染剂量为0.2×103～1.2×103TCID50。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述病毒株的感染剂量为0.5×103TCID50。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒的接种途径为腹腔接种、颅腔接种或肌肉接种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述病毒的接种途径为腹腔接种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物的日龄为3-9日龄。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述动物的日龄为5日龄。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物为哺乳动物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物为大鼠或小鼠。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物为小鼠。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对所述病毒株进行培养的步骤，所述培养在感染动物之前。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述培养为将所述病毒株在细胞株中进行培养。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述细胞株为RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞或WI-38细胞。
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