TW202228747A - 草藥組成物、其製備方法及將其投藥用於預防或治療病毒感染的方法 - Google Patents

草藥組成物、其製備方法及將其投藥用於預防或治療病毒感染的方法 Download PDF

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Abstract

本揭露係提供一種草藥組成物，包括源自草藥原料之萃取物，該草藥原料包括艾草、茉草、魚針草、麥冬、魚腥草、桔梗、甘草、紫蘇和菊花中之至少一者。本揭露亦提供一種用於製備該草藥組成物之方法以及用於向有需要之個體投藥有效量之該草藥組成物以預防或治療病毒感染之方法。

Description

草藥組成物、其製備方法及將其投藥用於預防或治療病毒感染的方法
本揭露係關於一種草藥組成物，特別係關於一種用於預防或治療病毒感染之草藥組成物。
病毒感染已經確定且仍然是一種嚴重的動物及人類困擾。冠狀病毒(CoV)是病毒的一大家族，該病毒可引起範圍遍及普通感冒至更嚴重疾病之病症。例如，感染人類冠狀病毒株，CoV-229E、CoV-OC43、CoV-NL63及CoV-HKU1，經常導致輕度的自限性上呼吸道感染，例如普通感冒，如流鼻水、噴嚏、頭痛、咳嗽、喉嚨痛及發燒。其他感染可能導致更嚴重的疾病，例如嚴重急性呼吸道症候群(SARS)、中東呼吸道症候群(MERS)及嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，其導致嚴重急性呼吸道症候群、腎衰竭及死亡，並引發國際公共衛生緊急事件(global public health emergency)。特別是，由SARS-CoV-2引起的新冠病毒肺炎(coronavirus disease 2019(COVID-19))已在全球感染超過1.94億人，並造成超過4,160,000人死亡。
迄今為止，挽救生命的最快方法是重新利用FDA批准的現有藥物，該些藥物原本針對COVID-19的其他疾病。然而，大多數抗病毒藥物引起噁心、腹瀉、頭暈及發燒等嚴重的副作用，並且仍然沒有可用的或被證明對治療或預防個體的冠狀病毒感染有效的具體抗病毒治療方法。
因此，存在未滿足需求以提供有效且安全的療法來預防或治療冠狀病毒感染。
有鑒於此，本揭露提供一種草藥組成物，該草藥組成物能夠干擾冠狀病毒棘(S)蛋白與宿主細胞表面的ACE2之間的交互作用，並壓制冠狀病毒在宿主中進入和複製所必需的蛋白質之表現，從而保護個體免受病毒感染。
在本揭露之至少一實施例中，該草藥組成物包含源自草藥原料之萃取物和藥學上可接受之載體，其中，該草藥原料包含茉草(Ohwia caudata)和魚針草(Anisomeles indica(L.)O.Ktze.)中之至少一者。在一些實施例中，該茉草係茉草根、茉草葉或其組合。
在本揭露之至少一實施例中，該草藥組成物包含源自草藥原料之萃取物，該草藥原料包含茉草和魚針草中之至少一者，以及艾草(Artemisia argyi)、麥門冬(Ophiopogon japonicus)、魚腥草(Houttuynia cordata)、桔梗(Platycodon grandiflorus)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)、紫蘇(Perilla frutescens)和菊花(chrysanthemum)中之至少一者。在一些實施例中，該草藥組成物包含源自草藥原料之萃取物，該草藥原料包含茉草和魚針草中之至少一者，以及艾草、麥門 冬、魚腥草、桔梗、甘草、紫蘇和菊花。在一些實施例中，源自該草藥原料之該萃取物係水萃取物或酒精萃取物。
在本揭露之至少一實施例中，該草藥組成物包含源自草藥原料之萃取物，該草藥原料，基於其總重量，包含以重量計18%至25%之茉草和魚針草中之至少一者，以及以重量計18%至25%之艾草、以重量計10%至17%之麥門冬、以重量計10%至17%之魚腥草、以重量計10%至17%之桔梗、以重量計4%至11%之甘草、以重量計4%至11%之紫蘇和以重量計0.4%至11%之菊花中之至少一者。
在本揭露之至少一實施例中，該草藥組成物係藉由一種方法所製備，該方法包含：提供如上所述的該草藥原料；利用萃取液萃取該草藥原料以獲得粗萃取物，其中，該萃取液包含水、酒精或其組合；以及從該粗萃取物除去固體以獲得液體部分。
在本揭露之至少一實施例中，用於製備該草藥組成物之該方法復包含將該草藥原料磨碎成粉末或碎片。
在本揭露之至少一實施例中，萃取該草藥原料包含將該草藥原料在該萃取液中煮沸至少5分鐘，例如5分鐘至2小時，和/或包含將該草藥原料浸入該萃取液中至少10分鐘，例如10分鐘至1小時，該萃取液之溫度低於其沸點。在一些實施例中，該草藥原料與該萃取液之重量比係2：1至30：1，例如2：1、3：1、5：1、8：1、10：1、15：1、20：1、25：1和30：1。
在本揭露之至少一實施例中，用於製備該草藥組成物之該方法復包含將該液體部分濃縮以獲得濃縮萃取物。
在本揭露之至少一實施例中，提供一種用於在有需要之個體預防或治療病毒感染之方法。該方法包含向該個體投藥有效量之上述草藥組成物中之至少一者。
在本揭露之至少一實施例中，該病毒感染係由冠狀病毒引起。在一些實施例中，該冠狀病毒係嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸道症候群冠狀病毒(MERS-CoV)、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、小鼠肝炎病毒(MHV)或豬流行性下痢病毒(PEDV)。在一些實施例中，該冠狀病毒係SARS-CoV-2之變體，例如D614G突變株、B.1.1.7(α)突變株、B.1.351(β)突變株和P1突變株。
在本揭露之至少一實施例中，源自該草藥組成物中該草藥原料之該萃取物係以約25毫克/公斤/天至約2,500毫克/公斤/天之有效量投藥於該個體，例如約30毫克/公斤/天至約1,000毫克/公斤/天和約50毫克/公斤/天至約500毫克/公斤/天。
在本揭露中，於本揭露中所提供的草藥組成物作為抗病毒劑，可抑制病毒複製並減少宿主細胞中的病毒數量。此外，於本揭露中所提供的草藥組成物係安全且可解決先前技術中的副作用問題。因此，本揭露提供一種有效的對抗病毒感染的策略，其可用於控制冠狀病毒的爆發。
藉由閱讀以下實施例的描述並參考所附圖式，可以更全面地理解本揭露。
圖1A至圖1G示出經本揭露之草藥組成物抑制的病毒棘蛋白與ACE2受體的結合活性的長條圖。Ctrl.：無治療組；Ctrl.1：20毫克/毫升之阿比朵爾(Arbidol)；Ctrl.2：複合處方；Ctrl.3：蓮花清瘟膠囊(Lianhua Qingwen capsule)；Ctrl.4：橄欖(Olive)葉萃取物；Ctrl.5：接骨木(Elderberry)萃取物；Ctrl.6：源自花蓮慈濟醫院之中藥配方；Exp.1至Exp.6：本揭露之草藥組成物。
圖2A至圖2C分別示出經本揭露之草藥組成物治療之CTX、H9c2和HFL-1的細胞生存力的長條圖。Ctrl.：無治療組。*：p值<0.05，**：p值<0.01。
圖3A至圖3D示出經本揭露之草藥組成物治療之小鼠的血液參數的長條圖。圖3A示出血液中肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天冬胺酸轉胺酶(GOT)和丙胺酸轉胺酶(GPT)的量級。圖3B至圖3D分別示出血液中的肌酸酐(CRE)、總膽紅素(T-Bil)和葡萄糖(Glu)的量級。Ctrl.：無治療組；Exp.1：本揭露之草藥組成物。
圖4A和圖4B示出藉由西方墨點法(western blotting)分析的跨膜絲胺酸蛋白酶2(TRPMSS2)的表現。Ctrl.：無治療組；Ctrl.1：20毫克/毫升之阿比朵爾；Ctrl.2：複合處方；Ctrl.3：蓮花清瘟膠囊；Exp.1：本揭露之草藥組成物；L：低劑量，50微克/毫升；H：高劑量，150微克/毫升。
圖5A和圖5B示出藉由西方墨點法分析的FK506結合蛋白51(FKBP51)的表現。Ctrl.：無治療組；Ctrl.2：複合處方；Ctrl.3：蓮花清瘟膠囊；Exp.1：本揭露之草藥組成物；L：低劑量，50微克/毫升；H：高劑量，150微克/毫升。
圖6和圖7分別示出本揭露之草藥組成物(Exp.1)抑制的3CL蛋白酶和RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)的活性的長條圖。*：p值<0.05，**：p值<0.01，**：p值<0.001。
圖8A和圖8B分別示出本揭露之草藥組成物對Caco-2細胞和Calu-3細胞中SARS-CoV-2之野生型、D614G突變體、B.1.1.7突變體和B.1.13513突變體感染的抑制功效。Ctrl：無治療組；Exp.7至Exp.9：本揭露之草藥組成物。
圖9A至圖9D示出本揭露之草藥組成物對小鼠中SARS-CoV-2之野生型(圖9A)、D614G突變體(圖9B)、B.1.1.7突變體(圖9C)和B.1.1351突變體(圖9D)的感染的抑制功效。Ctrl.：無治療組；Ctrl.7：僅病毒治療；Exp.1-L：本揭露之草藥組成物之低劑量；Exp.1-H：本揭露之草藥組成物之高劑量。
圖10A示出根據本揭露之不同實施例之草藥組成物對Caco-2細胞中SARS-CoV-2的B.1.1.7突變體感染之抑制功效。Ctrl.：無治療組；Exp.1、Exp.10和Exp.11：本揭露之草藥組成物。
圖10B示出根據本揭露之不同實施例之草藥組成物對小鼠中SARS-CoV之P1突變體感染之抑制功效。Ctrl：無治療組；Ctrl.7：僅病毒治療；Exp.1和Exp.10：本揭露之草藥組成物。
以下將對本揭露實施例中所闡述的技術方案進行更清楚、完整的描述，明顯地，所描述之實施例僅是本揭露實施例之一部分且並非旨在限制。本 揭露亦可如不同實例中所描述的那樣實施或應用。所屬技術領域中具有通常知識者在無創作所獲得的其他實施例皆在本揭露之範疇。
進一步注意，如在本揭露中所用，單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」包含複數指稱對象，除非明確且毫無歧義地限於一個指稱對象。除非上下文另有明確指示，否則術語「或」與術語「和/或」可互換使用。
如本文所用，術語「包含(comprising)」或「包含(comprises)」用於指包括含在本揭露中之組成物、方法及其各自的組分，但對含括未指定之元件或步驟開放，無論是否必要。
本揭露內容係關於草藥組成物、製備該草藥組成物之方法以及藉由使用該草藥組成物在有需要之個體中用於預防或治療病毒感染之方法。
在至少一實施例中，藉由本揭露之方法治療的病毒感染可為由冠狀病毒(CoV)所引起。
CoV之結構蛋白包括核鞘(N)、小包膜(E)、基質(M)和三聚體棘(S)醣蛋白，它們對病毒體組裝和在感染期間完成病毒生命週期的功能至關重要。在一些實施例中，本揭露之用於預防或治療病毒感染之方法包含向有需要之個體投藥可阻斷冠狀病毒S蛋白和血管張力素轉化酶2(ACE2)受體之相互作用之草藥組成物，以及壓制冠狀病毒在宿主中進入和/或複製所必需的蛋白質的表現，從而影響感染病毒或加重疾病進展之風險。因此，本揭露之草藥組成物可具有抗病毒能力並可用於有效預防或治療病毒感染。
如本文所用，術語「預防(preventing)」或「預防(prevention)」是指對疾病或疾病之症狀或病症的預防或避免措施，其包括但不限於向個體施用或投藥一種或多種活性劑，該個體為尚未被診斷為患有該疾病或該疾病之症 狀或病症但可能易感或易患該疾病之患者。提供本揭露之預防措施以避免、預防或推遲疾病或疾病之症狀或病症的發生。
如本文所用，術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」是指獲得期望的藥理學和/或生理學效果，例如，抑制病毒進入和/或在宿主中複製。該效果在完全或部分預防疾病或其症狀或病症方面可為預防性的，或者在完全或部分治癒、緩解、弛緩、補救或改善疾病或歸因於該疾病或其症狀或狀況的不利影響方面可為治療性的。
如本文所用，術語「患者」及「個體」可互換使用。術語「個體」是指人或動物。個體的實例包括但不限於人、猴、小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔、倉鼠、牛、馬、豬、鹿、狗、貓、狐狸、狼、雞、鴯鶓(emu)、鴕鳥、和魚。在本揭露之一些實施例中，該個體是哺乳動物，例如，靈長類諸如人。
如本文所用，片語「有效量」是指對有需要之個體賦予期望的預防或治療效果(例如，減少宿主中的病毒量)所需的活性劑的量。如所屬技術領域中具有通常知識者所公認，有效劑量可以變化，這取決於投藥途徑、賦形劑的使用、與其他治療性治療聯用的可能性以及待治療的病症。
如本文所用，術語「投藥(administering)」或「投藥(administration)」是指藉由方法或途徑將活性劑設置於個體，而導致活性劑至少部分定位在期望的位點以產生期望的效果。本文所述的活性劑可藉由本領域已知的任何適當途徑投藥。例如，本揭露之草藥組成物藉由口服投藥給個體。
在至少一實施例中，本揭露之草藥組成物包含源自草藥原料之萃取物及其藥學上可接受之載體，其中，該草藥原料包含茉草和魚針草中之至少一 者。在一些實施例中，該草藥原料復包含艾草、麥門冬、魚腥草、桔梗、甘草、紫蘇、菊花及其任意組合。
在至少一實施例中，該草藥原料包含，基於該草藥原料之總重量，以重量計18%至25%(例如，18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%和25%)之茉草和魚針草中之至少一者，以重量計18%至25%(例如，18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%和25%)之艾草，以重量計10%至17%(例如，10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%和17%)之麥門冬，以重量計10%至17%(例如，10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%和17%)之魚腥草，以重量計10%至17%之桔梗，4%至11%(例如，4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%和11%)之甘草，以重量計4%至11%(例如，4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%和11%)之紫蘇和以重量計0.4%至11%(例如，0.4%、0.6%、0.8%、1%、3%、5%、7%、8%、9%、10%和11%)之菊花。
在至少一實施例中，草藥原料於約20克至約80克範圍包含5克至7克的茉草和魚針草中之至少一者、5克至7克之艾草、3克至5克之麥門冬、3克至5克之魚腥草、3克至5克之桔梗、1克至3克之甘草、1克至3克之紫蘇和0.1克至3克菊花。在一些實施例中，草藥原料可為範圍約20克至約70克、約20克至約60克、約20克至約50克或約20克至約40克。
在至少一實施例中，草藥組成物中的藥學上可接受之載體可為稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、助滑劑、表面活性劑或其任意組合。組成物中之載體是「可接受的」，這是因為其與組成物之活性劑相容(例如，能夠穩定活性劑)並且對要投藥之個體無害。一種或多種助溶劑可用作藥物賦形劑用以遞送活性成分。其他載體的實例包含膠體氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素和硫酸月桂鈉。 在一些實施例中，草藥組成物包含藥學上可接受之載體，該藥學上可接受之載體選自水、酒精、麥芽糊精、結晶纖維素及其任意組合。
已使用許多實例來闡明本揭露。以下實例不應視為對本揭露範圍之限制。
實例
為了更詳細地描述本揭露，將參考以下實例詳細描述本揭露提供之草藥組成物、製備方法和組成物之用途。本揭露中使用但在此未注釋的材料是可商購的。
製備實例1-1
取6g之艾草、6克之茉草、4g之麥門冬、4g之魚腥草、4g之桔梗、2克之甘草、2克之紫蘇和0.2g菊花並粉碎成粉末或小塊。將所有的草藥材料與600毫升水混合後，將混合物煮沸5至10分鐘。經過濾收集550毫升濾液(定性濾紙No.1，TOYO Advantec)，並由0.22微米無菌針筒過濾器過濾，以獲得草藥茶。乾燥後，測量所獲得之草藥茶中草藥材料之萃取物之含量為約20至40毫克/毫升。
製備實例1-2
取6g之艾草、6克之茉草、4g之麥門冬、4g之魚腥草、4g之桔梗、2克之甘草、2克之紫蘇和0.2g菊花並粉碎成粉末或小塊。將所有的草藥材料與600毫升水混合後，將混合物沸騰至大約60毫升。經過濾收集濾液(定性 濾紙No.1，TOYO Advantec)，並由0.22微米無菌針筒過濾器過濾，以獲得草藥茶濃縮物。乾燥後，測量所獲得之草藥茶濃縮物中草藥材料之萃取物之含量為約150至200毫克/毫升。
製備實例2
取20重量%之艾草、20重量%之茉草、13.33重量%之麥門冬、13.33重量%之魚腥草、13.33重量%之桔梗、6.67重量%之甘草、6.67重量%之紫蘇和6.67重量%之菊花，且草藥材料之總重量為約14克。將這些草藥材料粉碎成小塊，並裝入茶包中。將茶包浸入300毫升之熱水(100℃左右)中15至20分鐘，以獲得草藥茶。
製備實例3
取20重量%之艾草、20重量%之茉草、13.33重量%之麥門冬、13.33重量%之魚腥草、13.33重量%之桔梗、6.67重量%之甘草、6.67重量%之紫蘇和6.67重量%之菊花，且草藥材料之總重量為約28克。將這些草藥材料粉碎成小塊，並裝入茶包中。將茶包浸入600毫升之37%醇中30分鐘，隨後煮沸5至10分鐘，以獲得酒精萃取物。
製備實例4
取6g之艾草、6克之茉草、4g之麥門冬、4g之魚腥草、4g之桔梗、2克之甘草、2克之紫蘇和0.2g菊花並粉碎成粉末或小塊。將所有的草藥材料與600毫升水混合後，將混合物煮沸60分鐘。經過濾收集濾液(定性濾紙No.1， TOYO Advantec)，並由0.22微米無菌針筒過濾器過濾，接著煮沸用於濃縮以獲得水萃取物(30毫升，約5克)。
製備實例5
取6g之艾草、6克之茉草、4g之麥門冬、4g之魚腥草、4g之桔梗、2克之甘草、2克之紫蘇和0.2g菊花並粉碎成粉末或小塊。將所有的草藥材料與225.6毫升水(草藥材料總重量的8倍)混合後，將混合物煮沸60分鐘，接著經過濾以獲得第一濾液。將141.0毫升的水(草藥材料總重量的5倍)加入殘留物後，再煮沸60分鐘，接著經過濾以獲得第二濾液。合併第一和第二濾液並由0.22微米無菌針筒過濾器過濾，接著煮沸用於濃縮以獲得水萃取物(36.66毫升，約5克)。
製備實例6
在本實例中，藉由製備實例4或5中所描述之方法製備水萃取物，不同之處在於本實施例中將製備實施例4或5中使用之茉草的葉替換為茉草的根。
製備實例7
在本實例中，藉由製備實例4或5中所描述之方法製備水萃取物，不同之處在於將茉草替換為魚針草。
製備實例8
在本實施例中，藉由製備實例4或5中所描述之方法製備艾草水萃取物，不同之處在於本實施例中使用的草藥材料是單獨的6克艾草。
製備實例9
在本實施例中，藉由製備實施例4或5中所描述之方法製備茉草的水萃取物，不同之處在於本實施例中使用的草藥材料是單獨的6克茉草。
藥理學實例1：材料和方法
本揭露提供之草藥組成物用於預防或治療冠狀病毒感染之治療效果藉由以下藥理學實例2至7確定。試驗樣本取自製備實例1至9，作為對照組之對照樣本為如下所列：
對照組(Ctrl.)-無治療組；
對照組1(Ctrl.1)-阿比朵爾，亦稱為烏米非諾韋(Umifenovir)，是俄羅斯產的廣效抗病毒藥物，該藥物用於一些包膜和非包膜病毒；
對照組2(Ctrl.2)-複合處方，包含乳鐵蛋白、膠體銀、橄欖葉萃取物和接骨木萃取物；
對照組3(Ctrl.3)-蓮花清瘟膠囊，一種用於治療流感之傳統中藥劑型，且包含連翹(Forsythia suspensa)、忍冬(Lonicera japonica)、草麻黃(Ephedra sinica)、苦杏仁(bitter almond)、石膏(gypsum)、菘藍(Isatis indigotica)根、粗莖鱗毛蕨(Dryopteris crassirhizoma)、魚腥草(Houttuynia cordata)、廣藿香(Pogostemon cablin)、大黃(rhubarb)、紅景天(Rhodiola rosea)、薄荷醇(menthol)和甘草(Glycyrrhiza uralensis)；
對照組4(Ctrl.4)-橄欖葉萃取物；
對照組5(Ctrl.5)-接骨木萃取物；以及
對照組6(Ctrl.6)-源自花蓮慈濟醫院(臺灣)的中藥劑型，包含麥門冬、魚腥草、桔梗、菊花、甘草、紫蘇。
此外，這些實例中所使用的實驗方法為描述如下：
(1)抑制病毒棘蛋白與血管張力素轉化酶2(ACE2)受體結合之檢定
根據製造廠說明書，藉由使用COVID-19棘-ACE2結合檢定套組II(RayBiotech)測定試驗樣本用於抑制SARS-CoV-2棘蛋白與人類ACE2受體結合的效果。
簡而言之，所有試劑在使用前為置於室溫(約18℃至25℃)。接下來，將100微升的各試驗樣本加入至可拆卸的8孔板的孔中，並蓋上板密封膜，在室溫孵育2.5小時或在4℃溫和振盪培育過夜。然後棄去孔中的溶液，並以1×清洗液將各孔清洗4次。此外，藉由使用填充有1×清洗緩衝液(300微升)之多通道移液吸管或自動清洗器來清洗各孔。最後一次清洗後，藉由吸出或傾析除去剩餘的1×清洗緩衝液，將100微升的1×小鼠二級辣根過氧化酶(HRP)接合的IgG加入各孔，並在室溫溫和振盪培育1小時。之後，棄去各孔中的溶液，並如上所述清洗各孔。隨後，將100微升的3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)單步驟受質試劑(One-Step Substrate Reagent)加入各孔，並在室溫避光培育30分鐘並溫和振盪。最後，將50微升停止液加入各孔，立即讀取450奈米的光學吸光度。
(2)抑制病毒的3C-樣(3CL)蛋白酶之檢定
根據製造廠說明書，藉由使用SensoLyte SARS-CoV-2 3CL蛋白酶活性檢定套組(螢光)測定試驗樣本用於抑制SARS-CoV-2的3CL蛋白酶以抵抗病毒在人體細胞中複製的效果。
簡而言之，首先製備工作溶液。具體而言，藉由將10毫升的2×檢定緩衝液加入10毫升的去離子水以製備1×檢定緩衝液。藉由用檢定緩衝液將3CL蛋白酶受質稀釋100倍以製備3CL蛋白酶受質溶液。藉由用檢定緩衝液將3CL蛋白酶稀釋80倍以製備3CL蛋白酶稀釋劑。藉由用檢定緩衝液將10微米抑制劑溶液稀釋100倍以製備抑制劑(GC376)稀釋劑。
接下來，對於酶促反應，將試驗樣本和3CL蛋白酶稀釋劑分別以10微升/孔和40微升/孔的量加入微板盤孔中。同時，設置以下對照組孔：陽性對照組，包含3CL蛋白酶，不含試驗樣本；抑制劑對照組，包含3CL蛋白酶和抑制劑GC376；媒劑對照組，包含3CL蛋白酶和用於遞送試驗樣本的媒劑(例如，濃度不超過1%的二甲基亞碸(DMSO))；試驗樣本對照組，包含檢定緩衝液和試驗樣本；以及受質對照組，包含檢定緩衝液。藉由使用檢定緩衝液使所有對照組的總體積達到50微升。
隨後，將50微升的3CL蛋白酶受質溶液加入各孔，接著藉由動力學讀數或終點讀數測量螢光訊號。對於動力學讀數，立即在激發/發射(Ex/Em)=490奈米/520奈米連續測量螢光強度，並於每5分鐘記錄一次資料，持續30至60分鐘。對於終點讀數，將反應溶液在37℃孵育30至60分鐘並避免直接光照，接著在Ex/Em=490奈米/520奈米測量螢光強度。
(3)抑制病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)之檢定
根據製造廠說明書，藉由使用SARS-CoV-2 RNA聚合酶(RdRp)檢定套組(ProFoldin)測定試驗樣本用於抑制SARS-CoV-2的RNA聚合酶以抵抗病毒在人體細胞中複製的效果。
簡而言之，在96孔盤格式中進行SARS-CoV2 RdRp檢定。首先，將1微升DMSO中的試驗樣本加入96孔檢定盤的各孔中。此外，將41微升的H2O、5微升的10×緩衝液、1微升的50×模板和1微升50×RdRp所組成的48微升的預混物加入，隨後培育5分鐘。接著，將1微升50×NTP加入並於34℃培育60至120分鐘。反應結束後，將150微升的1×螢光染料溶液加入所培育的反應混合物中，並在5分鐘內於450奈米測量螢光強度。
(4)抑制跨膜絲胺酸蛋白酶2(TRPMSS2)和FK506結合蛋白51(FKBP51)之檢定
在10公分培養皿中培養4×105個Caco-2細胞24小時，將濃度為50微克/毫升(低劑量)或150微克/毫升(高劑量)的試驗樣本加入，並於12小時後，收集細胞以及藉由西方墨點法分析TRPMSS2和FKBP51的量級。藉此，測定試驗樣本用於抑制TRPMSS2以抵抗SARS-CoV-2附著和侵入宿主細胞中以及用於減少FKBP51以抵抗壓力反應的效果。
(5)SARS-CoV-2假型慢病毒檢定
由中央研究院(臺灣)RNAi核心提供SARS-CoV-2假型慢病毒，其是一種慢病毒，在該慢病毒的基因組中具有綠色螢光蛋白基因或螢光酶基因，並在該慢病毒的表面包膜上表現SARS-CoV-2棘蛋白。將人類腸道上皮細胞株Caco-2和人類肺細胞株Calu-3培養12小時，接著與10微克/毫升或30微克/毫升的試驗樣本共同培養24小時，以用於測定試驗樣本在體外預防SARS-CoV-2感染的效果。之後，將所培養的細胞以SARS-CoV-2假型慢病毒的野生型、D614G突變體、α突變體(B.1.1.7)或β突變體(B.1.351)感染。24小時後，用螢光顯微鏡觀察被感染的細胞。
另一方面，藉由胃管灌食法(16.22毫克或48.66毫克/0.3毫升/小鼠/天)用試驗樣本對SKH2/J小鼠進行治療連續7天，以用於體內測定。在第4天至第6天，以Aerogen Solo噴霧器(10微升的1.2×106顆粒/小鼠/天)由鼻內遞送假型慢病毒，使小鼠感染SARS-CoV-2的野生型、D614G突變體、α突變體(B.1.1.7)、β突變體(B.1.351)或P1突變體(巴西變體)。在第8天，藉由體內成像系統(IVIS)測定小鼠的病毒感染。
Aerogen Solo噴霧器的參數為如下。流速：大於0.2毫升/分鐘(平均：約0.38毫升/分鐘)；粒徑：(1)規格範圍：1微米至5微米，平均值：3.1微米，由安德森級聯衝擊採樣器測得；(2)規格範圍：1.5微米至6.2微米，平均值：3.9微米，由Marple 298級聯衝擊採樣器測定。根據EN 13544-1標準，起始劑量為2毫升，以及氣溶膠輸出速度為0.30毫升/分鐘。此外，該氣溶膠輸出為1.02毫升/劑，以及餘氣量為每3毫升劑量小於0.1毫升。
(6)細胞毒性和細胞生存力檢定
為了測定試驗樣本的體外毒性，進行MTT(溴化-3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)檢定以評估細胞活性和增生。具體而言，星形細胞CTX、心肌細胞H9c2和肺纖維芽細胞HFL-1為與試驗樣本以31.25微克/毫升至4,000微克/毫升的濃度共同培養24小時。之後，將MTT加入到培養物中並培育2小時。藉由將MTT晶體溶解在二甲基亞碸(DMSO)中，藉由酶聯免疫吸附測定(ELISA)讀取器測量590奈米的吸光度。
另一方面，藉由胃管灌食法用試驗樣本以5,200毫克/公斤/天的劑量對C57BL/6小鼠進行治療，以用於測定試驗樣本的體內毒性。24小時後，測定小鼠血液中肌酸磷酸激酶、乳酸脫氫酶、天冬胺酸轉胺酶、丙胺酸轉胺酶、肌酸酐、總膽紅素和葡萄糖的量級。
藥理學實例2：抑制病毒棘蛋白與ACE2受體的結合
對由製備實施例4或5(Exp.1，6至30毫克/毫升)所製備的草藥組成物用於抑制SARS-CoV-2棘蛋白與人類ACE2受體結合的效果進行測定，並與阿比朵爾(Ctrl.1，20毫克/毫升)、複合處方(Ctrl.2)、蓮花清瘟膠囊(Ctrl.3)、橄欖葉萃取物(Ctrl.4)、接骨木萃取物(Ctrl.5)、源自花蓮慈濟醫院的中藥劑型(Ctrl.6)進行比較。
這些結果顯示在圖1A至圖1F，表明與Ctrl.2至Ctrl.6相比，Exp.1對於病毒棘蛋白與ACE2受體結合展現出顯著提高的阻斷活性。此外，參考圖1B和圖1C，用6毫克/毫升和12毫克/毫升的Exp.1治療與用24毫克/毫升和30毫克/毫升的Ctrl.3治療的棘蛋白的結合活性相當；也就是說，在相同的投藥劑量下，本申請的草藥組成物的阻斷活性比蓮花清瘟膠囊高約2.5至4倍。另外， 圖1C顯示18毫克/毫升的Exp.1可達到比20毫克/毫升的阿比朵爾更高的阻斷效果，這意味著低劑量的本揭露之草藥組成物可有效地阻斷病毒棘蛋白與ACE2受體之間的相互作用，從而能夠避免因使用一般抗病毒藥物(例如阿比朵爾)所造成的噁心、腹瀉和頭暈等嚴重的副作用。
此外，圖1G顯示鑒於抑制SARS-CoV-2棘蛋白與人類ACE2受體結合的效果，比較由不同萃取方法製備的草藥組成物，其中，將由製備實例4或5所製備的水萃取物標記為Exp.1；將由製備實例1所製備的草藥茶標標記為Exp.2；將由製備實例2所製備的草藥茶標記為Exp.3；將由製備實例3所製備的酒精萃取物標記為Exp.4；將由製備實例8所製備的艾草萃取物標記為Exp.5；以及將由製備實例9所製備的茉草萃取物標記為Exp.6。這些結果表明，藉由不同萃取方法製備的本揭露之草藥組成物亦可阻斷病毒棘蛋白與ACE2受體之間的相互作用。
藥理學實例3：本揭露之草藥組成物的安全性
藉由MTT檢定和動物模型測定由製備實例4或5(Exp.1)所製備的草藥組成物的毒性。
細胞株CTX、H9c2和HFL-1的MTT試驗結果分別如圖2A至2C所示，這些結果示出低於1,000微克/毫升的量的本揭露之草藥組成物不會對腦、心和肺的生理活性產生影響。由於本揭露之草藥組成物作為製備實例1-1所提供的可飲用草藥茶，包含20至40毫克/毫升的草藥原料萃取物，這暗示了即使70公斤的成年人類大量飲用5.6升的草藥組成物，本揭露之草藥組成物也不會引起毒性。
在動物模型中，對C57BL/6小鼠以5,200毫克/公斤/小鼠/天的劑量餵食本揭露之草藥組成物，這是一個人每日推薦攝入量的20倍。結果為，肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天冬胺酸轉胺酶(GOT)、丙胺酸轉胺酶(GPT)、肌酸酐(CRE)、總膽紅素(T-Bil)和葡萄糖(Glu)在小鼠血液中的量級顯示於下表1以及圖3A和圖3B。CPK和LDH是心和腦功能的指標；GOT和GPT是肝功能指標；CRE是腎功能的指標；T-Bil包含直接膽紅素和間接膽紅素，其是膽功能的指標。這些結果表明，用和不用草藥組成物治療的小鼠之間的血液參數沒有顯著差異，這意味著本揭露之草藥組成物即使在極高的劑量下也不會導致不利影響。
表1.投藥本揭露之草藥組成物後小鼠的血液參數
Figure 110146572-A0202-12-0020-1
藥理學實例4：抑制TRPMSS2和FKBP51的表現量
對由製備實例4或5(Exp.1)所製備的草藥組成物用於抑制TRPMSS2和FKBP51表現的效果進行測定，並與阿比朵爾(Ctrl.1，20毫克/毫升)、複合處方(Ctrl.2)、蓮花清瘟膠囊(Ctrl.3)進行比較。
抑制TRPMSS2表現量的結果如圖4A和圖4B所示，這些結果表明與Ctrl.2和Ctrl.3相比，Exp.1顯著抑制了TRPMSS2的表現。此外，當Exp.1的投藥劑量從50微克/毫升(低劑量，L)增加至150微克/毫升(高劑量，H)時，TRPMSS2表現降低70%，而當投藥時劑量的Ctrl.3從50微克/毫升(低劑量，L)增加到150微克/毫升(高劑量，H)，TRPMSS2表現僅降低10%。也就是說，與蓮花清瘟膠囊相比，本揭露之草藥組成物可抑制TRPMSS2表現的功效高出7倍，這意味著本揭露之草藥組成物在阻斷病毒進入宿主細胞方面的有效作用。
FKBP51表現的抑制結果顯示如圖5A和圖5B所示，當Exp.1的投藥劑量從50微克/毫升(低劑量，L)增加至150微克/毫升(高劑量，H)時，FKBP51的表現降低40%。FKBP51是壓力的分子鏈聯，因此這些結果暗示本揭露之草藥組成物具有對抗可能由COVID-19引起的情緒壓力、焦慮和抑鬱的作用。
藥理學實例5：抑制3CL蛋白酶和RdRp的活性
將由製備實例4或5(Exp.1)所製備的草藥組成物用於抑制SARS-CoV-2的3CL蛋白酶和RdRp的活性的效果進行測定。
結果分別如圖6(3CL)和圖7(RdRp)所示，這些結果表明本揭露之草藥組成物以劑量依賴性方式將RdRp和3CL蛋白酶的活性降低35%至40%。對於SARS-CoV-2而言，3CL參與多聚蛋白(polyprotein)的裂解，產生病毒生命週期至關重要的病毒蛋白，且使用RdRp以用於病毒基因體的複製和病毒基因的轉錄。因此，這些結果暗示本揭露之草藥組成物對COVID-19的治療有效果。
藥理學實例6：預防SARS-CoV-2感染
本揭露之草藥組成物用於預防SARS-CoV-2感染的效果是藉由使用SARS-CoV-2假型慢病毒的野生型和變體來進行測定。
對於體外試驗，待試驗的草藥組成物為如下：Exp.7，含有1.5克由製備例4或5所製備的水萃取物和1.5克的賦形劑(麥芽糊精和結晶纖維素的混合物)(水萃取物的濃度：10微克/毫升)；Exp.8，含有3克由製備例4或5所製備的水萃取物和3克的賦形劑(麥芽糊精和結晶纖維素的混合物)(水萃取物的濃度：30微克/毫升)；及Exp.9，含有3g製備例4或5製備的水萃取物(水萃取物的濃度：30微克/毫升)。將各組成物加入至Caco-2細胞或Calu-3細胞。24小時後，加入野生型假型慢病毒及其三種變體(即，D614G突變體、B.1.1.7突變體和B.1.351突變體)。
結果如圖8A(Caco-2)和圖8B(Calu-3)所示，這些結果表明本揭露之草藥組成物對Caco-2而言可將野生型和變體的病毒感染降低51%至74%，以及對Calu-3而言可降低64%至86%。
治療對於體內檢定，連續7天藉由胃管灌食法將由製備實例4或5所製備的草藥組成物以16.22毫克/0.3毫升/小鼠/天(Exp.1-L)或48.66毫克/0.3毫升/小鼠/天(Exp.1-H)劑量對SKH2/J小鼠投藥，並在第4天至第6天，藉由鼻內投藥將野生型假型慢病毒及其三種變體(即，D614G突變體、B.1.1.7突變體和B.1.351突變體)對小鼠投藥。
結果如圖9A(野生型)、圖9B(D614G突變體)、圖9C(B.1.1.7突變體)和圖9D(B.1.351突變體)所示，其中，Ctrl.是沒有任何藥物或病毒治 療的小鼠組，且Ctrl.7是僅以假型慢病毒處裡的小鼠組。如圖9A所示，由本揭露之草藥組成物治療的小鼠在牠們的組織中表現出較低的亮度量級，這意味著本揭露之草藥組成物可有效地防止野生型SARS-CoV-2的感染。
此外，如圖9B所示，在Exp.1-L和Exp.1-H的小鼠中D614G突變體的感染為分別降低5倍和25倍，這意味著本揭露之草藥組成物可有效地防止D614G突變體的感染。
如圖9C所示，Ctrl.7的小鼠患有由B.1.1.7突變體造成的嚴重肺部感染(如箭頭所示)，而Exp.1-L和Exp.1-H可有效地防止B.1.1.7突變體強烈感染肺部(如圓圈區域所示)。
如圖9D所示，B.1.351突變體在Exp.1-L和Exp.1-H的感染減少；特別地，如圓圈區域所示，由B.1.351突變體引起的鼻和腸道感染在Exp.1-L和Exp.1-H中顯著減少。
上述的這些結果表明，本揭露之草藥組成物可顯著預防野生型和突變體變體的病毒感染。
藥理學實例7：含有可替代成分的本揭露之草藥組成物的效果
在這個實例中，將由製備實例4或5(即，包含茉草葉萃取物的那些)所製備的草藥組成物用於預防SARS冠狀病毒-2感染的效果，與由製備實例6(即，包含茉草根萃取物的那些)所製備的組成物進行比較。另外，由於茉草和魚針草通常可被標識為相同的中藥材料，由製備實例4或5所製備的草藥組成物的效果，也與由製備實例7(即，包含魚針草萃取物的那些)所製備的 組成物進行比較。該比較是藉由用於預防SARS-CoV的-2假型慢病毒感染的這些草藥組成物的效果進行測定。
結果如圖10A和圖10B所示，其中，包含茉草葉萃取物的草藥組成物被標記為Exp.1；含有茉草根萃取物的草藥組成物被標記為Exp.10；含有魚針草萃取物的草藥組成物被標注為Exp.11；以及Ctrl.7是僅用SARS-CoV-2假型慢病毒的P1突變體治療的小鼠組。
在圖10A中，使用SARS-CoV-2假型慢病毒的B.1.1.7突變體感染用30微升/毫升試驗樣本治療的Caco-2細胞，結果顯示，與Exp.1相同，Exp.10和Exp.11亦可分別減少約48%和約64%的病毒感染。
在圖10B中，在P1突變體感染前，將試驗樣本以48.66毫克/0.3毫升/小鼠/天的劑量餵食SKH2/J小鼠，結果顯示，在Exp.1和Exp.10中，P1突變體在小鼠中的感染減少分別減少25倍和40倍。
上述的這些結果表明，含有茉草根萃取物或魚針草萃取物的草藥組成物亦可顯著預防SARS-CoV-2感染。
雖然上面已經詳細描述本揭露的一些實施例，但所屬技術領域中具有通常知識者可對所示出的實施例進行各種修飾和改變，而基本上不背離本揭露的教導及優點。因此，這樣的修飾和改變包含在如所附申請專利範圍中所闡述的本揭露之範圍內。

Claims (20)

  1. 一種用於預防或治療病毒感染的草藥組成物，包含源自草藥原料之萃取物和藥學上可接受之載體，其中，該草藥原料包含茉草和魚針草中之至少一者。
  2. 如請求項1所述之草藥組成物，其中，該茉草係茉草根、茉草葉或其組合。
  3. 如請求項1所述之草藥組成物，其中，該草藥原料復包含艾草、麥門冬、魚腥草、桔梗、甘草、紫蘇和菊花中之至少一者。
  4. 如請求項3所述之草藥組成物，其中，源自該草藥原料之該萃取物係水萃取物或酒精萃取物。
  5. 如請求項3所述之草藥組成物，其中，該草藥原料包含，基於其總重量，以重量計18%至25%之茉草和魚針草中之至少一者，以及以重量計18%至25%之艾草、以重量計10%至17%之麥門冬、以重量計10%至17%之魚腥草、以重量計10%至17%之桔梗、以重量計4%至11%之甘草、以重量計4%至11%之紫蘇和以重量計0.4%至11%之菊花中之至少一者。
  6. 如請求項3所述之草藥組成物，其中，該草藥原料包含5克至7克之茉草和魚針草中之至少一者，以及5克至7克之艾草、3克至5克之麥門冬、3克至5克之魚腥草、3克至5克之桔梗、1克至3克之甘草、1克至3克之紫蘇和0.1克至3克之菊花中之至少一者。
  7. 一種製備如請求項1所述的草藥組成物之方法，包含：
    提供包括茉草和魚針草中之至少一者的草藥原料；
    以萃取液萃取該草藥原料以獲得粗萃取物，其中，該萃取液含有水和酒精中之至少一者；以及
    去除該粗萃取物中之固體以獲得液體部分。
  8. 如請求項7所述之方法，其中，該草藥原料復包含艾草、麥門冬、魚腥草、桔梗、甘草、紫蘇和菊花中之至少一者。
  9. 如請求項7所述之方法，其中，該萃取包含將該草藥原料在該萃取液中煮沸至少5分鐘。
  10. 如請求項7所述之方法，其中，該萃取包含將該草藥原料浸入溫度低於其沸點之該萃取液中至少10分鐘。
  11. 如請求項7所述之方法，其中，該草藥原料與該萃取液之重量比係2：1至30：1。
  12. 如請求項7所述之方法，復包含濃縮該液體部分以獲得該草藥原料之濃縮萃取物。
  13. 一種用於在有需要之個體預防或治療病毒感染之方法，包含向該個體投藥有效量之如請求項1所述的草藥組成物。
  14. 如請求項13所述之方法，其中，該病毒感染係由冠狀病毒引起。
  15. 如請求項14所述之方法，其中，該冠狀病毒係嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(SARS-CoV)、中東呼吸道症候群冠狀病毒(MERS-CoV)、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)、小鼠肝炎病毒(MHV)或豬流行性下痢病毒(PEDV)。
  16. 如請求項15所述之方法，其中，該冠狀病毒係新型冠狀病毒之變體。
  17. 如請求項13所述之方法，其中，該草藥組成物中源自該草藥原料之該萃取物係以約25毫克/公斤/天至約2,500毫克/公斤/天之有效量投藥於該個體。
  18. 如請求項17所述之方法，其中，該草藥組成物中源自該草藥原料之該萃取物係以約50毫克/公斤/天至約500毫克/公斤/天之有效量投藥於該個體。
  19. 如請求項13所述之方法，其中，該草藥組成物干擾病毒之棘蛋白與血管張力素轉化酶2(ACE2)受體之結合。
  20. 如請求項13所述之方法，其中，該草藥組成物抑制3CL蛋白酶、RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)、跨膜絲胺酸蛋白酶2(TRPMSS2)和FK506結合蛋白5(FKBP5)中之至少一者之表現。
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