TWI764284B - 使用喹啉化合物來對抗冠狀病毒感染的方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種對抗冠狀病毒感染的方法，其包括對一有此需要的個體投藥以一有效量的6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸或其藥學上可接受的鹽類。

Description

使用喹啉化合物來對抗冠狀病毒感染的方法

本發明是有關於一種使用6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸{6-bromo-2-[1-(2,5-dimethylphenyl)-5-methyl-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline-4-carboxylic acid}來對抗冠狀病毒感染的方法。

6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸是一種已知被歸類為喹啉化合物的藥物，其以下列式(I)來表示：

已經被報導的是：6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸對多種RNA病毒皆展現出抗病毒活 性，諸如腸病毒71(Enterovirus 71,EV71)、柯薩奇病毒A6、A10、A16與B3(Coxsackie viruses A6,A10,A16,and B3)、A型與B型流感(influenza types A and B)，以及人類鼻病毒血清型2(human rhinovirus serotype 2,HRV2)。6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸在感染後早期階段可以有效地抑制RNA-依賴性RNA聚合酶3D蛋白(RNA-dependent RNA polymerase 3D proteins)與病毒複製，並且降低病毒RNA累積位準(John T.A.Hsu et al.(2012),Antimicrob Agents Chemother.,56(2)：647-657；與Arul Balaji Velu et al.(2014),Antiviral Research,112,18-25)。

冠狀病毒(Coronaviruses)是一群相關聯的RNA病毒(RNA viruses)，其感染包括人類在內的各種動物，諸如嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、中東呼吸道症候群冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、人類冠狀病毒229E(human coronavirus 229E,HCoV-229E)。冠狀病毒疾病2019(Coronavirus disease 2019,COVID-19)是一種傳染性疾病，由近期被發現為一種新穎的冠狀病毒的嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)所引起。主要症狀包括呼吸道症狀，諸如高於38℃的發燒、咳嗽、呼吸急促，以及呼吸困難。可能 會觀察到諸如嗅覺和味覺的喪失、腹瀉、頭痛、發冷、食慾不振、全身不適以及意識障礙(impaired consciousness)的症狀。目前，對於COVID-19尚無有效的治癒性治療(curative treatment)被建立，而是以對症治療(symptomatic treatment)為核心。

發明概要

因此，本發明之目的是提供一種對抗冠狀病毒感染的方法，其可以減低先前技術的至少一個缺點。

依據本發明，該方法包括對一有此需要的個體投藥以一有效量的6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸或其藥學上可接受的鹽類。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

本發明提供一種對抗冠狀病毒感染的方法，其包括對一有此需要的個體投藥以一有效量的6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲 基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸(下稱“HP520-3”)或其藥學上可接受的鹽類。

如本文中所用的，術語“對抗冠狀病毒感染(against coronavirus infection)”或“抗-冠狀病毒感染(anti-coronavirus infection)”意指預防冠狀病毒所造成的感染、抑制冠狀病毒的複製，和/或治療和/或預防由冠狀病毒所引起的傳染性疾病。

如本文中所用的，術語“投藥(administration)”或“投藥(administering)”意指藉由任何合適的途徑將一預定的活性成分導入、提供或遞送至一個體中以執行其預期功能。

如本文中所用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的動物，諸如人類、猴子、牛、綿羊、馬、豬、山羊、狗、貓，小鼠，以及大鼠。在某些具體例中，該個體是一人類。

如本文中所用的，術語“藥學上可接受的鹽類(pharmaceutically acceptable salt)”意指在對該個體投藥時能夠(直接地或間接地)提供如本文所述的化合物(亦即，HP520-3)而沒有過度的毒性、刺激性、過敏反應以及類似之物的任何鹽類。特別是，“藥學上可接受的鹽類”可以包含由聯邦或州政府的監管機構所批准，或是美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍被認可之供用於動物(特別是人類)的藥典中所列示的那些者。鹽類的製備可以藉由本技藝中所熟知的方法而被進行。

例如，HP520-3的藥學上可接受的鹽類可以是酸加成鹽類、鹼加成鹽類或金屬鹽類，且它們可以藉由常規的化學方法被合成自含有鹼性或酸性部分的母化合物。一般而言，該等鹽類，例如，是藉由在水或一有機溶劑或它們的混合物之中，使這些化合物在游離酸或鹼的形式下與一化學計量含量之合適的鹼或酸反應而被製得。酸加成鹽類的實例可包括：礦物酸加成鹽類，諸如，例如，鹽酸鹽(hydrochloride)、氫溴酸鹽(hydrobromide)、氫碘酸鹽(hydroiodide)、硫酸鹽(sulfate)、硝酸鹽(nitrate)，以及磷酸鹽(phosphate)；以及有機酸加成鹽類，諸如，例如，醋酸鹽(acetate)、順丁烯二酸鹽(maleate)、反丁烯二酸鹽(fumarate)、檸檬酸鹽(citrate)、草酸鹽(oxalate)、琥珀酸鹽(succinate)、酒石酸鹽(tartrate)、蘋果酸鹽(malate)、苯乙醇酸(mandelate)、甲烷磺酸鹽(methanesulphonate)、對甲苯磺酸鹽(p-toluenesulphonate)、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulphonate)，以及1,2-乙二磺酸鹽(1,2-ethanedisulphonate)。鹼加成鹽類的實例可包括無機鹽類，諸如，例如，銨鹽(ammonium)；以及有機鹽類，諸如，例如，乙二胺鹽(ethylenediamine salt)、乙醇胺鹽(ethanolamine salt)、N，N-二烷基乙醇胺鹽(N,N-dialkylenethanolamine salt)、三乙醇胺鹽(triethanolamine salt)、膽鹼鹽(choline salt)、還原葡糖胺鹽(glucamine salt)，以及鹼性胺基酸鹽(basic amino acids salts)。金屬鹽類的實例可包括，例如，鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋁鹽，以及鋰鹽。

依據本發明，該冠狀病毒感染可由一選自於下列所構成之群組中的冠狀病毒所引起：嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)、中東呼吸道症候群冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、人類冠狀病毒229E(human coronavirus 229E,HCoV-229E)，以及它們的組合。

依據本發明，HP520-3或其藥學上可接受的鹽類可藉由使用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於，例如，非經腸道的(parenteral)或口服投藥(oral administration)之劑型(dosage form)的藥學組成物。適合投藥的劑型包括，但不限於：注射劑(諸如，無菌的水溶液或分散液)、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablets)、片劑(troches)、口含錠(lozenges)、膠囊(capsules)、散粉劑(dispersible powder)、顆粒劑(granule)、溶液(solutions)、懸浮液(suspensions)、乳劑(emulsions)、糖漿(syrup)、酏劑(elixirs)、濃漿(slurry)，以及類似之物。

依據本發明，該藥學組成物可經由一選自於下列所構成之群組中的非經腸道途徑來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、胸膜內注射(intrapleural injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、動脈內注射(intraarterial injection)、關節內注射(intraarticular injection)、滑液內注射(intrasynovial injection)、椎管內注射(intrathecal injection)、顱內注射(intracranial injection)，以及舌下給藥(sublingual administration)。

依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技藝中之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑包括一或多者下列的試劑：溶劑(solvents)、緩衝液(buffers)、乳化劑(emulsifiers)、懸浮劑(suspending agents)、分解劑(decomposers)、崩解劑(disintegrating agents)、分散劑(dispersing agents)、黏結劑(binding agents)、賦形劑(excipients)、安定劑(stabilizing agents)、螯合劑(chelating agents)、稀釋劑(diluents)、膠凝劑(gelling agents)、防腐劑(preservatives)、填料(fillers)、潤濕劑(wetting agents)、潤滑劑(lubricants)、吸收延遲劑(absorption delaying agents)、脂質體(liposomes)，以及類似之物。前述試劑的選用與數量是落在熟習此技藝者的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該藥學組成物的投藥劑量與投藥頻率會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性、投藥途徑，以及要被治療的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。該藥學組成物的每日劑量可以單一劑量或以數個劑量而被投藥。

依據本發明，包含有HP520-3的藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被配製成一適合施用於手或皮膚的外部製劑(external preparation)[諸如手部消毒劑(hand sanitizer)或手部清潔劑(hand washing agent)]。該外部製劑包括，但不限於：乳劑(emulsion)、肥皂(soap)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)，以及滴劑(drop)。

依據本發明，包含有HP520-3的藥學組成物易於施用、低毒性、環境友善，且不具生物累積性(bioaccumulative)，故可被使用作為環境消毒劑(environmental disinfectant)[諸如表面清潔劑(surface cleaner)、清潔劑(detergent)，以及滅菌劑(sterilant)]。

依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有供作為一協同抗病毒劑(synergistic antiviral agent)的瑞德西韋(remdesivir)。

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 一般實驗材料： 1. Vero E6細胞的來源與培養

非洲綠猴腎臟細胞(African green monkey kidney cells)(Vero E6)是得自於長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院(Chang Gung Medical Foundation,the Linkou Chang Gung Memorial Hospital)(台灣)。將Vero E6細胞培養在一10-cm培養皿(10-cm Petri dish)中，其中含有添加有10% FBS(Cat.No.26140-079,Gibco)的DMEM(Cat.No.12000-061,Gibco)(下稱“E10培養基”)。將Vero E6細胞培養在一培養條件被設定為37℃與5% CO₂的培養箱中。每2至3天進行培養基更換。當所培養的細胞達到80%-90%匯聚(confluence)時進行細胞繼代(cell passage)。

2.病毒株

在下面的實驗中所使用的嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)與人類冠狀病毒229E(human coronavirus 229E, HCoV-229E)是由長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院(台灣)所提供。

SARS-CoV-2與HcoV-229E各自被溶於經補充有2%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Cat.No.26140-079,Gibco)的杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(Cat.No.12000-061,Gibco)(下稱“E2培養基”)，以製備一具有5.73×10⁶pfu/mL之病毒量的SARS-CoV-2溶液以及一具有6.6×10⁶pfu/mL之病毒量的HcoV-229E溶液。此兩種病毒溶液被保存在-80℃的冷凍庫中以供進一步的實驗。

實施例1. 6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸對抗HCoV-229E的效用之評估 實驗方法：

Vero E6細胞被分成6組，包括一個正常對照組、一個病理對照組，以及四個實驗組(亦即，實驗組1至4)。將各組Vero E6細胞以2x10⁴細胞/井被培育在含有100μL的E2培養基的96-井培養盤的各井中，繼而在培養箱(37℃,5% CO₂)中進行培養歷時24小時。之後，移除各井中的培養基，對實驗組1至4中的細胞分別預處理以濃度為39、78、156，以及312nM的6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸(亦即，HP520-3)(Cat.No. Molport-020-176-277,Molport Inc.)，接著加入150μL之在“一般實驗材料”的第2點當中所配製的HcoV-229E溶液。

此外，對病理對照組的細胞添加以50μL的E2培養基，繼而加入150μL之在“一般實驗材料”的第2點當中所製得的HcoV-229E溶液。對正常對照組的細胞添加以200μL的E2培養基，並且不予以處理以在“一般實驗材料”的第2點當中所製得的HcoV-229E溶液。

各組在培養箱(37℃,5% CO₂)中培養歷時96小時。移除各井中的液體，接著加入50μL的3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯四唑溴化物{3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide}(MTT)。在培養箱(37℃,5% CO₂)中培養歷時2小時後，對所得到的各個細胞培養物添加以150μL的二甲亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)，繼而藉由ELISA讀取儀(ELISA reader)將所得到的混合物拿來進行在590nm的波長下的吸光值之測定。

細胞可活性比率(%)是藉由下列公式(I)而被計算：A=(B/C)×100 (I)

其中：A=細胞可活性比率(%)

B=各組的OD₅₉₀值

C=正常對照組的OD₅₉₀值

此外，50%有效濃度(EC₅₀)是藉由會降低經處理的細胞之吸光值達50%(與病理對照組相較之下)的活性成分濃度(n=3)而從所繪製之劑量-反應曲線的線性部份被測定出。實驗數據是以平均值±SD[標準偏差(standard deviation)]來表示。

結果：

圖1顯示各組的細胞可活性比率。從圖1可見，實驗組1至4中所測得之細胞可活性比率是顯著地高於病理對照組中所測得者，並且HP520-3展現劑量-相關的抗病毒效用。此外，HP520-3的EC₅₀值為140.7±15.45nM。

總結上述測試結果，明顯的是：HP520-3可有效地對抗HcoV-229E感染。

實施例2. HP520-3對抗SARS-CoV-2的效用之評估 A.病毒溶菌斑減少試驗(Viral plaque reduction assay)：

Vero E6細胞被分成3組，包括一個病理對照組與兩個實驗組(亦即，實驗組1至2)。將各組Vero E6細胞以4x10⁵細胞/井培育在含有0.5mL的E2培養基的24-井培養盤的各井中，繼而在培養箱(37℃,5% CO₂)中進行培養歷時24小時。之後，移除各井中的培養基，以0.01的感染倍數(multiplicity of infection,m.o.i)之SARS-CoV-2來感染各組的細胞。在培養箱(37℃,5% CO₂)中培養 歷時1小時後，移除各井中的液體，並且以磷酸鹽-緩衝的生理鹽水(phosphate-buffered saline,PBS)來清洗各組經SARS-CoV-2-感染的Vero E6細胞兩次。

此後，對實驗組1的經SARS-CoV-2-感染的Vero E6細胞覆蓋以含有1.4%甲基纖維素(methyl cellulose)與1μM HP520-3的E2培養基，對實驗組2的經SARS-CoV-2-感染的Vero E6細胞覆蓋以含有1.4%甲基纖維素與10μM HP520-3的E2培養基，以及對病理對照組的經SARS-CoV-2-感染的Vero E6細胞覆蓋以含有1.4%甲基纖維素的E2培養基。

在培養箱(37℃,5% CO₂)中培養歷時72小時後，在室溫下以0.5mL的4%三聚甲醛(paraformaldehyde)溶液來固定各組的細胞歷時1小時。之後，以1%結晶紫(crystal violet)來對各井中經固定的細胞進行染色歷時20分鐘。以水洗滌經染色的細胞之後，藉由肉眼觀察來分析各井中的病毒溶菌斑(viral plaques)的分佈，並且計數各組病毒溶菌斑的數量。

結果：

參閱圖2至圖3，實驗組1至2中所測得的病毒溶菌斑數量分別低於病理對照組中所測得者，顯示：HP520-3能在經SARS-CoV-2感染的宿主細胞中有效地減少病毒複製。

B.病毒基因表現的定量測定：

Vero E6細胞被分成4組，包括一個病理對照組和三個實驗組(亦即，實驗組1-3)。將各組Vero E6細胞以4x10⁵細胞/井培育在含有100μL的E10培養基的24-井培養盤的各井中，繼而在培養箱(37℃,5% CO₂)中培養歷時24小時。之後，移除各井中的培養基，對實驗組1-3的細胞分別預處理以濃度為0.3125μM、1.25μM，以及5μM的HP520-3，繼而處理以0.01的感染倍數(m.o.i)的SARS-CoV-2。

此外，對病理對照組的細胞處理以0.01的感染倍數(m.o.i)的SARS-CoV-2，但不予以處理HP520-3。

將各組在一培養箱(37℃,5% CO₂)中培養歷時1小時。收集各井中的液體，並且依據製造商的操作指南而使用TRIzol試劑(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Carlsbad,CA)來進行總RNA的萃取。

此後，以所得到的各組的RNA(1μg)作為模板，並藉由使用MMLV反轉錄酶(M-MLV reverse transcriptase)(Invitrogen,USA)的反轉錄聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)來合成cDNA。將由此所得到的cDNA作為DNA模板，以去離子蒸餾水予以稀釋100倍，並且令其進行反轉錄定量聚合酶鏈鎖反應 (reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)[其是使用TaqMan^TM qRT-PCR套組以及表1中所示的反應條件而在一StepOnePlus即時PCR系統(Applied Biosystems)上被執行]，以測定套膜(Envelope,E)基因表現的變化。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因作為在RT-qPCR的定量分析中的一內源性對照(endogenous control)來標準化基因表現數據。

SARS-CoV-2-E基因-特異性引子對和GAPDH基因-特異性引子對是購自於TaqMan(Thermo Fisher Scientific)。前述引子對的詳細資訊被總結於表2中。

表2

為了定量基因表現的變化，使用循環閾值變化之方法[threshold cycle(△C _T )method]來計算相對於GAPDH基因而被標準化的相對倍數變化。

結果：

圖4顯示在被感染且被預處理以HP520-3的Vero E6細胞中SARS-CoV-2的E基因之相對RNA表現位準。由圖4可見：實驗組1至3的RNA表現位準是顯著地低於病理對照組所具者，顯示：HP520-3可以在宿主細胞中減少病毒基因表現，從而抑制病毒複製。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參照被認為是示範性的具體例而被描述，應被瞭解的是：本揭露內容不限於所揭示的具體例，而意欲涵蓋被包括在最廣泛的解釋之精神與範疇中之各種不同的配置，俾以包含所有這類的修改以及等效的配置。

本發明的上述以及其他目的、特徵與優點在參照以下之詳細說明與例示性具體例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中：圖1顯示在下文實施例1中各組的細胞可活性比率(cell viability rate)；圖2顯示在下文實施例2中A項所描述的各組的病毒溶菌斑(viral plaques)之分佈圖； 圖3顯示在下文實施例2中A項所描述的各組中的病毒溶菌斑數量；以及圖4顯示在下文實施例2中B項所描述的各組中的相對RNA表現位準。

Claims (4)

1. 一種6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸{6-bromo-2-[1-(2,5-dimethylphenyl)-5-methyl-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline-4-carboxylic acid}或其藥學上可接受的鹽類供應用於製備一用來對抗冠狀病毒感染之醫藥品的用途。
2. 如請求項1的用途，其中該冠狀病毒感染是由一選自於下列所構成之群組中的冠狀病毒所引起：嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)、中東呼吸道症候群冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)、人類冠狀病毒229E(human coronavirus 229E,HCoV-229E)，以及它們的組合。
3. 如請求項1的用途，其中該6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸或其藥學上可接受的鹽類是呈一供口服投藥的劑型。
4. 如請求項1的用途，其中該6-溴-2-[1-(2,5-二甲苯)-5-甲基-1H-吡唑-4-基]-喹啉-4-羧酸或其藥學上可接受的鹽類是呈一供非經腸道投藥的劑型。

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