JP2009529048A - 経口インターフェロンによる広域免疫および抗ウイルス遺伝子調節 - Google Patents

Abstract

動物における抗ウイルス／免疫調節反応は、ヒトを含む感染した動物へのα‐インターフェロンの経口投与によって誘発される。トリインフルエンザを含むウイルスに抵抗性を与えるか、またはウイルスへの暴露の作用を緩和する方法が記載される。

Description

（関連する出願に対する相互参照）
本出願は２００６年３月８日に出願された米国仮特許出願番号第６０／８０，０７９号に基づく優先権を主張する。

本発明は、天然に存在するα‐インターフェロン、および場合によりトリインフルエンザ（ＡＶＩ）のようなウイルス感染の作用と闘うための免疫反応を活性化する他の成分の混合物からなるα‐インターフェロンの使用に関する。

ヒト細胞のウイルス感染は、１型インターフェロン、とりわけ、インターフェロン‐アルファ（α）によって媒介される生得免疫反応の（第一防御ライン）活性化に帰着する。これは、通常、免疫“オーケストラ”のある型の指揮者として作用するインターフェロン‐αが、免疫オーケストラを構成する種々のメディエーター（サイトカインまたはリンホカインとも呼ばれる）のタイミングおよび相対的な量を同調させるにつれて、免疫学的“カスケード”の活性化を導く。免疫オーケストラの指揮者、具体的にはインターフェロン‐α、が不活性化されると、オーケストラのメンバーはその後不規則に振る舞い、順序などを逸脱し、その累積効果が、ヒトの身体に対し有益で快適ではなく、実際には非常に有害である可能性がある。致死的な急性ヒトウイルスは、典型的には、ヒト体内に“足場（ｆｏｏｔｈｏｌｄ）”を得るためにインターフェロン‐αを不活性化する。このように振る舞う典型的なウイルスは、トリインフルエンザウイルス、ＳＡＲＳウイルス、天然痘ウイルスその他であり、それらは数時間、または数日でヒト宿主を死に至らす可能性がある（同様の作用が家畜集団においても観察される）。

肺病変（剖検）の最近の試験は、免疫オーケストラの指揮者であるインターフェロン‐αの破壊／無能力化により、ある種のメディエーター／“プレイヤー”が過剰反応し、肺に免疫に媒介された損傷を引き起こし、潜在的に死を導くことを示唆した。動物を基礎にした研究およびヒトのデータ（本明細書で主題の発明として報告される）は、免疫的に不適切で潜在的に致死的な免疫調節不全が、他の場合なら効し難い感染の前または初期の段階のいずれかで、経口的に／口腔粘膜に一時的に適用される少量のインターフェロン‐αによって適切に調節されうることを示唆する。

トリインフルエンザにおける肺病変の試験は、組織傷害だけでなく、酸化的損傷、肺水腫および出血を明らかにする。インターフェロン‐α［本明細書で使用されるＡｌｆｅｒｏｎ Ｎ、これは、およそ２０種のアルファインターフェロンのヒトファミリー由来の８種の異なるインターフェロン分子種の“カクテル”である］は、短時間の経口暴露によって、抗ウイルス／免疫調節遺伝子を誘導することによってこれらの変化を無効にしうる。我々は、Ａｌｆｅｒｏｎ Ｎによって一時的に誘導され、致死的ウイルスに対して連繋した攻撃を実施する、３８５個に達するそのような関連遺伝子を、本明細書において記録に残す。

Ｇｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ−Ｓｃｉ，Ａｕｇｕｓｔ ６，２００２，ｖｏｌ９９，ｎｏ１６）は、世界的に流行するインフルエンザにおける肺上皮の病変は、“インターフェロンに調節される遺伝子発現の遮断”に起因すると報告した。他の研究者は“免疫反応の強い活性化”を指摘していて、この多くはＴＮＦ（腫瘍壊死因子）の不適切な発現に起因するが、ＴＮＦは、本発明の実施により効果的にダウンレギュレートされる免疫調節リンホカインである。

群を抜いて、本発明は関連するインターフェロン免疫調節経路を再活性化し、炎症性サイトカイン（ＴＮＦが最もよく研究された典型的な例である）の顕著なアップレギュレーションは見られない。

本明細書で記載された治療手順のα‐インターフェロン成分は、好ましくはＡｌｆｅｒｏｎ Ｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標）に基づき、これは、米国で入手可能な唯一認可された天然の複数種α‐インターフェロンである。それは初めての天然源の、複数種インターフェロンであり、少なくとも７種のα‐インターフェロンの不変の混合物である。対照的に、他の入手可能なα‐インターフェロンは、ＤＮＡ組換え技術を使用して細菌中で作られた単一分子種のα‐インターフェロンである。また、これらの単一分子種のα‐インターフェロンは重要な構造炭水化物成分を欠く、というのは、このグリコシル化ステップが細菌による製法では実行されないからである。

組換え技術によって生産されたα‐インターフェロン種と異なり、Ａｌｆｅｒｏｎ Ｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標）は、複数のα‐インターフェロン種をグリコシル化することが可能なヒト白血球により生産される。逆相ＨＰＬＣ研究は、ＡｌｆｅｒｏｎＮ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標）は少なくとも７種のα‐インターフェロン（α２、α４、α７、α８、α１０、α１６、α１７）の不変の混合物であることを示す。この天然源インターフェロンは特有の抗ウイルス特性を有することで、遺伝子工学的に操作されたインターフェロンと識別される。Ａｌｆｅｒｏｎ Ｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標）の高い純度、および７種のインターフェロンの天然の混合物であって、その一部が、８ｂのように、他の種よりも（たとえば、ＩｎｔｒｏｎＡの唯一の成分である２ｂ種よりも）強い抗ウイルス活性を有するという利点。他の入手可能な組換えインターフェロン、たとえばＩｎｔｒｏｎ ＡおよびＲｏｆｅｒｏｎ Ａに比較したＡｌｆｅｒｏｎ Ｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標）の、たとえば、慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＨＩＶの治療における優れた抗ウイルス活性および耐容性が報告されている。

ＡｌｆｅｒｏｎＮ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標）は１ｍｌにつき５，０００，０００国際単位（ＩＵ）を含む注射用溶液として入手可能である。
体内への投与の場合、α‐インターフェロンは、たとえば慣用の方法で経口、鼻腔内または口腔内投与のために製剤されてもよい。経口投与のための製剤には、水性溶液、シロップ、エリキシル、粉末剤、顆粒剤、錠剤およびカプセル剤が挙げられ、それらは典型的には慣用の賦形剤、たとえば結合剤、充填剤、潤沢剤、崩壊剤、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、保存剤、バッファー塩、香味剤、着色および／または甘味剤が挙げられる。

α‐インターフェロンは、療法のために、好ましくは、経口、鼻腔内または局所（経皮、口腔内および舌下を含む）を含む適切な経路によって投与されてよい。好ましい経路は受容者の状態および年齢、インターフェロンの性質ならびに選択された活性成分と共に変化することは認識されるであろう。

成分の推奨される投薬量は、患者の臨床状態および同じような感染を治療することにおける医師の経験に依存することになる。一般的な指針として、全身感染に利用されるＡｌｆｅｒｏｎＮ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標）の投薬量は週に３回、５〜１０ミリオン単位（ｓｑ）である。現在までの経験は患者の体重１ｌｂにつき３ＩＵより多い投薬量を支持する。経口α‐インターフェロン（Ａｌｆｅｒｏｎ ＬＤＯ）は、５００〜２０００ＩＵ／日の範囲で液体溶液として投与され、１５０ポンドのヒトを基準に計算すると、これは１日に３．３〜１３．３ＩＵ／ｌｂに相当する。

われわれの経験は、有益な結果は４５０ＩＵを上回るα‐インターフェロンの投薬量レベルで得られることを示唆し、これは体重１ポンドに付き３ＩＵ以上である。これらの量は、米国特許第５，９１０，３０４号においてＣｕｍｍｉｎｓが使用した、咽頭粘膜への経口的、またはトローチもしくは錠剤としてのα‐インターフェロン投与とは異なり、それより多い。

低用量のアルファインターフェロンへの口腔粘膜（ｏｒｏｍｕｃｏｓａ）の暴露は動物およびヒトにおいて生物学的作用を導くことが報告されている。しかし、全身の抗ウイルス作用を獲得するための低用量の経口α‐インターフェロンの最適投薬／スケジュールは医師によって決定される。天然に由来するアルファα‐インターフェロン（ＡｌｆｅｒｏｎＮ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（登録商標））は尖圭コンジローマ（ｃｏｎｄｙｌｏｍａｔａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）の治療に認可されている。それは、組換えアルファα‐インターフェロンに使用される量より有意に低い量で活性である。

本研究はカニクイサルにおけるインフルエンザＨ５Ｎ１感染に対するＡｌｆｅｒｏｎの予防効力を測定するために行った。
カニクイサル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）はインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１に感染させ、マカクにおける臨床徴候はトリインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスに感染したヒトに見いだされる徴候に類似することが証明されているので、従ってインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスによるカニクイサルの感染はヒトにおけるこれらの感染のモデルとして役立つ（Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．２００３；４７（３ Ｓｕｐｐｌ）：９３１−３，Ｋｕｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｖｅｔ Ｐａｔｈｏｌ．２００３ Ｍａｙ；４０（３）：３０４−１０，Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．２００１ Ｊｕｌ；７５（１４）：６６８７−９１）。

上述のマカクＨ５Ｎ１感染モデルを使用して、インフルエンザウイルスＡ／ベトナム／１１９４／’０４（Ｈ５Ｎ１）による気管内攻撃の５日前から始め、種々の量で１０日間毎日投薬する、カニクイサルへのＡｌｆｅｒｏｎの口腔粘膜送達後の、カニクイサルにおけるＡｌｆｅｒｏｎの予防効力を測定した。

安全上および実用的な理由のために、それぞれの手順（Ａｌｆｅｒｏｎの口腔粘膜送達およびトリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１による感染）前に動物は麻酔された。実験はそれぞれ３匹の動物からなる４群から構成された。グループＡは１０ｍｇ／ｋｇ Ａｌｆｅｒｏｎ、グループＢは２５ｍｇ／ｋｇ Ａｌｆｅｒｏｎ、グループＣは６２．５ｍｇ／ｋｇ Ａｌｆｅｒｏｎ、そしてグループＤはプラセボにより処置された。有害作用は観察されなかった。

感染５日目に安楽死させた後、肉眼観察した肺損傷は、６２．５ｍｇ／ｋｇで処置したグループＣの動物は他の群の動物に比較して、肺に隔離された暗赤色領域またはびまん性の暗領域を示さなかった。これは顕微鏡観察による発見と一致し、その発見はこの群の動物における左前‐および尾部肺葉の両方における低い進行度の原発性異型肺炎をさらに示唆する。

Ａｌｆｅｒｏｎの口腔粘膜送達によるマカクの予防的処置は有益な投薬量依存的な作用を有すると考えられ、処置された動物における肉眼および顕微病変が軽減した。

研究Ａ：ＣＤ４レベル＞４００の無症候性ＨＩＶに感染した対象は、１０日間毎日経口投与される、注射用にＡｌｆｅｒｏｎ（登録商標）を希釈することによって調製された、水性緩衝溶液中のＡｌｆｅｒｏｎ（登録商標）５００ＩＵまたは１０００ＩＵで処置された。末梢血白血球由来のＲＮＡは、Ｐａｘｇｅｎｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎを使用して治療前、治療中、治療後に集められた。ｃＤＮＡマイクロアレイ解析を利用して、Ａｌｆｅｒｏｎ（登録商標）経口投与の結果として調節される遺伝子を同定した。研究Ｂ：正常な健康被験者（ボランティア）は類似の方法で研究された。

研究Ａにおける初めの結果は、複数種の天然白血球α‐インターフェロン５００ＩＵまたは１，０００ＩＵの経口投与後の末梢血白血球におけるα‐インターフェロン関連遺伝子活性の誘導を示唆した。

この研究で使用したＡｌｆｅｒｏｎ（登録商標）はポリプロピレンで覆ったホイルポーチに密閉して包装された液体溶液として供給された。それぞれのポーチには１．０ｍｌのＡｌｆｅｒｏｎ（登録商標）（５００ＩＵまたは１０００ＩＵ）またはプラセボが含まれた。溶液は経口的に１０日間、毎日摂取された。投与前３０分から投与後３０分まで食物および水は摂取されない。投与および血液サンプリングは表１に示す。用量作用は表２〜４に示す。

血液試料は以下のようなｃＤＮＡマイクロアレイに供した。
アレイ構築 この研究で使用されるアレイはＲｅｓｅｒａｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．の配列が証明されたｃＤＮＡクローンのサブセットを含み、アデニレート／ウリジレートリッチエレメントを含む９５０遺伝子およびＡＵ−指向ｍＲＮＡ減少に潜在的に関与する１８遺伝子を表す、４０，０００クローンセット、多様な細胞型においてＩＦＮによって刺激される、確認された候補遺伝子を含む、先に記載のクローンセットの拡張を表す８５５ＩＳＧ、ウイルスアナログポリ（Ｉ）．ポリ（Ｃ）に反応する２８８遺伝子、および８５ハウスキーピング遺伝子。

標的ＲＮＡ調製 標的ＲＮＡはリニア増幅反応に基づいてＴ７ポリメラーゼ中で生成された。全容量５．５μｌ中の２μｌの全ＲＮＡおよび５ｐｍｏｌのＴ７−（ｄＴ）２４プライマー（５′ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ−（ｄＴ）２４−３′は７０℃で１０分間インキュベーションし、氷上で冷やした。第１鎖ｃＤＮＡ合成の場合、アニーリングしたＲＮＡ鋳型は、第１鎖バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｍＭ ＤＴＴ、１Ｕ／μｌ 抗‐ＲＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）、５００μＭ ｄＮＴＰｓおよび２Ｕ／μｌ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１０μｌ反応物中、１時間、４２℃でインキュベーションした。第２鎖合成は、第１鎖反応生成物、第２鎖バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５０μＭ ｄＮＴＰ、０．０６Ｕ／μｌ ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）、０．２６Ｕ／μｌ ＤＮＡポリメラーゼＩ、（ＮＥＢ）ならびに０．０１２Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ Ｈ（Ａｍｂｉｏｎ）および３．３ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ／μｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む、全反応容量５０μｌ中、１６℃で２時間、さらに１６℃で１５分間インキュベーションした。第２鎖反応生成物は、取り扱い説明書に従って、Ｐｈａｓｅｌｏｃｋマイクロ遠心チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出によって精製し、エタノール沈殿させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は改変したプロトコルに従って、Ｔ７メガスクリプトキット（ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ ｋｉｔ）（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して実行し、プロトコルでは、精製したｃＤＮＡは、１０μｌ反応容量中のそれぞれ１μｌの１０Ｘ ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰならびに１μｌ Ｔ７酵素ミックスと合わせ、９時間、３７℃でインキュベーションした。増幅したＲＮＡはＲｎｅａｓｙ ＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して精製した。

ＲＮＡの標識 Ｃｙ３またはＣｙ５標識ｃＲＮＡは間接取込によって調製された。２μｇの増幅されたＲＮＡ、１μｌのｄＴ１２〜１８プライマー（１μｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．６μｌの任意のヘキサヌクレオチド（３μｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１μｌの抗‐ＲＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）を１５．５μｌの反応容量に合わせ、７０℃で１０分間インキュベーションした。逆転写は、アニーリングしたＲＮＡ鋳型、第１鎖バッファー、それぞれ５００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、３００μＭ ｄＴＴＰ、２００μＭ アミノアリル‐ｄＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ＤＴＴ、１２．７Ｕ／μｌ ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩを含む３０μｌの反応物中、２時間、４２℃で行った。鋳型加水分解の場合、１０μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨを逆転写反応物に添加し、混合物は７０℃で１０分間インキュベーションし、５分間室温に戻し、１０μｌの０．１Ｍ ＨＣｌの添加によって中和した。ｃＤＮＡは１μｌの線形アクリルアミド（Ａｍｂｉｏｎ）、４μｌの３Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５．２）および１００μｌの無水エタノールの添加後、−２０℃で３０分間沈殿させ、５μｌの０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３に再懸濁した。色素カップリングのために、Ｃｙ３またはＣｙ５色素を含むＮＨＳエステルの１チューブの内容物は４５μｌのＤＭＳＯに溶かした。色素溶液５μｌはｃＤＮＡと混合し、暗所中、室温で１時間インキュベーションした。標識されたｃＤＮＡは、取り扱い説明書に従ってＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。溶出したｃＤＮＡは真空下で乾燥し、Ｓｌｉｄｅｈｙｂ ＩＩハイブリダイゼーションバッファー（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁した。２分間、９５℃で変性後、ハイブリダイゼーション混合物はカバーガラス下のマイクロアレイスライドに注いだ。ハイブリダイゼーションは５５℃の水浴中の密封した湿度の高いチャンバー内で一晩続けた。ハイブリダイゼーション後、スライドは連続して５分間、それぞれ、２ＸＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ、５５℃、その後２ＸＳＳＣ、５５℃で洗浄し、最後に０．２ＸＳＳＣ中、室温で５分間洗浄した。

データの取得および標準化 データはＧｅｎｅＰｉｘ ４００ＢレーザースキャナーおよびＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏ５．０ソフトウェアにより取得した。生データはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ６．０ソフトウェア（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に移し、局所的に重み付けした線形回帰（ＬＯＥＳＳ）により、すべての値の分布に基づき標準化し、さらに解析した。

研究Ａにおける始めの結果は、経口的に投与したＡｌｆｅｒｏｎ（登録商標）は５００および１，０００ＩＵ／日の投薬量レベルで十分耐容されることを示唆した。ｃＤＮＡマイクロアレイ解析は、２人以上の患者において、基準の２倍を超えて発現された３８５の遺伝子を同定した。表２、３および４に示すように、５００ＩＵ／日に比較して、１，０００ＩＵ／日の投薬量レベルで約４倍の遺伝子発現の増加が見られた（ｐ＜０．０００１）。網羅的なリストではないが、表５は患者試料の３３％以上において、２５の遺伝子が基準の２倍を超えて発現されたことを示す。ＰＤＺおよびＬＩＮドメイン５および２′‐５′オリゴアデニレートシンセターゼ様はアップレギュレーションされた上位５種に含まれた。２′‐５′オリゴアデニレートシンセターゼはインターフェロン抗ウイルス経路の重要な成分である。重要なことには、表６に示すように、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連遺伝子のような炎症反応の活性化に関連した遺伝子はダウンレギュレーションされた。

最近のエビデンスは、トリ（Ｈ５Ｎ１）分離株を含むインフルエンザＡの毒性はヒトＰＤＺドメインに結合する非構造ＮＳ１ウイルスタンパク質の能力に関連し、それによってインターフェロン経路を含む宿主細胞の抗ウイルス遺伝子の発現を妨げることを示す（Ｓｃｉｅｎｃｅ ｘｐｒｅｓｓ，２６ Ｊａｎｕａｒｙ ２００６）。従って、経口投与されたＡｌｆｅｒｏｎ（登録商標）はＰＤＺドメイン発現をアップレギュレーションすることができるという発見は、ヒト宿主防御機序を回避するトリ（Ｈ５Ｎ１）を含むインフルエンザウイルスの能力を妨げることにおいてＡｌｆｅｒｏｎ（登録商標）が重要な役割を果たしうる可能性を高める。

経口投与されたＡｌｆｅｒｏｎ（登録商標）は重篤な有害事象の報告が無く、十分耐容された。いくつかの軽度な有害事象、たとえば口腔における金属製風味または鼓腸／腹部膨満だけが報告された。実験室パラメータにおける臨床的に顕著な変化およびＫａｒｍｏｆｓｋｙ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｔｕｓ（ＫＰＳ）における変化は見られなかった。

今日までの実験は、経口的に投与された天然のヒトインターフェロン‐種の生物学的カクテルは、末梢血白血球におけるα‐インターフェロン関連遺伝子のアップレギュレーションに基づいた全身性の生物学的活性を有することを示唆する。アルファα‐インターフェロンは広域スペクトラムの抗ウイルス／免疫調節分子であるため、トリインフルエンザのような呼吸器感染への適用を含む、非常に多数のα‐インターフェロン‐感受性疾患における適用の可能性が存在する。

Claims (6)

1. 感染した動物またはヒトにアルファインターフェロンを経口投与することを含む、ヒトを含む動物において抗ウイルス／免疫調節反応を誘発する方法。
2. 動物またはヒトにアルファインターフェロンを経口投与することを含む、生得免疫反応を全身的に活性化する方法。
3. インターフェロンが動物の体重１ポンドにつき少なくとも３ＩＵの量で、経口的に、または鼻腔内投与される、請求項１または２に記載の方法。
4. ウイルスへの暴露前、またはウイルスへの暴露直後であるが症状を示す前に、動物またはヒトにアルファインターフェロンを経口投与することを含む、感受性の高いウイルス感染の作用を緩和するか、またはそれに対して抵抗性を与える、方法。
5. インターフェロンが動物の体重１ポンドにつき少なくとも３ＩＵの量で、経口的に、または鼻腔内投与される、請求項４に記載の方法。
6. ウイルス感染がトリインフルエンザである、請求項４に記載の方法。