CN108841980A

CN108841980A - 一种用于致病性弧菌检测的核酸组合及其应用

Info

Publication number: CN108841980A
Application number: CN201810852735.5A
Authority: CN
Inventors: 韩嘉钰; 陈浩东; 吴春云; 黄忱; 彭丽
Original assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Huahan Trio Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2018-11-20
Anticipated expiration: 2038-07-27
Also published as: CN108841980B

Abstract

本发明公开了一种用于致病性弧菌检测的核酸组合及其应用，涉及致病性弧菌检测技术。该核酸组合包括如下引物对中的一种或多种的组合：SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.7‑8、SEQ ID NO.9‑10、SEQ ID NO.11‑12、SEQ ID NO.13‑14、SEQ ID NO.15‑16、SEQ ID NO.17‑18以及SEQ ID NO.19‑20；该核酸组合通过PCR方法，可对常见的致病弧菌如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等进行检测，避免非特异性扩增，具有较强的特异性和较高的灵敏度。

Description

一种用于致病性弧菌检测的核酸组合及其应用

技术领域

本发明涉及致病性弧菌检测技术领域，具体而言，涉及一种用于致病性弧菌检测的核酸组合及其应用。

背景技术

食源性疾病是当今世界上最广泛的卫生问题之一，发病率居人类各种疾病首位，世界卫生组织(WHO)的数据表明，食源性和水源性腹泻病每年导致约220万人死亡，其中多数是儿童；在工业化国家，每年有超过30％的人口患有食源性疾病。

致病性弧菌(Pathogenic Vibrio)是一类重要的食源性病原菌，广泛存在于自然水环境，特别是海水中，对海产品有较大程度的污染。我国沿海省份有着广阔的海域和丰富的海产品，居民爱吃海产品，历来有生食或半生食贝类、甲壳类等海产品的习惯。近年来进出口海产品中致病性弧菌的检出屡见不鲜，致病性弧菌污染引起的食源性疾病爆发已成为突出的公共卫生问题，严重危害人民的身体健康并造成经济财产损失。

致病性弧菌主要包括霍乱弧菌(Vibrio cholerea,V.c)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus,V.p)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus,V.v)、河流弧菌(Vibrioflurialis,V.f)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,V.a)、拟态弧菌(Vibrio mimicus,V.m)等12种。前两种弧菌危害大、致病率高。霍乱弧菌是一种古老而流行广泛的烈性病原体之一，被WHO定为国际检疫菌；近年来以肠道门诊监测为基础的食源性疾病主动监测结果显示，副溶血性弧菌是导致食源性疾病发病最多的细菌性病原微生物；创伤弧菌、河弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌等致病性弧菌的感染亦十分普遍。报道指出浙江省进口食品被创伤弧菌污染食品引起的食物中毒是最为严重的食源性疾患之一，免疫力低下患者致死率达50％～60％；河流弧菌在我国沿海地区海水中检出率约为6％～15％，海产品中检出率为4％～5％；溶藻弧菌数量位居海水类弧菌之首，能够引起食物中毒、中耳炎、败血症、脑膜炎等严重疾病而未受到重视；拟态弧菌腹泻症状与霍乱弧菌所致腹泻症状极为相似，典型症状都是米泔水样便。

目前致病性弧菌的检测方法有标准检测和快速检测两种，其中标准方法主要基于生理、生化指标，利用在高盐条件下产酸、产气以及生长代谢方面等特性进行鉴定。这些方法操作步骤繁琐，对操作人员技术水平要求比较高，且检测的周期长，在相当大的程度上限制了致病性弧菌快速检测、鉴定的能力。随着分子生物学技术的发展，许多方法如PCR、酶联免疫荧光方法、胶体金方法等已经应用到致病性弧菌的检测中，大大的缩短了检测的周期。在这些技术的基础上又开发了AFLP、RFLP等方法。这些检测方法的建立在一定程度上提高了检测的效率，缩短了检测的周期，但是上述技术也存在各自的弊端。如PCR方法易出现污染导致假阳性结果，而且一些阳性结果还需要测序鉴定；酶联免疫荧光技术存在检测灵敏度不高等缺点。随着人民生活水平的提高，消费者对食品卫生提出了更高的标准，单一弧菌的检测方法已不再适用现今多重检测的迫切需求。有研究发现创伤弧菌可能与副溶血性弧菌一起通过牡蛎等海水产品复合感染生食者。虽然北欧食品协会的“食品中致病性弧菌的检测和计数”分别规定了4种致病性弧菌的检测方法，但仍难以反映海产品被其他致病性弧菌污染的真正状况。

现在国内关于致病性弧菌的国家标准和行业标准检测方法仅限于传统的微生物学检测方法，每种检测方法只能检测一种致病性弧菌。而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAC、ISO等)也是以检测单一或少数目标菌为目的设计的程序。每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂，费时费力。

目前，API 20E和VITEK等作为成熟的微生物快速鉴定系统已经被应用于致病性弧菌的检测，然而临床常见的12种弧菌用自动化鉴定系统仅63.1％～80.9％可正确鉴定到种级水平。在分子生物学检测方法方面，目前FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序，检测不同的弧菌需要不同的反应条件。近年来，多种检测新方法应用到致病性弧菌的检测中。Vezzulli L等新近寻找到霍乱弧菌一种高度保守序列——N-乙酰氨基葡萄糖结合蛋白A(GbpA)基因，在此基础上开发出一种新型荧光定量PCR方法用以检测纯培养物、海水、沉积物、粪便、福尔马林固定样本等样本中霍乱弧菌的存在，研究表明该方法可从1966年8月福尔马林固定样本中检出霍乱弧菌。Zhang X.等建立了一种CPA霍乱弧菌初筛方法，能够对各种血清型的霍乱弧菌进行鉴别，检测限达到2CFU/mL，表现出比环介导等温扩增(LAMP)方法更高的灵敏度和实用性。Low K.F.等将超敏电化学基因检测技术应用到霍乱弧菌特异性lolB基因序列的检测中，该方法采用磁珠作为生物识别相，通过乳胶-纳米金颗粒进行信号放大杂交标签，检测限同样达到了2CFU/mL。

近年来用多重靶标检测致病性弧菌的报道逐渐增加。Kurakawa T等针对霍乱弧菌/拟态弧菌、副溶血性弧菌/溶藻弧菌rRNA基因建立了RT-qPCR检测方法，检测限达到了10个细胞/克粪便，但是仅为两重检测方法。Senachai P等针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌特异性基因设计特异性引物，建立了一种四重PCR方法用于食品安全评估。Park JY等建立了一种多重实时荧光RT-PCR检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法，检测限达到了10CFU/反应。由以上报道的方法可以看出，现有的致病性弧菌多重检测方法能够检测的弧菌种类最多不超过4种，应用的方法受技术本身限制存在检测限高、检测时间长、容易出现假阳性等问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于致病性弧菌检测的核酸组合，该核酸组合可检测出待测样品中的致病性弧菌例如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌，具有特异性好、灵敏和可靠等特性。

本发明的另一目的在于提供上述核酸组合的应用，将其用于制备致病性弧菌检测试剂盒，该试剂盒具有特异性好、灵敏度高、结果可靠等特点。

本发明的另一目的在于提供一种致病性弧菌检测试剂盒，其含有上述的核酸组合，可以针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等致病性弧菌进行检测。该试剂盒具有检测快速、操作方便、灵敏度高、特异性好、检测结果可视、结果准确等诸多优点。

本发明的另一目的在于提供一种致病性弧菌的检测方法，该检测方法可以针对霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等致病性弧菌进行检测，具有检测快速、操作方便、灵敏度高、特异性好、检测结果可视、结果准确等诸多优点。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了一种用于致病性弧菌检测的核酸组合，其包括如下引物对中的一种或多种的组合：

用于检测霍乱弧菌toxR基因(toxR(V.c))的第一引物对，其包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；

用于检测霍乱弧菌ctxAB基因的第二引物对，其包括：SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；

用于检测副溶血性弧菌toxR基因(toxR(V.p))的第三引物对，其包括：包括SEQ IDNO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；

用于检测副溶血性弧菌tlh基因的第四引物对，其包括：SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；

用于检测副溶血性弧菌tdh基因的第五引物对，其包括：SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物；

用于检测副溶血性弧菌trh基因的第六引物对，其包括：SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；

用于检测创伤弧菌vvhA基因(vvhA(V.v))的第七引物对，其包括：SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；

用于检测拟态弧菌toxR基因(toxR(V.m))的第八引物对，其包括：SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物；

用于检测河流弧菌toxR基因(toxR(V.f))的第九引物对，其包括：SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物；

用于检测溶藻弧菌coIH基因(coIH(V.a))的第十引物对，其包括：SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物。

通过弧菌基因组序列包括相关毒力基因序列，通过clustalx等软件进行序列比对，根据基因具有保守性、特异性的原则选择合适的区域，采用primer6和oligo7设计出上述10种特异检测引物对。各对引物的目标序列分别为细菌内参基因序列，toxR(V.c)，ctxAB，toxR(V.p)，tlh，tdh，trh，vvhA(V.v)，toxR(V.m)，toxR(V.f)，coIH(V.a)特异靶序列。

上述10种引物对可同时在同一体系中进行多重PCR扩增，避免非特异性扩增，具有较高的特异性和灵敏度。此外，在多重PCR的基础上本发明提供的核酸组合还可同时进行非对称PCR扩增技术(Asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。

非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物(或是扩增延伸条件不同的上游引物和下游引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的对应的探针杂交，从而提高检测灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括碱基序列如SEQ IDNO.23-32所示的探针中的一种或多种。

其中，SEQ ID NO.23所示的探针为toxR(V.c)探针，其可以与第一引物对的扩增产物特异性结合。SEQ ID NO.24所示的探针为ctxAB探针，其可以与第二引物对的扩增产物特异性结合。SEQ ID NO.25所示的探针为toxR(V.p)探针，其可以与第三引物对的扩增产物特异性结合。SEQ ID NO.26所示的探针为tlh探针，其可以与第四引物对的扩增产物特异性结合。SEQ ID NO.27所示的探针为tdh探针，其可以与第五引物对的扩增产物特异性结合。SEQID NO.28所示的探针为trh探针，其可以与第六引物对的扩增产物特异性结合。SEQ IDNO.29所示的探针为vvhA(V.v)探针，其可以与第七引物对的扩增产物特异性结合。SEQ IDNO.30所示的探针为toxR(V.m)探针，其可以与第八引物对的扩增产物特异性结合。SEQ IDNO.31所示的探针为toxR(V.f)探针，其可以与第九引物对的扩增产物特异性结合。SEQ IDNO.32所示的探针为coIH(V.a)探针，其可以与第十引物对的扩增产物特异性结合。

上述10种引物对的扩增产物通过碱基互补原则对应地与探针杂交，经显色处理后，可显示出相应颜色，进而使得检测结果可视化，提高检测的便捷性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述探针的5’端标记有用于固定至膜芯片上的第一连接基团。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第一连接基团为氨基。

通过对探针的5’端的氨基修饰，可以使得在制备膜芯片时，探针更容易或更稳定地结合在膜芯片上，提高其稳定性，防止探针脱落，避免出现假阴性结果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括阳性对照探针，上述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.34所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.36所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述阳性对照探针的5’端标记有用于固定至膜芯片上的第二连接基团。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第二连接基团为氨基。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括阴性对照探针，上述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.35所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述阴性对照探针的5’端标记有用于固定至膜芯片上的氨基。

阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性探针结合，而不与阴性探针结合。因此，在膜芯片上的阳性探针位置有斑点而阴性探针位置没有斑点说明杂交结果可靠，检测结果更可信。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括用于扩增致病性弧菌内参基因即16sRNA基因的内参引物对以及相应的内参探针；

内参引物对包括SEQ ID NO.21所示的上游引物和SEQ ID NO.22所示的下游引物。

内参探针的碱基序列如SEQ ID NO.33所示。

内参引物对的扩增产物可特异性地与内参探针结合。

通过对内参基因的检测，可以使得检测结果可靠准确。当然，在其他的实施例中，也可以是使用其他致病性弧菌的内参基因。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述各引物对中的上游引物或下游引物的5’端标记有用于与催化酶结合的第一亲和物；

第一亲和物选自地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种。

通过第一亲和物的标记，使得各引物对的PCR产物也带上相应的亲和物，当PCR产物与探针结合后，通过第一亲和物，可以将带有可与第一亲和物特性结合的用第二亲和物标记的催化酶固定，再根据催化酶催化底物的显色情况，进而可以判断相应显色位置的致病性弧菌有无或类别的检测结果。

当然，催化酶上标记的第二亲和物的类别可根据第一亲和物的类别选择，例如，当第一亲和物是地高辛时，第二亲和物为地高辛抗体；当第一亲和物为异硫氰酸荧光素时，第二亲和物为异硫氰酸荧光素抗体；当第一亲和物是生物素时，第二亲和物为链霉亲和素。

另一方面，本发明提供了上述的核酸组合在制备致病性弧菌检测试剂盒中的应用。

另一方面，本发明提供了一种用于致病性弧菌检测的试剂盒，其包括核酸组合，该核酸组合包括：如下引物对中的一种或多种的组合：

包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物的用于检测霍乱弧菌toxR基因的第一引物对；

包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物的用于检测霍乱弧菌ctxAB基因的第二引物对；

包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物的用于检测副溶血性弧菌toxR基因的第三引物对；

包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物的用于检测副溶血性弧菌tlh基因的第四引物对；

包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物的用于检测副溶血性弧菌tdh基因的第五引物对；

包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物的用于检测副溶血性弧菌trh基因的第六引物对；

包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物的用于检测创伤弧菌vvhA基因的第七引物对；

包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物的用于检测拟态弧菌toxR基因的第八引物对；

包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物的用于检测河流弧菌toxR基因的第九引物对；

包括SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物的用于检测溶藻弧菌coIH基因的第十引物对。

上述10种引物对可同时在同一体系中进行多重PCR扩增，避免非特异性扩增，具有较高的特异性和灵敏度，此外，在多重PCR的基础上还本发明提供的核酸组合还可同时进行非对称PCR扩增技术(Asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。

非对称PCR扩增技术是指在PCR扩增过程中采用不等量的上游引物和下游引物(或是扩增条件不同的上游引物和下游引物)，PCR扩增后产生大量的单链DNA，该单链DNA可以有效的和固定在支持膜上的对应的探针杂交，从而提高检测灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括：包括SEQ ID NO.21所示的上游引物和SEQ ID NO.22的下游引物的用于检测内参基因16sRNA基因的内参引物对。

通过对内参基因的检测，可以使得检测结果可靠准确。当然，在其他的实施例中，也可以是其他的内参基因。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括膜芯片，上述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.23-32所示的探针中的一种或多种。

其中，膜芯片可以是硝酸纤维素膜或尼龙膜，或者是聚丙烯膜，或者是硅片等能够起到固相支撑的作用的物质。较佳地，膜芯片为硝酸纤维素膜。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述膜芯片上还固定有阳性对照探针，上述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.34所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述核酸组合还包括：用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.36所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述膜芯片上还固定有阴性对照探针，上述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.35所示。

阳性寡核苷酸单链DNA可与阳性对照探针结合，而不与阴性对照探针结合。因此，在膜芯片上的阳性对照探针位置有斑点而阴性对照探针位置没有斑点说明杂交结果可靠，检测结果更可信。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有生物素。

通过生物素的标记，使得各引物对的PCR产物也带上相应的生物素，当PCR产物与探针结合后，通过生物素，可以将带有可与第生物素特性结合的用链霉亲和素标记的催化酶固定，再根据催化酶催化底物的显色情况，进而可以判断相应探针位置的致病性弧菌有无或类别的检测结果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括如下组分中的一种或多种：

PCR缓冲液、去活化液、去活化清洗液、杂交液、杂交清洗液、含链霉亲和素标记的催化酶的酶孵育液、孵育清洗液1、孵育清洗液2以及含催化酶的底物的显色液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述催化酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；

当催化酶为辣根过氧化物酶时，显色液中的底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任意一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应，使得检测结果可视化。

当催化酶为碱性磷酸酶时，显色液中的底物是对BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)和NBT(NitrotetrazoliμM Bluechloride、四唑硝基蓝)的组合物、硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。

当上述催化酶为葡萄糖氧化酶时，显色液中的底物是葡萄糖。葡萄糖经葡萄糖氧化酶(GOD)氧化，产生葡萄糖酸和过氧化氢，后者可通过辣根过氧化物酶-TMB显色系统进行检测。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述去活化液为：NaOH溶液；

优选的，上述去活化清洗液为：含0.8％-0.12％SDS的SSPE缓冲液；

优选的，上述杂交液为：含0.8％-0.12％SDS的SSPE缓冲液；

优选的，上述杂交清洗液为：含0.4％-0.6％SDS的SSPE缓冲液；

优选的，上述孵育清洗液1为：含0.4％-0.6％SDS的SSPE缓冲液；

优选的，上述孵育清洗液2含有：NaCl、NaH₂PO₄和C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述去活化液为：90-110mmol/L的NaOH溶液；

优选的，上述孵育清洗液2含有：0.25-0.35mol/L NaCl、18-22mmol/L NaH₂PO₄和18-22mmol/L C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，pH为7.2-7.5。

另一方面，本发明还提供了一种检测致病性弧菌的方法，其包括：对待测样本的DNA进行PCR扩增反应；

上述PCR扩增反应的PCR反应体系中含有如下引物对中的一种或多种的组合：

用于检测创伤弧菌vvhA基因的第七引物对，其包括：SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；

各引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于与催化酶结合的第一亲和物。

上述10种引物对在同一体系中进行多重PCR，避免非特异性扩增，具有较高的特异性和灵敏度，能够检测出常见的致病性弧菌例如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌。

进一步地，上述反应体系中还含有：由SEQ ID NO.21所示的上游引物和SEQ IDNO.22的下游引物的组成的用于检测内参基因的内参引物对。

进一步地，上述反应体系中还含有：SEQ ID NO.36所示的阳性寡核苷酸单链DNA。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比大于1，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比大于1。

此外，在多重PCR的基础上还本发明提供的核酸组合还可同时进行非对称PCR扩增技术(Asymmetric PCR)用以提高检测灵敏度。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.1-1.5，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.1-1.5。

优选地，在本发明的一些实施方案中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.2，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.2。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述PCR扩增反应之后，上述方法还包括：杂交步骤；

上述杂交步骤包括：将由上述PCR扩增反应得到的PCR反应产物与膜芯片反应，进行杂交处理；

其中，上述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.23-32所示的探针中的一种或多种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述膜芯片上还固定有SEQ ID NO.33、34以及35所示的探针。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述杂交处理的条件包括：温度为44-46℃、转速为80-100rpm以及时间为40-50min。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在进行杂交处理之前，上述杂交步骤还包括去活化处理；

上述去活化处理包括：

用去活化液对上述膜芯片进行孵育，36-38℃孵育8-10min；然后用去活化清洗液对上述膜芯片进行孵育，58-62℃孵育4-6min。

上述去活化液为：90-110mmol/L的NaOH溶液；

优选的，上述去活化清洗液为：含0.8％-0.12％SDS的SSPE缓冲液。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在进行杂交处理之后，上述杂交步骤还包括酶孵育处理；

上述酶孵育处理包括：将含有上述催化酶的酶孵育液与上述膜芯片接触，在温度为40-44℃、转速为80-100rpm条件下震荡孵育28-32min；

上述催化酶标记有用于与上述第一亲和物特异性结合的第二亲和物。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述第一亲和物选自地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种；

上述第二亲和物选自地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体和链霉亲和素；

优选的，上述催化酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任意一种。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在进行酶孵育处理之后，上述杂交步骤还包括显色处理；

上述显色处理包括：将显色液与上述膜芯片接触，静置5-20min。

其中，上述显色液含有上述催化酶的底物。

上述催化酶选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶；

当催化酶为辣根过氧化物酶时，显色液的底物是TMB(Tetramethylbenzidine、四甲基联苯胺)、ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(o-Phenylenediamine、邻苯二胺)中的任一种。TMB、ABTS和OPD均是辣根过氧化物酶的底物，在辣根过氧化物酶的催化作用下发生显色反应，使得检测结果可视化。

当催化酶为碱性磷酸酶时，显色液的底物是对BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐)和NBT(NitrotetrazoliμM Bluechloride、四唑硝基蓝)的组合物、硝基苯磷酸盐、4-硝基苯磷酸二钠、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。

当上述催化酶为葡萄糖氧化酶时，显色液的底物是葡萄糖。葡萄糖经葡萄糖氧化酶(GOD)氧化，产生葡萄糖酸和过氧化氢，后者可通过辣根过氧化物酶-TMB显色系统进行检测。

综上，本发明采用基于反向斑点杂交的可视化膜芯片技术对多种致病性弧菌检测，其工作原理是首先将针对各种物种特异性序列的单链探针按顺序排列固定于支持膜表面的特定区域，再将待测的多重PCR产物与其杂交，这样PCR产物中的特异性序列单链DNA就会和支持膜上的探针杂交，经洗涤去除未结合的DNA样品，由于待测PCR产物的DNA上带有亲和物标记例如生物素标记，结合了待测DNA的探针点就偶联上了生物素标记物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号，这样一张膜芯片上就可以同时检测多种致病性弧菌例如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌等。

总之，采用本发明提供的核酸组合、试剂盒和检测方法，可以实现对多种致病性弧菌例如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌的检测，具有较高的特异性和灵敏度，且具有操作方便、检测快速、结果可靠等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的致病性弧菌试剂盒的膜芯片上各探针的固定位置模式图；

图2为本发明实施例3的检测结果；

图3为本发明实施例4的检测结果；

图4为本发明实施例5的检测结果；

图5为本发明实施例6的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例了一种检测致病性弧菌试剂盒，其包括核酸组合以及膜芯片。

其中，核酸组合包括如下引物对，各引物对的上游引物和下游引物的碱基序列(5’-3’)如下：

用于霍乱弧菌toxR基因(toxR(V.c))的第一引物对：

上游引物：ATTGACGGCTACGCCATCGACA(SEQ ID NO.1)，下游引物：ACCGCAGCCAGCCAATGTTG(SEQ ID NO.2)；

用于检测霍乱弧菌ctxAB基因的第二引物对：

上游引物：CATCTGGATGAGGACTGTATGC(SEQ ID NO.3)，下游引物：GCCAAGAGGACAGAGTGAGTA(SEQ ID NO.4)；

用于检测副溶血性弧菌toxR基因(toxR(V.p))的第三引物对：

上游引物：GAAGGCAGCCAGATGTTGATT(SEQ ID NO.5)，下游引物：TCTCAGTTCCGTCAGATTGGT(SEQ ID NO.6)；

用于检测副溶血性弧菌tlh基因的第四引物对：

上游引物：GTTAGCGTCTCGAACAAGGCGT(SEQ ID NO.7)，下游引物：CAGTGCTTCTGCATAATCCGCTTT(SEQ ID NO.8)；

用于检测副溶血性弧菌tdh基因的第五引物对：

上游引物：GCCTTTGAGCTTCCATCTGTC(SEQ ID NO.9)，下游引物：ACCGCTGCCATTGTATAGTCT(SEQ ID NO.10)；

用于检测副溶血性弧菌trh基因的第六引物对：

上游引物：TTGTGAAGACCGTTGAGAGG(SEQ ID NO.11)，下游引物：GCAATCGTTGATGACTACTGGA(SEQ ID NO.12)；

用于检测创伤弧菌vvhA基因(vvhA(V.v))的第七引物对：

上游引物：TCGCACCACACTGTTCGACTGT(SEQ ID NO.13)，下游引物：CGGTTAACGGCTGGAGCTGTCA(SEQ ID NO.14)；

用于检测拟态弧菌toxR基因(toxR(V.m))的第八引物对：

上游引物：GCGTTGTGACAGGGAAATGCTG(SEQ ID NO.15)，下游引物：GCCTAATCGGATGATCTCTTCAGGTG(SEQ ID NO.16)；

用于检测河流弧菌toxR基因(toxR(V.f))的第九引物对：

上游引物：CTGTTGGTTGCCGTCATACTGC(SEQ ID NO.17)，下游引物：CGGGTGATTGATTGGCGTGCT(SEQ ID NO.18)；

用于检测溶藻弧菌coIH基因(coIH(V.a))的第十引物对：

上游引物：CGGCATTCTCAAAGTCACCAG(SEQ ID NO.19)，下游引物：GGAATGGTACGGGCAACCTAA(SEQ ID NO.20)；

用于检测内参基因的内参引物对：

上游引物：TCCACGATTACTAGCGATTCC(SEQ ID NO.21)，下游引物：CCTTACCTACTCTTGACATCCA(SEQ ID NO.22)。

以及，阳性寡核苷酸单链DNA：

CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC(SEQ IDNO.36)。

其中，每个引物对中的下游引物的5’端以及阳性寡核苷酸单链DNA的5’端带有生物素标记。

需要说明的是，在其他的实施例中，核酸组合可以包括第一至第十引物对中的一种或两种或三种或四种或五种或六种或七种或八种或九种，其均可以根据检测需求进行选择，其均属于本发明的保护范围。

此外，本实施例中，膜芯片表面固定有多种探针，各探针的碱基序列(5’-3’)如下：

toxR(V.c)探针：

CCGCTATCAGAATAAGCAGTCGATTCCC(SEQ ID NO.23)；

ctxAB探针：

ATCCCGTCTGAGTTCCTCTTGCATGATC(SEQ ID NO.24)；

toxR(V.p)探针：

GCGGGTGATTTACAGGTGTCATCAC(SEQ ID NO.25)；

tlh探针：

CAGTGTCATCAACATGAAGTTCTTCGCACC(SEQ ID NO.26)；

tdh探针：

ATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTAC(SEQ ID NO.27)；

trh探针：

CACGACTTCAGGCTCAAAATGGTTAAGC(SEQ ID NO.28)；

vvhA(V.v)探针：

CCCAAACTTGGTTCCAACTGCCG(SEQ ID NO.29)；

toxR(V.m)探针：

CATTCTTGCTGAAAGATTTACCTTTGATCCC(SEQ ID NO.30)；

toxR(V.f)探针：

GACGCTTGGCAGTGTTCAACGATG(SEQ ID NO.31)；

coIH(V.a)探针：

GGCCAACCAGAGTTACTGTATTCAAGC(SEQ ID NO.32)；

内参探针：

CACCTGTCTCAGTGCTCCCGAA(SEQ ID NO.33)；

阳性对照探针(PC)：GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG(SEQ ID NO.34)；

阴性对照探针(NC)：GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC(SEQ ID NO.35)。

上述13种探针按图1所示的位置顺序地分别固定在膜芯片上的相应位置。在其他的实施例中，探针的固定顺序可与本实施例有所不同。

其中，上述膜芯片制作方法可参考如下方法：

(1)探针制备：根据上述探针序列，合成与5’端氨基修饰的探针，用0.5mol/LNaHCO₃分别稀释各探针，制备5μM探针溶液；

(2)探针固定：先对膜芯片活化使其带有羧基，将各种探针溶液按图1所示的位置顺序地分别点制到膜芯片(硝酸纤维素膜)上，探针通过末端的氨基进行固定在膜芯片上。其中，Blank位置点制空白的NaHCO₃溶液。

(3)芯片封闭：采用氢氧化钠终止反应，封闭探针，室温晾干后，保存备用，制成膜芯片。

实施例2

采用上述试剂盒检测待测样本中致病性弧菌的方法，具体如下：

2.1采用3％氯化钠碱性蛋白胨水对样品进行混合增菌培养，取培养后的混合菌液进行DNA提取；该步骤根据需要进行。

2.1按照CTAB法提取待测样本的基因组DNA，并用超微量分光光度计测定DNA溶液质量浓度后备用。

2.2多重PCR体系和条件

PCR扩增的反应体系：

10×PCR Buffer(含Mg²⁺，含UNG酶):5μL；

dNTP(2.5mM each)：5μL；

Taq DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL；

带生物素标记的下游引物(20μM)：1.2μL；上游引物(20μM)：1μL；说明：11种引物对(实施例1提供的)都加入，每个引物对的下游引物1.2μL，上游引物1μL；

待测样本的DNA模板：20-400ng；

阳性寡核苷酸DNA(20μM):0.01μL；

加ddH₂O至总体积50μL。

对上述反应体系进行多重PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程包括UNG酶消化反应和多重PCR循环反应(预变性、变性、退火和延伸)，各反应条件分别为：

UNG酶消化反应：温度37℃，时间5分钟；

多重PCR循环：

预变性：温度95℃，时间3分钟；变性：温度95℃，时间15秒；退火：温度55℃，时间30秒；延伸：温度72℃，时间15秒；35个循环；最后延伸：温度72℃，时间3分钟；保存：温度4℃。

2.3将得到多重PCR产物后，进行膜芯片斑点杂交检测，具体如下。

(1)将固定有探针的膜芯片放入杂交盒中，芯片标签正面朝上，加入去活化液(100mmol/L NaOH)1mL，37℃孵育8min；

(2)加入去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)1mL，60℃孵育5min；

(3)吸除去活化清洗液(2×SSPE，0.1％SDS)，加入杂交体系液(将PCR后产物变性后加入杂交液(2×SSPE，0.1％SDS)中混合)1mL，45℃水平摇床90rpm孵育45min；

(4)吸除杂交体系液，加入预热好的杂交清洗液(2×SSPE，0.5％SDS)1mL，52℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(5)吸除杂交清洗液，加入预热好的酶孵育液(链霉亲和素标记的碱性磷酸酶，按1:2000的比例加入到999.5μL的孵育液(2×SSPE，0.5％SDS)中)，42℃水平摇床90rpm，震荡孵育30min；

(6)吸除酶孵育液，加入预热好的孵育清洗液1(2×SSPE，0.5％SDS)1mL，42℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(7)吸除孵育清洗液1，加入预热好的孵育清洗液2(含：0.3mol/L NaCl，20mmol/LNaH₂PO₄，20mmol/L C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈·2H₂O，pH为7.4)1mL，37℃水平摇床90rpm，震荡清洗5min，洗涤2次；

(8)吸除孵育清洗液2，加入显色液(含BCIP/NBT的混合物，即5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰)1mL，室温静置显色15min。

(9)吸除显色液，加入去离子水1mL室温洗涤2次，待膜芯片干燥后进行结果判读。具体杂交流程如表1。

表1杂交流程表

(10)结果分析：

在实际的样本检测过程中，应当设置空白对照、阴性对照、阳性对照，提高检测结果的准确性。

a)空白对照：使用水作为空白对照样本作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，其余靶点不显色；

b)阴性对照：使用阴性对照样本(除霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌以外的致病菌DNA)作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，内参显色；

c)阳性对照：使用阳性对照样本(含霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌标准菌液中的一种的或多种致病菌的混合的DNA)作为模板，按上述的检测方法进行的结果，PC(阳性质控点)显色，NC(阴性质控点)不显色，内参显色，相应靶点显色(例如是阳性对河流弧菌DNA，则在芯片toxR(V.f)靶点区域有显色)；

同时满足以上三个条件的为有效实验，则可根据显色结果判断所含致病弧菌类别，探针各基因位置阴阳性结果及其对应的致病弧菌阴阳性判断如下：

霍乱弧菌：toxR(V.c)阳性，ctxAB阴性或阳性；ctxAB为毒力因子基因，霍乱弧菌分为含毒力因子ctxAB(例如大部分霍乱弧菌O1群、霍乱弧菌O139群都含有毒力因子ctxAB)或不含毒力因子ctxAB的两种类别，通过检测toxR(V.c)基因可以确定是否有霍乱弧菌，再检测ctxAB基因，可以确定该霍乱弧菌是含有此毒力因子。

副溶血性弧菌：toxR(V.p)和tlh中的至少一个为阳性，tdh(和/或trh)为阴性或阳性；toxR(V.p)和tlh基因中的任意一个基因均可以用于鉴定副溶血性弧菌，tdh和trh为副溶血性弧菌的强致病毒力因子基因，通过检测tdh和/或trh确定该副溶血性弧菌是否具有致病能力等信息。

创伤弧菌：vvhA(V.v)阳性；

拟态弧菌：toxR(V.m)阳性；

河流弧菌：toxR(V.f)阳性；

溶藻弧菌：coIH(V.a)阳性。

需要说明的是：可通过肉眼判读结果，也可采用扫描仪判读结果，以减少人为主观判读带来的误差。扫描仪判读软件根据大量数据统计各靶点信号值，设定各靶标阈值，若信号值大于阈值判定为阳性，小于阈值判定为阴性。

实施例3

按照天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：DP302)的说明分别提取不同致病弧菌标准菌株(霍乱弧菌(不具有毒力因子ctxAB)、霍乱弧菌O1群(具有毒力因子ctxAB)、副溶血弧菌1(不具有毒力因子tdh或trh)、副溶血弧菌2(具有毒力因子tdh和trh)、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌及溶藻弧菌)基因组DNA。提取后的DNA用超微量分光光度计(Thermo NanoDrop 2000)测定浓度及质量后备用。

用实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，根据杂交点显色情况参照图1进行结果判读，结果如图2所示。

图2显示了霍乱弧菌(非霍乱弧菌O1或霍乱弧菌O139群，不具有毒力因子ctxAB)、霍乱弧菌O1群(具有毒力因子ctxAB)、副溶血弧菌1(不具有毒力因子tdh或trh)、副溶血弧菌2(具有毒力因子tdh和trh)、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌及溶藻弧菌的检测结果，与预期结果相符合，该试剂盒和方法能够较好地区分各种致病性弧菌，无交叉反应，表明实施例1的试剂盒和实施例2的方法具有较好的特异性。

实施例4

在含3％氯化钠碱性胰蛋白胨水中加入25g带鱼，并同时加入霍乱弧菌(不具有毒力因子ctxAB)、副溶血弧菌(不具有毒力因子tdh或trh)、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌标准菌液(各标准菌液浓度为10CFU/mL)各0.2mL，35℃恒温培养24小时。

用实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，根据杂交点显色情况参照图1进行结果判读，结果如图3所示。

判读结果为该样品检测到霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌，与预期结果相符合，表明该实施例1的试剂盒和实施例2的方法具有较好的灵敏度，在低至0.48CFU/g的浓度下仍然能够检测出。

实施例5

按照天根生化科技(北京)有限公司粪便基因组DNA提取试剂盒(货号：DP328)的说明提取腹泻物基因组DNA。提取后的DNA用超微量分光光度计(Thermo NanoDrop 2000)测定浓度及质量后备用。

用实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，根据杂交点显色情况参照图1进行结果判读，结果如图4所示。

结果显示该腹泻样本中含有副溶血弧菌以及此副溶血弧菌含有毒力因子tdh。

实施例6

按照天根生化科技(北京)有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：DP302)的说明提取嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌基因组DNA。提取后的DNA用超微量分光光度计(Thermo NanoDrop 2000)测定质量后备用。

用实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法分别对上述样本进行检测，根据杂交点显色情况参照图1进行结果判读，结果如图5所示。

结果显示该样本中未检测到目标致病性弧菌霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌，这几种致病弧菌结果均为阴性，与预期结果相符，该结果表明实施例1的试剂盒和实施例2的方法具有较好的特异性，能够有效区分目标致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌)和非目标致病性弧菌。

综上，定性PCR检测一般采用凝胶电泳分析，具有一定的局限性，只能检测到10ng以上的DNA条带，因此在目的片段产量较低时无法检测到。实时荧光定量PCR通过检测荧光信号的强弱从而实时检测PCR产物扩增量，可以对转基因成分进行定量分析，但是只能做单重或最高3-4重，无法提高其通量。基因芯片是一种生物芯片，首先将大量基因探针固定在硅片、玻璃、尼龙膜等固相支持物表面上，然后按照碱基互补的特性与标记好的样品DNA进行杂交，最终利用荧光等方法检测信号获取样品信息。

本发明将多重PCR与膜芯片杂交技术结合，利用11对特异引物对，可同时对多达11种特异基因片段进行检测，并通过PCR产物与膜芯片上探针的杂交进一步保证检测结果的特异性与准确率，较普通定性PCR和荧光定量PCR的检测效率和准确性有所提高。膜芯片杂交中使用的反向斑点杂交技术，可使PCR产物与膜芯片上探针的杂交特异性的结合，而生物素的酶联放大作用则大大提高了PCR产物的检测灵敏度。膜芯片技术最后通过碱性磷酸酶与BCIP/NBT的显色作用，将杂交结果直观的显示在膜芯片上，不需借助额外的仪器，肉眼即可判断检测结果，大大简化了检测步骤。

综上所述，本发明可对6种致病弧菌以其毒力因子同时检测，并且检测灵敏度和检测通量高，特异性好，结果直观可见，大大提高了检测效率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川华汉三创生物科技有限公司

<120> 一种用于致病性弧菌检测的核酸组合及其应用

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attgacggct acgccatcga ca 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accgcagcca gccaatgttg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catctggatg aggactgtat gc 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccaagagga cagagtgagt a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaggcagcc agatgttgat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctcagttcc gtcagattgg t 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gttagcgtct cgaacaaggc gt 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagtgcttct gcataatccg cttt 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcctttgagc ttccatctgt c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

accgctgcca ttgtatagtc t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttgtgaagac cgttgagagg 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaatcgttg atgactactg ga 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcgcaccaca ctgttcgact gt 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cggttaacgg ctggagctgt ca 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcgttgtgac agggaaatgc tg 22

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcctaatcgg atgatctctt caggtg 26

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctgttggttg ccgtcatact gc 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgggtgattg attggcgtgc t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cggcattctc aaagtcacca g 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ggaatggtac gggcaaccta a 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tccacgatta ctagcgattc c 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccttacctac tcttgacatc ca 22

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccgctatcag aataagcagt cgattccc 28

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atcccgtctg agttcctctt gcatgatc 28

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcgggtgatt tacaggtgtc atcac 25

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cagtgtcatc aacatgaagt tcttcgcacc 30

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

atggtcaatc agtattcaca acgtcaggta c 31

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cacgacttca ggctcaaaat ggttaagc 28

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cccaaacttg gttccaactg ccg 23

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cattcttgct gaaagattta cctttgatcc c 31

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gacgcttggc agtgttcaac gatg 24

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggccaaccag agttactgta ttcaagc 27

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cacctgtctc agtgctcccg aa 22

<210> 34

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gcatccagat cagaagcaat aatgagcagt gcgagaagaa cgagtgtcca aagtaccag 59

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

ggttccttga gaaatgtttt acgggattac ttccatgttt gttggatgat cctattttc 59

<210> 36

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ctggtacttt ggacactcgt tcttctcgca ctgctcatta ttgcttctga tctggatgc 59

Claims

1.一种用于致病性弧菌检测的核酸组合，其特征在于，其包括如下引物对中的一种或多种的组合：

用于检测霍乱弧菌toxR基因的第一引物对，其包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；

用于检测副溶血性弧菌toxR基因的第三引物对，其包括：包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；

用于检测拟态弧菌toxR基因的第八引物对，其包括：SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物；

用于检测河流弧菌toxR基因的第九引物对，其包括：SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物；

用于检测溶藻弧菌coIH基因的第十引物对，其包括：SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物。

2.根据权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括碱基序列如SEQID NO.23-32所示的探针中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的核酸组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有用于固定至膜芯片上的第一连接基团。

4.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述第一连接基团为氨基。

5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括阳性对照探针，所述阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.34所示。

6.根据权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括用于与阳性探针杂交结合的阳性寡核苷酸单链DNA分子，阳性寡核苷酸单链DNA分子的碱基序列如SEQ IDNO.36所示。

7.根据权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述阳性对照探针的5’端标记有用于固定至膜芯片上的第二连接基团。

8.根据权利要求7所述的核酸组合，其特征在于，所述第二连接基团为氨基。

9.根据权利要求1-4任一项所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括阴性对照探针，所述阴性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO.35所示。

10.权利要求1-9中任一项所述的核酸组合在制备致病弧菌检测试剂盒中的应用。