CN108004339A - 一种检测阿米巴原虫的lamp引物组、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测阿米巴原虫的LAMP引物组、试剂盒及方法。该LAMP引物包括外引物amb‑F3和amb‑B3；内引物amb‑FIP和amb‑BIP和环引物LB。检测试剂盒包括LAMP引物组，并用于快速检测阿米巴原虫。检测方法包括(1)提取待检样品的DNA；(2)LAMP反应体系建立；(3)LAMP反应检测。本发明的方法可实时监测反应并且定量、快速检测，具有特异性强等优点，为简便、快速地检测阿米巴原虫带来便利。

Description

一种检测阿米巴原虫的LAMP引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种检测的LAMP引物组、试剂盒及方法。

背景技术

阿米巴原虫病主要是由溶组织内阿米巴(Entamoeba hi stoly ti ca)引起的一种高发病率、高度致病性的人兽共患寄生性原虫病。该原虫多寄生于人和动物的肠道和肝脏，引发阿米巴痢疾或肝脓肿。临床上表现发热、腹痛腹胀、呕吐、恶臭痢疾血便等症状，病理剖解多见肠炎、肠道出血水肿、溃疡、增生等，个别病例肝脏上出现脓肿。阿米巴原虫病分布范围广泛，易感动物较多，呈世界性流行传播。自1875年Feder Lo sch首次在人体发现该原虫以来，该病已给人和动物的健康带来了严重的影响，同时也造成了巨大的经济损失。比如食蟹猴等动物被阿米巴原虫感染，不仅给养殖业带来经济损失，还严重影响动物质量和动物跟踪研究检测结果的准确性，同时威胁动物饲养人员、兽医工作者及相关密切接触人群身体健康，因此快速的检测出阿米巴原虫感染情况，及时控制清除病原，保持动物的清洁，具有重要的公共卫生意义和研究意义。

溶组织内阿米巴以滋养体和包囊两种存在形式。滋养体大小为7um～60um，形态多变，其胞质分内外两层，内质较浓密呈颗粒状，外质透明，运动时外质伸出，形成伪足，能做定向运动，细胞核呈泡状，核膜薄，核仁细小，居中或偏离中心。包囊多呈球形,直径为10um～16um，未染色时为一折光性圆形小体，碘染色后呈黄色，外周包围一层透明的囊壁，内含1个～4个核,每个核具有1个位于中央的核仁。未成熟包囊，有1个～2个核，常见含有染成棕色的糖原泡和透明的杆状拟染色体；成熟包囊具有4个核，糖原泡和拟染色体不易见到。目前用于实验动物原虫检测还是采用粪便涂片或沉淀染色法等传统检测手段，如GB/T18448.9,GB/T 18448.10，这些方法虽然要求设备仪器不高，但由于原虫体积较小，常常受杂质影响较大，显微镜检查时检出率较低；染色法需要配制试剂种类多，步骤繁琐，要求显微镜操作者非常熟悉各类原虫及卵囊形态，具有超强辨别能力和较好的视力，否则受人为因素影响较大。对于大批量的样品检测，需要大量的人力物力，特别是显微镜观察者眼睛极易疲劳，难以在短时间内完成大量检测样品的工作。因此利用现代新的分子生物学知识和新仪器设备研究开发新的快速检测原虫病方法，制定出操作规程或标准，非常迫切。在人医学方面有学者研究建立了免疫学诊断法及分子生物学PCR检测方法，部分关键技术尚需研究尚未广泛推广使用，其实用性需进一步研究，PCR检测方法需要复杂的仪器设备，成本高，不适合基层和现场检测。而LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、不需要昂贵仪器等优势，可在早期预防控制疾病扩散中发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测阿米巴原虫的LAMP引物组、试剂盒、方法，以及在阿米巴原虫检测中的用途。本发明提供一种适合LAMP引物组，并构建试剂盒，能够快速、实现实时定量检测，为基层提供更为简便、快捷准确地检测阿米巴原虫的方法。

一种检测阿米巴原虫的LAMP引物组，包括以下LAMP引物：外引物是amb-F3和amb-B3；内引物是amb-FIP和amb-BIP；所述的环引物是LB；

其中：

amb-F3:GGCGCGTAAATTACCCAA

amb-B3:GCGTTTTAATCAACAACTT

amb-FIP:CCTTCAAGACATGCTTACGCACCAACAGATAGAAGAGGTAGTGAC

amb-BIP:GAGTAAGAAGCAAAGAGTCTTACGATTGGAGCTGGAATTACCG

LB:AATCAATTGGAGGGCAAGTCTG。

本发明的检测阿米巴原虫的试剂盒，包括上述的LAMP引物组。

检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，采用上述的LAMP引物组检测阿米巴原虫。

本发明的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，具体包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)LAMP(环介导等温扩增反应)反应体系建立；以每25μl体积的LAMP反应体系为计，

上述的2×反应缓冲液可直接采购日本荣研公司或荣研生物科技(中国)有限公司的，Loopamp品牌，其组分包含Tris-HCl(pH8.8)、KCl、MgSO₄、(NH4)₂SO₄、Tween20、Betaine、dNTPs。

(3)LAMP反应检测。

上述提取待检样品的DNA是按照粪便基因组DNA提取试剂盒提取待检样品的DNA。

作为技术方案的优选，LAMP反应检测包括特异性检测、敏感性检测和实时定量检测。LAMP反应温度60～65℃，反应20-35min间出现扩增。检测过程采用密闭全程监控。

本发明的特异性检测是以检测样品的DNA为模板，用实时浊度仪LA-320c在60～65℃条件下进行LAMP扩增，反应在20-35min间出现扩增，从而检验特异性。

本发明的敏感性检测是以检测样品的DNA为模板，用LAMP外引物amb-F3/amb-B3进行PCR扩增，然后进行胶回收、克隆、转化、测序；将测序正确的序列进行提取质粒并测浓度；将此质粒作为标准样品进行梯度稀释，用实时浊度仪LA-320c在60～65℃条件下对样品进行敏感性试验。

作为技术方案的优选，LAMP反应的最佳温度63℃，反应20-35min间出现扩增。

本发明的LAMP引物组在制备检测阿米巴原虫的试剂盒中的运用。

本发明的有益效果是：

1)特异性强，所检测的阴性对照株均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。

2)灵敏度高，PCR检测方法的检测限为2.567×10^-3ng/μL，而用本发明检测方法，检测限约为2.567×10^-4ng/μL，是PCR方法的10倍左右。

3)检测迅速得出结果，效率高。普通的PCR整个过程在2-3小时左右才能得出结果，一般的LAMP方法也要在1小时左右得出结果，而本发明的检测方法反应在20-35min间出现扩增，能显著提高工作效率。

4)可实时定量，本发明利用Tubidimeter real-time LA-320浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的阿米巴拷贝数，达到定量检测产物的目的。

5)本发明寻找出合适的LAMP引物组为后续精确检测、提高检测效率奠定了基础。

6)本发明利用现代分子生物学理论知识、新的核酸扩增技术及先进的LAMP实时浊度仪，建立一套快速、灵敏、准确检测阿米巴原虫的环介导等温扩增技术(LAMP)，该技术不同于以肉眼评判结果的常规LAMP方法(常规LAMP方法是采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，只能分析LAMP反应的最终结果，且存在气溶胶污染实验室的危险，由于缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定)。本发明使用的LAMP方法它根据反应液浊度的变化由仪器灵敏、准确地读取数据进行判断，不仅敏感度高，特异性强，不造成环境污染，快速得出结果，并且可实时定量检测，而且操作简便，只需按建立的体系加样即可，为简便、快捷准确地检测阿米巴原虫带来便利。本发明的专利技术将为早期诊断和大批量检测样品提供技术支持，为今后食蟹猴等动物阿米巴原虫病临床诊断、病原监测、进出口检验检疫以及综合防控提供指导。

附图说明

图1是本方明LAMP方法特异性检测结果；1株阿米巴反应管出现浊度的上升曲线，5株阴性对照株反应管均无扩增。

图2是本发明的LAMP方法进行的敏感性检测结果图；质粒样品原始浓度为25.670ng/μL，从图2可以看出，LAMP方法的检测到浓度为2.567×10^-4ng/μL。

图3是传统的PCR方法进行的敏感性检测结果图；质粒样品原始浓度为25.670ng/μL，从图3可以看出，PCR方法检测限为2.567×10^-3ng/μL。

图4本发明阿米巴定量标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间阿米巴的拷贝数。

具体实施方式

本发明用下列实施例进行说明，但不是对本发明的使用范围的限制。

实施例

1、材料的准备

阿米巴、鞭虫、纤毛虫、大肠杆菌、沙门氏菌均为广西兽医研究所分离保存。粪便基因组DNA提取试剂盒、2×ES Taq MasterMix(Dye)、Marker DM2000、100bp Ladder、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速质粒小提试剂盒、DH5α等，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；PMD18-T，购自Takara公司。实时浊度仪、LAMP试剂盒购于日本荣研公司。PCR仪，购自天根生化科技有限公司。

2、LAMP引物的设计与合成

根据GenBank中已经发表的溶组织内阿米巴序列，利用在线软件http:// primerexplorer.jp/e/设计LAMP引物，得到具体引物信息如下：

amb-F3:GGCGCGTAAATTACCCAA

amb-B3:GCGTTTTAATCAACAACTT

amb-FIP:CCTTCAAGACATGCTTACGCACCAACAGATAGAAGAGGTAGTGAC

amb-BIP:GAGTAAGAAGCAAAGAGTCTTACGATTGGAGCTGGAATTACCG

LB:AATCAATTGGAGGGCAAGTCTG。

3、待检样品的DNA抽提

DNA抽提按照粪便基因组DNA提取试剂盒进行提取，其具体步骤操作如下：

(1)取100-300mg粪便样本，置于离心管中，加入1mL Buffer SW，涡旋振荡3-5min，使样本均匀分散于溶液中，12000rpm离心1min，弃掉上清。

(2)加入1mL Buffer SL，涡旋振荡3-5min，使样本均匀分散于溶液中，65℃水浴20min，期间可每隔5min涡旋振荡15s。12000rpm离心5分钟，将上清移至新的离心管中。

(3)向上清液中加等体积Buffer GL，颠倒混匀15-25次，冰上放置5min，12000rpm离心5min。

(4)将步骤3所得上清加入已装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(5)向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(7)重复步骤6。

(8)12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

(9)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50-100μLBuffer GE，室温放置2-5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存。

4、LAMP反应体系建立

按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：

2×反应缓冲液组分包含Tris-HCl(pH8.8)40mM、KCl 20mM、MgSO₄ 16mM、(NH4)₂SO₄20mM、Tween20 0.2％、Betaine 1.6M、dNTPs 2.8mM每种。

LAMP反应在以实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本发明的扩增反应，条件是反应温度60～65℃，反应时间为30～60min。

5、LAMP检测方法

1)特异性检测

分别提取阿米巴、鞭虫、纤毛虫、大肠杆菌、沙门氏菌的DNA为模板，用实时浊度仪LA-320c在63℃条件下进行各虫(菌)株的LAMP扩增，检验LAMP方法的特异性，得到特异性结果。

对1株阿米巴原虫和5株阴性对照虫(菌)株进行LAMP扩增，结果如图1所示，1株阿米巴原虫反应管在20分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，5株阴性对照虫(菌)株反应管曲线均无扩增情况出现，LAMP呈阴性结果。说明建立阿米巴原虫的LAMP快速检测方法具有良好的特异性。

2)敏感性检测

以阿米巴DNA为模板，用LAMP外引物(amb-F3/amb-B3)进行PCR扩增，然后进行胶回收、克隆、转化、测序。将测序正确的序列进行提取质粒并测浓度。以阿米巴重组质粒PMD18-T-16S rRNA进行10倍梯度稀释6个稀释度，各取2μL作为模板分别进行LAMP和PCR敏感性试验，结果如图2和图3。从图2可以看出，LAMP方法的检测到浓度为2.567×10^-4ng/μL；从图3可以看出，PCR方法检测线为2.567×10^-3ng/μL。说明建立阿米巴原虫的LAMP快速检测方法具有良好的敏感性，比PCR检测方法高出10倍。

3)阿米巴定量标准曲线的绘制

以阿米巴重组质粒PMD18-T-16S rRNA进行10倍梯度稀释6个稀释度，各取2μL作为模板进行LAMP扩增。

设置对照：浓度为2.567×10¹ng/μL、2.567×10⁰ng/μL、2.567×10^-1ng/μL、2.567×10^-2ng/μL、2.567×10^-3ng/μL、2.567×10^-4ng/μL、2.567×10^-5ng/μL、2.567×10^-6ng/μL的标准重组质粒PMD18-T-16S rRNA样品各一个，因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间(表1)做成标准曲线，获得标准曲线方程：y＝0.3143x-7.3523，如图4所示。从标准曲线方程来看相关系数R²为0.9967，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10^-y，再乘以基数2.567，即2.567×10^-y ng/μL。根据拷贝数换算公式copies/μL＝(6.02×10²³×(ng/ul x 10^-9))/(DNA length×660)，DNA length为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+177＝2870bp，将其换算成拷贝数(copies/μL)：6.02×10²³×(2.567x10^-y×10^-9)/(22870×660)，简化为：8.157×10⁸×10^-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y＝2.077，则浓度为10^-2.077，再乘以基数2.567，即为该试验样品点的浓度，拷贝数为8.157×10⁸×10^-2.077，即8.157×10^6.077，从而达到定量的效果。

表1

时间(min)	20.1	23.9	26.5	29.3	32.8
						标准值(-LOG)	-1	0	1	2	3

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 一种检测阿米巴原虫的LAMP引物组、试剂盒及方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgcgcgtaa attacccaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgttttaat caacaactt 19

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccttcaagac atgcttacgc accaacagat agaagaggta gtgac 45

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagtaagaag caaagagtct tacgattgga gctggaatta ccg 43

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatcaattgg agggcaagtc tg 22

Claims (10)

1.一种检测阿米巴原虫的LAMP引物组，其特征在于，包括以下LAMP引物：

外引物是amb-F3和amb-B3；内引物是amb-FIP和amb-BIP；所述的环引物是LB；

其中：

amb-F3:GGCGCGTAAATTACCCAA

amb-B3:GCGTTTTAATCAACAACTT

amb-FIP:CCTTCAAGACATGCTTACGCACCAACAGATAGAAGAGGTAGTGAC

amb-BIP:GAGTAAGAAGCAAAGAGTCTTACGATTGGAGCTGGAATTACCG

LB:AATCAATTGGAGGGCAAGTCTG。

2.一种检测阿米巴原虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的LAMP引物组。

3.一种检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1或2所述的LAMP引物组检测阿米巴原虫。

4.根据权利要求3所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待检样品的DNA；

(2)LAMP反应体系建立；以每25μl体积的LAMP反应体系为计，

(3)LAMP反应检测。

5.根据权利要求4所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述LAMP反应检测包括特异性检测、敏感性检测和实时定量检测。

6.根据权利要求4所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述LAMP反应温度60～65℃，反应20-35min间出现扩增。

7.根据权利要求5所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述特异性检测是以检测样品的DNA为模板，用实时浊度仪在60～65℃条件下进行LAMP扩增，反应在20-35min间出现扩增，从而检验特异性。

8.根据权利要求5所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述敏感性检测是以检测样品的DNA为模板，用LAMP外引物amb-F3/amb-B3进行PCR扩增，然后进行胶回收、克隆、转化、测序；将测序正确的序列进行提取质粒并测浓度；将此质粒作为标准样品进行梯度稀释，用实时浊度仪在60～65℃条件下对样品进行敏感性试验。

9.根据权利要求4所述的检测阿米巴原虫的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，所述提取待检样品的DNA是按照粪便基因组DNA提取试剂盒提取待检样品的DNA。

10.一种如权利要求1或2所述的LAMP引物组在制备检测阿米巴原虫的试剂盒中的用途。