CN105886499A

CN105886499A - 一种检测大豆疫霉菌的lamp试剂盒及其专用引物

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Publication number: CN105886499A
Application number: CN201610064023.8A
Authority: CN
Inventors: 于杰; 李辉; 李献刚; 邢颖新; 李雪梅; 薛春生; 李奉京
Original assignee: BEIJING LANPU BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; Dongguan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau Of Prc
Current assignee: BEIJING LANPU BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd; Dongguan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau Of Prc
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: CN105886499B

Abstract

本发明公开了一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物。本发明所提供的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的专用引物由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3组成，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。实验证明，本发明提供的一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物能特异性的检测大豆疫霉菌，与其他菌无交叉反应，对大豆疫霉菌的基因组DNA的最小检测限为1.44pg。

Description

一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物。

背景技术

大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann)属于藻菌界，卵菌门，霜霉目，腐霉科，疫霉属。大豆疫霉菌喜欢生活在潮湿凉爽的环境中，多数大豆疫霉菌株的菌丝生长最适温度为25～28℃，最高为32～35℃，最低为5℃，其无性繁殖产生游动孢子的最适温度为20℃，最低温度为5℃，在潮湿有水膜存在时，孢子囊产生大量的游动孢子，游动孢子游动一段时间后休眠形成休止孢，遇到合适寄主组织，休止孢萌发产生芽管侵入寄主表皮。

大豆疫霉菌可以在大豆的各个生育期为害。在大豆出苗前可以引起种子腐烂、出苗前腐烂，出苗后可以引起植株枯萎。一般苗期感病植株表现为出苗差、近地表茎部出现水浸状病斑、叶片变黄萎蔫，严重时植株猝倒死亡。成株期植株受侵染后下部叶片变黄，随后上部叶片逐渐变黄并很快萎蔫；近地表茎部病斑褐色，并可向上扩展，茎皮层及髓变褐；根腐烂，根系发育不良；未死亡病株的荚数明显减少，空荚、瘪荚较多，籽粒皱缩。由于在潮湿条件下，根部侵染的病菌可以产生大量游动孢子，孢子随雨水飞溅，为害茎部和叶片，甚至出现病荚，其症状为绿色豆荚基部出现水浸状斑，病斑逐渐变褐并从荚柄蔓延至荚尖，最后整个豆荚呈黄褐色干枯，种子失水干瘪。为此，开展大豆疫霉菌的实验室诊断研究具有重要意义。目前用于大豆疫霉菌诊断的实验室方法很多，如大豆霉疫菌的分离鉴定和PCR技术的检测方法，但是其非常耗时且依赖昂贵的检测设备，很难在农业上推广应用。为此，急需建立一种敏感、准确、快速、简便的大豆疫霉菌实验室诊断方法。虽然基于也已建立，但PCR需要昂贵的仪器，而且操作繁琐。

近年来开发的环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上4个特异区域的引物和1个具有链置换特性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等温条件下高效扩增靶基因，灵敏度和特异性高，该方法已广泛应用于病毒、类病毒、细菌、真菌及转基因的检测，而迄今尚未应用该技术检测大豆疫霉菌的报道。

发明内容

本发明所要解决技术问题是如何检测大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmannet Gerdemann)。

本发明首先提供了一种成套引物，由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3组成，它们均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。其中，序列表的序列1由44个核苷酸组成，序列表的序列2由44个核苷酸组成，序列表的序列3由24个核苷酸组成，序列表的序列4由22个核苷酸组成，序列表的序列5由21个核苷酸组成。所述成套引物可以对大豆疫霉菌的基因组DNA进行特异性的环介导等温扩增。

所述成套引物中，所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF、所述引物F3和所述引物B3的摩尔比可为8:8:4:1:1。

所述成套引物中，各引物的量如下：1.6μmol所述引物FIP、1.6μmol所述引物BIP、0.8μmol所述引物LF、0.2μmol所述引物F3、0.2μmol所述引物B3。

所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是引物中各种单链DNA摩尔数之和。

所述成套引物的用途为如下a)或b)或c)或d)：a)制备用于检测或辅助检测大豆疫霉菌的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有大豆疫霉菌；c)制备用于鉴定或辅助鉴定大豆疫霉菌的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。

本发明还保护所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)或d)：a)制备用于检测或辅助检测大豆疫霉菌的试剂盒；b)检测或辅助检测待测样品中是否含有大豆疫霉菌；c)制备用于鉴定或辅助鉴定大豆疫霉菌的试剂盒；d)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。

本发明还保护含有所述成套引物的试剂盒。所述试剂盒的用途为如下e)或f)：e)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌；f)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。

所述试剂盒还可包括Bst DNA聚合酶和/或甜菜碱。

所述试剂盒还可包括荧光显色剂。

所述荧光显色剂具体可为钙黄绿素荧光染料。

所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述试剂盒的制备方法可为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)：

(Ⅰ)所述成套引物中各条引物分别单独包装；

(Ⅱ)所述成套引物中各条引物按照所述摩尔比混合在一起；

(Ⅲ)所述成套引物中各条引物按照所述量混合在一起。

本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下e)或f)：e)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌；f)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。

本发明还提供了一种检测待测样品是否含有大豆疫霉菌的方法，包括如下步骤：

提取待测样品的总DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总DNA的环介导等温扩增，则待测样品中含有或疑似含有大豆疫霉菌；如果所述成套引物不能实现对所述总DNA的环介导等温扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。

所述“检测待测样品是否含有大豆疫霉菌的方法”具体可为方法一，包括如下步骤：提取待测样品的总DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增，如果浊度曲线呈现为典型的“S型”、则待测样品中含有或疑似含有大豆疫霉菌，如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。

所述“检测待测样品是否含有大豆疫霉菌的方法”具体可为方法二，包括如下步骤：提取待测样品的总DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增(反应体系中含有钙黄绿素荧光染料)，得到待测样品反应液，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则待测样品中含有或疑似含有大豆疫霉菌，如果待测样品反应液为橙色、则所述待测样品中不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。

本发明还保护一种鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌的方法，包括如下步骤：

提取待测菌的基因组DNA，以所述成套引物进行转录环介导等温扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述基因组DNA的转录环介导等温扩增，则待测菌为候选的大豆疫霉菌；如果所述成套引物不能实现对所述基因组DNA的转录环介导等温扩增，则所述待测菌为候选的非大豆疫霉菌。

所述“鉴定待测菌是否为大豆疫霉菌的方法”具体可为方法三，包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增，如果浊度曲线呈现为典型的“S型”、则待测菌为候选的大豆疫霉菌，如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测菌为候选的非大豆疫霉菌。

所述“鉴定待测菌是否为大豆疫霉菌的方法”具体可为方法四，包括如下步骤：提取待测样品的基因组DNA，以所述成套引物进行环介导等温扩增(反应体系中含有钙黄绿素荧光染料)，得到待测样品反应液，目测待测样品反应液的颜色变化，如果待测样品反应液为绿色、则待测菌为候选的大豆疫霉菌，如果待测样品反应液为橙色、则所述待测菌为候选的非大豆疫霉菌。

所述钙黄绿素荧光染料可为向31.12mg钙黄绿素(sigma公司产品，产品目录号为B2346)和197.9mg氯化锰(sigma公司产品，产品目录号为G5468)中加入10mL超纯水得到的染料。

所述环介导等温扩增可在60-67℃条件下进行。

所述环介导等温扩增具体可在65℃条件下进行。

所述待测样品可为微生物样品。

所述待测菌可为大豆疫霉菌或辣椒疫霉。

实验证明，本发明提供的一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物能特异性的检测大豆疫霉菌，而且与其他菌无交叉反应，如辣椒疫霉。本发明提供一种检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒及其专用引物对大豆疫霉菌的基因组DNA的最小检测限为1.44pg，比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。

附图说明

图1为检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的最佳反应条件的筛选。

图2为检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的灵敏度。

图3为检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的灵敏度。

图4为普通PCR检测大豆疫霉菌的灵敏度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann et Gerdemann)记载在如下文献中：宋志刚，郭成亮，赵曙郭等.大豆疫霉菌的分离与鉴定[J].菌物研究，2008.，公众可从中华人民共和国东港出入境检验检疫局(即申请人处)获得上述材料。

钙黄绿素荧光染料为向31.12mg钙黄绿素(sigma公司产品，产品目录号为B2346)和197.9mg氯化锰(sigma公司产品，产品目录号为G5468)中加入10mL超纯水得到的染料。

Tris·HCl(pH8.8)为上海生科生物科技有限公司产品，产品目录号为ZC12458；BstDNA聚合酶为NEB公司产品，产品目录号为D4579；甜菜碱为sigma公司产品，产品目录号为B3813；MgSO₄为国药集团化学试剂有限公司产品，产品目录号为TV25671；dNTP为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为SF357898；KCl为国药集团化学试剂有限公司产品，产品目录号为TV24673；(NH₄)₂SO₄为国药集团化学试剂有限公司产品，产品目录号为TV17360；0.1％Tween20为FLUKA公司产品，产品目录号为Y245C1。

实施例1、检测大豆疫霉菌的LAMP成套引物的制备

本实施例的检测大豆疫霉菌的LAMP成套引物由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3组成，各条引物均为单链DNA分子，它们的核苷酸序列依次如序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5所示。

引物序列如下：

引物FIP:5’-gtccgccaccgatgattcgacgattaatcaaccatcactcaccg-3’；

引物BIP：5’-ccaacgtgggttcggattggaccttcttgggtactgtgtaccag-3’；

引物LF：5’-gatgtaggatgattggatgaacac-3’；

引物F3：5’-gcagcgtcctatcacctagtgc-3’；

引物B3：5’-acggcgtattgagggttgctg-3’。

制备引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3。

实施例2、利用检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒检测待测样品

一、检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的制备

制备检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒，包括试剂盒C或试剂盒D：

试剂盒C为将反应试剂C、空白对照和阳性对照组装在一起得到的产品；

试剂盒D为将反应试剂D、空白对照和阳性对照组装在一起得到的产品。

其中，所述反应试剂C，包括20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP(每种)，8U Bst DNA聚合酶、引物FIP和引物BIP各1.6μmol、引物LF 0.8μmol、引物F3和引物B3各0.2μmol，用去离子水补至23μL。

所述反应试剂D，包括20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱，8mM MgSO₄，1.4mM dNTP(每种)，8U Bst DNA聚合酶、引物FIP和引物BIP各1.6μmol、引物LF 0.8μmol、引物F3和引物B3各0.2μmol、钙黄绿素荧光染料1μL，用去离子水补至24μL。

所述阳性对照为大豆疫霉菌的基因组DNA，使用时加入2μL。

所述空白对照为灭菌超纯水，使用时加入2μL。

二、利用步骤一制备的试剂盒C确立LAMP扩增最佳反应条件

1、提取大豆疫霉菌的基因组DNA，基因组DNA的浓度为72ng/μL。

2、LAMP

具体的检测方法如下：

向试管中加入23μL反应试剂C和2μL步骤1提取的大豆疫霉菌的基因组DNA得到反应液，然后将反应液于60℃反应60分钟。以反应时间为横坐标，浊度仪测量的浊度为纵坐标，得到浊度曲线。

按照上述方法，将60℃替换为61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃或67℃，其它步骤均不变，得到相应的浊度曲线。

结果表明(图1)，所有的浊度曲线均呈现典型的“S型”。可见，LAMP扩增反应条件可为60℃～67℃、反应60min。LAMP扩增最佳反应条件具体可为65℃、反应60min。

三、利用步骤一制备的试剂盒D检测待测样品

1、提取大豆疫霉菌的基因组DNA，大豆疫霉菌的基因组DNA的浓度为72ng/μL。

2、LAMP

具体的检测方法如下：

(1)向试管中加入24μL反应试剂D加入2μL大豆疫霉菌的基因组DNA得到反应液，然后将反应液于65℃反应60min。反应结束后，观察反应液的颜色变化。

按照上述方法，将大豆疫霉菌的基因组DNA替换为灭菌超纯水，其它步骤均不变。反应结束后，观察反应液的颜色变化。

(2)结果观察和判定：如果反应液的目测颜色为绿色、则含有或疑似含有大豆疫霉菌；如果反应液的目测颜色为橙色、则不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。

实验结果表明：加入大豆疫霉菌的基因组DNA的试管进行LAMP后，反应液目测颜色为绿色；而加入灭菌超纯水的试管进行LAMP后，反应液目测颜色为橙色。结果表明，本发明提供的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒可准确的检测大豆疫霉菌。

实施例3、实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的特异性

以实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒C进行特异性实验，实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、分别提取大豆疫霉菌的基因组DNA和辣椒疫霉的基因组DNA，大豆疫霉菌的基因组DNA和辣椒疫霉的基因组DNA的浓度均为50ng/μL。

2、向试管中加入23μL反应试剂C和2μL步骤1提取的大豆疫霉菌的基因组DNA或辣椒疫霉的基因组DNA得到反应液，然后将反应液于65℃反应60分钟。以反应时间为横坐标，浊度仪测量的浊度为纵坐标，得到浊度曲线。

实验结果表明，加入大豆疫霉菌基因组DNA的试管进行LAMP得到典型的“S型”扩增曲线，加入辣椒疫霉基因组DNA的试管进行LAMP不能得到典型的“S型”扩增曲线。

实施例4、实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒的灵敏度

一、以实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒C进行灵敏度实验，实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、提取大豆疫霉菌的基因组DNA，命名为DNA1，DNA1中DNA浓度为72ng/μL。

2、吸取1mL DNA1加入盛有9ml无菌超纯水中的试管中充分混匀，得到DNA2；以此类推制成DNA3、DNA4、DNA5、DNA6和DNA7。使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的DNA浓度，分别为7.2ng/μL、720pg/μL、72pg/μL、7.2pg/μL、0.72pg/μL和0.072pg/μL。

3、LAMP

(1)向试管中加入23μL反应试剂C和2μL步骤1制备的DNA1得到反应液，然后将反应液于65℃反应60min。以反应时间为横坐标，浊度仪测量的浊度为纵坐标，得到浊度曲线。

按照上述方法，将DNA1分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7和灭菌超纯水，其它步骤均不变，得到相应的浊度曲线。

(2)结果观察和判定：如果浊度曲线呈现典型的“S型”、则待测样品中含有或疑似含有大豆疫霉菌；如果浊度曲线呈现为水平直线、则所述待测样品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。

实验结果见图2，向反应试剂C中加入DNA1、DNA2、DNA3、DNA4、DNA5或DNA6进行LAMP均得到典型的“S型”扩增曲线，而向反应试剂C中加入DNA7或灭菌超纯水进行LAMP得到的扩增曲线均为水平的直线。

二、以实施例2制备的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒D进行灵敏度实验，实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、同步骤一中1。

2、同步骤一中2。

3、LAMP

具体的检测方法如下：

(1)向试管中加入24μL反应试剂D加入2μL DNA1得到反应液，然后将反应液于65℃反应60min。反应结束后，观察反应液的颜色变化。

按照上述方法，将DNA1分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7和灭菌超纯水，其它步骤均不变。反应结束后，观察反应液的颜色变化。

实验结果见图3(1为DNA1，2为DNA2，3为DNA3，4为DNA4，5为DNA5，6为DNA6，7为DNA7，8为灭菌超纯水)。只有加入DNA7或灭菌超纯水的试管进行LAMP后，反应液为橙色。

结果表明，本发明提供的检测大豆疫霉菌的LAMP试剂盒C和试剂盒D对大豆疫霉菌基因组DNA的最小检测限为1.44pg。

三、普通PCR检测大豆疫霉菌基因组DNA的灵敏度实验

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、同步骤一中1。

2、同步骤一中2。

3、以2μL DNA1为模板，以F:5’-GCGTATTGAGGGTTGCTG-3’和B:5’-GCGTCCTATCACCTAGTGC-3’为引物，进行PCR，得到PCR扩增产物。

按照上述方法，将DNA1分别替换为步骤2制备的DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6、DNA7和灭菌超纯水，其它步骤均不变，获得相应的PCR扩增产物。

4、结果观察和判定：如果PCR扩增产物含有203bp的DNA片段、则含有或疑似含有大豆疫霉菌；如果PCR扩增产物不含有203bp的DNA片段、则不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。所述203bp的DNA片段如序列表中序列6所示。

实验结果见图4(1为DNA1，2为DNA2，3为DNA3，4为DNA4，5为DNA5，6为DNA6，7为DNA7，8为灭菌超纯水)。以DNA1、DNA2、DNA3、DNA4或DNA5为模板获得的PCR扩增产物中含有203bp的DNA片段，以DNA6、DNA7或无菌超纯水为模板获得的PCR扩增产物中不含有203bp的DNA片段。可见，普通PCR对大豆疫霉菌基因组DNA的最小检测限为14.4pg。

Claims

1.一种成套引物，由引物FIP、引物BIP、引物LF、引物F3和引物B3组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。

2.如权利要求1所述成套引物，其特征在于：所述成套引物中，所述引物FIP、所述引物BIP、所述引物LF、所述引物F3和所述引物B3的摩尔比为8:8:4:1:1。

3.如权利要求2所述成套引物，其特征在于：所述成套引物中，各引物的量如下：1.6μmol所述引物FIP、1.6μmol所述引物BIP、0.8μmol所述引物LF、0.2μmol所述引物F3、0.2μmol所述引物B3。

4.权利要求1至3中任一所述成套引物的应用，为如下a)或b)或c)或d)：

a)制备用于检测或辅助检测大豆疫霉菌的试剂盒；

b)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌；

c)制备用于鉴定或辅助鉴定大豆疫霉菌的试剂盒；

d)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。

5.含有权利要求1至3中任一所述成套引物的试剂盒。

6.权利要求5所述试剂盒的制备方法，为如下(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)：

(Ⅰ)所述成套引物中各条引物分别单独包装；

(Ⅱ)所述成套引物中各条引物按照权利要求2所述比例混合在一起；

(Ⅲ)所述成套引物中各条引物按照权利要求3所述量混合在一起。

7.权利要求5所述试剂盒的应用，为如下e)或f)：

e)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有大豆疫霉菌；

f)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌。

8.一种检测待测样品是否含有大豆疫霉菌的方法，包括如下步骤：

提取待测样品的总DNA，以权利要求1至3中任一所述成套引物进行环介导等温扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总DNA的环介导等温扩增，则待测样品中含有或疑似含有大豆疫霉菌；如果所述成套引物不能实现对所述总DNA的环介导等温扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有大豆疫霉菌。

9.如权利要求4或7所述的应用，或，权利要求8所述的方法，其特征在于：所述待测样品为微生物样品。

10.一种鉴定待测菌是否为候选的大豆疫霉菌的方法，包括如下步骤：

提取待测菌的基因组DNA，以权利要求1至3中任一所述成套引物进行环介导等温扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述基因组DNA的环介导等温扩增，则待测菌为候选的大豆疫霉菌；如果所述成套引物不能实现对所述基因组DNA的环介导等温扩增，则所述待测菌为候选的非大豆疫霉菌。