CN107805668A - 检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法，涉及生物技术领域，该检测支原体的引物，能够同时扩增多种支原体16SrDNA保守区。该引物在检测支原体中的应用，能够同时检测出多种支原体，具有广谱性，扩大了适用范围。该检测支原体的方法，检测快速，广谱性强，灵敏度高，可同时检测多个样品，降低了检测成本。缓解了现有技术中存在的缺乏一种具有广谱性的能够同时快速检测多种支原体的产品和方法的问题。

Description

检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法。
背景技术
支原体(Mycoplasma)又称霉形体，是目前发现的最小最简单的原核生物，支原体中唯一可见的细胞器是核糖体。
支原体污染是细胞培养过程中最常见的污染之一，特别是在哺乳动物细胞的培养过程中，主要原因有：支原体体积非常小，直径为0.1μm，一般过滤除菌无法去除，光学显微镜下难以看清它的形态结构；支原体生命力顽强，能在pH 7.6～8.0条件下生存，且对青霉素有抗药性；支原体污染初期，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢、形态变圆。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染、培养基的污染、污染支感染的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。目前发现，至少有二十多种支原体能污染细胞，其中最常见的有：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)、唾液支原体(M.salivarium)、肺支原体(M.pulmonis)和梨支原体(M.pirum)等。
支原体污染最终会导致细胞死亡，不过更常见的情况是，支原体与细胞共存。在这种过程当中，支原体慢慢增殖，直至对细胞产生明显的影响，如干扰细胞迁移、信号转导、淋巴细胞活化和细胞因子表达。对于相关科研工作者来说，支原体污染最严重的后果是污染在不知不觉中改变许多参数和实验结果，例如细胞因子转录和表达水平的变化，病毒对细胞活力和增殖的影响，外源物质对细胞生理的调控作用等，使研究成果的可信度降低甚至得到错误数据。并且由于污染需要重新购买或者复苏细胞以重新得到能够稳定生长传代的细胞，给科研工作者的时间和科研成本造成巨大的浪费。
常用的支原体检测手段包括传统的培养法、ELISA法、PCR法等，目前PCR法是主流的支原体检测方法，然而目前已有的PCR支原体检测手段仍存在诸多问题，例如，灵敏度不够或特异性不够等。并且，目前主流试剂盒只能针对某一种支原体，广谱性差，不适于实际上存在多种支原体能够污染细胞的实际情况，不适于实际实际科研和实验室中的应用。
因此，一种具有广谱性的能够同时快速检测多种支原体的产品和方法是目前有待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测支原体的引物，本发明的第二目的在于提供一种检测支原体的引物的应用，本发明的第三目的在于提供一种检测支原体的方法，缓解了现有技术中存在的缺乏具有广谱性的能够同时快速检测多种支原体的产品和方法的技术问题。
一种检测支原体的引物，所述引物用于扩增支原体16SrDNA；
所述引物包括PmyF和PmyR，所述PmyF具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述PmyR具有如SEQ ID NO.2所示序列。
进一步的，所述引物扩增的支原体包括以下种类：Mycoplasma pirum、Mycoplasmaarginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hominis、Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pulmonis、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma timone、Mycoplasma faucium、Mycoplasma spumans、Mycoplasma phocicerebrale、Mycoplasmaauris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma arthritidis、Mycoplasma falconis、Mycoplasma gypis、Mycoplasma subdolum、Mycoplasma anseris、Mycoplasma canadense、Mycoplasma zalophi、Mycoplasma cloacale和Mycoplasma buccale。
一种上述引物在制备检测支原体产品中的应用。
一种包含上述引物的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒包括如下试剂：反应试剂、阴性对照、阳性对照。
所述反应试剂包括上述引物、dNTP、DNA聚合酶和Buffer。
进一步的，所述阴性对照为DNA-free ddH2O。
进一步的，所述阳性对照为猪鼻支原体基因组DNA。
进一步的，所述试剂盒还包括荧光染料。
一种检测支原体的方法，应用上述的引物和上述的试剂盒。
进一步的，所述方法包括如下步骤：以所述引物为扩增引物，以待测样本的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到待测样本的Ct值，根据所述待测样本的Ct值在标准曲线中对应的模板含量得到待测样本的模板含量。
本发明提供的检测支原体的引物，能够同时扩增多种支原体16SrDNA保守区。本发明提供的引物在检测支原体中的应用，能够同时检测出多种支原体，具有广谱性，扩大了适用范围。本发明提供的检测支原体的方法，检测快速，广谱性强，可同时检测多个样品，降低了检测成本，该方法灵敏度高，可检测低浓度的支原体污染，为细胞培养中支原体污染的早期排查和提供了一种简便快速高效的方法，节约了科研成本和时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的引物PmyF和PmyR扩增支原体16SrDNA的电泳图；
图2为本发明实施例2提供的检测引物PmyF和PmyR扩增支原体16SrDNA灵敏度的电泳图；
图3为本发明实施例3提供的Ct至在5-40范围内的标准曲线；
图4为本发明实施例3提供的Ct至在5-37范围内的标准曲线；
图5为本发明实施例3提供的标准曲线的扩增曲线；
图6为本发明实施例3提供的标准曲线的溶解度曲线。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种检测支原体的引物，该引物用于扩增支原体16SrDNA；
上述引物包括PmyF和PmyR，上述PmyF具有如SEQ ID NO.1所示序列，上述PmyR具有如SEQ ID NO.2所示序列。
上述引物可扩增出多种支原体16SrDNA基因保守区。16SrRNA基因是原核微生物的标志基因，具有高度保守型，适合作为标志性基因用于原核微生物的鉴别。16SrDNA基因序列可以分为所有原核生物均相同的保守序列、种属特异性的半保守序列和菌种特异性的序列。本发明选择在支原体中16SrDNA基因保守序列部分，设计扩增引物，可扩增出多种支原体的16SrDNA基因保守区。
在一个可选的实施方式中，上述引物扩增的支原体包括以下种类：Mycoplasmapirum、Mycoplasma arginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hominis、Mycoplasmahyorhinis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pulmonis、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma timone、Mycoplasma faucium、Mycoplasma spumans、Mycoplasmaphocicerebrale、Mycoplasma auris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasmaarthritidis、Mycoplasma falconis、Mycoplasma gypis、Mycoplasma subdolum、Mycoplasma anseris、Mycoplasma canadense、Mycoplasma zalophi、Mycoplasmacloacale和Mycoplasma buccale。
本发明提供了一种包含上述引物在制备检测支原体产品中的应用。
本发明提供了一种包含上述引物的试剂盒。该试剂盒能够同时检测出多种支原体，具有广谱性，扩大了适用范围。
在一个可选的实施方式中，上述试剂盒包括如下试剂：反应试剂、阴性对照、阳性对照。
上述反应试剂包括上述的引物、dNTP、DNA聚合酶和Buffer。
在一个可选的实施方式中，Buffer包括ddH2O和Mg2+。
在一个可选的实施方式中，上述阴性对照为DNA-free ddH2O，其中DNA-free ddH2O为不包含核酸的去离子水。
在一个可选的实施方式中，上述阳性对照为猪鼻支原体基因组DNA。
细胞培养的支原体污染中，有98％以上是由以下五种支原体引起的：M.orale、M.arginini、M.hyorhinis和A.laidlawii，M.Fermentans。猪鼻支原体(M.hyorhinis)为常见的细胞污染支原体种类之一，检测结果稳定，因此选择猪鼻支原体作为阳性对照。
在一个优选的实施方式中，上述阳性对照猪鼻支原体基因组DNA的浓度为5μg/ml。
在一个可选的实施方式中，上述试剂盒还包括荧光染料。
在一个可选的实施方式中，上述荧光染料为SYBR Grenn荧光染料。
试剂盒中添加荧光染料，使上述试剂盒适用于实时荧光定量PCR的体系和方法，适用性更广泛，检测更便捷，其中SYBR Grenn荧光染料适用于多种荧光定量PCR反应仪器。
本发明提供了一种检测支原体的方法，包含上述的引物和上述试剂盒。
在一个可选的实施方式中，上述方法包括如下步骤：以上述引物为扩增引物，以待测样本的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到待测样本的Ct值，根据上述待测样本的Ct值在标准曲线中对应的模板含量得到待测样本的模板含量。
在一个优选的实施方式中，实时荧光定量PCR采用SYBR Grenn荧光染料法。
实时荧光定量PCR扩增操作简便、快速、高效、具有很高的敏感性和特异性；该方法在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，降低了污染的可能性；该方法检测通量大，所需样品量少，适合产业化生产使用。
在一个优选的实施方式中，实时荧光定量PCR扩增反应体系为：
其中，2×SYBR Premix Ex Taq为预混了SYBR Grenn荧光染料，dNTP、DNA聚合酶和Buffer的预混液。
在一个优选的实施方式中，实时荧光定量PCR扩增反应程序为：
95℃30s预变性；95℃5s变性，60℃30s退火并延伸，共45个循环；95℃5s,60℃-95℃，每隔1min读取一次荧光值，用于生成熔解曲线。
在一个可选的实施方式中，对照组为阳性对照组和阴性对照组。
在一个优选的实施方式中，阳性对照为猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)基因组DNA，阴性对照为DNA-free ddH2O。
该方法检测快速，广谱性强，可同时检测多个样品，降低了检测成本，该方法灵敏度高，可检测低浓度的支原体污染，为细胞培养中支原体污染的早期排查提供了一种简便快速高效的方法，节约了科研成本和时间。
为了更清楚的说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
分别提取被如下支原体感染的vero细胞，采用CTAB法提取DNA：
Mycoplasma pirum、Mycoplasma arginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasmahominis、Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pulmonis、Mycoplasmasalivarium、Mycoplasma timone、Mycoplasma faucium、Mycoplasma spumans、Mycoplasmaphocicerebrale、Mycoplasma auris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasmaarthritidis、Mycoplasma falconis、Mycoplasma gypis、Mycoplasma subdolum、Mycoplasma anseris、Mycoplasma canadense、Mycoplasma zalophi、Mycoplasmacloacale和Mycoplasma buccale。
使用引物PmyF和PmyR作为扩增引物，建立20μl反应体系：
引物序列如下表所示：
引物 编号 5'-3'
PmyF SEQ ID NO.1 TACATAGGTCGCAAGCGTTATCC
PmyR SEQ ID NO.2 TCTAATCCTGTTTGCTCCCCAC
反应体系如下表所示：
试剂 体积
5×Buffer 4μL
PmyF(10μM) 1μL
PmyR(10μM) 1μL
DNA模板 2μL
Taq酶 0.5μL
DNA-free ddH2O 11.5μL
扩增程序：95℃30s预变性；95℃5s变性，56℃30s退火，72℃延伸30s，共25个循环；72℃延伸10min。
结果如图1所示，产物均在200bp-300bp之间，符合目标产物为260bp的条件，其中泳道1：Mycoplasma pirum；泳道2：Mycoplasma arginini；泳道3：Mycoplasma fermentans；泳道4：Mycoplasma hominis；泳道5：Mycoplasma hyorhinis；泳道6：Mycoplasma orale；泳道7：Mycoplasma pulmonis；泳道8：Mycoplasma salivarium；泳道9：Mycoplasma timone；泳道10：Mycoplasma faucium；泳道11：Mycoplasma spumans；泳道12：Mycoplasmaphocicerebrale；泳道13：Mycoplasma auris；泳道14：Mycoplasma alkalescens；泳道15：Mycoplasma arthritidis；泳道16：Mycoplasma falconis；泳道17：Mycoplasma gypis；泳道18：Mycoplasma subdolum；泳道19：Mycoplasma anseris；泳道20：Mycoplasmacanadense；泳道21：Mycoplasma zalophi；泳道22：Mycoplasma cloacale；泳道23：Mycoplasma buccale。图1各待测样品条带清晰，表明引物PmyF和PmyR可扩增多种支原体DNA，且扩增效率高，引物PmyF和PmyR检测支原体具有广谱性。
实施例2灵敏度
以猪鼻支原体基因组DNA为模板，将DNA模板按照如下浓度稀释：1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL、1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL。
以实施例1提供的引物和扩增方法扩增上述各浓度模板，结果如图2所示：泳道1：1μg/mL；泳道2：100ng/mL；泳道3：10ng/mL；泳道4：1ng/mL；泳道5：100pg/mL；泳道6：10pg/mL；泳道7：1pg/mL；泳道8：100fg/mL；泳道9：10fg/mL；泳道10：1fg/mL。由图2可知，该引物可检测出浓度为10fg/mL的DNA模板，具有高灵敏度。
实施例3
建立20μL实时荧光定量PCR反应体系，如表1所示：
试剂 体积
2×SYBR Premix Ex Taq 10μL
PmyF(10μM) 0.4μL
PmyR(10μM) 0.4μL
模板 2μL
DNA-free ddH2O(无菌水) 7.2μL
按如下程序进行实时荧光定量PCR扩增反应：
95℃30s预变性；95℃5s变性，60℃30s退火并延伸，共45个循环；95℃5s,60℃-95℃，每隔1min读取一次荧光值，用于生成熔解曲线。
建立标准曲线：以猪鼻支原体基因组DNA模板系列浓度梯度5ng/μl-0.5fg/μl为模板，每个浓度梯度取2ul检测，使用猪鼻支原体基因组DNA模板量对应为10ng-1fg。标准浓度模板检测的标准曲线R2＝0.9995，斜率为-4.413，最高荧光信号值约17000，扩增效率为84.25％，最低检测限为10fg，样品量为10fg时Ct值为40。结果如图3所示；进一步分析显示：Ct值在5-37范围内，线性关系R2＝0.9999，斜率为-4.722，扩增效率为81.4％。这个范围内检测结果比较准确，结果如图4所示；由图5和图6可知，本实施例标准曲线建立时，猪鼻支原体基因组DNA模板扩增效果良好，溶解度曲线无杂峰，未扩增出引物二聚体，标准曲线结果可信。
由该标准曲线得到判断标准范围为：Ct值小于或等于37时，表示可以扩增出支原体的16SrDNA基因保守区，结果准确，可以根据标准曲线计算出待测样品DNA模板量。而当Ct值超过40，本实施例提供的方法无法检测出支原体16SrDNA基因保守区，本实施例建立的方法视为其为阴性；当Ct值为37-40时，本实施例提供的方法需要重复检测待测样品。因此，本实施例建立的判断标准如下：
(a)Ct值小于等于37的标本为阳性结果；
(b)Ct值大于40的标本为阴性性结果；
(c)Ct值在37-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
实施例4
收集被支原体感染的细胞样本200例，其中已知100例是由如下其中一种或多种支原体感染的细胞：Mycoplasma pirum、Mycoplasma arginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hominis、Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pulmonis、Mycoplasma salivarium、Mycoplasma timone、Mycoplasma faucium、Mycoplasmaspumans、Mycoplasma phocicerebrale、Mycoplasma auris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasma arthritidis、Mycoplasma falconis、Mycoplasma gypis、Mycoplasmasubdolum、Mycoplasma anseris、Mycoplasma canadense、Mycoplasma zalophi、Mycoplasma cloacale和Mycoplasma buccale；使用本发明建立的测支原体的方法和提供的引物检测待测样本，统计待测样本阳性率(阳性率＝检测为阳性的样本数/总样本数)，结果如下表所示：
感染已知支原体种类样品 感染未知支原体种类样品
阳性率 95％ 90％
Ct<37 90 84
37<Ct<40 6 10
Ct>40 4 16
由上表结果可知，本发明提供的引物可扩增出多种支原体DNA，且广谱性和灵敏度高，在本实施例中，100例感染已知支原体种类的样品阳性检出率达到94％，其中疑似阳性(37<Ct<40)的6例样品只有1例未检出，并且90％的样品可通过一次检测即可确定样品是否为阳性；对于检测感染未知支原体种类的样品检测的样品阳性率也高达90％，说明本发明提供的引物可以扩增出除去上述种类的支原体外的其他种类的支原体。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州华安生物技术有限公司
<120> 检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tacataggtc gcaagcgtta tcc 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctaatcctg tttgctcccc ac 22

Claims (10)

1.一种检测支原体的引物，其特征在于，所述引物用于扩增支原体16SrDNA；
所述引物包括PmyF和PmyR，所述PmyF具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述PmyR具有如SEQ ID NO.2所示序列。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物扩增的支原体包括以下种类：Mycoplasma pirum、Mycoplasma arginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasmahominis、Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma orale、Mycoplasma pulmonis、Mycoplasmasalivarium、Mycoplasma timone、Mycoplasma faucium、Mycoplasma spumans、Mycoplasmaphocicerebrale、Mycoplasma auris、Mycoplasma alkalescens、Mycoplasmaarthritidis、Mycoplasma falconis、Mycoplasma gypis、Mycoplasma subdolum、Mycoplasma anseris、Mycoplasma canadense、Mycoplasma zalophi、Mycoplasmacloacale和Mycoplasma buccale。
3.如权利要求1或2所述的引物在制备检测支原体产品中的应用。
4.一种包含权利要求1或2所述的引物的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：反应试剂、阴性对照、阳性对照；
所述反应试剂包括权利要求1或2所述的引物、dNTP、DNA聚合酶和Buffer。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为DNA-free ddH2O。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为猪鼻支原体基因组DNA。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光染料。
9.一种检测支原体的方法，其特征在于，应用权利要求1或2所述的引物或权利要求4-7任一项所述的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以所述引物为扩增引物，以待测样本的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到待测样本的Ct值，根据所述待测样本的Ct值在标准曲线中对应的模板含量得到待测样本的模板含量。
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