JP2015517315A - 質量分析法を用いた特性評価及び／または同定のための抗酸菌の不活性化及び抽出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の不活性化及び／または抽出方法であり、以下の連続した工程を含む方法に関する：（a）抗酸菌の含有が確認されている、または予想される試験試料を用意し、試験試料をエタノール及びビーズを含む容器中で懸濁する；（b）容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する；及び（c）その後懸濁液を少なくとも約3分間、室温でインキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌を不活性化する。本発明に従い、試験試料を遠心分離によりペレット状にし、ギ酸で再懸濁し、アセトニトリルを加え、そして質量分析にかけて抗酸菌の特性評価及び／または同定をすることができる。
Description
本出願は、2013年3月14日に出願された米国特許出願第13/828,119号（発明の名称：Methods for Inactivation and Extraction of Acid-Fast Bacteria for Characterization and/or Identification Using Mass Spectrometry）、及び2012年5月17日に出願された米国特許仮出願第61/648,420号（発明の名称：Methods for Inactivation and Extraction of Mycobacteria for Characterization and/or Identification using Mass Spectrometry）の優先権を主張し、これらは本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は、マイコバクテリア及びノカルジアなどの抗酸菌の不活性化及び抽出方法に関する。具体的には、本発明は、質量分析法を用いた試験試料中のマイコバクテリアまたはノカルジアの迅速な特性評価及び/または同定方法を対象とする。
Vitek（登録商標）、Phoenix（商標）、及びMicroscan（登録商標）システムのような従来の自動化表現型同定試験、またはAPIのような手動表現型試験では、強固な結果を得るために、微生物が適切な増殖期にあり、かつ干渉性培地及び血液製剤が存在しないことが必要である。これらのシステムでは、陽性培養液から18〜24時間かけて平板培地上で培養したコロニーが使用される。しかしながら、より迅速な結果を得るための試みとして微生物を陽性血液培養瓶から隔離したシステムの使用が一部の研究室から報告されている。このようなダイレクトフロムボトル試験（direct-from-the-bottle test）は必ずしもすべての微生物（例えばグラム陽性球菌）に適しているわけではなく、試験製造業者によって検証されておらず、通常は結果が得られるまで３〜８時間かかる。陽性培養の結果が出てから最初の数時間以内、好ましくは１時間以内に臨床的に意義のある結果を医師に提供するために、より迅速かつより広範な特異的試験が緊急に必要とされている。
質量分析法は、微生物の同定を非常に迅速にできるようにする可能性があるが、液体微生物培地中及び血液のような臨床試料中、またはそれらの組合せの中に存在する多くの化合物から干渉を受ける恐れがある。陽性血液培養ブロスから微生物を直接回収するために最も一般的に利用されている方法は、2工程の分画遠心分離および血清分離チューブ内の遠心分離である。
他の微生物分離、特性評価および／または同定方法が下記の文献に記載されている。
米国特許第6,177,266号には、細胞タンパク質抽出物または全細胞のマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF-MS）分析によって生成される、属、種および株固有のバイオマーカーによる細菌の化学分類方法が開示されている。
しかしながら、当技術分野には、続けて質量分析により特性評価及び／または同定分析をするための、効率的及び迅速な微生物試験試料の不活性化及び／または抽出のプロトコルが必要とされている。具体的には、不活性化または細胞死は、マイコバクテリアまたはノカルジアなどの抗酸菌をバイオセーフティレベル3（BSL-s/P3）環境の外部で続けて取り扱うためにしばしば必要である。
一態様においては、本発明は、試験試料中の抗酸菌の不活性化及び／または抽出方法を対象とし、本発明に係る方法は以下の連続した工程を含む：（a）試験試料を、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の含有が確認されている、または予想される固体または半固体培地から用意し、試験試料をエタノール及びビーズを含む容器中で懸濁する工程；（b）容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；及び（c）その後、懸濁液を少なくとも約3分間インキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌を不活性化する工程。抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）は、固体または半固体培地から、白金耳または綿棒を使用して入手できる。
一実施形態においては、工程（a）の容器は約50%〜約100%エタノール、例えば、約70%エタノールを含んでもよい。本発明に係る方法は、工程（b）の容器を約1分〜約30分ビーズ破砕またはボルテックスする工程を更に含んでもよい。他の一実施形態においては、ビーズは0.5 mmガラスビーズである。一実施形態においては、その後のインキュベーション工程（c）は、少なくとも約3分間、または少なくとも約10分間インキュベートする工程を含む。他の一実施形態においては、工程（c）のインキュベーションは室温で実施される。
他の一実施形態においては、本発明に係る方法は更に以下の連続した追加工程を含んでもよい：（d）容器を遠心分離にかけ、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）試料をペレット状にし、上澄み液を除去する工程；（e）ギ酸中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；及び（f）その後、容器にアセトニトリルを加える工程。必要に応じて、本発明に係る方法は工程（f）の後に、容器中の試験試料を遠心分離にかける工程を更に含む。任意の一実施形態においては、工程（d）の上澄み液を直接、または水懸濁液として質量分析スライドまたはプレートに塗布することができる。
工程（d）のペレットを、約50%〜約90%ギ酸、または約70%ギ酸を使用して再懸濁してもよい。ペレットを再懸濁後、アセトニトリルを約35%〜約65%の最終濃度、または約50%の最終濃度になるまで加えることができる。一実施形態においては、工程（e）においてペレットをギ酸約10 μLに再懸濁してもよく、工程（f）においてアセトニトリル約10 μLを再懸濁したペレットに加えることができる。
他の一実施形態に従えば、本発明に係る方法は更に以下の連続した追加工程を含む：（g）前記工程（f）の上澄み液のアリコートを質量分析ターゲットスライドに移し、上澄み液にマトリックス溶液を加える工程；及び（h）スライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の質量スペクトルを取得し、並びに試験試料中の前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した1つ以上の質量スペクトルと1つ以上の参照質量スペクトルの比較によって行う工程。必要に応じて、工程（g）は、前記工程（f）後に得られた試験試料のアリコートを質量分析スライドまたはプレートに移し、アリコートを乾燥させ、その後マトリックスを加える工程を含む。任意の既知マトリックスを使用することができ、例えば、マトリックスはα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）を使用してもよい。本発明によれば、本発明に係る方法は、次に特性評価及び／または同定するための、マイコバクテリアまたはノカルジアの不活性化及び／または抽出に使用される。例えば、マイコバクテリアまたはノカルジアは、質量分析を使用して科、属、種、及び／または株レベルで同定され、例えば、MALDI-TOF質量分析を使用して同定される。
他の一態様においては、本発明は以下の連続した工程を含む方法を対象とする：（a）試験試料を、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の含有が確認されている、または予想される液体培地から用意し、試験試料を容器に加える工程、（b）容器を遠心分離にかけ試験試料中の抗酸菌をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；（c）抗酸菌ペレットをエタノールに再懸濁し、容器にビーズを加える工程；（d）容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；及び（e）その後、懸濁液を少なくとも約3分間インキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）を不活性化する工程。
一実施形態においては、工程（c）において、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）ペレットを約50%〜約100%エタノールに再懸濁することができ、例えば、ペレットを約70%エタノールに再懸濁してもよい。本発明に係る方法は、工程（d）において容器を約1分〜約30分ビーズ破砕及び／またはボルテックスする工程を更に含んでもよい。一実施形態においては、ビーズは0.5 mmガラスビーズである。一実施形態においては、続くインキュベーション工程（e）は、少なくとも約3分間、または少なくとも約10分間のインキュベーションを含む。他の一実施形態においては、インキュベーション工程（e）は室温で実施される。
他の一実施形態においては、本発明に係る方法は更に以下の連続した追加工程を含んでもよい：（f）容器を遠心分離にかけ、不活性化抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；（g）ギ酸中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；及び（h）容器にアセトニトリルを加える工程。必要に応じて、工程（f）の上澄み液を直接、または水懸濁液として、質量分析スライドまたはプレートに塗布することができる。
工程（g）のペレットを約50%〜約90%ギ酸を使用して再懸濁してもよく、例えば、70%ギ酸を使用してペレットを再懸濁してもよい。ペレットを再懸濁後、アセトニトリルを約35%〜約65%の最終濃度になるまで加えることができ、例えば、約50%の最終濃度になるまで加えることができる。一実施形態においては、工程（h）においてペレットをギ酸10 μLに再懸濁してもよく、工程（g）においてアセトニトリル10 μLを再懸濁したペレットに加えることができる。
本実施形態に従えば、本発明に係る方法は更に以下の連続した追加工程を含んでもよい：（i）前記工程（h）の上澄み液のアリコートを質量分析ターゲットスライドに移し、マトリックス溶液を加える工程；及び（j）スライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得し、試験試料中の前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した質量スペクトルと1つ以上の参照質量スペクトルの比較によって行う工程。必要に応じて、工程（i）は、前記工程（h）から得られた試験試料のアリコート（例えば1 μL）を質量分析スライドまたはプレートに移し、アリコートを乾燥させ、その後マトリックスを加える工程を含む。任意の既知マトリックスを使用してもよく、例えば、マトリックスはα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）でもよい。本発明に従い、抗酸菌は、質量分析を使用して属、種、及び／または株レベルで同定され、例えば、MALDI-TOF質量分析を使用して同定される。
更に他の一態様においては、本発明は、試験試料中の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の不活性化及び抽出方法を対象とし、本発明に係る方法は以下の連続した工程を含む：（a）試験試料を、抗酸菌の含有が確認されている、または予想される固体または半固体培地から用意し、試験試料を70%エタノール及び0.5 mmガラスビーズを含む容器中で懸濁する工程；（b）容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、凝集塊を粉砕する及び／または容器中の抗酸菌細胞を粉砕する工程；（c）その後、懸濁液を少なくとも約5分間、室温でインキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）を不活性化する工程；（d）容器を遠心分離にかけ、抗酸菌試料をペレット状にし、上澄み液を除去する工程；（e）少なくとも3 μLのギ酸中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；（f）容器に少なくとも3 μLのアセトニトリルを加える工程；（g）前記工程（f）の上澄み液のアリコートを質量分析ターゲットスライドに移し、上澄み液にマトリックス溶液を加える工程；及び（h）スライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得し、試験試料中の前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した1つ以上の質量スペクトルと1つ以上の参照質量スペクトルの比較によって行う工程。本発明に従い、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）は、属、種、及び／または株レベルで同定され、例えば、MALDI-TOF質量分析を使用して同定される。
更に他の一態様においては、本発明は、試験試料中の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の不活性化及び抽出方法を対象とし、本発明に係る方法は以下の連続した工程を含む：（a）試験試料を、抗酸菌の含有が確認されている、または予想される液体培地から用意し、試験試料を容器に加え、容器を遠心分離にかけ試験試料中の抗酸菌をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；（b）抗酸菌ペレットをエタノールに再懸濁する工程；（c）その後容器に0.5 mmガラスビーズを加える工程；（d）容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；（e）その後、懸濁液を少なくとも約5分間、室温でインキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）を不活性化する工程；（f）容器を遠心分離にかけ、不活性化抗酸菌をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；（g）ギ酸中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；（h）その後、容器にアセトニトリルを加える工程；（i）前記工程（h）の上澄み液のアリコートを質量分析ターゲットスライドに移し、上澄み液にマトリックス溶液を加える工程；及び（j）スライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得し、試験試料中の前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した質量スペクトルと1つ以上の参照質量スペクトルの比較によって行う工程。本発明に従い、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）は属、種、及び／または株レベルで同定され、例えば、MALDI-TOF質量分析を使用して同定される。
［発明の詳細な説明］
本発明は様々な形態で実施することができ、本明細書に記載した実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は本開示が詳細で完全なものとなり、本発明の範囲が当業者に十分伝わるようにするために提示するものである。例えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の一実施形態に関して例示した特徴をその実施形態から削除することもできる。また、本開示に照らせば、本明細書に示した実施形態に対する本発明から逸脱しない様々な変更及び追加が当業者には理解されるであろう。
本発明は様々な形態で実施することができ、本明細書に記載した実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は本開示が詳細で完全なものとなり、本発明の範囲が当業者に十分伝わるようにするために提示するものである。例えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の一実施形態に関して例示した特徴をその実施形態から削除することもできる。また、本開示に照らせば、本明細書に示した実施形態に対する本発明から逸脱しない様々な変更及び追加が当業者には理解されるであろう。
本譲受人のVITEK（登録商標）MSシステム（bioMerieux社、ミズーリ州セントルイス）は、試料のタンパク質プロフィールを分析し、既存の微生物プロフィールのデータベースと照合するための、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（MALDI-TOF）質量分析計を使用した細菌同定の基盤を提供する。試料をターゲットスライドに接種し、マトリックスで覆い（例えば、CHCAマトリックス（α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸マトリックス））、次いで該質量分析計で処理をする。
最も一般的に臨床的に意義のある微生物は、細胞を直接VITEK（登録商標）MSターゲットスライドに接種することで分析できる。分析用抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）試料の調整は、バイオセーフティレベル3（BSL-3/P3）環境の外部で取り扱えるように試料を安全にするための不活性化工程が必要であるという点で、標準処理とは異なる。
本出願人は、機械的破砕と同時のエタノール中でのインキュベーションによって、効果的で迅速な抗酸菌の不活性化方法が提供されることを発見した。エタノール曝露が有効だということは、粉砕された試料をエタノール中、室温で少なくとも3分間、少なくとも5分間または少なくとも10分間インキュベートすることによる不活性化工程が後に続く機械的破砕工程を伴う処理を用いたときに示された。一実施形態においては、機械的破砕はビーズ破砕機（BioSpec社、オクラホマ州バートルズビル）、試料を含む密閉微量遠心バイアルを撹拌することで細胞を破砕するホモジナイザー、抽出溶液、及びビーズ（例えば、微小ガラスビーズ）を使用して実施される。一般的には、ビーズは、容器または微量遠心チューブ中で細胞を破砕する機能を有する任意の既知ビーズでよい。例えば、ビーズは、ガラスビーズ、セラミックビーズ、ジルコニアビーズ、シリコンビーズ、メタルビーズ、スチールビーズ、タングステンカーバイドビーズ、ガーネットビーズ、砂粒ビーズ、またはサファイアビーズでよい。一実施形態においては、ビーズは約0.1 mm〜約1 mmのサイズ、例えば、0.5 mmのサイズであってよい。
明確かつ一貫性のあるスペクトルを取得するために、不活性化細胞から細胞タンパク質を抽出するのを補助する追加処理工程が使用されてもよい。例えば、ギ酸による処置工程に続いてアセトニトリルに曝す工程を用い、後の分析（例えば、質量分析による）用にタンパク質を抽出及び溶解してもよい。
本発明は、試験試料中の未知の抗酸菌の不活性化、抽出、特性評価及び／または同定方法を提供する。本発明はまた、質量分析法を用いた試験試料中の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の迅速な特性評価及び/または同定方法を対象とする。迅速な本発明に係る方法により、従来技術より速い抗酸菌の特性評価及び／または同定が可能となり、結果的により速い診断及び試験試料の特性評価／同定をもたらす。本発明方法に関わる工程である、試料の入手から抗酸菌の特性評価／同定の工程は、かなり短い時間枠のうちに実施することができ、臨床的に意義のある実利的情報を得られる。諸実施形態においては，本発明の方法は、約120分未満、例えば、約110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、または10分未満のうちに実施することができる。本発明の方法の迅速さは、従来技術を超える改善を示す。
一態様においては、本発明は、試料中または試験試料中に含まれる、または含まれる疑いのある抗酸菌の不活性化方法を対象とする。
本発明の一実施形態においては、試料は、抗酸菌に感染している、または感染の疑いのある被験者（例えば、患者）から入手される。本明細書で使用される「抗酸菌」とは、マイコバクテリア及びアクチノマイセス（Actinomyces）属（ノカルジア属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴードニア（Gordonia）属、ツカムレラ（Gordonia）属、及びディエツィア（Dietzia）属を含む）を含むが、これらに限定されない任意の既知抗酸菌を包含することを意図している。
本明細書で使用される「マイコバクテリア」とは、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、マイコバクテリウム・ミクロティ（Mycobacterium microti）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobacterium africanum）、マイコバクテリウム・カネッティ（Mycobacterium canetti）、鳥型結核菌（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium intracellulare）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Mycobacterium scrofulaceum）、マイコバクテリウム・カンサシ（Mycobacterium kansasii）、マイコバクテリウム・マルモエンセ（Mycobacterium malmoense）、マイコバクテリウム・ゼノピ（Mycobacterium xenopi）、マイコバクテリウム・マリナム（Mycobacterium marinum）、マイコバクテリウム・シミエ（Mycobacterium simiae）、マイコバクテリウム・テラエ（Mycobacterium terrae）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans）、マイコバクテリウム・アブセサス（Mycobacterium abscessus）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacterium fortuitum）、マイコバクテリウム・ケロネー（Mycobacterium chelonae）、及びマイコバクテリウム・ゴルドナエ（Mycobacterium gordonae）を含むが、これらに限定されない任意の既知マイコバクテリアを包含することを意図している。
本明細書で使用される「ノカルジア」とは、ノカルジア・アエロコロニゲネス（Nocardia aerocolonigenes）、ノカルジア・アフリカーナ（Nocardia africana）、ノカルジア・アルゼンティネンシス（Nocardia argentinensis）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroids）、（Nocardia blackwellii）、ノカルジア・ブラックウェルイー（Nocardia blackwellii）、ノカルジア・ブラジリエンシス（Nocardia brasiliensis）、ノカルジア・ブレビカテナ（Nocardia brevicatena）、ノカルジア・カメア（Nocardia camea）、ノカルジア・カヴィエ（Nocardia caviae）、ノカルジア・セラドエンシス（Nocardia cerradoensis）、ノカルジア・コラリナ（Nocardia corallina）、ノカルジア・シリアシジョージカ（Nocardia cyriacigeorgica）、ノカルディア・ダソンヴィレイ、ノカルディア・エレガンス（Nocardia elegans）、ノカルジア・ファルシニカ（Nocardia farcinica）、ノカルディア・ナイジイタンシス（Nocardia nigiitansis）、ノカルジア・ノヴァ（Nocardia nova）、ノカルジア・オパカ（Nocardia opaca）、ノカルジア・オティティジス-キャビアルム（Nocardia otitidis-cavarium）、ノカルジア・パウシボランス（Nocardia paucivorans）、ノカルジア・シュードブラシリエンシス（Nocardia pseudobrasiliensis）、ノカルジア・ルブラ（Nocardia rubra）、ノカルジア・セリオラエ（Nocardia seriolae）、ノカルジア・トランスバレンシス（Nocardia transvelencesis）、ノカルジア・ユニフォルミス（Nocardia uniformis）、ノカルジア・ヴァシニ（Nocardia vaccinii）、及びノカルジア・ベテラナ（Nocardia veterana）を含むが、これらに限定されない任意の既知ノカルジアを包含することを意図している。
本明細書で使用される「特性評価」とは、生物学的粒子の広範なカテゴリ化または分類、及び／または抗酸菌の単一属若しくは単一種の実際の同定を包含する。分類は、抗酸菌の表現型及び／または形態上の特性の判定を含んでもよい。例えば、細菌の特性評価は、組織、形、大きさ、色、菌株群の形成、及び／または代謝などの観察できる違いに基いて実施されてもよい。
本明細書で使用される「同定」とは、これまで未知とされてきた抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）が、どの科、属、種及び／または株に属するかを判定することを意味する。例えば、これまで未知とされてきた抗酸菌を、科、属、種及び／または株レベルで同定することなどである。
一実施形態においては、本発明に係る方法は、以下の連続した工程を含む：（a）試験試料を、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の含有が確認されている、または予想される固体または半固体培地から用意し、試験試料をエタノール及びビーズを含む容器中で懸濁する工程；（b）容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；及び（c）その後、懸濁液を少なくとも約3分間インキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌を不活性化する工程。一般的には、抗酸菌試験試料は任意の既知の方法で入手でき、例えば、抗酸菌試験試料は固体または半固体培地から、白金耳または綿棒を使用して入手、または採取できる。
一実施形態においては、工程（a）の容器は、エタノール約20μL〜約1mL、または約50 μL〜約750μL、約100μL〜約500μL、またはエタノール約500μLを含んでもよい。容器中のエタノールは、約50%〜約100%エタノール、約60%〜約90%エタノール、または約50%、60%、70%、80%または90%エタノールであってよい。
前述の通り、最初に抗酸菌試験試料に工程（b）の機械的破砕を施すことができ、例えば、ビーズ破砕機（BioSpec社、オクラホマ州バートルズビル）、試料を含む密閉微量遠心バイアルを撹拌することで細胞を破砕するホモジナイザー、抽出溶液、及びビーズが使用される。一般的には、ビーズは、容器または微量遠心チューブ中で細胞を破砕する機能を有する任意の既知ビーズでよい。例えば、ビーズは、ガラスビーズ、セラミックビーズ、ジルコニアビーズ、シリコンビーズ、メタルビーズ、スチールビーズ、タングステンカーバイドビーズ、ガーネットビーズ、砂粒ビーズ、またはサファイアビーズでよい。一実施形態においては、ビーズは約0.1 mm〜約1 mmのサイズ、例えば、0.5 mmのサイズであってよい。一実施形態においては、ビーズは0.5 mmのガラスビーズである。一般的には、工程（b）の容器を約1分間〜約30分間、約5分間〜約20分間、約5分間〜約10分間、または約5分間若しくは約10分間ビーズ破砕及び／またはボルテックスすることにより、容器に破砕を施す。
試験試料中の抗酸菌を破砕した後、容器を少なくとも3分間インキュベートすることにより、容器、つまり試験試料中の抗酸菌に不活性化を施す。一実施形態においては、インキュベーション工程（c）は少なくとも5分間または少なくとも10分間であってよい。他の一実施形態においては、インキュベーション工程（c）は約3分間〜約30分間、約5分間〜約20分間、約10分間〜約15分間、または約5、10、15、20、若しくは30分間であってよい。一実施形態においては、インキュベーション工程（c）は室温で実施される。
他の一実施形態においては、本発明は、液体培地中に含まれるまたは含まれる疑いのある抗酸菌の不活性化方法を対象とする。
一実施形態においては、本発明に係る方法は以下の連続した工程を含む：（a）試験試料を、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の含有が確認されている、または予想される液体培地から用意し、試験試料を容器に加える工程、（b）容器を遠心分離にかけ試験試料中の抗酸菌をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；（c）抗酸菌ペレットをエタノールに再懸濁し、その後容器にビーズを加える工程；（d）容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；及び（e）その後、懸濁液を少なくとも約5分間インキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）を不活性化する工程。一実施形態においては、入手した液体培養試料は約0.5 mL〜約10 mL、約1 mL〜約5 mL、約1 mL〜約3 mL、または約1、2、3若しくは5 mLであってよい。
遠心分離工程（b）の後、工程（c）において抗酸菌ペレットを、エタノール約10μL〜約1mLを含む容器、または約50μL〜約750μL、約100μL〜約500μL、またはエタノール約500μLを含む容器に再懸濁することができる。ペレットの再懸濁に使用するエタノールは、約50%〜約100%エタノール、約60%〜約90%エタノール、または約50%、60%、70%、80%、若しくは90%エタノールであってよい。
前述の通り、最初に抗酸菌試験試料に工程（d）の機械的破砕を施すことができ、例えば、ビーズ破砕機（BioSpec社、オクラホマ州バートルズビル）、試料を含む密閉微量遠心バイアルを撹拌することで細胞を破砕するホモジナイザー、抽出溶液、及びビーズが使用される。一般的には、ビーズは、容器または微量遠心チューブ中で細胞を破砕する機能を有する任意の既知ビーズでよい。例えば、ビーズは、ガラスビーズ、セラミックビーズ、ジルコニアビーズ、シリコンビーズ、メタルビーズ、スチールビーズ、タングステンカーバイドビーズ、ガーネットビーズ、砂粒ビーズ、またはサファイアビーズでよい。一実施形態においては、ビーズは約0.1 mm〜約1 mmのサイズ、例えば、0.5 mmのサイズであってよい。一実施形態においては、ビーズは0.5 mmのガラスビーズである。一般的には、工程（d）の容器を約1分間〜約30分間、約5分間〜約20分間、約5分間〜約10分間、または約5分間若しくは約10分間ビーズ破砕及び／またはボルテックスすることにより、容器に破砕を施す。
試験試料中の抗酸菌を破砕した後、容器を少なくとも3分間インキュベートすることにより、容器、つまり試験試料中の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）に不活性化を施す。一実施形態においては、インキュベーション工程（e）は少なくとも5分間または少なくとも10分間であってよい。他の一実施形態においては、インキュベーション工程（e）は約5分間〜約30分間、約10分間〜約20分間、または約5、10、15、20若しくは30分間であってよい。一実施形態においては、インキュベーション工程（e）は室温で実施される。
他の一態様においては、本発明は抗酸菌試験試料の更なる抽出工程を対象とする。一実施形態においては、本発明の抽出工程を施す抗酸菌試験試料は、前述の不活性化方法から得られた試験試料（すなわち、上記の不活性化抗酸菌試験試料）であってよい。
本抽出方法は、以下の工程を含んでよい：容器を遠心分離にかけ、不活性化抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）をペレット状にし、上澄み液を除去する工程；ギ酸中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；及び、その後容器にアセトニトリルを加える工程。
例えば、一実施形態において、上記の固体または半固体培地から得られた抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）試験試料の不活性化方法の後に、本抽出方法を使用できる。この実施形態に従い、本発明に係る方法は更に以下の連続した追加工程を含んでもよい：（d）容器を遠心分離にかけ、抗酸菌試料をペレット状にし、上澄み液を除去する工程；（e）ギ酸中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；及び（f）その後、容器にアセトニトリルを加える工程。必要に応じて、本発明に係る方法は工程（f）の後に、容器中の試験試料を遠心分離にかける工程を更に含む。
他の一実施形態においては、上記の液体培地から得られた抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）試験試料方法の不活性化方法の後に、本抽出方法を使用できる。この実施形態に従い、本発明に係る方法は更に以下の連続した追加工程を含んでもよい：（f）容器を遠心分離にかけ、不活性化抗酸菌をペレット状にし、上澄み液を除去する工程；（g）ギ酸中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；及び（h）その後、容器にアセトニトリルを加える工程。
これら実施形態に従い、ペレットを約50%〜約100%ギ酸、約60%〜約90%ギ酸、または約50%、60%、70%、80%、90%若しくは100%ギ酸を使用して再懸濁してもよい。ペレットを再懸濁後、アセトニトリルを約35%〜約65%の最終濃度、約40%〜約60%の最終濃度、または約35%、40%、50%、60%若しくは65%アセトニトリルの最終濃度になるまで加えてもよい。一般的には、この工程には100%アセトニトリルを使う。
一実施形態においては、（工程（e）（固体または半固体培地から得られた試験試料の場合）において、または工程（g）（液体試験試料の場合）において）ペレットを少なくとも約3、5または10 μLのギ酸に再懸濁してもよく、及び少なくとも約3、5または約10 μLのアセトニトリルを再懸濁したペレットに加えてもよい。他の一実施形態においては、ペレットをギ酸約3 μL〜約100 μLのギ酸、約5 μL〜約80 μL、ギ酸約10 μL〜約50 μL、またはギ酸約3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90若しくは100 μLを使用して再懸濁してもよい。他の一実施形態においては、ペレットを再懸濁後、少なくとも約3、5または約10 μLのアセトニトリルを再懸濁したペレットに加える。例えば、アセトニトリル約3 μL〜約100 μL、アセトニトリル約5 μL〜約80 μL、アセトニトリル10 μL〜約50 μL、またはアセトニトリル約3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90若しくは100 μLを再懸濁した試料に加えてもよい。
本発明はまた、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF質量分析）などの質量分析を使用した、未知の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の特性評価及び／または同定方法を提供する。本発明に従えば、特性評価及び／または同定工程は、上記の不活性化及び抽出工程の後に続いてよい。
この実施形態に従えば、本発明に係る方法は更に以下の連続した追加工程を含んでもよい：工程（f）（固体または半固体培地から試料調整する場合）、または工程（h）（液体培地から試料調整する場合）の上澄み液のアリコートを質量分析ターゲットスライドに移し、上澄み液にマトリックス溶液を加える工程；及びスライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得し、試験試料中の前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した1つ以上の質量スペクトルと1つ以上の参照質量スペクトルの比較によって行う工程。必要に応じて、移したアリコートは約0.5 μL〜約2.5 μL、または約1 μLであってよい。当技術分野で周知のように、一般的にはアリコートを乾燥させ、その後マトリックス溶液を加える。一般に、当技術分野で既知の任意のマトリックスを使用してもよい。例えば、一実施形態においては、マトリックスはα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）である。本発明に従えば、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）は、科、属、種、及び／または株レベルで同定され、例えば、以下で更に記述のMALDI-TOF質量分析を使用して同定される。
質量分析プレートまたはスライドを用意した後、スライドまたはプレートを質量分析計に挿入する。試料のポンプダウン時間が終わった後（すなわち、10-5〜10-7 torrの雰囲気下になるように大気ガスを試料から除去する）、試料を質量分析計のイオン化室に導入する。試料を装置に合わせて並べる。最適配置が得られたら、窒素レーザーを照射する。マトリックスはレーザーエネルギーを吸収し、蓄積した高エネルギーによりプレート表面から気化する。副次的効果として、本工程において抗酸菌細胞の一部も蒸発してイオン化される。これらのイオンは、プレートと質量分析計の飛行管への入り口の間の静電界の発生により、既知運動エネルギーにまで加速される（すなわち、装置の当該部位は質量／電荷識別器である）。質量にかかわらず、すべての一価イオンは飛行管の入り口で同じ運動エネルギーを有するが、その質量に反比例した速度を有する。飛行管の入り口から、イオンは飛行管を走行して検出器に向かい、より軽いイオンはより重いイオンの前に達する（飛行管は質量／電荷識別器である）。検出器は毎時電荷を発生し、イオンは検出器に衝突する。検出器の出力はデジタル化され、その出力は１つの座標軸に質量／電荷比、もう一方の座標軸に衝突した数を表示する。一実施形態においては、スライドまたはプレート上の抗酸菌は、MALDI-TOF質量分析、脱離エレクトロスプレーイオン化（DESI）質量分析、ガスクロマトグラフ質量分析、液体クロマトグラフ質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ESI）質量分析、及び選択イオンフローチューブ（SIFT）分析、またはその他任意の既知質量分析技法などを使用して解析することができる。
本発明によると、対照測定値（control measurements）を既知の抗酸菌と見なし、したがって測定した試験データと調査対象の抗酸菌の特性評価との相関付けを当業者に既知の様々な数学的方法を使用して行うことが可能となる。例えば、当業者に既知のソフトウェアシステムを利用して試料からのデータと基準、すなわち対照測定値とを比較することができる。より詳細には、データの分析をいくつかの多変量解析法、例えば一般判別分析（GDA）、部分最小二乗法判別分析（PLSDA）、部分最小二乗回帰、主成分分析（PCA）、平行因子分析（PARAFAC）、ニューラルネットワーク分析（NNA）及び／またはサポートベクターマシン（SVM）によって行うことができる。これらの方法を使用することにより、前述したような有機体のモニタリング、検出及び／または特性評価を行うシステムを設計する際に、調査対象の未知抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）を、既存の命名法に基づく関連群、及び／または有機体の代謝、病原性及び／若しくは毒性に基づいて天然群に分類することができる。一実施形態においては、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得後、その1つ以上のスペクトルを「Saramis」微生物同定ソフトウェア（bioMerieux社、ミズーリ州セントルイス）に入力し、抗酸菌の解析、つまり特性評価及び／または同定を実施する。
また別の実施形態では、検出システムからの検出時間や増殖速度のような非分光測定値を、試験試料の抗酸菌の特性評価及び／または同定の補助として使用することができる。
本発明のいくつかの実施形態では、試験試料中の抗酸菌の特性評価及び／または同定において必ずしも正確な種の同定を行う必要はない。特性評価は、単一種の実際の同定だけでなく、生物学的粒子の広範なカテゴリ化または分類も包含してもよい。本明細書で使用される「同定」とは、これまで未知とされてきた抗酸菌がどの科、属、種及び／または株に属するのか判定すること、例えばこれまで未知とされてきた抗酸菌を科、属、種及び／または株レベルで同定することを意味する。
更に他の一態様においては、図1に示すように、本発明は試験試料中の抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）の不活性化及び抽出方法も対象とし、本発明に係る方法は以下の工程を含む：（a）試験試料を、抗酸菌の含有が確認されている、または予想される固体または半固体培地から用意し、試験試料を70%エタノール及び0.5 mmガラスビーズを含む容器中で懸濁する工程；（b）容器を少なくとも5分間ビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；（c）その後、懸濁液を少なくとも約10分間、室温でインキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌を不活性化する工程；（d）容器を遠心分離にかけ、抗酸菌をペレット状にし、上澄み液を除去する工程；（e）ギ酸10 μL中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；（f）容器にアセトニトリル10 μLを加える工程；（g）工程（f）の上澄み液のアリコート1 μLを質量分析ターゲットスライドに移し、上澄み液にマトリックス溶液1 μLを加える；及び（h）スライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得し、前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した1つ以上の質量スペクトルと参照質量スペクトルの比較によって行う工程。本発明に従えば、抗酸菌（例えば、マイコバクテリアまたはノカルジア）を科、属、種、及び／または株レベルで同定することができる。
更に他の一態様においては、図2に示すように、本発明は試験試料中の抗酸菌の不活性化及び抽出方法を対象とし、本発明に係る方法は以下の工程を含む：（a）試験試料2 mLを、抗酸菌の含有が確認されている、または予想される液体培地から用意し、試験試料を容器に加え、容器を遠心分離にかけ試験試料中の抗酸菌をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；（b）抗酸菌ペレットを、70%エタノール500 μLに再懸濁する工程；（c）その後容器に0.5 mmガラスビーズを加える工程；（d）容器を少なくとも5分間ビーズ破砕し、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；（e）その後、懸濁液を少なくとも約10分間、室温でインキュベートし、試験試料中に含まれる任意の抗酸菌を不活性化する工程；（f）容器を遠心分離にかけ、不活性化抗酸菌をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；（g）ギ酸10 μL中に抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；（h）その後、容器にアセトニトリル10 μLを加える工程；（i）前記工程（h）の上澄み液のアリコート1 μLを質量分析ターゲットスライドに移し、上澄み液にマトリックス溶液1 μLを加える工程；及び（j）スライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得し、前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した1つ以上の質量スペクトルと参照質量スペクトルの比較によって行う工程。本発明に従えば、抗酸菌を科、属、種、及び／または株レベルで同定することができる。
Claims (30)
- 試験試料中の抗酸菌の不活性化及び抽出方法であり、以下の連続した工程を含む方法：
（a）試験試料を、抗酸菌の含有が確認されている、または予想される固体または半固体培地から用意し、該試験試料をエタノール及びビーズを含む容器中で懸濁する工程；
（b）該容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、該容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；及び
（c）その後、該懸濁液を少なくとも約5分間、室温でインキュベートし、該試験試料中に含まれる任意の抗酸菌を不活性化する工程。 - 請求項1に記載の方法であり、更に以下の連続した追加工程を含む方法：
（d）該容器を遠心分離にかけ、抗酸菌試料をペレット状にし、上澄み液を除去する工程；
（e）ギ酸中に該抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；及び
（f）その後、該容器にアセトニトリルを加える工程。 - 請求項1または2に記載の方法であり、更に以下の連続した追加工程を含む方法：
（g）前記工程（f）の上澄み液のアリコートを質量分析ターゲットスライドに移し、該上澄み液にマトリックス溶液を加える工程；及び
（h）スライドまたはプレート上の該試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得し、該試験試料中の前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した1つ以上の質量スペクトルと1つ以上の参照質量スペクトルとの比較によって行う工程。 - 請求項1〜3に記載の方法であり、前記抗酸菌がマイコバクテリアまたはノカルジアである方法。
- 請求項2〜4に記載の方法であり、前記工程（d）の上澄み液を直接、または水懸濁液として、質量分析スライドまたはプレートに塗布する方法。
- 請求項1〜5に記載の方法であり、前記容器が70%エタノールを含む方法。
- 請求項1〜6に記載の方法であり、前記ビーズが0.5 mmガラスビーズである方法。
- 請求項2〜7に記載の方法であり、前記工程（d）のペレットを70%ギ酸に再懸濁する方法。
- 請求項2〜8に記載の方法であり、アセトニトリルを約35%〜約65%の最終濃度になるまで加える方法。
- 請求項1〜9に記載の方法であり、前記工程（b）の容器を約1分〜約30分ビーズ破砕またはボルテックスする工程を更に含む方法。
- 請求項1〜10に記載の方法であり、前記工程（c）の懸濁液を少なくとも約5分間インキュベートする工程を更に含む方法。
- 請求項1〜11に記載の方法であり、前記工程（c）の懸濁液を少なくとも約10分間インキュベートする工程を更に含む方法。
- 請求項2〜12に記載の方法であり、前記工程（e）において、該ペレットを少なくとも3 μLのギ酸に再懸濁する方法。
- 請求項2〜12に記載の方法であり、前記工程（f）において、少なくとも3 μLのアセトニトリルを再懸濁した該ペレットに加える方法。
- 請求項1〜14に記載の方法であり、前記工程（f）の後に、該容器中の試験試料を遠心分離する工程を更に含む方法。
- 請求項3〜15に記載の方法であり、前記工程（g）が、該試験試料のアリコートを質量分析スライドまたはプレートに移し、該アリコートを乾燥させ、続いてマトリックスを加える工程を含む方法。
- 請求項3〜16に記載の方法であり、前記マトリックスがα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）である方法。
- 請求項3〜16に記載の方法であり、前記抗酸菌を属、種、及び／または株レベルで同定する方法。
- 試験試料中の抗酸菌の不活性化及び抽出方法であり、以下の連続した工程を含む方法：
（a）試験試料を、抗酸菌の含有が確認されている、または予想される固体または半固体培地から用意し、該試験試料を70%エタノール及び0.5 mmガラスビーズを含む容器中で懸濁する工程；
（b）該容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／またはマイコバクテリア細胞を粉砕する工程；
（c）その後、該懸濁液を少なくとも約5分間、室温でインキュベートし、該試験試料中に含まれる任意の抗酸菌を不活性化する工程；
（d）該容器を遠心分離にかけ、抗酸菌をペレット状にし、上澄み液を除去する工程；
（e）少なくとも3 μLのギ酸中に該抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；
（f）該容器に少なくとも3 μLのアセトニトリルを加える工程；
（g）前記工程（f）の上澄み液のアリコートを質量分析ターゲットスライドに移し、該上澄み液にマトリックス溶液を加える工程；及び
（h）スライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上の抗酸菌の質量スペクトルを取得し、前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した質量スペクトルと1つ以上の参照質量スペクトルとの比較によって行う工程。 - 請求項19に記載の方法であり、前記抗酸菌がマイコバクテリアまたはノカルジアである方法。
- 請求項19〜20に記載の方法であり、前記抗酸菌を科、属、種、及び／または株レベルで同定する方法。
- 試験試料中の抗酸菌の不活性化及び抽出方法であり、以下の連続した工程を含む方法：
（a）試験試料を、抗酸菌の含有が確認されている、または予想される液体培地から用意し、該試験試料を容器に加え、該容器を遠心分離にかけ試験試料中の抗酸菌をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；
（b）該抗酸菌ペレットをエタノールに再懸濁する工程；
（c）該容器にガラスビーズを加える工程；
（d）該容器をビーズ破砕及び／またはボルテックスし、容器中の凝集塊を粉砕する及び／または抗酸菌細胞を粉砕する工程；
（e）その後、該懸濁液を少なくとも約5分間、室温でインキュベートし、該試験試料中に含まれる任意の抗酸菌を不活性化する工程；
（f）該容器を遠心分離にかけ、該不活性化抗酸菌をペレット状にし、その後上澄み液を除去する工程；
（g）ギ酸中に該抗酸菌ペレットを再懸濁する工程；
（h）その後、該容器にアセトニトリルを加える工程；
（i）前記工程（h）の上澄み液のアリコートを質量分析ターゲットスライドに移し、該上澄み液にマトリックス溶液を加える工程；及び
（j）スライドまたはプレート上の試験試料を質量分析により解析し、1つ以上のマイコバクテリアの質量スペクトルを取得し、該試験試料中の前記抗酸菌の特性評価及び／または同定を、測定した1つ以上の質量スペクトルと1つ以上の参照質量スペクトルとの比較によって行う工程。 - 請求項22に記載の方法であり、前記抗酸菌がマイコバクテリアまたはノカルジアである方法。
- 請求項22〜23に記載の方法であり、前記容器が70%エタノールを含む方法。
- 請求項22〜24に記載の方法であり、前記ビーズが0.5 mmガラスビーズである方法。
- 請求項22〜25に記載の方法であり、前記工程（d）のペレットを70%ギ酸に再懸濁する方法。
- 請求項22〜26に記載の方法であり、アセトニトリルを約35%〜約65%の最終濃度になるまで加える方法。
- 請求項22〜27に記載の方法であり、前記工程（b）の該容器を約1分〜約30分ビーズ破砕またはボルテックスする工程を更に含む方法。
- 請求項1に記載の方法であり、前記工程（c）の懸濁液を少なくとも約10分間インキュベートする工程を更に含む方法。
- 請求項22に記載の方法であり、前記抗酸菌を科、属、種、及び／または株レベルで同定する方法。
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