JP2018527925A - 質量分析法を用いた、特性評価および／または同定のための、液体培地に由来する抗酸菌を不活性化および抽出するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、抗酸菌の不活性化のための方法およびキットを対象とする。一実施形態においては、方法は以下を含み得る：サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、第１のチューブは、本体、開口部を有する本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する本体の第２の端を含む、工程；凹型の先端中に抗酸菌をペレット化するためにチューブを遠心分離し、次いで上清をデカントする工程；抗酸菌のペレットをアルコールに再懸濁する工程；懸濁液を、ビーズを含む第２のチューブへと移す工程；抗酸菌細胞を破砕するために、第２のチューブをアジテートする工程；および試験サンプル中の抗酸菌を不活性化するために、懸濁液をインキュベートする工程。方法はまた、質量分析法を用いて、抗酸菌を同定する工程を含み得る。【選択図】図１

Description

本発明は、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）などの抗酸菌を、不活性化および抽出するための方法に関連する。特に、本発明は、質量分析法を用いた、液体培地中で増殖したマイコバクテリウム属またはノカルディア属の種の迅速な特性評価および／または同定のための方法を対象とする。

Ｖｉｔｅｋ（登録商標）、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）、およびＭｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）システムなどの、従来の自動化表現型ＩＤ試験、またはＡＰＩなどの手動表現型試験では、ロバストな結果を得るために、微生物が適切な増殖期にあり、かつ干渉する培地および血液生成物を含まないことを必要とする。これらのシステムでは、プレート状培地の上で１８から２４時間、陽性培養液から培養したコロニーを用いる。しかしながら、より迅速な結果を得るための試みとして、これらのシステムを臨床サンプルから単離した微生物とともに用いることが、いくつかの研究室から報告されている。臨床的に意義がある結果を医者に提供するために、より迅速かつより幅広い特異的な試験が、緊急で必要とされる。

液体培地中で培養した微生物を同定することは、サンプル容器中の微生物の濃度が低く、および液体培地が質量分析法などの分析方法に干渉することから、特に難しい。

質量分析法は、微生物の非常に迅速な同定を可能にする可能性を有するが、液体培地中、および、痰、無菌の体液、またはそれらの組み合わせなどの臨床サンプル中に存在する多くの化合物からの干渉に直面し得る。

微生物の特性評価および同定をするための他の方法が、以下を含む文献に記述されている：

米国特許第６，１７７，２６６号は、細胞タンパク質抽出物または全細胞のいずれかを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）で分析することによって生成された、属、種、および系統特異的バイオマーカによる、細菌の化学分類学的特性評価のための方法を開示する。

米国特許第８，７３５，０９１号は、固体および液体培地に由来する、マイコバクテリウム属またはノカルディア属などの抗酸菌を、不活性化および抽出するための方法を開示する。しかしながらこの‘０９１特許においては、液体培地中で増殖させた場合の、抗酸菌のタンパク質抽出に伴う難しさが認識されていない。特に、‘０９１特許においては、質量分析法を用いて同定するために、十分な量の微生物のバイオマスを液体培地から確保することの難しさが認識されていない。さらに、‘０９１特許においては、質量分析法を用いた同定に干渉する、不活性化溶液を取り除くことの難しさが認識されていない。‘０９１特許においては、特定の大きさおよび／または形状を有するチューブ中で、不活性化および抽出するために抗酸菌の十分なバイオマスを収集および保持することによる、予期しない利益が認識されていない。最後に、‘０９１特許は、質量分析法を用いた同定のために、ペレットを液体培地から分離して干渉を避けることの難しさに対処していない。

したがって、当該技術分野において、後続の質量分析法による分析、特性評価、および／または同定のために、液体培地に由来する微生物を不活性化および／または抽出するための、効率がよく、かつ迅速なプロトコールに対する要求が残されている。特に、不活性化または細胞死は、マイコバクテリウム属またはノカルディア属などの抗酸菌を、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ−３／Ｐ３）環境の外において続けて取り扱うためにしばしば必要である。

米国特許第６，１７７，２６６号 米国特許第８，７３５，０９１号

発明を解決するための手段

一実施形態において、本発明は、液体培地に由来する試験サンプル中の抗酸菌（例えば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属の種）を不活性化および抽出するための方法を対象とし、該方法は、以下の連続的な工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹型の先端中に抗酸菌をペレット化するために前記第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程であって、凹型の先端で終わる円錐台形の部分は、第１の上清の少なくとも９０％をデンカントする際に、抗酸菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されている、工程；（ｃ）抗酸菌のペレットをアルコールに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、第１のチューブから、ビーズを含む第２のチューブへと移す工程；（ｅ）塊を壊すため、および／または、第２のチューブ中の抗酸菌細胞を破砕するために、第２のチューブをアジテートする工程；および（ｆ）試験サンプル中の抗酸菌を不活性化するために、少なくとも５分間、懸濁液をインキュベートする工程。

一実施形態において、抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）ペレットは、工程（ｃ）において、約５０％から約１００％のエタノールに再懸濁することができ、例えば、ペレットは、約７０％のエタノールに再懸濁することができる。方法は、工程（ｅ）において、約１分間から約３０分間、ビーズ式破砕をする工程、および／または、容器をボルテックスする工程を、さらに含み得る。一実施形態において、ビーズは、０．５ｍｍのガラスビーズである。一実施形態において、続くインキュベーション工程（ｆ）は、少なくとも約３分間、または少なくとも約１０分間のインキュベーションを含む。一実施形態において、工程（ｆ）におけるインキュベーションは、室温において実施される。

他の実施形態においては、方法は、タンパク質抽出の一部として、以下の追加の連続的な工程をさらに含む：（ｇ）懸濁液を第３のチューブへと移し、不活性化した抗酸菌をペレット化するために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程；および（ｈ）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌のペレットを再懸濁する工程。いくつかの実施形態においては、工程（ｈ）からの上清を直接、または水懸濁液として、質量分析スライドまたはプレートへと適用することができる。

工程（ｇ）におけるペレットは、約５０％から約９０％のギ酸を用いて、再懸濁し得、例えば、工程（ｈ）において、ペレットは、７０％のギ酸を用いて、再懸濁し得る。ペレットを再懸濁する工程の後、アセトニトリルの最終濃度が約３５％から約６５％となるまで、例えば、約５０％の最終濃度となるまで、アセトニトリルを加え得る。一実施形態において、ペレットは、工程（ｈ）において１０μＬのギ酸に再懸濁し得、および工程（ｈ）においてペレットを再懸濁するために１０μＬのアセトニトリルを加え得る。いくつかの実施形態においては、工程（ｉ）に示すように、細胞デブリスをペレット化するために、懸濁液を遠心分離し得る。

本実施形態にしたがい、方法は、以下の追加の連続的な工程をさらに含み得る：（ｊ）工程（ｉ）からの上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移し、マトリックス溶液を加える工程；および（ｋ）抗酸菌の１または２以上のマススペクトルを取得するために、不活性化した抗酸菌のタンパク質プロファイルを、質量分析スライド上で、質量分析装置を用いて同定し、測定した１または２以上のスペクトルを１または２以上の参照用マススペクトルと比較することによって、試験サンプル中の抗酸菌を特性評価および／または同定する工程。任意で、工程（ｊ）は、工程（ｉ）から得られた試験サンプルのアリコート（例えば、１μＬ）を、質量分析スライドまたはプレートへと移す工程を含み、これにより、アリコートを乾燥することができ、かつ次いでマトリックスを加える。任意の公知のマトリックスを用いることができ、例えば、マトリックスは、アルファ‐シアノ‐４‐ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）であり得る。本発明にしたがって、抗酸菌を、質量分析法、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて、科、属、種、系統レベル、および／または、群／複合体まで同定することができる。

一実施形態に関して記載された任意の１または２以上の態様または特徴は、それに関して具体的に記載されていないが、異なる実施形態に組み込むことができることに留意されたい。すなわち、任意の実施形態のすべての実施形態および／または特徴は、任意の方法および／または組み合わせで組み合わせることができる。出願人は、最初に提出した任意の請求項を変更する、またはそれに応じて任意の新しい請求項を提出する権利を留保し、それは、最初に提出した任意の請求項を、その様式において最初に請求項化されていなくても、任意の他の請求項の任意の特徴に従属する、および／または、任意の他の請求項の任意の特徴を取りこむように、補正することができる権利を含む。本発明のこれらおよび他の目的および／または態様を、以下に示す明細書において詳細に説明する。

本開示の方法およびキットを、以下の添付の図と一緒に説明する：
図１は、本開示の一実施形態に係る、液体培地に由来する抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）を不活性化および抽出する方法のフローチャートを示す。 図２は、本発明の一実施形態に係る、凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有するチューブの例を示す。 図３は、本発明の一実施形態に係る、異なる外形を有するチューブの例を示す。 図４は、ＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）中でインキュベートした、さまざまなマイコバクテリウム属の系統の同定結果を示す。 図５は、Ｂａｃｔｅｃ（商標） ＭＧＩＴ（商標）９６０ マイコバクテリア検出システム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）中でインキュベートした、さまざまなマイコバクテリウム属系統の同定結果を示す。 図６は、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ装置中でインキュベートした、さまざまなマイコバクテリウム属の系統の同定結果を示す。

本発明は、異なる形態で実施することができ、本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示を徹底的かつ完全にするため、および本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して説明された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、および特定の実施形態に関して説明された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、本明細書に示唆された実施形態に対する多くの変形および追加は、本開示に照らして当業者には明らかであり、本発明から逸脱しない。

本譲受人らのＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳシステム（ビオメリュー・インコーポレイテッド、ミズーリ州セントルイス）は、サンプルのタンパク質プロファイルを分析し、および公知の生物のプロファイルのデータベースと一致させるために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法―飛行時間型（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）質量分析計を用いた、細菌の同定のためのプラットフォームを提供する。サンプルをターゲットスライド上に置き、マトリックス（例えば、ＣＨＣＡマトリックス（α‐シアノ‐４‐ヒドロキシ‐桂皮酸マトリックス））によって覆い、およびそれから、質量分析計で処理した。

最も一般的な臨床的に意義のある微生物を、細胞を直接ＶＩＴＥＫ（登録商標）ＭＳターゲットスライド上へと置くことによって分析することができる。分析のための抗酸菌（例えば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）サンプルの調製は、バイオセーフティレベル３（ＢＳＬ‐３／Ｐ３）環境の外でサンプルを安全に操作することができるようにするために、不活性化工程が必要であるという点において、標準的な手順とは異なる。さらに、液体培地由来のサンプルを分析することは、十分な量のバイオマスを確保すること、および同定に干渉する不活性化溶液を排除することへの挑戦につながる。

本出願において、アルコール中におけるインキュベーションを機械的破砕と組み合わせることによって、抗酸菌の不活性化のための、効果的かつ迅速な方法がもたらされることが見出された。アジテーションまたは機械的破砕の工程と、その後破砕したサンプルをアルコール中において室温で、少なくとも３分間、少なくとも５分間、または少なくとも１０分間、インキュベートすることによる不活性化工程とを含むプロセスを用いるときに、アルコールへの曝露が効果的であることを示した。いくつかの実施形態において、アルコールはエタノールである。一実施形態において、機械的破砕は、ボルテックス、または、サンプル、抽出溶媒、およびビーズ（例えば、ごく小さいガラスビーズ）を含む封をしたマイクロ遠心チューブをアジテートすることによって細胞を破砕するホモジナイザーである、ビーズ式破砕装置（ＢｉｏＳｐｅｃ、オクハラマ州バートルズビル）を用いて実施する。典型的には、ビーズは、微量遠心チューブの中で細胞を破砕するために機能することができる、任意の公知のビーズであり得る。例えば、ビーズは、ガラス、セラミック、ジルコニア、シリコン、金属、スチール、タングステンカーバイド、ガーネット、砂、またはサファイアビーズであり得る。一実施形態において、ビーズは、約０．１ｍｍから約１ｍｍの大きさであり得、例えば、約０．５ｍｍの大きさであり得る。

明確かつ一貫したスペクトルをもたらすために、不活性化した細胞からの細胞タンパク質の抽出を助けるための追加の処理工程を用いることができる。例えば、ギ酸による処置工程に続いてアセトニトリルに曝す工程を用い、後の分析（例えば、質量分析法による）用にタンパク質を抽出及び溶解してもよい。

本発明は、液体培地に由来する試験サンプル中の未知の抗酸菌を不活性化、抽出、特性評価、および／または、同定する方法を提供する。本発明はまた、質量分析法を用いた、液体培地に由来する試験サンプル中の抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）を迅速に特性評価および／または同定するための方法を対象とする。迅速な方法によって、従来の技術に比べてより迅速に抗酸菌を特性評価および／または同定することができ、試験サンプルのより迅速な診断および特性評価／同定につながる。サンプルの取得から、抗酸菌のサンプルの特性評価／同定までの、本発明の方法に含まれる工程は、臨床的に意義がある利用できる情報を得るために、とても短い時間枠において実行することができる。特定の実施形態において、本発明の方法は、約１２０分間未満、たとえば、約１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、または１０分間未満で、実行することができる。本発明の方法の迅速性は、従来の方法に対する改善を表す。

本発明の一実施形態において、サンプルは、抗酸菌感染を有する、または有すると疑われる被験者（たとえば、患者）から得られる。本明細書中で用いられる場合、用語「抗酸菌」は、マイコバクテリウム属およびアクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）（ノカルディア属、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ツカムレラ属（Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ）、およびディエチア属（Ｄｉｅｔｚｉａ））を包含するが、これらに限定されない任意の抗酸菌を包含する。

本明細書中で用いられる場合、用語「マイコバクテリア」または「マイコバクテリウム属」は、マイコバクテリウム ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウム アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｅｔｔｉ）、マイコバクテリウム アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム カンサシ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム マルモエンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ゼノピ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ）、マイコバクテリウム マリヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム シミアエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｍｉａｅ）、マイコバクテリウム テラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｒｒａｅ）、マイコバクテリウム ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム アブセッサス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、マイコバクテリウム フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム ケロネー（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ）、マイコバクテリウム スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム アルベイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｖｅｉ）、マイコバクテリウム ファルシノゲネス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マイコバクテリウム フォーチュイタム フォーチュイタム亜種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ ｓｓｐ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウム ハウストネンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ ｈｏｕｓｔｏｎｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ペレグリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒｅｇｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム ポルシナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｒｃｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム セネガレンセ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ゲナベンス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎａｖｅｎｓｅ）、マイコバクテリウム ヘモフィルム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、マイコバクテリウム イムノゲナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｕｍ）、マイコバクテリウム レンティフラバム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｎｔｉｆｌａｖｕｍ）、マイコバクテリウム ムコゲニカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｕｃｏｇｅｎｉｃｕｍ）、マイコバクテリウム ツルガイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｚｕｌｇａｉ）、マイコバクテリウム ツベルクローシス複合体（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ）およびマイコバクテリウム ゴードナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ）などの、迅速発育菌、または遅発育菌を包含するが、これらに限定されない任意の公知のマイコバクテリウム属を含むことを意図している。いくつかの実施形態において、Ｍ． アブセッサス（Ｍ． ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、Ｍ． フォーチュイタム（Ｍ． ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ． ケロネー（Ｍ． ｃｈｅｌｏｎａｅ）、およびＭ． スメグマチス（Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）などの迅速発育菌は、短い時間で同定することができ、診断および処理を助ける。予期できなかったことに、遅発育菌マイコバクテリウム属の種もまた、敏速に不活性化および抽出することができ、また、図４〜６に示すように、短い時間で同定できた。

本明細書中で用いられる場合、用語「ノカルディア属」は、ノカルディア アエロコロニゲネス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｅｒｏｃｏｌｏｎｉｇｅｎｅｓ）、ノカルディア アフリカーナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｆｒｉｃａｎａ）、ノカルディア アルゼンティネンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎｅｎｓｉｓ）、ノカルディア アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ノカルディア ブラックウェルイー（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｌａｃｋｗｅｌｌｉｉ）、ノカルディア ブラジリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ノカルディア ブレビカテナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒｅｖｉｃａｔｅｎａ）、ノカルディア カメア（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃａｍｅａ）、ノカルディア カヴィエ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃａｖｉａｅ）、ノカルディア セラドエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｅｒｒａｄｏｅｎｓｉｓ）ノカルディア コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ノカルディア シリアシジョージカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｙｒｉａｃｉｇｅｏｒｇｉｃａ）、ノカルディア ダソンヴィレイ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ノカルディア エレガンス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｅｌｅｇａｎｓ）、ノカルディア ファルシニカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ）、ノカルディア ナイジイタンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｎｉｇｉｉｔａｎｓｉｓ）、ノカルディア ノヴァ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｎｏｖａ）、ノカルディア オパカ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｐａｃａ）、ノカルディア オティティジス−キャビアルム（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｏｔｉｔｉｄｉｓ−ｃａｖａｒｉｕｍ）、ノカルディア パウシボランス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ノカルディア シュードブラシリエンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｐｓｅｕｄｏｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ノカルディア ルブラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ）、ノカルディア セリオラエ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｅｒｉｏｌａｅ）、ノカルディア トランスバレンシス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｔｒａｎｓｖｅｌｅｎｃｅｓｉｓ）、ノカルディア ユニフォルミス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ノカルディア ヴァシニ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｖａｃｃｉｎｉｉ）、およびノカルディア ベテラナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｖｅｔｅｒａｎａ）を包含するが、これらに限定されない任意の公知のノカルディア属を包含することを意図している。

本明細書で用いられる場合、「特性評価」は、生物学的粒子の幅広いカテゴリ化、または分類、および／または、抗酸菌の科、属、種、および／または系統レベルまたは群／複合体の実際の同定を包含する。分類は、抗酸菌の表現型および／または形態上の特性の判定を含んでもよい。例えば、細菌の特性評価は、構造、形、大きさ、着色、クラスタリング、および／または代謝などの観察できる違いに基づいて達成されてもよい。

本明細書で使用される場合、「同定」とは、これまで未知とされてきた抗酸菌（例えば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）が、どの科、属、種、系統、または群／複合体に属するかを決定することを意味する。例えば、これまで未知とされてきた抗酸菌を、科、属、種、系統レベル、および／または、群／複合体まで同定することなどである。

実施態様において、本発明は、液体培地中に含まれる抗酸菌の不活性化方法を対象とする。一実施形態においては、方法は以下の工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹型の先端中に抗酸菌をペレット化するために第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程であって、凹型の先端で終わる円錐台形の部分は、第１の上清の少なくとも９０％をデンカントする際に、抗酸菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されている、工程；（ｃ）抗酸菌のペレットをアルコールに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、ビーズを含む第２のチューブへと移す工程；（ｅ）第２のチューブ中の塊を壊すため、および／または、抗酸菌細胞を破砕するために、第２のチューブをアジテートする工程；および（ｆ）試験サンプル中の抗酸菌を不活性化するために、少なくとも５分間、懸濁液をインキュベートする工程。

一実施形態においては、取得した液体培養サンプルは、約０．５ｍＬから約１０ｍＬ、約１ｍＬから約５ｍＬ、約１ｍＬから約３ｍＬ、または約１、２、３、４、もしくは５ｍＬであり得る。例示的な実施形態においては、陽性の液体培地から取得したサンプルは、約３ｍＬである。液体培養サンプルからの少なくとも約３ｍＬを含むサンプルは、質量分析法による正確な同定をもたらすために十分な微生物を有することが見出されている。

いくつかの実施形態においては、抗酸菌を含有する液体培地は、抗酸菌について陽性の試験結果が得られたサンプル容器である。たとえば、サンプル容器は、被験者からの生物学的サンプルを培養し得る。被験者が抗酸菌について陽性であるとき、サンプル容器は、たとえば容器内のセンサによって、陽性と認定される。一実施形態においては、液体培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定された後、少なくとも約２４時間後に取得される。いくつかの実施形態においては、液体培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定された後、約２４時間から７２時間の間に、取得される。さらなる実施形態においては、液体培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定された後、１時間、２時間、４時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、または２４時間後に、取得される。さらに他の実施形態においては、液体培養サンプルは、サンプル容器が陽性と認定された後、４８時間よりも遅くに取得される。いくつかの実施形態においては、陽性と認定された後もサンプル容器をインキュベートし続けることによって、サンプル容器内の微生物の個体数が増加する。たとえば、いくつかの実施形態においては、抗酸菌についての必要とされるバイオマスとして、最低濃度の１．０×１０^７ＣＦＵ／ｍＬがサンプル中に存在する。このようにして、液体培養サンプル中の微生物の濃度はより多くなり、かつ、質量分析により正確に同定できる可能性がより増加する。さらに、いくつかの研究室においては、日または週の間に、サンプル容器を評価することができない時が存在し得る。本方法は、時間の長さに融通がきき、サンプル容器が陽性と認定された後、サンプル容器をインキュベートし得る。

説明したように、いくつかの実施形態においては、方法は、本体、開口部を有する本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する本体の第２の端を有するチューブの中で、サンプルを遠心分離する工程を含む。図２について簡単に説明すると、説明した例示的なチューブが示されている。図２においては、チューブ２００は、チューブ２００の縦軸２１０にそって、本体２０２、本体２０２の第１の端における開口部２０４、および本体２０２の第２の端における凹型の先端２０８で終わる円錐台形の部分２０６を含む。一実施形態において、本体は、約５ｍＬの容積を有する。たとえば、本体は、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、または７ｍＬの容積を有する。本明細書中で用いられる場合、「円錐台形」は、円錐の錐台の形状を意味する。円錐の錐台は、土台に対して並行な面で上部を切ることによって形成された、円錐の土台部分である。いくつかの実施形態においては、チューブ２００は、チューブ２００の内容物を保持するために何度も封ができるキャップ２１２を含み、チューブ２００の内容物は、さらにセーフティロックによって保持されてもよい。いくつかの実施形態においては、何度も封ができるキャップは、スクリューキャップであり得る。この実施形態においては、スクリューキャップは、第１のチューブ中に微生物を封じることによってユーザを保護する。たとえば、スクリューキャップは、感染の機会を減少させるために、気密な封を形成してもよい。さらなる実施形態においては、何度も封ができるキャップは、スナップフィットキャップであり得、Ｏリングシールまたはツイストロックのような特徴を含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、円錐台形の部分２０６の縦軸２１０からの角度は、４５度より小さい。たとえば、円錐台形の部分２０６の縦軸からの角度は、約３０度、約２５度、約２０度、約１５度、約１０度、または約５度であり得る。円錐台形の部分２０６の縦軸２１０に対する角度は、ペレット化された微生物を凹型の先端中に保持しながら、チューブから上清をデカントすることを助ける。いくつかの実施形態においては、凹型の先端は、上清（たとえば、液体培地など）をデカントする際に、抗酸菌のペレットを保持するように構成されている。

いくつかの実施形態においては、第１のチューブを少なくとも約１０分間遠心分離し、たとえば、第１のチューブを、５分間、１０分間、１５分間など、遠心分離し得る。一実施形態においては、チューブの底にペレットを、かつペレットの上部に上清を生成するために、第１のチューブを３，０００×ｇにおいて遠心分離する。第１のチューブは、当業者の決定に従い、より速い、またはより遅い速度で遠心され得る。

いくつかの実施形態においては、第１のチューブ中でサンプルを遠心分離した後、遠心分離によって生じた第１の上清を第１のチューブからデカントし、ここで、凹型の先端で終わる円錐台形の部分は、抗酸菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されている。いくつかの実施形態においては、少なくとも約９０％の第１の上清がデカントされる。たとえば、９０％、９５％、９９％、または９９．９％の上清が第１のチューブからデカントされる。上清の除去およびペレット化された微生物の保持は、質量分析法を用いた微生物の正確な同定のために重要である。生物学的サンプル中の過剰な上清が、質量分析計を用いて生成されたスペクトルに干渉し得ることから、上清の除去は重要である。質量分析計による分析のために十分な微生物が利用できることを保証するために、ペレット化された微生物の保持は重要である。いくつかの実施形態においては、デカントする工程は、第１のチューブを吸い取り紙によって乾かす工程、および／または、上清が開口部から出ていくことができるように、第１のチューブを一定時間さかさまにする工程を含む。

遠心分離工程（ｂ）の後、工程（ｃ）において、約１０μＬから約１ｍＬ、または約５０μＬから約７５０μＬ、約１００μＬから約５００μＬ、または約５００μＬのアルコールによって、第１のチューブ中で抗酸菌のペレットを再懸濁することができる。ペレットを懸濁するために用いるアルコールは、約５０％から約１００％のアルコール、約６０％から約９０％のアルコール、または約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のアルコールであり得る。例示的な実施形態においては、アルコールはエタノールである。

いくつかの実施形態においては、方法は、第１のチューブから、ビーズを含む第２のチューブへと懸濁液を移す工程を含む。いくつかの実施形態においては、方法は、塊を壊すため、および／または、抗酸菌細胞を破砕するために、懸濁液をアジテートする工程を含む。たとえば、抗酸菌試験サンプルを、ボルテックス、または、サンプル、抽出溶媒、およびビーズを含む封をしたマイクロ遠心チューブをアジテートすることによって細胞を破砕するホモジナイザーである、ビーズ式破砕装置（たとえば、ＢｉｏＳｐｅｃ社（オクラホマ州バートルズビル）のビーズ式破砕装置）を用いて、機械的に破砕する。典型的には、ビーズは、容器または微量遠心チューブの中で細胞を破砕するために機能する、任意の公知のビーズであり得る。例えば、ビーズは、ガラス、セラミック、ジルコニア、シリコン、金属、スチール、タングステンカーバイド、ガーネット、砂、またはサファイアビーズであり得る。一実施形態において、ビーズは、約０．１ｍｍから約１ｍｍの大きさであり得、例えば、約０．５ｍｍの大きさであり得る。一実施形態において、ビーズは、０．５ｍｍのガラスビーズである。典型的には、工程（ｅ）において、約１分間から約３０分間、約５分間から約２０分間、約５分間から約１０分間、または約５分間または１０分間、ビーズ式破砕、または容器をボルテックスすることにより、チューブに破砕を施す。さらなる実施形態においては、ボルテックスを用いて、チューブを一定時間アジテートする。たとえば、チューブを少なくとも約１５分間ボルテックスし得る。いくつかの実施形態においては、チューブを１０分間、１５分間、２０分間、３０分間、またはそれより長く、ボルテックスする。

試験サンプル中の抗酸菌を破砕した後、チューブ、およびすなわち試験サンプル中の抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）を、容器を少なくとも３分間インキュベートすることによって、不活性化する。一実施形態においては、インキュベーション工程（ｆ）は、少なくとも５分間または少なくとも１０分間であり得る。他の実施形態において、インキュベーション工程（ｆ）は、約５分間から約３０分間、約１０分間から約２０分間、または約５、１０、１５、２０、２５または３０分間であり得る。一実施形態においては、インキュベーション工程（ｆ）は、室温において実施される。他の実施形態において、インキュベーション工程（ｆ）は、より高い温度、たとえば、３０℃、３７℃、または５５℃において実施される。

他の様態において、本発明は、抗酸菌試験サンプルのタンパク質抽出のためのさらなる工程を対象とする。一実施形態において、本発明の抽出工程にさらされる抗酸菌試験サンプルは、上述した不活性化のための方法から得られた試験サンプルであり得る（すなわち、上述した不活性化した抗酸菌試験サンプル）。

抽出方法は、以下の工程を含み得る：（ｇ）懸濁液を第３のチューブへと移し、不活性化した抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）をペレット化するために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程；および（ｈ）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌のペレットを再懸濁する工程。いくつかの実施形態においては、不活性化した抗酸菌のペレットを、ギ酸および／またはアセトニトリルに再懸濁する。任意で、方法は、細胞タンパク質を抽出し（工程（ｉ））、細胞デブリスをペレット化するために、工程（ｈ）の後に容器中の試験サンプルの遠心分離を、さらに含む。たとえば、第３のチューブは、１６，０００×ｇにおいて２分間、遠心分離することができる。

これらの実施形態にしたがって、約５０％から約１００％のギ酸、約６０％から約９０％のギ酸、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のギ酸を用いて、ペレットを再懸濁し得る。いくつかの実施形態においては、ペレットを再懸濁した後、アセトニトリルを、約３５％から約６５％の最終濃度まで、約４０％から約６０％の最終濃度まで、またはアセトニトリルの最終濃度が、約３５％、４０％、５０％、６０％、または６５％となるまで、加える。一実施形態においては、この工程において１００％アセトニトリルを用いるが、他の濃度のアセトニトリルを用いてもよい。

一実施形態においては、ペレットを少なくとも３、５、または１０μＬのギ酸に再懸濁し得、および再懸濁したペレットに、少なくとも３、５、または１０μＬのアセトニトリルを加えることができる。他の実施形態においては、ペレットを、約３μＬから約１００μＬのギ酸、約５μＬから約８０μＬのギ酸、約１０μＬから約５０μＬのギ酸、または約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μＬのギ酸を用いて再懸濁し得る。他の実施形態においては、ペレットを再懸濁した後、少なくとも約３、５、または１０μＬのアセトニトリルを、再懸濁したペレットに加える。たとえば、約３μＬから約１００μＬのアセトニトリル、約５μＬから約８０μＬのアセトニトリル、１０μＬから約５０μＬのアセトニトリル、または約３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μＬのアセトニトリルを、再懸濁したサンプルに加え得る。

本発明は、質量分析法を用いた、たとえば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐質量分析法）を用いた、未知の抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）を特性評価、および／または、同定するための方法もまた提供する。本発明にしたがって、特性評価および／または同定工程は、上述した不活性化および抽出工程の後に行い得る。

この実施形態にしたがって、方法は、以下の追加の工程をさらに含み得る：工程（ｊ）からの上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移し、上清へマトリックス溶液を加える工程；および（ｋ）抗酸菌の１または２以上のマススペクトルを取得するために、質量分析法によって、質量分析スライド上において、第３の上清中の不活性化した抗酸菌のタンパク質プロファイルを同定し、測定した１または２以上のスペクトルを１または２以上の参照用マススペクトルと比較することによって、試験サンプル中の抗酸菌を、特性評価および／または同定する工程。任意で、移したアリコートは、約０．５μＬから約２．５μＬ、または約１μＬであり得る。当該技術分野においてよく知られているように、アリコートは、典型的には乾燥することができ、かつ次いで、マトリックス溶液を加える。一般的に、当該技術分野における任意の公知のマトリックスを用いることができる。たとえば、一実施形態においては、マトリックスは、アルファ‐シアノ‐４‐ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）である。本発明にしたがって、抗酸菌（たとえば、マイコバクテリウム属またはノカルディア属）は、さらに以下で記載するように、たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて、科、属、種、系統レベル、または、群／複合体まで同定することができる。

質量分析プレートまたはスライドを準備した後、スライドまたはプレートを質量分析計に挿入する。試料のポンプダウン時間が終わった後（すなわち、１０−５から１０−７Ｔｏｒｒの雰囲気下になるように大気ガスを試料から除去する）、試料を質量分析計のイオン化室に導入する。試料を装置に合わせて並べる。最適配置が得られたら、窒素レーザーを照射する。マトリックスはレーザーエネルギーを吸収し、蓄積した高エネルギーによりプレート表面から気化する。副次的効果として、本工程においては、抗酸菌細胞の一部（たとえばタンパク質）も蒸発してイオン化される。これらのイオンは、プレートと、質量分析計の飛行管への入り口との間における静電界の発生により、既知の運動エネルギーにまで加速される。質量にかかわらず、すべての一価イオンは、飛行管の入り口で同じ運動エネルギーを有するが、その質量に反比例した速度を有する。飛行管の入り口から、イオンは、飛行管を移動して検出器に向かい、かつ、より軽いイオンは、より重いイオンの前に達する（飛行管は質量／電荷識別器である）。検出器は、イオンが検出器に衝突するたびに電荷を発生する。検出器の出力はデジタル化され、その出力は、一方の座標軸に質量／電荷比、もう一方の座標軸に衝突回数を表示する。一実施形態においては、スライドまたはプレート上の抗酸菌のタンパク質プロファイルは、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）質量分析法、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）質量分析法、液体クロマトグラフ（ＬＣ）質量分析法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法、及び選択イオンフローチューブ（ＳＩＦＴ）分析法などの、任意の公知の質量分析技術、或いは、他の質量分析技術を用いて、解析することができる。

一実施形態においては、対照測定値（ｃｏｎｔｒｏｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）を既知の抗酸菌に対して取ることで、測定した試験データと調査対象の抗酸菌の特性評価との相関付けを様々な数学的方法を使用して行うことが可能となる。例えば、ソフトウェアシステムを活用して、サンプルからのデータを、基準または対照測定値と比較し得る。より詳細には、データを多数の多変量解析法、例えば、一般判別分析（ＧＤＡ）、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳＤＡ）、部分最小二乗回帰、主成分分析（ＰＣＡ）、平行因子分析（ＰＡＲＡＦＡＣ）、ニューラルネットワーク分析（ＮＮＡ）及び／またはサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によって分析し得る。これらの方法を使用することにより、調査対象の未知の抗酸菌（例えば、マイコバクテリア属またはノカルディア属）を、既存の命名法に基づいて関連群に、及び／または、有機体の代謝、病原性及び／若しくは毒性に基づいて、天然群に分類することができる。一実施形態においては、抗酸菌の１または２以上のマススペクトルを取得した後、その１または２以上のスペクトルを「ＳＡＲＡＭＩＳ」微生物同定ソフトウェア（ビオメリュー社、ミズーリ州セントルイス）に入力し、抗酸菌の解析、つまり特性評価及び／または同定を実施する。

また別の実施形態では、検出時間および増殖率などの検出システムからの非分光測定値を、試験サンプルに由来する抗酸菌の特性評価及び／または同定を助けるために用いることができる。

本発明のいくつかの実施形態においては、試験サンプル中の抗酸菌の特性評価及び／または同定において、正確な種の同定を行う必要はない。特性評価は、単一の種の実際の同定だけでなく、生物学的粒子の幅広いカテゴリ化または分類も包含し得る。本明細書で使用される場合、「同定」とは、これまで未知とされてきた抗酸菌が、どの科、属、種、系統レベル、または、群／複合体に属するのか決定することを意味する。例えば、これまで未知とされてきた抗酸菌を、科、属、種、系統レベル、または群／複合体まで同定する。

ここで図１を参照すると、一様態において、液体試験サンプル中の抗酸菌の不活性化、抽出、および同定のための方法１００を提供する。一実施形態において、方法は、以下の工程を含む：（ａ）試験サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；（ｂ）凹型の先端中に抗酸菌をペレット化するために第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程；（ｃ）懸濁液を生成するために、抗酸菌のペレットをアルコールに再懸濁する工程；（ｄ）懸濁液を、機械的破砕のために、ビーズを含む第２のチューブへと移す工程；（ｅ）抗酸菌を不活性化するために、アルコール中の懸濁液をインキュベートする工程；（ｆ）懸濁液を、第３のチューブへと移す工程；（ｇ）不活性化した抗酸菌をペレット化するために、第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程；（ｈ）不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、不活性化した抗酸菌のペレットを再懸濁する工程；（ｉ）不活性化した抗酸菌を含む溶液から細胞タンパク質を抽出し、前記細胞デブリスをペレット化するために、前記溶液を遠心分離する工程；（ｇ）工程（ｉ）からの第３の上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移す工程；および（ｈ）抗酸菌のタンパク質プロファイルの１または２以上のマススペクトルを取得するために、質量分析法によって、前記質量分析ターゲットスライドを解析し、測定した１または２以上のスペクトルを１または２以上のタンパク質プロファイルの参照用マススペクトルと比較することによって、前記試験サンプル中の前記抗酸菌を特性評価および／または同定する工程。

ここでブロック１０２を参照すると、いくつかの実施形態において、方法は、陽性の液体培地から、陽性の結果後２４〜７２時間の間に、３．０ｍＬのサンプルを取得する工程を含む。説明したように、サンプルの容積は、質量分析装置を用いて、受容し得るスペクトルを取得するために、十分な微生物がサンプル中に存在することを保証することを助ける。同様に、陽性の液体培地から、陽性の結果後２４〜７２時間の間に、サンプルを取得することによって、液体培地中の微生物の数を増加させる。いくつかの実施形態においては、陽性の液体培地からサンプルを、２４時間より短い時間内で取得する。たとえば、マイコバクテリウム属の多くの系統が、陽性のわずか２時間後に同定され得ることを示す図４〜６を参照されたい。

ブロック１０４においては、いくつかの実施形態においては、サンプルを、凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有するチューブ（たとえば、５．０ｍＬのチューブ）中に入れ、それから遠心分離する。たとえば、ペレットを凹型の先端中に、かつ上清をペレットの上に生成するために、チューブを３，０００×ｇにおいて１０分間遠心分離することができる。それから上清を、デカントする工程によって捨てる。たとえば、チューブを逆さまにし、上清を開口部を通して捨て、それから過剰な液体を取り除くために、チューブを吸い取り紙によって乾かし得る。

ブロック１０６においては、ペレットをアルコールに再懸濁する。いくつかの実施形態においては、ペレットを５００μＬの７０％エタノールに再懸濁し、および一実施形態においては、懸濁液を０．５ｍｍのガラスビーズを含む第２のチューブに移す。いくつかの実施形態においては、ガラスビーズを元のチューブに加える。いくつかの実施形態においては、アルコールは微生物を不活性化しはじめるが、細胞は懸濁液中で塊になったままである。結果として、はじめのアルコール処理は、アジテーション後の処理と同じくらい効果的ではない。

ブロック１０８において、一実施形態においては、チューブをビーズ式破砕し、それからインキュベートする。たとえば、５分間チューブをビーズ式破砕し得、それから１０分間インキュベートし得る。アジテーションおよびインキュベーションの組み合わせは、微生物を不活性化する。或いは、ブロック１１０に示すように、いくつかの実施形態においては、チューブをボルテックスしてからインキュベートし、たとえば１５分間ボルテックスしてから１０分間インキュベートする。議論したように、インキュベーションは室温において、またはより高い温度において実施され得る。

ここで、ブロック１１２を参照すると、いくつかの実施形態においては、アジテーションおよびインキュベーションの後にチューブ中に存在する不活性化した抗酸菌を、ボルテックスし、懸濁液を空のチューブに移す。ブロック１１４においては、懸濁液を遠心分離し、エタノールの上清を取り除き、不活性化した抗酸菌をチューブ中でペレット化したまま残す。

ブロック１１６および１１８においては、細胞タンパク質を、１０μＬの７０％ギ酸を加え、その後１０μＬのアセトニトリルを加えることによって抽出する。いくつかの実施形態においては、細胞デブリスをペレット化するために、ギ酸および／またはアセトニトリルを加えた後にチューブをボルテックスする。

ブロック１２０においては、１μＬの懸濁液を質量分析ターゲットスライド上に播種し、ブロック１２２においてマトリックスをターゲットスライドに加え、およびブロック１２４においてＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法を用いて微生物を同定する。この方法においては、液体培地から同定を行うことの難しさに対処する特定の工程を用いることによって、液体培地に由来する微生物の同定における予期しない改善を表す。

ここで話を図３に移すと、チューブの外形の比較３００を提供する。図３に示すように、チューブＡは、凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する。この外形は、チューブＢ、Ｃ、Ｄ、およびＥと対照的である。チューブＡは、質量分析法を用いた微生物の同定を助けるために、上清の多くの割合をデカントする際に、ペレットを凹型の先端に保持することが見出された。チューブＢは、たとえば、ペレットのいくらか、またはすべてが上清をデカントする工程の間に失われてしまうため、同定に適さない。チューブＣは、デカントする工程の間に、保持された上清を減らすが、ペレットを保持するように設計されていない。かわりに、先端の形によって、上清はペレットの下および周囲に保持される。同様に、チューブＤは、ペレットを保持するが、ペレットの下の角のある先端中に液体もまた保持する。たとえば、チューブＡをデカントした後に、一実験においてはたった１０〜２０μＬの培地のみがチューブ中に保持されていたが、チューブＤにおいてはデカントした後に、２００〜４００μＬの培地がチューブ中に残っていた。チューブＥは、デカントする工程の間に、ペレットのいくらか、またはすべての損失につながった。予期できなかったことに、チューブＡは、液体培地を用いることの難しさに対処しながら、質量分析装置を用いた微生物の同定において、著しく改善した結果を示す。

図４においては、ＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システム中でインキュベートした、ＡＴＣＣおよび臨床的に単離したマイコバクテリウム属の種の、多数の系統の同定結果を提供する。この図においては、２８の異なるマイコバクテリウム属の系統を、ＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システム中でインキュベートした。各系統をサンプル容器中でＶｅｒｓａＴＲＥＫ（登録商標）自動微生物検出システムを用いてインキュベートし、サンプル容器が微生物の増殖について陽性であるとシステムが表示したときに取り除き、追加の時間、サンプル容器中でインキュベートし、およびマイコバクテリウム属の細胞からのタンパク質を不活性化かつ抽出するために、サンプル容器からのサンプルを、本明細書中で開示した方法によって、断続的に処理した。陽性後のサンプルが、正確なマススペクトルを生じるために、十分なバイオマスを有し、かつコンタミネーションを欠いているかどうかを決定するために、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法によって、マイコバクテリアのタンパク質を分析した。図４に示す結果は、本明細書に開示した方法が、サンプル容器が微生物の増殖について陽性であるとシステムが判定した後、短い時間で、マイコバクテリアのタンパク質を不活性化および抽出することができ、および、正確にスペクトルを生成することができ、予期された種レベルの同定に対して、９９．９％の一致度で合致することを実証する。陽性の後、３６時間以内に処理したとき、試験したすべての系統が正確に同定され、かつ、３つの系統を除いてすべてが２４時間以内に同定された。驚くべきことに、Ｍ． ａｖｉｕｍ（Ｍ． アビウム）およびＭ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（Ｍ． イントラセルラーレ）などの高い普及率の系統を含む多くの系統は、陽性後、１２時間以内に処理したとき、正確に同定された。

図５は、Ｂａｃｔｅｃ（商標） ＭＧＩＴ（商標）９６０マイコバクテリア検出システム中でインキュベートした、さまざまなマイコバクテリウム属の系統の同定結果を示す。図４と同様に、図５は、本方法が陽性の後迅速に、マイコバクテリアのタンパク質を不活性化、抽出、および同定することができることを実証する。たとえば、２つ以外のすべての系統は、２４時間以内で、予期された種レベルの同定に対して、９９．９％の一致度で合致するサンプルスペクトルを有していた。残りの２つの系統は、４０時間以内で、予期された種レベルの同定に対して、９９．９％の一致度で合致した。マイコバクテリアのタンパク質のこの迅速な不活性化、抽出、および同定は、マイコバクテリアに関連する感染症の治療に衝撃を与えるだろう。

図６においては、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ装置中でインキュベートしたマイコバクテリウム属のさまざまな系統の同定結果を提供する。再度、サンプルをサンプル容器中でインキュベートし、装置はサンプルが微生物の増殖について陽性となったときを判定し、および開示した方法によって、試験のために、サンプルを陽性のサンプル容器から、断続的に取得する。この例において、すべての系統は、２４時間以内で、予期された種レベルの同定に対して、９９．９％合致するサンプルスペクトルを有していた。

他の様態においては、図１および本明細書の他の場所で記載した、方法とともに用いるためのキットを提供する。一実施形態においては、キットは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を有する第１のチューブであって、第１のチューブは少なくとも５ｍＬの容積を有する、第１のチューブ；アルコールの溶液；ギ酸の溶液；およびアセトニトリルの溶液を含む。さらなる実施形態においては、キットは０．５ｍｍのガラスビーズおよび／または吸い取り紙を含み得る。同様に、キットは、第１のチューブをデカントするためのスタンド、または本明細書中で記載し、およびキットがそのために用いるように設計された方法のための使用説明書を含み得る。

図面において、線の厚さ、層、特徴、構成要素および／または領域は、明確化のために誇張され得る。加えて、動作（または工程）の配列は、特に指示がない限り、特許請求の範囲に示された順序に限定されない。

本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された特徴、工程、動作、要素および／または構成要素の存在を特定するが、１または２以上の他の特徴、工程、動作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を排除しない。「含む」という用語は、本明細書で使用することができるが、要素を「含む」と呼ばれる目的語は、要素「からなる」または「から本質的になる」ことでもあり得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つまたは２以上の任意のおよびすべての組み合わせを含む。同様の番号は、全体を通して同様の要素を指す。本明細書中で使用される場合、「ＸとＹとの間」および「約ＸとＹとの間」などの語句は、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使用する場合、「約ＸとＹとの間」などの語句は、「約Ｘと約Ｙとの間」を意味する。本明細書中で使用する場合、「約ＸからＹまで」などの語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。

他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書に定義された用語などの用語は、明細書および関連技術の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、および、本明細書中において明確にそのように定義されない限り、理想化された、または過度に正式な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。周知の機能または構成は、簡潔さ、および／または明確さのために、詳細には説明されない場合がある。

本発明は、部分的に、本発明の実施形態に係る方法、装置（システム）およびコンピュータプログラム製品のフローチャート図および／またはブロック図を参照して説明される。フローチャート図および／またはブロック図の各ブロック、およびフローチャート図および／またはブロック図のブロックの組み合わせは、コンピュータプログラムの命令によって実施できることが理解されるであろう。これらのコンピュータプログラムの命令は、汎用コンピュータ、特殊目的コンピュータ、または他のプログラマブルデータプロセシング装置のプロセッサに提供されて機械を生成することができ、コンピュータまたは他のプログラマブルデータプロセシング装置のプロセッサを介して実行される命令は、フローチャートおよび／またはブロック図のブロックで指定された機能／動作を実施するための手段を作成する。

本明細書の一部の図面のフローチャートおよびブロック図は、本発明の実施形態の可能な実施の例示的なアーキテクチャ、機能性、および動作を示す。いくつかの代替的な実施形態においては、ブロックに記載された工程は、図に示された順序から外れることがあることに留意されたい。例えば、関連する機能目的に依存して、連続して示された２つのブロックは、実際には実質的に同時に実行されてもよく、またはブロックは時には逆の順序で実行されてもよく、または２つまたは３つ以上のブロックが結合されていてもよい。

例えば、上記に示した２つのブロックは、本発明を説明するものであり、および本発明を限定するものではない。本発明の少しの例示的な実施形態を記述したが、本発明の新規な教示および利点から実質的に逸脱することなく、例示的な実施形態において多くの変更が可能であることを、当業者は容易に理解するであろう。したがって、そのような変更の全ては、特許請求の範囲に定義されるように、本発明の範囲内に含まれることが意図される。本発明は、添付の特許請求の範囲によって定義され、特許請求の範囲の等価物がその中に含まれる。

Claims (29)

1. 以下の連続的な工程を含む、試験サンプル中の抗酸菌を不活性化および抽出するための方法：
   （ａ）試験サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；
   （ｂ）前記凹型の先端中に前記抗酸菌をペレット化するために前記第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程であって、前記凹型の先端で終わる前記円錐台形の部分は、前記第１の上清の少なくとも９０％をデンカントする際に、前記抗酸菌のペレットを前記凹型の先端中に保持するように構成されている、工程；
   （ｃ）懸濁液を生成するために、前記抗酸菌のペレットをアルコールに再懸濁する工程；
   （ｄ）前記懸濁液を、前記第１のチューブから、ビーズを含む第２のチューブへと移す工程；
   （ｅ）任意で、塊を壊すため、および／または、抗酸菌細胞を破砕するために、前記第２のチューブをアジテートする工程；および
   （ｆ）任意で、前記試験サンプル中の前記抗酸菌を不活性化するために、好ましくは少なくとも５分間、前記懸濁液をインキュベートする工程。
2. さらに、以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
   （ｇ）前記懸濁液を第３のチューブへと移し、前記不活性化した抗酸菌をペレット化するために、該第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程。
3. さらに以下の工程を含む、請求項２に記載の方法：
   （ｈ）前記不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、前記不活性化した抗酸菌のペレットを再懸濁する工程；
   （ｉ）不活性化した抗酸菌を含む前記溶液から細胞タンパク質を抽出し、前記細胞デブリスをペレット化するために、前記溶液を遠心分離する工程；
   （ｊ）工程（ｉ）からの第３の上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移す工程；および
   （ｋ）前記不活性化した抗酸菌のタンパク質プロファイルを、前記質量分析スライド上で、質量分析装置を用いて同定する工程。
4. 工程（ｈ）の前記ペレットを、ギ酸に再懸濁する、請求項３に記載の方法。
5. 前記再懸濁した不活性化した抗酸菌に、アセトニトリルを、約３５％から約６５％の最終濃度になるまで加える、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗酸菌サンプルを、科、属、種、系統レベル、および／または、群／複合体まで同定する、請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記抗酸菌の１または２以上のマススペクトルを取得するために、前記スライド上の前記試験サンプルを質量分析法によって解析し、前記測定した１または２以上のスペクトルを１または２以上の参照用マススペクトルと比較することによって、前記試験サンプル中の前記抗酸菌を特性評価および／または同定する工程をさらに含む、請求項３から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記サンプルは液体培地に由来し、かつ：
   工程（ａ）の前記試験サンプルは、液体培地であり；
   任意で、工程（ｅ）の、塊を壊すため、および／または、抗酸菌細胞を破砕するための、前記第２のチューブをアジテートする工程を有さず、
   工程（ｆ）は必要条件であり、かつ前記懸濁液をアルコール中でインキュベートする工程を含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記本体は、約５ｍＬの容積を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記第１の上清の少なくとも約９９％が、工程（ｂ）において取り除かれる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記抗酸菌は、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記アルコールは、エタノールである、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 工程（ｅ）が必要であり、かつ前記第２のチューブを、ビーズ式破砕装置またはボルテックスおよびビーズを用いてアジテートする工程を含み、該ビーズは０．５ｍｍのガラスビーズである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記方法は、工程（ｆ）の前記懸濁液を少なくとも１０分間、室温においてインキュベートする工程をさらに含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 以下の連続的な工程を含む、液体培地由来の試験サンプル中の抗酸菌を、不活性化、抽出、および同定するための方法：
    （ａ）試験サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；
    （ｂ）前記凹型の先端中に前記抗酸菌をペレット化するために前記第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程；
    （ｃ）懸濁液を生成するために、前記抗酸菌のペレットをアルコールに再懸濁する工程；
    （ｄ）前記懸濁液を、機械的破砕のために、ビーズを含む第２のチューブへと移す工程；
    （ｅ）前記抗酸菌を不活性化するために、アルコール中の前記懸濁液をインキュベートする工程；
    （ｆ）前記懸濁液を、第３のチューブへと移す工程；
    （ｇ）前記不活性化した抗酸菌をペレット化するために、前記第３のチューブを遠心分離し、次いで第２の上清を取り除く工程；
    （ｈ）前記不活性化した抗酸菌を含む溶液を生成するために、前記不活性化した抗酸菌のペレットを再懸濁する工程；
    （ｉ）不活性化した抗酸菌を含む前記溶液から細胞タンパク質を抽出し、前記細胞デブリスをペレット化するために、前記溶液を遠心分離する工程；
    （ｊ）工程（ｉ）からの第３の上清のアリコートを、質量分析ターゲットスライドへと移す工程；および
    （ｋ）前記抗酸菌のタンパク質プロファイルの１または２以上のマススペクトルを取得するために、質量分析法によって、前記質量分析ターゲットスライドを解析し、前記測定した１または２以上のスペクトルを１または２以上のタンパク質プロファイルの参照用マススペクトルと比較することによって、前記試験サンプル中の前記抗酸菌を特性評価および／または同定する工程。
16. 前記細胞タンパク質は、ギ酸を用いて、工程（ｉ）において抽出される、請求項３から８、または１５に記載の方法。
17. 前記ギ酸を加えた後、アセトニトリルを加える工程をさらに含み、該アセトニトリルは、前記不活性化した抗酸菌から細胞タンパク質を抽出する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記アルコールの添加の後、前記抗酸菌を壊すため、および／または、破砕するために、前記第２のチューブをアジテートする工程をさらに含む、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 以下を含む、試験サンプル中の抗酸菌を不活性化および同定するためのキット：
    本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を有する第１のチューブであって、該第１のチューブは少なくとも５ｍＬの容積を有する、第１のチューブ；
    アルコールの溶液；
    ギ酸の溶液；および
    アセトニトリルの溶液。
20. ０．５ｍｍのガラスビーズをさらに含む、請求項１９に記載のキット。
21. 上清をデカントする間、前記第１のチューブを乾燥するために、吸い取り紙をさらに含む、請求項１９または２０に記載のキット。
22. 前記凹型の先端は、上清を取り除く際、前記ペレットを保持するが、液体を保持しないように構成されている、請求項１９から２１のいずれか１項に記載のキット。
23. さらに、追加のチューブを少なくとも１つ含む、請求項１９から２２のいずれか１項に記載のキット。
24. ２ｍＬの丸底チューブをさらに含む、請求項２３に記載のキット。
25. 以下の連続的な工程を含む、試験サンプル中の抗酸菌を同定するための方法：
    （ａ）試験サンプルを、抗酸菌を含有する液体培地から第１のチューブへと移す工程であって、該第１のチューブは、本体、開口部を有する該本体の第１の端、および凹型の先端で終わる円錐台形の部分を有する該本体の第２の端を含む、工程；
    （ｂ）前記凹型の先端中に前記抗酸菌をペレット化するために前記第１のチューブを遠心分離し、次いで第１の上清をデカントする工程であって、前記凹型の先端で終わる前記円錐台形の部分は、前記第１の上清の少なくとも９０％をデンカントする際に、前記抗酸菌のペレットを凹型の先端中に保持するように構成されている、工程；
    （ｃ）第２のチューブへと移す工程において、または第２のチューブへと移す工程の前に、前記抗酸菌のペレットをアルコールに再懸濁する工程；
    （ｄ）塊を壊すため、および／または、抗酸菌細胞を破砕するために、前記第２のチューブをアジテートする工程；および
    （ｅ）質量分析法によって前記抗酸菌を同定する工程。
26. 前記試験サンプルを前記第１のチューブへと移す工程の前に、前記試験サンプルが微生物の増殖について陽性であることを判定する工程をさらに含む、請求項１から１８、および２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記試験サンプルを、試験陽性の後、２４〜７２時間の間に、前記第１のチューブへと移す、請求項２６に記載の方法。
28. 前記試験サンプルを、試験陽性の後、２４時間以内に、前記第１のチューブへと移す、請求項２６に記載の方法。
29. 試験サンプルを、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、および約１２時間、から選ばれる時間以内に、前記第１のチューブへと移す、請求項２８に記載の方法。

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