CN108291247A - 用于从液体培养基失活和提取耐酸细菌以用于使用质谱法表征和/或鉴定的方法 - Google Patents

用于从液体培养基失活和提取耐酸细菌以用于使用质谱法表征和/或鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于失活耐酸细菌的方法和试剂盒。在一些实施方案中，所述方法可以包括：将来自包含耐酸细菌的液体培养物的样品移至第一管中，其中所述第一管包括主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端；离心管以使耐酸细菌沉淀于凹形尖端中并且随后倾析上清液；将耐酸细菌沉淀物重悬于醇中；将悬浮液转移至包含珠的第二管中；搅动第二管以破坏耐酸细菌细胞；并且孵育悬浮液以使测试样品中的耐酸细菌失活。所述方法还可以包括用质谱法鉴定耐酸细菌。

Description

用于从液体培养基失活和提取耐酸细菌以用于使用质谱法表 征和/或鉴定的方法
发明领域
本发明涉及用于失活和提取耐酸细菌诸如分枝杆菌属(Mycobacterium)或诺卡氏菌属(Nocardia)的方法。特别地，本发明涉及一种用于使用质谱法快速表征和/或鉴定在液体培养基中生长的分枝杆菌属或诺卡氏菌属物种的方法。
发明背景
传统的自动化的表型ID测试，诸如PhoenixTM和系统，或手动的表型测试诸如API，要求微生物应当在适当的生长期中并且没有干扰培养基和血液制品以提供可靠的结果。这些系统使用在铺板的培养基(plated media)上从阳性肉汤生长18-24小时的菌落。然而，在为了获得更快的结果的努力中，某些实验室已经报道了将这些系统用于从临床样品分离的微生物。迫切地需要更快的并且更宽泛地特异性测试，以向医师提供临床上相关的结果。
鉴定液体培养基中培养的微生物特别困难，因为样品容器中微生物的浓度较低，并且因为液体培养基可能干扰分析方法诸如质谱法。
质谱法具有允许非常迅速地鉴定微生物的潜力，但可能遭遇来自在液体培养基中以及在临床样品诸如痰、无菌体液或其组合中存在的许多化合物的干扰。
用于表征和/或鉴定微生物的其他方法已经被描述，包括：
美国专利第6,177,266号，其公开了一种用于通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)分析细胞蛋白提取物或整个细胞产生的属、种和菌株特异性生物标志物对细菌进行化学分类学分类的方法。
美国专利第8,735,091号，其公开了一种用于从固体和液体培养基中失活和提取耐酸细菌诸如分枝杆菌属或诺卡氏菌属的方法。然而，‘091专利未认识到当在液体培养基中生长时与耐酸细菌的蛋白提取相关的困难。特别地，‘091专利未认识到确保来自液体培养基的足够量的微生物生物质用于使用质谱法鉴定的困难。此外，‘091专利未认识到去除干扰使用质谱法鉴定的失活溶液的困难。‘091专利未认识到将足够的用于失活和提取的耐酸细菌生物质收集和保留在具有特定尺寸和/或形状的管中的意想不到的益处。最后，‘091专利未解决将沉淀物从液体培养基分离以避免干扰使用质谱法鉴定的困难。
因此，本领域对用于从液体培养基中失活和/或提取微生物用于随后通过质谱法分析、表征和/或鉴定的有效且快速的方案仍然存在需求。特别地，在生物安全等级3(BSL-3/P3)环境以外，对于随后处理耐酸细菌(诸如分枝杆菌属或诺卡氏菌属)失活或细胞死亡通常是必要的。
发明概述
在一个方面，本发明涉及一种用于失活和提取来自液体培养基的测试样品中的耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)的方法，所述方法包括以下顺序步骤：(a)将来自包含耐酸细菌的液体培养物的测试样品转移至第一管中，其中所述第一管包括主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端；(b)离心第一管以使耐酸细菌沉淀于凹形尖端中并且随后倾析第一上清液，其中以所述凹形尖端终止的所述截头圆锥体部分被配置为将所述耐酸细菌的沉淀物保留在所述凹形尖端中同时倾析至少90％的所述第一上清液；(c)将耐酸细菌沉淀物重悬于醇中；(d)将来自所述第一管的悬浮液转移至包含珠的第二管中；(e)搅动所述第二管以破碎团块和/或破坏所述第二管中的耐酸细菌细胞；以及(f)孵育悬浮液持续至少约5分钟以使测试样品中的耐酸细菌失活。
在一个实施方案中，耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)沉淀物可以在步骤(c)中被重悬于从约50％至约100％的乙醇中，例如，沉淀物可以被重悬于约70％的乙醇中。该方法还可以包括在步骤(e)中珠磨和/或涡旋容器持续约1分钟至约30分钟。在一个实施方案中，珠是0.5mm玻璃珠。在一个实施方案中，随后的孵育步骤(f)包括孵育持续至少约3分钟、或至少约10分钟。在另一个实施方案中，在步骤(f)中的孵育处于室温。
在另一个实施方案中，该方法还可以包括以下另外的连续步骤作为蛋白提取的一部分：(g)将悬浮液转移至第三管中并且离心所述第三管以使所失活的耐酸细菌沉淀，并且随后去除第二上清液；以及(h)重悬失活的耐酸细菌沉淀物以产生包含所述失活的耐酸细菌的溶液。在一些实施方案中，来自步骤(h)的上清液可以直接应用，或作为水悬浮液应用至质谱法载玻片或板上。
步骤(g)中的沉淀物可以使用从约50％至约90％的甲酸重悬，例如，沉淀物可以在步骤(h)中使用70％的甲酸重悬。在重悬沉淀物之后，可以添加乙腈以获得从约35％至约65％的乙腈终浓度，例如，以获得约50％的终浓度。在一个实施方案中，沉淀物可以在步骤(h)中被重悬于10μL甲酸中，并且在步骤(h)中可以添加10μL乙腈至所重悬的沉淀物中。在一些实施方案中，如步骤(i)中示出的，可以离心悬浮液以使细胞碎片沉淀。
根据该实施方案，该方法还可以包括以下另外的顺序步骤：(j)将来自步骤(i)的上清液的等分试样转移至质谱法靶载玻片并且添加基质溶液；以及(k)通过质谱法鉴定质谱法载玻片上的失活耐酸细菌的蛋白谱以获得所述耐酸细菌的一个或更多个质谱并且通过将所测量的质谱与一个或更多个参考质谱进行比较来表征和/或鉴定测试样品中的所述耐酸细菌。任选地，步骤(j)包括将从步骤(i)获得的测试样品的等分试样(例如，1μL)转移至质谱法载玻片或板，允许等分试样干燥并随后添加基质。可以使用任何已知的基质，例如，基质可以是α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。根据本发明，可以使用质谱法例如MALDI-TOF质谱法将耐酸细菌鉴定为科、属、种、菌株水平和/或群(group)/复合种群(complex)。
应当注意的是，关于一个实施方案所描述的任何一个或更多方面或特征可以被并入到不同的实施方案中，尽管对其没有进行相关的具体描述。也即，所有实施方案和/或任何实施方案的特征可以以任何方式和/或组合被组合。申请人保留改变任何原始提交的权利要求或相应地提交任何新的权利要求的权利，包括能够修改任何原始提交的权利要求以从属于和/或合并任何其它权利要求的任何特征的权利，尽管最初未以此种方式要求保护。本发明的这些和其他的目的和/或方面在以下阐述的说明书中被详细解释。
附图简述
本公开内容的方法和试剂盒将结合附图被描述，在附图中：
图1示出了根据本发明的实施方案的用于失活和提取来自液体培养基的耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)的方法的流程图。
图2示出了根据本发明的实施方案的具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的管的实例。
图3示出了根据本发明的实施方案的具有不同轮廓(profile)的管的实例。
图4示出了在自动化的微生物检测系统中孵育的多种分枝杆菌属菌株的鉴定结果。
图5示出了在BactecTM MGITTM 960分枝杆菌(Mycobacterial)检测系统中孵育的多种分枝杆菌属菌株的鉴定结果。
图6示出了在3D仪器中孵育的多种分枝杆菌属菌株的鉴定结果。
发明详述
本发明可以以不同的形式体现，并且不应该被解释为限于本文阐述的实施方案。更确切地说，这些实施方案被提供以使得本公开内容将是透彻的并且完整的，并且将向本领域技术人员充分地传达本发明的范围。例如，关于一个实施方案阐释的特征可以被并入到其他实施方案中，并且关于特定实施方案阐释的特征可以从该实施方案中删除。另外，根据本公开内容，本文建议的实施方案的许多变化形式和添加对于本领域技术人员将是明显的，而不脱离本发明。
本受让人的MS系统(bioMérieux,Inc.,St.Louis,MO)提供了一种用于使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪分析样品的蛋白谱并且将其与已知生物体谱的数据库匹配进行细菌鉴定的平台。将样品沉积在覆盖有基质(例如，CHCA基质(α-氰基-4-羟基-肉桂酸基质))的靶载玻片上，并且然后通过质谱仪处理。
最常见的临床相关微生物可以通过将细胞直接沉积在MS靶载玻片上进行分析。用于分析的耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)样品的制备与标准程序的不同之处在于，为了使样品在生物安全等级-3(BSL-3/P3)环境以外处理是安全的失活步骤是必要的。另外，分析来自液体培养基的样品导致确保足够量的生物质以及清除将干扰鉴定的失活溶液的挑战。
本申请人已经发现，在醇中孵育结合机械破坏提供了一种用于失活耐酸细菌的有效且快速的方法。当使用包括搅动或机械破坏步骤，随后通过在室温将破坏的样品在醇中孵育持续至少3分钟、至少5分钟或至少10分钟的随后失活的过程时，醇暴露被证明是有效的。在一些实施方案中，醇是乙醇。在一个实施方案中，使用涡旋器(vortex)或珠磨器(BioSpec,Bartlesville,OK)(一种通过搅动包含样品、提取溶液和珠(例如，微小玻璃珠)的密封微型离心管来破坏细胞的匀浆器)执行机械破碎。通常，珠可以是可以用于破坏容器或微型离心管中的细胞的任何已知的珠。例如，珠可以是玻璃珠、陶瓷珠、氧化锆珠、硅珠、金属珠、钢珠、碳化钨珠、石榴石珠、沙珠或蓝宝石珠。在一个实施方案中，珠可以是从约0.1mm至约1mm的尺寸，例如约0.5mm的尺寸。
然后可以使用另外的处理步骤辅助从失活细胞中提取细胞蛋白，以产生清晰且一致的谱。例如，在甲酸中随后暴露于乙腈的处理步骤可以用于提取和溶解蛋白用于随后分析(例如，通过质谱法)。
本发明提供了用于失活、提取、表征和/或鉴定来自液体培养基的测试样品中的未知耐酸细菌的方法。本发明还涉及一种用于使用质谱法快速表征和/或鉴定来自液体培养基的测试样品中耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)的方法。快速方法允许比先前技术更快速地表征和/或鉴定耐酸细菌，导致测试样品的更快的诊断和表征/鉴定。从获得样品至表征/鉴定耐酸细菌的被包括在本发明方法中的步骤可以在非常短的时间帧内进行，以获得临床相关的可操作(actionable)信息。在某些实施方案中，本发明的方法可以在少于约120分钟，例如，在少于约110分钟、100分钟、90分钟、80分钟、70分钟、60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟或10分钟内进行。本发明方法的快速性代表了对先前方法的改进。
在本发明的一个实施方案中，样品从患有或怀疑患有耐酸细菌感染的受试者(例如，患者)获得。如本文使用的，术语“耐酸细菌”意图涵盖任何耐酸细菌，包括，但不限于，分枝杆菌属和放线菌属(包括诺卡氏菌属、红球菌属(Rhodococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、冢村氏菌属(Tsukamurella)和迪茨氏菌属(Dietzia))。
如本文使用的，术语“分枝杆菌(mycobacteria)”或“分枝杆菌属”意图涵盖任何已知的分枝杆菌，包括，但不限于，快速和缓慢生长的细菌，诸如，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canetti)、鸟型分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、莫尔门分枝杆菌(Mycobacterium malmoense)、蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、蜂房分枝杆菌(Mycobacterium alvei)、产鼻疽分枝杆菌(Mycobacterium farcinogenes)、Mycobacterium fortuitum ssp fortuitum、Mycobacteirum houstonense、外来分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)、猪分枝杆菌(Mycobacterium porcinum)、塞内加尔分枝杆菌(Mycobacterium senegalense)、日内瓦分枝杆菌(Mycobacterium genavense)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilum)、免疫原分枝杆菌(Mycobacterium immunogenum)、缓黄分枝杆菌(Mycobacteriumlentiflavum)、产黏液分枝杆菌(Mycobacterium mucogenicum)、楚尔盖分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex)和戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)。在一些实施方案中，快速生长物，诸如脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)可以在短时间段内被鉴定出，这有助于诊断和治疗。出人意料地，缓慢生长的分枝杆菌属物种也可以被失活并且快速提取，并且然后在短时间段内被鉴定，如图4-6中示出的。
如本文使用的，术语“诺卡氏菌属”意图涵盖任何已知的诺卡氏菌属，包括，但不限于，产气群诺卡氏菌(Nocardia aerocolonigenes)、非洲诺卡氏菌(Nocardia africana)、阿根廷诺卡氏菌(Nocardia argentinensis)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids)、布莱克威耳诺卡氏菌(Nocardia blackwellii)、巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)、短链诺卡氏菌(Nocardia brevicatena)、Nocardia camea、豚鼠诺卡氏菌(Nocardia caviae)、Nocardia cerradoensis、珊瑚红诺卡氏菌(Nocardia corallina)、盖尔森基兴诺卡氏菌(Nocardia cyriacigeorgica)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardia dassonvillei)、Nocardiaelegans、皮疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、Nocardia nigiitansis、新星诺卡氏菌(Nocardia nova)、不透明诺卡氏菌(Nocardia opaca)、Nocardia otitidis-cavarium、少食诺卡氏菌(Nocardia paucivorans)、假巴西诺卡氏菌(Nocardia pseudobrasiliensis)、红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)、鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)、Nocardiatransvelencesis、均匀诺卡氏菌(Nocardia uniformis)、越桔诺卡氏菌(Nocardiavaccinii)、和Nocardia veterana。
如本文使用的，“表征”涵盖生物颗粒的广泛归类(categorization)或分类(classification)和/或耐酸细菌的科、属、种和/或菌株水平或群/复合种群的实际鉴定。分类可以包括确定耐酸细菌的表型和/或形态学特征。例如，细菌的表征可以基于可观察到的差异诸如组成、形状、尺寸、色素沉着、成簇和/或代谢来完成。
如本文使用的，“鉴定”意指确定先前未知的耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)属于哪个科、属、种、菌株或群/复合种群。例如，将先前未知的耐酸细菌鉴定为科、属、种、菌株水平和/或群/复合种群。
在实施方案中，本发明涉及一种用于失活包含在液体培养基中的耐酸细菌的方法。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)将来自液体培养物的包含耐酸细菌的测试样品转移至第一管中，其中所述第一管包括主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端；(b)离心第一管以使耐酸细菌沉淀于凹形尖端中并且随后倾析第一上清液，其中以所述凹形尖端终止的所述截头圆锥体部分被配置为将所述耐酸细菌的沉淀物保留在所述凹形尖端中同时倾析至少90％的所述第一上清液；(c)将耐酸细菌沉淀物重悬于醇中；(d)将悬浮液转移至包含珠的第二管中；(e)搅动第二管以破碎团块和/或破坏所述第二管中的耐酸细菌细胞；以及(f)孵育悬浮液持续至少约5分钟以使测试样品中的耐酸细菌失活。
在一个实施方案中，所获得的液体培养物样品可以是从约0.5mL至约10mL、从约1mL至约5mL、从约1mL至约3mL或约1mL、2mL、3mL、4mL或5mL。在示例性实施方案中，从阳性液体培养基取出的样品是约3mL。已经发现，包含至少约3mL来自液体培养物样品的样品存在有足够的微生物以经由质谱法产生准确鉴定。
在一些实施方案中，包含耐酸细菌的液体培养物是已经测试为耐酸细菌阳性的样品容器。例如，样品容器可以培养来自受试者的生物样品。如果受试者是耐酸细菌阳性的，样品容器经由例如容器中的传感器被鉴定为阳性的。在一个实施方案中，液体培养物样品在样品容器被鉴定为阳性之后至少约24小时获得。在一些实施方案中，液体培养物样品在样品容器被鉴定为阳性之后在约24小时与约72小时之间获得。在另外的实施方案中，液体培养物样品在样品容器被鉴定为阳性之后1小时、2小时、4小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、21小时或24小时获得。仍在另外的实施方案中，液体培养物样品在样品容器被鉴定为阳性之后晚于48小时获得。在一些实施方案中，允许样品容器在它已被鉴定为阳性之后继续孵育，引起样品容器中微生物群体大小的增加。例如，在一些实施方案中，最小浓度1.0x107CFU/mL存在于样品中作为所需的耐酸细菌的生物质。以该方式，液体培养物样品中微生物的浓度将更大，并且经由质谱法的准确鉴定的可能性也会增加。此外，一些实验室可能在白天或者一周期间有几次当时不能评价样品容器。本发明方法在样品容器已经被鉴定为阳性之后它可以被孵育的时间长度上是灵活的。
如讨论的，在一些实施方案中，该方法包括离心管中的样品，所述管具有主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端。暂时转到图2，示出了所描述的示例性管。在图2中，管200包括主体202、在主体202的第一末端处的开口204以及沿着管200的纵向轴线210在主体202的第二末端处以凹形尖端208终止的截头圆锥体部分206。在实施方案中，主体具有约5mL的体积。例如，主体可以具有3mL、4mL、5mL、6mL、或7mL的体积。如本文使用的，“截头圆锥体”意指锥体的平截头体的形状。锥体的平截头体是通过平行于基座的平面切割顶部而形成的锥体的基座部分。在一些实施方案中，管200包括用于固定管200的内容物的可再密封帽212，其可以经由安全锁进一步固定。在一些实施方案中，可再密封帽可以是螺帽。在该实施方案中，螺帽将第一管中的微生物密封以保护使用者。例如，螺帽可以形成气密密封以降低感染的机会。在另外的实施方案中，可再密封帽可以是卡扣帽(snap fit cap)，并且可以包括特征诸如O形圈密封件(O-ringseal)或扭锁(twist-lock)。
在一些实施方案中，截头圆锥体部分206与纵向轴线210的角度小于45度。例如，截头圆锥体部分206与纵向轴线的角度可以是约30度、约25度、约20度、约15度、约10度或约5度。截头圆锥体部分206相对于纵向轴线210的角度有助于从管中倾析上清液，同时将沉淀的微生物保留在凹形尖端中。在一些实施方案中，凹形尖端被配置为保留沉淀的微生物同时倾析上清液(例如，液体培养基等)。
在一些实施方案中，第一管被离心至少约10分钟。例如，第一管可以被离心5分钟、10分钟、15分钟等。在实施方案中，将第一管以3,000×g离心至在管的底部产生沉淀物和在沉淀物上方的上清液。如由本领域技术人员确定的，第一管可以以更快或更慢的速率离心。
在一些实施方案中，在离心第一管中的样品之后，由离心产生的第一上清液从第一管倾析，其中以凹形尖端终止的截头圆锥体部分被配置为将耐酸细菌的沉淀物保留在所述凹形尖端中。在一些实施方案，第一上清液的至少约90％被倾析。例如，上清液的90％、95％、99％、或99.9％从第一管倾析。去除上清液并保留沉淀的微生物对于使用质谱法准确鉴定微生物是重要的。去除上清液是重要的，因为生物样品中过量的上清液可能干扰使用质谱仪产生的谱。沉淀的微生物的保留对于确保有足够的微生物可用于质谱仪分析是重要的。在一些实施方案中，倾析包括吸干第一管和/或倒转第一管持续一定时间段，使得上清液可以离开开口。
在离心步骤(b)之后，耐酸细菌沉淀物可以在步骤(c)中被重悬于第一管中，所述第一管具有从约10μL至约1mL的醇，或具有约50μL至约750μL，具有约100μL至约500μL，或具有约500μL。用于重悬沉淀物的醇可以是从约50％至约100％的醇，从约60％至约90％的醇或约50％、60％、70％、80％或90％的醇。在示例性实施方案中，醇是乙醇。
在一些实施方案中，该方法包括将悬浮液从第一管转移至包含珠的第二管中；在一些实施方案中，该方法包括搅动悬浮液以破碎团块和/或破坏耐酸细菌细胞。例如，耐酸细菌测试样品可以使用涡旋器或珠磨器(例如，Bead Beater、BioSpec、Bartlesville、OK)(一种通过搅动包含样品、提取溶液和珠的密封微型离心管来破坏细胞的匀浆器)经历机械破坏。通常，珠可以是可以用于破坏容器或微型离心管中的细胞的任何已知的珠。例如，珠可以是玻璃珠、陶瓷珠、氧化锆珠、硅珠、金属珠、钢珠、碳化钨珠、石榴石珠、沙珠或蓝宝石珠。在一个实施方案中，珠可以是从约0.1mm至约1mm的尺寸，例如约0.5mm的尺寸。在一个实施方案中，珠是0.5mm玻璃珠。通常，管通过在步骤(e)中搅拌或涡旋容器持续约1分钟至约30分钟、持续约5分钟至约20分钟、持续约5分钟至约10分钟或持续约5分钟或10分钟经历破坏。在另外的实施方案中，将管使用涡旋器搅动持续一定的时间段。例如，管可以被涡旋持续至少约15分钟。在一些实施方案中，管被涡旋持续10分钟、15分钟、20分钟、30分钟或更长。
在测试样品中的耐酸细菌已经被破坏之后，管和因此的测试样品中的耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)通过孵育容器持续至少3分钟经历失活。在一个实施方案中，孵育步骤(f)可以持续至少5分钟或持续至少10分钟。在另一个实施方案中，孵育步骤(f)可以持续约5分钟至约30分钟，持续约10分钟至约20分钟，或持续约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、或30分钟。在一个实施方案中，孵育步骤(f)处于室温。在另一个实施方案中，孵育步骤(f)处于升高的温度，例如，30摄氏度、37摄氏度或55摄氏度。
在另一个方面，本发明涉及耐酸细菌测试样品的蛋白提取的另外的步骤。在一个实施方案中，经历本发明的提取步骤的耐酸细菌测试样品可以是从先前描述的用于失活的方法获得的测试样品(即，以上描述的失活的耐酸细菌测试样品)。
提取方法可以包括以下步骤：(g)将悬浮液转移至第三管中并且离心所述第三管以使所失活的耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)沉淀，并且随后去除第二上清液；以及(h)重悬失活的耐酸细菌沉淀物以产生包含所述失活的耐酸细菌的溶液。在一些实施方案中，将失活的耐酸细菌沉淀物重悬于甲酸和/或乙腈中。任选地，该方法还包括在步骤(h)之后将容器中的测试样品离心以提取细胞蛋白(步骤(i))并且使细胞碎片沉淀。例如，第三管可以以16,000×g离心2分钟。
根据这些实施方案，沉淀物可以使用从约50％至约100％的甲酸、从约60％至约90％的甲酸或约50％、60％、70％、80％、90％或100％的甲酸重悬。在一些实施方案中，在重悬沉淀物之后，添加乙腈以获得从约35％至约65％的终浓度，以获得从约40％至约60％的终浓度，或者以获得约35％、40％、50％、60％或65％乙腈的终浓度。在一个实施方案中，该步骤使用100％乙腈，但也可以使用其他浓度的乙腈。
在一个实施方案中，沉淀物可以被重悬于至少约3μL、5μL或10μL的甲酸中，并且至少约3μL、5μL或10μL的乙腈可以被添加至所重悬的沉淀物中。在另一个实施方案中，沉淀物可以使用从约3μL至约100μL的甲酸，约5μL至约80μL的甲酸，约10μL至约50μL的甲酸或约3μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL或100μL的甲酸重悬。在另一个实施方案中，在重悬沉淀物之后，将至少约3μL、5μL或10μL的乙腈添加至所重悬的沉淀物中。例如，从约3μL至约100μL的乙腈，从约5μL至约80μL的乙腈，10μL至约50μL的乙腈，或约3μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL或100μL的乙腈可以被添加至所重悬的样品中。
本发明还提供了用于使用质谱法例如使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF质谱法)来表征和/或鉴定未知耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)的方法。根据本发明，表征和/或鉴定步骤可以在以上描述的失活和提取步骤后。
根据该实施方案，该方法还可以包括以下另外的步骤：将来自步骤(j)的上清液的等分试样转移至质谱法靶载玻片并且将基质溶液添加至上清液中；以及(k)通过质谱法鉴定质谱法载玻片上的第三上清液中的失活耐酸细菌的蛋白谱以获得所述耐酸细菌的一个或更多个质谱并且通过将所测量的一个或更多个质谱与一个或更多个参考质谱进行比较来表征和/或鉴定测试样品中的所述耐酸细菌。任选地，转移的等分试样可以是从约0.5μL至约2.5μL、或约1μL。如本领域熟知的，通常使等分试样干燥并且随后添加基质溶液。通常，可以使用本领域中的任何已知的基质。例如，在一个实施方案中，基质是α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)。根据本发明，可以使用例如MALDI-TOF质谱法将耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)鉴定为科、属、种、菌株水平或群/复合种群，如下文进一步详细描述的。
在质谱法板或载玻片已经被制备之后，将载玻片或板插入到质谱仪。在抽吸样品(即从样品中去除大气气体以使其处于10-5托至10-7托的环境中)所需的时间之后，将样品引入到质谱仪的电离室中。将样品与系统对齐。当达到最佳对齐时，氮激光被脉冲。由于高能量沉积，基质对激光能量的吸收使其从板表面脱落。作为副作用，耐酸细菌细胞的部分(例如蛋白)在该过程中也被汽化和电离。通过在板与质谱仪飞行管入口之间产生静电场，这些离子被加速至已知的动能。所有单电荷离子，无论质量如何，在飞行管入口处均具有相同的动能，但它们将具有与其质量成反比的速度。从那里，离子沿着飞行管朝向检测器移动，并且较轻的离子将在较重的离子之前到达(飞行管是质量/电荷鉴别器)。每当离子撞击检测器时，检测器就会产生电荷。检测器的输出被数字化，并且输出在一个轴上显示质量/电荷比率并在另一个轴上显示冲击次数。在一个实施方案中，可以使用任何已知的质谱技术诸如MALDI-TOF质谱法、解吸电喷雾电离(desorption electrospray ionization)(DESI)质谱法、GC质谱法、LC质谱法、电喷雾电离(ESI)质谱法和选择离子流管(SIFT)光谱法或其他质谱技术询问载玻片或板上耐酸细菌的蛋白谱。
在一些实施方案中，对已知耐酸细菌进行对照测量，因此允许使用多种数学方法使测量的测试数据与感兴趣的耐酸细菌的表征相关。例如，来自样品的数据可以与基线或对照测量利用软件系统进行比较。更特别地，数据可以通过多种多变量分析方法进行分析，所述多种多变量分析方法诸如，例如，一般判别分析(GDA)、偏最小二乘判别分析(PLSDA)、偏最小二乘回归，主成分分析(PCA)、平行因子分析(PARAFAC)、神经网络分析(NNA)和/或支持向量机(SVM)。这些方法可以用于基于现有命名法将感兴趣的未知耐酸细菌(例如，分枝杆菌属或诺卡氏菌属)分类为相关组，和/或基于生物体的代谢、致病性和/或毒力将其分级为天然存在的群。在一个实施方案中，在获得耐酸细菌的一个或更多个质谱之后，可以将该一个或更多个质谱输入到“SARAMIS”微生物鉴定软件(bioMérieux,Inc.,St.Louis,MO)中用于分析，并且因此用于表征和/或鉴定耐酸细菌。
又在另一个实施方案中，来自检测系统的非光谱学测量结果，诸如检测时间和生长速率可以用于辅助表征和/或鉴定来自测试样品的耐酸细菌。
在本发明的一些实施方案中，测试样品中的耐酸细菌的表征和/或鉴定不需要包括确切物种的鉴定。表征可以涵盖生物颗粒的广泛归类或分级以及单个物种的实际鉴定。如本文使用的，“鉴定”意指确定先前未知的耐酸细菌属于哪个科、属、种、菌株水平或群/复合种群。例如，将先前未知的耐酸细菌鉴定为科、属、种、菌株水平或群/复合种群。
现在转到图1，在一个方面，提供了一种用于失活、提取和鉴定液体测试样品中的耐酸细菌的方法100。在实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)将测试样品从包含耐酸细菌的液体培养基转移至第一管中，其中所述第一管包括主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端；(b)离心第一管以使耐酸细菌沉淀于凹形尖端中并且随后倾析第一上清液；(c)将耐酸细菌沉淀物重悬于醇中以产生悬浮液；(d)将悬浮液转移至包含珠的第二管中用于机械破坏；(e)将悬浮液在醇中孵育以使耐酸细菌失活；(f)将悬浮液转移至第三管中；(g)离心第三管以使所失活的耐酸细菌沉淀，并且随后去除第二上清液；(h)重悬所失活的耐酸细菌沉淀物以产生包含所失活的耐酸细菌的溶液；(i)从包含失活的耐酸细菌的溶液中提取细胞蛋白，并且离心溶液以使细胞碎片沉淀；(g)将来自步骤(i)的第三上清液的等分试样转移至质谱法靶载玻片；以及(h)通过质谱法询问质谱法靶载玻片以获得耐酸细菌的蛋白谱的一个或更多个质谱并且通过将所测量的一个或更多个质谱与蛋白谱的一个或更多个参考质谱进行比较来表征和/或鉴定测试样品中的所述耐酸细菌。
转到模块102，在一些实施方案中，该方法包括在阳性结果后24-72小时之间从阳性液体培养物中取出3.0mL样品。如讨论的，样品的体积有助于确保样品中存在足够的微生物以使用质谱仪获得可接受的谱。类似地，在阳性结果之后24小时与72小时之间从阳性液体培养物中取出样品增加了液体培养物中微生物的群体尺寸。在一些实施方案中，可以将样品在少于24小时内从阳性液体培养基物中取出。例如，参见图4-6，示出了分枝杆菌属的许多菌株可以在阳性后仅两小时内被鉴定出。
在模块104中，在一些实施方案中，将样品置于具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的管(例如，5.0mL管)中，然后将该管离心。例如，可以将管以3,000×g离心10分钟以在凹形尖端中产生沉淀物以及在沉淀物上方的上清液。然后将上清液通过倾析弃去。例如，可以将管倒置，并且将上清液通过开口倒出，并且然后将管吸干以去除过量液体。
在模块106中，将沉淀物重悬于醇中。在一些实施方案中，将沉淀物重悬于500μL70％乙醇中，并且在一个实施方案中，将悬浮液转移至包含0.5mm玻璃珠的第二管中。在一些实施方案中，将玻璃珠添加至原始管中。在这些实施方案中，醇开始使微生物失活，但细胞仍然可以一起聚集在悬浮液中。结果，最初的醇处理不如搅动之后的处理有效。
在模块108中，在一个实施方案中，管被珠搅拌并且然后孵育。例如，管可以被珠搅拌5分钟，并且然后孵育10分钟。搅动和孵育的组合使微生物失活。可选地，如模块110中示出的，在一些实施方案中，将管涡旋，并且然后孵育，诸如涡旋15分钟，并且然后孵育10分钟。如讨论的，孵育可以在室温或可以在升高的温度进行。
现在转到模块112，在一些实施方案中，在搅动和孵育之后将管中存在的失活的耐酸细菌涡旋，并且将悬浮液转移至空管中。在模块114中，将悬浮液离心并且去除乙醇上清液，使失活的耐酸细菌沉淀物留置于管中。
在模块116和118中，细胞蛋白通过添加10μL 70％甲酸并且然后添加10μL乙腈来提取。在一些实施方案中，将管在添加甲酸和/或乙腈之后涡旋以使细胞碎片沉淀。
在模块120中，将1L悬浮液接种到质谱法靶标载玻片上，在模块122中将基质添加至靶标载玻片上，并且在模块124中使用MALDI-TOF质谱法鉴定微生物。该方法描述了使用特定步骤从液体培养基鉴定微生物的意想不到的改进，其解决了从液体培养基进行鉴定的困难。
现在转到图3，提供了管轮廓的比较300。如图3中示出的，管A具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分。该轮廓与管B、C、D和E形成对比。发现管A既将沉淀物保留在凹形尖端中，同时又倾析大部分上清液以有助于使用质谱法鉴定微生物。例如，管B将不适合用于鉴定，因为在倾析上清液期间，部分或所有沉淀物将会损失。管C的尖端不被设计为在倾析期间保留沉淀物，同时降低上清液的保持。而是，由于尖端的形状，上清液将被保留在沉淀物的下面和周围。类似地，管D可以保留沉淀物，但也将流体保留在沉淀物下方的成角度的尖端中。例如，在倾析管A之后，在一个实验中仅10-20μL培养基保留在管中，但倾析管D在倾析之后导致200μL-400μL培养基保留在管中。管E在倾析步骤期间导致一些或所有沉淀物的损失。出乎意料地，管A在解决使用液体培养基的困难的同时，显示出用质谱仪鉴定微生物方面显著改进的结果。
在图4中，提供了在自动化的微生物检测系统中孵育的多个菌株包括分枝杆菌属物种的ATCC和临床分离珠的鉴定结果。在该图中，将二十八种不同的分枝杆菌属菌株在自动化的微生物检测系统中孵育。每一个菌株使用自动化的微生物检测系统在样品容器中孵育，当系统指示该样品容器是微生物生长呈阳性时被取出，在样品容器中孵育另外的时间段，并且将来自样品容器的样品经由本文公开的方法间歇地处理以失活并且从分枝杆菌属细胞中提取蛋白。然后经由MALDI-TOF质谱法分析分枝杆菌蛋白以确定阳性后样品是否具有足够的生物质并缺乏污染以产生准确的质谱。图4中显示的结果表明，本文公开的方法能够在系统将样品容器鉴定为微生物生长阳性之后在短时间段内失活并且提取分枝杆菌蛋白，并且准确地产生与预期的物种水平鉴定99.9％一致匹配的谱。所有测试菌株当在阳性后36小时内处理时均被正确鉴定，并且除了三个菌株以外所有菌株均在24小时内被鉴定。出人意料地，许多菌株，包括高流行性菌株，诸如鸟型结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌当在阳性后12小时内处理时具有正确的鉴定。
图5示出了在BactecTM MGITTM 960分枝杆菌检测系统中孵育的多种分枝杆菌属菌株的鉴定结果。类似于图4，图5表明该方法能够在阳性后快速地失活、提取和鉴定分枝杆菌蛋白。例如，除了两个菌株以外，所有菌株均24小时内与预期的物种水平鉴定具有99.9％匹配的样品谱。两个剩余菌株在40小时内与预期的物种水平鉴定具有99.9％一致性。这种分枝杆菌蛋白的快速失活、提取和鉴定将影响与分枝杆菌相关感染的治疗。
在图6中，提供了在3D仪器中孵育的多种分枝杆菌属菌株的鉴定结果。同样，将样品在样品容器中孵育，仪器确定当样品对微生物生长呈阳性时，并且经由所公开的方法间歇地从阳性样品容器取样以用于测试。在该实例中，所有菌株均具有24小时内与预期的物种水平鉴定99.9％匹配的样品谱。
在另一个方面，提供了用于与图1中和本文别处描述的方法一起使用的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括第一管，所述第一管具有主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端，其中所述第一管具有至少5mL的体积；醇溶液；甲酸溶液；和乙腈溶液。在另外的实施方案中，试剂盒可以包括0.5mm玻璃珠和/或吸纸。类似地，试剂盒可以包括用于倾析第一管的支架或用于本文描述方法并且该试剂盒藉以被设计以使用的说明书。
在附图中，为清楚起见，可以放大线的厚度、层、特征、组件或区域。另外，除非特别另有指示，操作(或步骤)的顺序不限于在权利要求中呈现的顺序。
本文使用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的，且不意图限制本发明。如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式，除非上下文另有清楚地指示。应当进一步理解，术语“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”，当在本说明书中使用时，指定所陈述的特征、步骤、操作、元件，和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或更多个其他特征、步骤、操作、元件、组件，和/或其组。尽管本文可以使用术语“包含(comprising)”，应该理解，被称为“包含”元件的对象也可以“由元件组成”或“基本上由元件组成”。如本文使用的，术语“和/或”包括相关的所列出的项中的一个或更多个的任何和所有的组合。相同的数字在全文中指代相同的元件。如本文使用的，措辞诸如“在X与Y之间”和“在约X与Y之间”应该理解为包括X和Y。如本文使用的，措辞诸如“在约X与Y之间”意指“在约X与约Y之间”。如本文使用的，措辞诸如“从约X至Y”意思是“从约X至约Y”。
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有如本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。应当进一步理解，术语，诸如在常用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与它们在本说明书和相关领域的上下文中的意思一致的含义，且除非本文中明确界定，不应该以理想的或过于正式的含义来理解。为了简洁或清晰，可能没有详细描述已知的功能或结构。
参考根据本发明的实施方案的方法、装置(系统)和计算机程序产品的流程图和/或模块图部分地描述本发明。应当理解，流程图和/或模块图中的每个模块以及流程图和/或模块图中的模块的组合可以通过计算机程序指令来实施。这些计算机程序指令可以被提供至通用计算机的、专用计算机的、或者其他可编程数据处理装置的处理器以生产机器，使得经由计算机的或者其他可编程数据处理装置的处理器执行的指令创建用于实施在流程图和/或模块图的一个或者更多个模块中指定的功能/动作的装置。
在本文中的某些图中的流程图和模块图示出本发明的实施方案的可能的实施的示意性的架构、功能和操作。应该注意到，在一些可选的实施中，在模块中记录的步骤可以与在图中记录的不同次序发生。例如，连续显示的两个模块可以实际上实质上同时地执行，或者模块有时可以按照相反的顺序执行，或者两个或更多个模块可以根据涉及的功能而组合。
前述是本发明的例证且不应被解释为是对其的限制。尽管描述了本发明的一些示例性实施方案，但本领域技术人员将容易理解的是，在示例性的实施方案中很多修改是可能的，而不脱离本发明的新颖的教导和优点。因此，所有此类修改意图包括在权利要求界定的本发明的范围内。本发明通过所附权利要求界定，其中权利要求的等同物包括在本文内。

Claims (29)

1.一种用于失活和提取测试样品中耐酸细菌的方法，所述方法包括以下顺序步骤：
(a)将来自包含耐酸细菌的液体培养物的测试样品转移至第一管中，其中所述第一管包括主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端；
(b)离心所述第一管以使所述耐酸细菌沉淀于所述凹形尖端中并且随后倾析第一上清液，其中以所述凹形尖端终止的所述截头圆锥体部分被配置为将所述耐酸细菌的沉淀物保留在所述凹形尖端中同时倾析至少90％的所述第一上清液；
(c)将所述耐酸细菌沉淀物重悬于醇中以产生悬浮液；
(d)将所述悬浮液从所述第一管转移至包含珠的第二管中；
(e)任选地搅动所述第二管以破碎团块和/或破坏耐酸细菌细胞；以及
(f)任选地孵育所述悬浮液，优选地持续至少约5分钟，以使所述测试样品中的所述耐酸细菌失活。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
(g)将所述悬浮液转移至第三管中并且离心所述第三管以使所失活的耐酸细菌沉淀，并且随后去除第二上清液。
3.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
(h)重悬所述失活的耐酸细菌沉淀物以产生包含所述失活的耐酸细菌的溶液；
(i)从包含失活的耐酸细菌的溶液中提取细胞蛋白，并且离心所述溶液以使细胞碎片沉淀；
(j)将来自步骤(i)的第三上清液的等分试样转移至质谱法靶载玻片；以及
(k)使用质谱仪在质谱法载玻片上鉴定所述失活的耐酸细菌的蛋白谱。
4.如权利要求3中所述的方法，其中步骤(h)中的所述沉淀物被重悬于甲酸中。
5.如权利要求4中所述的方法，其中将乙腈添加至所重悬的失活的耐酸细菌中至从约35％至约65％的最终浓度。
6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述耐酸细菌样品被鉴定为科、属、种、菌株水平和/或群/复合种群。
7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，所述方法还包括通过质谱法询问所述载玻片上的所述测试样品以获得所述耐酸细菌的一个或更多个质谱并且通过将所测量的一个或更多个质谱与一个或更多个参考质谱进行比较来表征和/或鉴定所述测试样品中的所述耐酸细菌。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述样品来自液体培养基并且其中：
步骤(a)中的测试样品是液体培养基；
任选地不存在搅动所述第二管以破碎团块和/或破坏耐酸细菌细胞的步骤(e)；
步骤(f)是需要的并且包括在醇中孵育所述悬浮液。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述主体具有约5mL的体积。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一上清液的至少约99％在步骤(b)中被去除。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述耐酸细菌是分枝杆菌属(Mycobacterium)或诺卡氏菌属(Nocardia)。
12.如权利要求1-11中任一项中所述的方法，其中所述醇是乙醇。
13.如权利要求1-12中任一项中所述的方法，其中步骤(e)是需要的并且包括使用珠磨器或涡旋器和珠搅动所述第二管，其中所述珠是0.5mm玻璃珠。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(f)中在室温孵育所述悬浮液持续至少约10分钟。
15.一种用于失活、提取和鉴定来自液体培养基的测试样品中耐酸细菌的方法，所述方法包括以下顺序步骤：
(a)将测来自包含耐酸细菌的液体培养基的试样品转移至第一管中，其中所述第一管包括主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端；
(b)离心所述第一管以使所述耐酸细菌沉淀于所述凹形尖端中并且随后倾析第一上清液；
(c)将所述耐酸细菌沉淀物重悬于醇中以产生悬浮液；
(d)将所述悬浮液转移至包含的珠的第二管中用于机械破碎；
(e)将所述悬浮液在醇中孵育以使所述耐酸细菌失活；
(f)将所述悬浮液转移至第三管中；
(g)离心所述第三管以使所失活的耐酸细菌沉淀，并且随后去除第二上清液；
(h)重悬所失活的耐酸细菌沉淀物以产生包含所述失活的耐酸细菌的溶液；
(i)从包含失活的耐酸细菌的溶液中提取细胞蛋白，并且离心所述溶液以使细胞碎片沉淀；
(j)将来自步骤(i)的第三上清液的等分试样转移至质谱法靶载玻片；以及
(k)通过质谱法询问质谱法靶载玻片以获得所述耐酸细菌的蛋白谱的一个或更多个质谱并且通过将所测量的一个或更多个质谱与蛋白谱的一个或更多个参考质谱比较来表征和/或鉴定所述测试样品中的所述耐酸细菌。
16.如权利要求3-8或15所述的方法，其中在步骤(i)中使用甲酸来提取细胞蛋白。
17.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括在添加所述甲酸之后添加乙腈，其中所述乙腈从所述失活的耐酸细菌中提取细胞蛋白。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，所述方法还包括搅动所述第二管以在添加醇之后破碎和/或破坏所述耐酸细菌。
19.一种用于失活和鉴定测试样品中耐酸细菌的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一管，所述第一管具有主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端，其中所述第一管具有至少5mL的体积；
醇溶液；
甲酸溶液；和
乙腈溶液。
20.如权利要求19所述的试剂盒，所述试剂盒还包括0.5mm玻璃珠。
21.如权利要求19或20所述的试剂盒，所述试剂盒还包括吸纸，所述吸纸用于在倾析上清液期间干燥所述第一管。
22.如权利要求19-21中任一项所述的试剂盒，其中所述凹形尖端被配置为当上清液被去除时保留沉淀物但不保留流体。
23.如权利要求19-22中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括至少一个另外的管。
24.如权利要求23所述的试剂盒，所述试剂盒还包括2mL圆底管。
25.一种用于鉴定测试样品中耐酸细菌的方法，所述方法包括以下顺序步骤：
(a)将来自包含耐酸细菌的液体培养物的测试样品转移至第一管中，其中所述第一管包括主体、具有开口的主体第一末端、和具有以凹形尖端终止的截头圆锥体部分的主体第二末端；
(b)离心所述第一管以使所述耐酸细菌沉淀于所述凹形尖端中并且随后倾析第一上清液，其中以所述凹形尖端终止的所述截头圆锥体部分被配置为将所述耐酸细菌的沉淀物保留在所述凹形尖端中同时倾析至少90％的所述第一上清液；
(c)将所述耐酸细菌沉淀物重悬于第二管中的醇中或者在转移至第二管中之前重悬于醇中；
(d)搅动所述第二管以破碎团块和/或破坏耐酸细菌细胞；以及
(e)经由质谱鉴定所述耐酸细菌。
26.如权利要求1-18和25中任一项所述的方法，所述方法还包括在将所述测试样品转移至所述第一管中之前确定所述测试样品是微生物生长阳性的。
27.如权利要求26所述的方法，其中在测试阳性之后24-72小时之间将所述测试样品转移至所述第一管中。
28.如权利要求26所述的方法，其中在测试阳性之后24小时内将所述测试样品转移至所述第一管中。
29.如权利要求28所述的方法，其中在选自以下的时间段内将所述测试样品转移至所述第一管中：约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、和约12小时。
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