CN109030614B - 鉴定o4:k8血清型副溶血弧菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法。本发明公开的鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法，包括：利用质谱方法测定待测样本的蛋白质，得到质荷比峰图，质荷比峰图中含有a1)和a2)的待测样本为O4:K8血清型副溶血弧菌或含有O4:K8血清型副溶血弧菌；质荷比峰图中至多含有a1)和a2)中一个质荷比峰的待测样本不为O4:K8血清型副溶血弧菌或不含O4:K8血清型副溶血弧菌；a1)(4382‑4384)m/z的质荷比峰；a2)(4396‑4398)m/z的质荷比峰。实验证明，本发明的方法可用于鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌。

Description

鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，首次鉴定于1950年日本的胃肠炎暴发，其广泛存在于海水，海底沉积物以及海产品中，人们通常由于食用生的或者未煮熟的被副溶血弧菌污染的海产品而引起感染，常见症状有胃肠炎，伤口感染和败血症，在中国副溶血弧菌是引起食源性疾病的首要原因之一，在美国海产品引起肠胃炎中，副溶血弧菌是首要的导致原因。由于副溶血弧菌经常会发生基因的水平转移，因此其生物型和基因型高度多样。副溶血弧菌的血清分型主要依据其菌体抗原(O)和荚膜抗原(K)特性进行划分，至今已发现至少13个O血清型和71个K血清型。1996年2月，O3:K6血清群被认为是引起印度腹泻病例大幅增长的主要原因，1995年后的O3:K6菌株在基因特性上无法区分，且在各种分型方法中形成一个克隆，但是，他们与1995年前O3:K6分离株相比具有独特的基因特性，从发现O3:K6血清型后，后续发现的O4:K68，O1:K25和O1:KUT与O3:K6有着相同的基因特性，被认为是O3:K6血清变异型，目前已发现20多个O3:K6血清变异型，O3:K6及其血清变异型是引起世界范围暴发的主要原因。O4:K8血清型是秘鲁地区的流行菌株，近年来也在其他一些地区形成流行态势，特别是在中国，O4:K8的流行呈现逐年增加的趋势，O4:K8有可能在中国形成较强的流行态势，因此对O4:K8血清型的监测尤为重要。目前O4:K8血清型的鉴定主要采用血清学方法和PCR方法。这两个方法操作较为复杂，且耗时较长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法，所述方法包括：利用质谱方法测定待测样本的蛋白质，得到质荷比峰图，根据所述质荷比峰图确定待测样本是否为或是否含有O4:K8血清型副溶血弧菌：所述质荷比峰图中含有a1)和a2)的待测样本为或候选为O4:K8血清型副溶血弧菌或含有或候选含有O4:K8血清型副溶血弧菌；所述质荷比峰图中至多含有a1)和a2)中一个质荷比峰的待测样本不为或候选不为O4:K8血清型副溶血弧菌或不含或候选不含O4:K8血清型副溶血弧菌；

a1)(4382-4384)m/z的质荷比峰；

a2)(4396-4398)m/z的质荷比峰。

上述方法中，所述待测样本可为副溶血弧菌。

上述方法中，a1)所述质荷比峰可为4383m/z的质荷比峰。

上述方法中，a2)所述质荷比峰可为4397m/z的质荷比峰。

上述方法中，所述质谱方法可为基质辅助激光解析飞行时间质谱方法。

上述方法中，所述待测样本的蛋白质可按照包括如下步骤的方法制备：

1)将待测样本利用乙醇处理，得到乙醇处理物；将所述乙醇处理物进行离心，收集沉淀；

2)向所述沉淀中加入甲酸水溶液，得到甲酸处理物；向所述甲酸处理物中加入乙腈，得到乙腈处理物；将所述乙腈处理物进行离心，得到的上清液即含有所述待测样本的蛋白质。

上述方法中，所述甲酸水溶液可由水与甲酸组成，所述甲酸水溶液中甲酸与水的体积比为7:3。

步骤1)中所述将待测样本利用乙醇处理可包括：将所述待测样本利用水悬浮，得到悬浮液，所述待测样本与水的配比可为5-10mg：300μl；研磨所述悬液，得到研磨产物，向所述研磨产物中添加乙醇，得到所述乙醇处理物，乙醇的添加量满足所述待测样本与乙醇的配比为5-10mg：900μl。步骤1)中所述离心的条件可为12,000g，23-27℃，2min。

步骤2)中所述离心的条件可为12,000g，2min。所述甲酸处理物中甲酸的添加量满足所述待测样本与甲酸的配比为5-10mg：50μl。所述乙腈处理物中乙腈的添加量满足所述待测样本与乙腈的配比为5-10mg：50μl。

本发明还提供了O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰的建立方法，所述方法包括：利用质谱方法测定O4:K8血清型副溶血弧菌与非O4:K8血清型副溶血弧菌的蛋白质，分别得到O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图与非O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图，比较所述O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图与所述非O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图，所述O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图含有而所述非O4:K8血清型副溶血弧菌得质荷比峰图不含的质荷比峰即为O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰。

所述质谱方法可为基质辅助激光解析飞行时间质谱方法。

上述方法中，O4:K8血清型副溶血弧菌与非O4:K8血清型副溶血弧菌的蛋白质均可按照包括如下步骤的方法制备：

1)将副溶血弧菌利用乙醇处理，得到乙醇处理物，所述副溶血弧菌为O4:K8血清型副溶血弧菌或非O4:K8血清型副溶血弧菌；将所述乙醇处理物进行离心，收集沉淀；

2)向所述沉淀中加入甲酸水溶液，得到甲酸处理物；向所述甲酸处理物中加入乙腈，得到乙腈处理物；将所述乙腈处理物进行离心，得到的上清液即含有所述待测样本的蛋白质。

所述甲酸水溶液可由水与甲酸组成，所述甲酸水溶液中甲酸与水的体积比为7:3。

步骤1)中所述将待测样本利用乙醇处理可包括：将所述待测样本利用水悬浮，得到悬浮液，所述待测样本与水的配比可为5-10mg：300μl；研磨所述悬液，得到研磨产物，向所述研磨产物中添加乙醇，得到所述乙醇处理物，乙醇的添加量满足所述待测样本与乙醇的配比为5-10mg：900μl。步骤1)中所述离心的条件可为12,000g，23-27℃，2min。

步骤2)中所述离心的条件可为12,000g，2min。所述甲酸处理物中甲酸的添加量满足所述待测样本与甲酸的配比为5-10mg：50μl。所述乙腈处理物中乙腈的添加量满足所述待测样本与乙腈的配比为5-10mg：50μl。

所述菌株可为处于对数生长期的菌株。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的模型的建立方法，所述方法包括：按照所述O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰的建立方法建立O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰，根据所述O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰或特征蛋白建立鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的模型；

所述特征质荷比峰为质谱方法检测O4:K8血清型副溶血弧菌蛋白质得到的a1)和a2)，所述特征蛋白为具有所述特征质荷比峰的O4:K8血清型副溶血弧菌蛋白质；

a1)(4382-4384)m/z的质荷比峰；

a2)(4396-4398)m/z的质荷比峰。

上述方法中，a1)所述质荷比峰可为4383m/z的质荷比峰。

上述方法中，a2)所述质荷比峰可为4397m/z的质荷比峰。

本发明还提供了按照所述鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的模型的建立方法建立的鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的模型。

利用所述模型鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法可包括b1)或b2)：

b1)含有所述特征质荷比峰的待测样本为或候选为O4:K8血清型副溶血弧菌或含有或候选含有O4:K8血清型副溶血弧菌，不含所述特征质荷比峰的待测样本不为或候选不为O4:K8血清型副溶血弧菌或不含或候选不含O4:K8血清型副溶血弧菌；

b2)含有所述特征蛋白的待测样本为或候选为O4:K8血清型副溶血弧菌或含有或候选含有O4:K8血清型副溶血弧菌，不含所述特征蛋白的待测样本不为或候选不为O4:K8血清型副溶血弧菌或不含或候选不含O4:K8血清型副溶血弧菌。

本发明还提供了下述任一应用：

X1)所述O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰的建立方法或所述鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的模型的建立方法在鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌中的应用；

X2)所述O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰的建立方法或所述鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的模型的建立方法在诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症中的应用；

X3)以所述特征蛋白为标志物的鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的物质在鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌中的应用；

X4)以所述特征蛋白为标志物的鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的物质在制备鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌产品中的应用；

X5)以所述特征蛋白为标志物的鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的物质在制备诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症产品中的应用；

X6)以所述特征蛋白为标志物的鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的物质在诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症中的应用；

X7)检测所述特征蛋白的物质在鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌中的应用；

X8)检测所述特征蛋白的物质在制备鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌产品中的应用；

X9)检测所述特征蛋白的物质在制备诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症产品中的应用；

X10)检测所述特征蛋白的物质在诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症中的应用；

X11)所述模型在鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌中的应用；

X12)所述模型在制备鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌产品中的应用；

X13)所述模型在诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症中的应用；

X14)所述模型在制备诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症产品中的应用。

本发明中，质谱图谱的分析可采用Biotyper 3.0、FlexAnalysis和/或ClinProTools软件分析。

本发明中，质谱方法的条件可为：

操作模式：线性阳离子模式

Ion Source1：20.00kV

Ion Source2：18.70Kv

Mass Range：2000-20000Da

Laser Frequency：20.0Hz

Shots：50

激光能量：60-70％。

本发明开发了一种基于蛋白指纹图谱的鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法。实验证明，利用本发明的鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌操作简单，样本的处理只需要经过简单的几步离心提取蛋白，图谱采集操作简单，人员通过简单培训就能完成所有鉴定步骤；速度较快，只需要约30分钟就能完成鉴定；灵敏度和特异性高，可用于O4:K8血清型副溶血弧菌的鉴定。

附图说明

图1为O4:K8血清型副溶血弧菌的质谱图。

图2为O3:K29血清型副溶血弧菌的质谱图。

图3为部分血清型副溶血弧菌的质谱图。

图4为各血清型副溶血弧菌的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

(1)试剂

心浸液培养基(HI,Heart infusion)肉汤：称取25g心浸液培养基和25g NaCl溶于800ml去离子水中，待培养基充分溶解后用去离子水定容至1L，121℃高压15分钟灭菌。

心浸液培养基(HI,Heart infusion)平板：称取25g心浸液培养基和15g琼脂粉溶于800ml去离子水中，待培养基充分溶解后用去离子水定容至1L，121℃高压15min灭菌，待温度降至90℃时放入55℃水浴锅中平衡30分钟，期间间隔震荡混匀，倒平板时平板厚度为培养皿深度一半。

70％甲酸水溶液：由甲酸和去离子水组成，该溶液中甲酸和去离子水的体积比为7:3；

标准溶剂由HPLC级超纯水、三氟乙酸和乙腈组成，其中HPLC级超纯水、三氟乙酸和乙腈的体积比为475：25：500。

HCCA基质溶液：HCCA基质溶液现配现用，吸取200μl标准溶剂于离心管中，然后向标准溶剂中加入0.2mg HCCA粉末，使用旋涡混匀器，室温振荡使粉末完全溶解，超声破碎5min后短暂离心，上清液即为HCCA基质溶液。其中，HCCA为α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)，美国西格玛·奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，货号：70990-250MG-F)。

(2)仪器

生物安全柜：美国NUAIRE公司

电热恒温培养箱：天津市中环实验电炉有限公司

超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司

低温高速离心机：美国Eppendorf公司

旋涡混匀器：江苏海门其林贝尔仪器公司

MALDI-TOF(基质辅助激光解析飞行时间质谱)质谱仪：德国布鲁克·道尔顿公司(Bruker Daltonics)

实施例1、O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰的建立

一、待测菌株

待测菌株为如下副溶血弧菌：36株O4:K8血清型副溶血弧菌、110株非O4:K8血清型副溶血弧菌(包括O3:K29、O3:K6、O4:K68、O1:K25、O1:KUT、O11:KUT、O8:K41、O1:K36、O2:KUT、O4:K42、O5:K68、O2:K3、O4:K13、O4:K9、O1:K68、O1:K8、O10:K60、O11:K50、O2:K22、O3:K36、O3:K68、O5:K15和O6:K18血清型)。待测菌株的血清型均采用金标准(血清凝集试验)鉴定确认。

二、O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰的建立与应用

1、菌株培养

取副溶血弧菌甘油菌种，取20μl接种于5ml HI肉汤，37℃条件下200r/min过夜培养至平台期后吸取200μl菌液涂布于HI平板，37℃过夜培养后，挑取1μl菌量再次接种于HI平板，培养至对数期，得到副溶血弧菌对数生长期培养物。

2、样品前处理

1)取5-10mg副溶血弧菌对数生长期培养物稀释于300μl超纯水中，得到菌株悬浮液；将所述菌株悬浮液充分研磨混匀，混匀后加入900μl无水乙醇，颠倒混匀，静置5min，得到乙醇处理物；

2)步骤1)完成后，将乙醇处理物于12,000g下常温(25±2℃)离心2min，弃去上清(注意不要碰到沉淀)，重复离心一次，尽量去除上清；

3)步骤2)完成后，向沉淀中加入50μl 70％甲酸水溶液，充分混匀后得到甲酸处理物；向得到的甲酸处理物中加入50μl乙腈(ACN)，充分混匀，得到乙腈处理物；将乙腈处理物于12,000g下离心2min，取1.5μl上清液点样于96孔靶盘，每个样品点5个靶点，室温晾干后，每个靶点覆盖2μl HCCA基质溶液，室温晾干后得到处理好的样品。

3、标准品的配置

1)将装有标准品粉末(德国布鲁克·道尔顿公司，货号：8255343)的离心管13,000g常温离心2min，使粉末都聚集在离心管底部；

2)步骤1)完成后，小心打开管盖，室温下加入50μl标准溶剂，用移液器小心吹打混匀(注意不要产生气泡)，至少吹打20次至粉末完全溶解；

3)步骤2)完成后，盖上管盖，室温放置5min，使标准品充分溶解；

4)步骤3)完成后，再次吹打2min，同样注意不要产生气泡；

5)步骤4)完成后，13,000g常温离心2min，得到标准品溶液，将标准品溶液分装于500μl离心管中，每管10μl，置于-40℃保存(标准品避免反复冻融，最多冻融3次，或者校准发现分子量偏移较大时，弃去该管标准品)。

4、图谱采集

所用质谱仪为MALDI-TOF质谱仪，图谱采集方法如下：

1)仪器参数设置

操作模式：线性阳离子模式

Ion Source1：20.00kV

Ion Source2：18.70Kv

Mass Range：2000-20000Da

Laser Frequency：20.0Hz

Shots：50

激光能量：60-70％

2)仪器分子量校准

利用细菌试验标准品(IVD Bacterial Test Standard,Bruker Daltonics)，对质谱仪进行校准，若质谱仪检测出来的校准品的8个校准峰均与校准品固有分子量(表1)偏差不大(Zoom Range:±5％)，误差低于300ppm，则说明此次校准无误，质谱仪状态良好，可进行后续实验。

表1、细菌试验校准品分子量列表

3)图谱采集

将步骤2得到的含有处理好的样品的靶盘放入质谱仪中进行蛋白指纹图谱的采集。激光打击50次形成1张峰图，6张峰图叠加形成1张蛋白指纹图谱，每个样品需采集至少3张蛋白指纹图谱。

5、数据分析

应用Biotyper 3.0构建副溶血弧菌质谱图谱数据库，FlexAnalysis和ClinProTools软件用于质谱谱图比对及分析。

结果(图1-4)显示，与其他副溶血弧菌的质谱图相比，O4:K8血清型副溶血弧菌蛋白质的质谱图(质荷比峰图)含有特异的4383±1m/z和4397±1m/z质荷比峰，表明，4383±1m/z和4397±1m/z质荷比峰为O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰。因此，可以依据质谱图中的质荷比峰确定待测副溶血弧菌是否为O4:K8血清型副溶血弧菌：蛋白质质荷比峰图中同时含有4383±1m/z和4397±1m/z质荷比峰的待测副溶血弧菌为O4:K8血清型副溶血弧菌，质荷比峰图中至多含有4383±1m/z和4397±1m/z质荷比峰中的一个的待测副溶血弧菌为非O4:K8血清型副溶血弧菌。

依据上述方法鉴定待测菌株的结果如下：从36株O4:K8血清型副溶血弧菌菌株中鉴定出32株O4:K8血清型副溶血弧菌，从110株非O4:K8血清型副溶血弧菌菌株中鉴定出2株O4:K8血清型副溶血弧菌，该方法的灵敏度为32/36×100％＝88.9％，特异性为108/110×100％＝98.2％，具体见表2。

表2、两种方法鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的结果

Claims (9)

1.鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的方法，包括：利用质谱方法测定待测样本的蛋白质，得到质荷比峰图，根据所述质荷比峰图确定待测样本是否为或是否含有O4:K8血清型副溶血弧菌：所述质荷比峰图中含有a1）和a2）的待测样本为或候选为O4:K8血清型副溶血弧菌或含有或候选含有O4:K8血清型副溶血弧菌；所述质荷比峰图中至多含有a1）和a2）中一个质荷比峰的待测样本不为或候选不为O4:K8血清型副溶血弧菌或不含或候选不含O4:K8血清型副溶血弧菌；

a1）（4382-4384）m/z的质荷比峰；

a2）（4396-4398）m/z的质荷比峰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测样本为副溶血弧菌；

和/或，a1）所述质荷比峰为4383 m/z的质荷比峰；

和/或，a2）所述质荷比峰为4397 m/z的质荷比峰。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述质谱方法为基质辅助激光解析飞行时间质谱方法。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待测样本的蛋白质按照包括如下步骤的方法制备：

1）将待测样本利用乙醇处理，得到乙醇处理物；将所述乙醇处理物进行离心，收集沉淀；

2）向所述沉淀中加入甲酸水溶液，得到甲酸处理物；向所述甲酸处理物中加入乙腈，得到乙腈处理物；将所述乙腈处理物进行离心，得到的上清液即含有所述待测样本的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述甲酸水溶液由水与甲酸组成，所述甲酸水溶液中甲酸与水的体积比为7:3。

6.O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰的建立方法，包括：利用质谱方法测定O4:K8血清型副溶血弧菌与非O4:K8血清型副溶血弧菌的蛋白质，分别得到O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图与非O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图，比较所述O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图与所述非O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图，所述O4:K8血清型副溶血弧菌质荷比峰图含有而所述非O4:K8血清型副溶血弧菌得质荷比峰图不含的质荷比峰即为O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰；

所述O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰为a1）和a2）：

a1）（4382-4384）m/z的质荷比峰；

a2）（4396-4398）m/z的质荷比峰。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：O4:K8血清型副溶血弧菌与非O4:K8血清型副溶血弧菌的蛋白质均按照包括如下步骤的方法制备：

1）将副溶血弧菌利用乙醇处理，得到乙醇处理物，所述副溶血弧菌为O4:K8血清型副溶血弧菌或非O4:K8血清型副溶血弧菌；将所述乙醇处理物进行离心，收集沉淀；

2）向所述沉淀中加入甲酸水溶液，得到甲酸处理物；向所述甲酸处理物中加入乙腈，得到乙腈处理物；将所述乙腈处理物进行离心，得到的上清液即含有所述待测样本的蛋白质。

8.鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的模型的建立方法，包括：按照权利要求6或7所述的方法建立O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰，根据所述O4:K8血清型副溶血弧菌的特征质荷比峰或特征蛋白建立鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的模型；

所述特征质荷比峰为质谱方法检测O4:K8血清型副溶血弧菌蛋白质得到的a1）和a2），所述特征蛋白为具有所述特征质荷比峰的O4:K8血清型副溶血弧菌蛋白质；

a1）（4382-4384）m/z的质荷比峰；

a2）（4396-4398）m/z的质荷比峰。

9.下述任一应用：

X1）权利要求6-8中任一所述的方法在鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌中的应用；

X2）以权利要求8中所述特征蛋白为标志物的鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的物质在鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌中的应用；

X3）以权利要求8中所述特征蛋白为标志物的鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的物质在制备鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌产品中的应用；

X4）以权利要求8中所述特征蛋白为标志物的鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌的物质在制备诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症产品中的应用；

X5）检测权利要求8中所述特征蛋白的物质在鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌中的应用；

X6）检测权利要求8中所述特征蛋白的物质在制备鉴定或辅助鉴定O4:K8血清型副溶血弧菌产品中的应用；

X7）检测权利要求8中所述特征蛋白的物质在制备诊断或辅助诊断O4:K8血清型副溶血弧菌引发的胃肠炎、伤口感染或败血症产品中的应用。