CN107190047A - 一种筛检细菌的方法及采用特征元素筛检六种致病菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛检细菌的方法及采用特征元素筛检六种致病菌的方法，其中一种筛检细菌的方法，通过检测细菌中的特征元素，从而实现细菌的快速筛查和鉴别。而采用特征元素筛检六种致病菌的方法，具体为采用特征元素筛检金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和蜡样芽孢杆菌的方法。本发明一种筛检细菌的方法，通过分析各细菌的无机元素含量，找出其中的特征元素，从而达到快速筛查细菌的目的。

Description

一种筛检细菌的方法及采用特征元素筛检六种致病菌的方法
技术领域
本发明属于细菌筛检技术领域，具体的说，涉及一种筛检细菌的方法及采用特征元素筛检六种致病菌的方法。
背景技术
传统意义上来说，细菌的检测由最初的显微镜镜下形态分析和动物实验，过渡到各种生化反应的鉴别实验，鉴别的特异性显著提高。随着检测设备的发展，细菌鉴定仪和PCR技术的使用，使得细菌的鉴定速度显著提升。
其中细菌鉴定仪是通过不同细菌有不同的生化反应，从而导致鉴定卡上颜色的变化，对照现有的谱图进行鉴别。虽然细菌鉴定仪的优点是能更方便的进行药敏实验，但其最大的缺点是完全不能受杂菌的干扰，不管是在培养阶段还是在鉴定阶段，一旦实验过程中被杂菌所污染，杂菌就会导致生化反应异常，可能造成结果的误判。
而PCR法进行检测对场地的要求比较高，虽然用荧光定量PCR可以避免后期的电泳阶段，但前期提取核酸阶段不但操作繁琐，而且容易污染实验室。PCR法检测需要找到对应的引物，但现在被研究出来公认的引物数量比较少，这也极大的限制了该仪器的应用。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种筛检细菌的方法及采用特征元素筛检六种致病菌的方法，通过分析各细菌的无机元素含量，找出其中的特征元素，从而达到快速筛查细菌的目的。
本发明目的是这样实现的：一种筛检细菌的方法，其关键在于：通过检测细菌中的特征元素，从而实现细菌的快速筛查和鉴别。
进一步地，上述的一种筛检细菌的方法：通过一种或多种所述特征元素对细菌进行鉴别、筛查。
进一步地，上述的一种筛检细菌的方法的具体步骤为：将已知细菌接种培养后，再将细菌消解、定容，通过电感耦合等离子体质谱仪检测细菌中常见无机元素的含量，然后对各种细菌中元素的含量进行对比区分，含量明显区别于其他菌的元素选为特征元素，最后将待测细菌进行接种培养后再将细菌消解、定容，并通过电感耦合等离子体质谱仪检测待测细菌中特征元素的含量进行细菌的筛查和鉴别。
进一步地，上述已知菌株和待测菌株的接种培养具体步骤为：将菌株的雌株接种于营养肉汤中，37℃震荡培养24h，12000r/min离心3min，弃去上清液，用超纯水反复洗涤三次后，将菌残渣放置于-70℃过夜，然后将其置于冷冻离心机中-40℃，抽取36h备用。培养处理中仍需要增菌，洗涤、冷冻干燥后方能够进行上机检测，其主要目的是去除菌落中的水分，从而使得不同细菌在相同的状态下进行比较。还有震荡培养不但可以使氧气充分融入培养基，而且可以有效的避免菌量增多后结成块状沉积于培养基底部。从而满足实验对细菌的产量的要求。
进一步地，上述已知菌株和待测菌株消解的具体步骤为：将菌体移入聚四氟乙烯罐中，加入2.0ml硝酸，1.0ml过氧化氢，超纯水2.0ml，混匀，浸泡30min，将聚四氟乙烯罐放入微波消解仪中，180℃消解20min。
进一步地，上述常见无机元素包括Na、K、Mg、Al、Ca、Fe、Zn、B、Mn、Cu、As、Se、Mo、Cd、Ba、Pb、Th、U、Be、V、Cr、Co、Ni、Ag、Sn、Sb、Hg、Tl。
本发明目的是这样实现的：一种采用特征元素筛检六种致病菌的方法，其关键在于：将金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和蜡样芽孢杆菌接种培养后，再将细菌消解、定容，通过电感耦合等离子体质谱仪检测细菌中28种无机元素的含量，即Na、K、Mg、Al、Ca、Fe、Zn、B、Mn、Cu、As、Se、Mo、Cd、Ba、Pb、Th、U、Be、V、Cr、Co、Ni、Ag、Sn、Sb、Hg和Tl，然后对六种细菌中所述无机元素的含量进行对比区分，其中含量明显区别于其他菌的元素选为特征元素，最后将待测细菌进行接种培养后再将细菌消解、定容，并通过电感耦合等离子体质谱仪检测待测细菌中特征元素的含量进行细菌的筛查和鉴别。
进一步地，上述已知菌株和待测菌株的接种培养具体步骤为：将菌株的雌株接种于营养肉汤中，37℃震荡培养24h，12000r/min离心3min，弃去上清液，用超纯水反复洗涤三次后，将菌残渣放置于-70℃过夜，然后将其置于冷冻离心机中-40℃，抽取36h备用。
进一步地，上述已知菌株和待测菌株消解的具体步骤为：将菌体移入聚四氟乙烯罐中，加入2.0ml硝酸，1.0ml过氧化氢，超纯水2.0ml，混匀，浸泡30min，将聚四氟乙烯罐放入微波消解仪中，180℃消解20min。
有益效果：
本发明方法：基于不同的细菌在生长过程中，为维持细胞的正常生长，维持渗透压平衡，控制氧化还原反应电位，会富集不同量的无机盐，不同的细菌种类对摄入金属的种类和数量均有所不同，因此能有效通过测定细菌的无机元素含量，实现对细菌的初步筛检。
附图说明
图1为样品的内标回收率；
图2为各细菌的特征元素含量。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1：以筛检金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌六种细菌为例。
1材料
1.1仪器设备
电感耦合等离子体质谱仪(Agilent，7700X)，微波消解仪(Speedwave，sw-4)，冷冻干燥机(宁波新芝，SCIENTZ-30ND)，超纯水机(Millipore，Milli-Q integral)，离心机(Thermofisher，X1R)。
1.2试剂
硝酸(Thermofisher，GR)，营养肉汤(青岛海博)，过氧化氢(30％，川东化工，GR)。
1.3标准菌株
金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)，福氏志贺氏菌(CICC10865)，大肠杆菌(ATCC25922)，副溶血弧菌(CICC21627)，蜡样芽孢杆菌(CICC23828)。
1.4标准溶液
(1)混标(Na，K，Mg，Al，Ca，Fe，Zn，Mn，Cu，As，Se，Mo，Cd，Ba，Pb，Th，U，Be，V，Cr，Co，Ni，Ag，Sb，Tl)，10mg/L，编号213035005，购自AccuStandard,Inc；(2)Hg，1000mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试中心；(3)B，1000mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试中心；(4)Sn，500mg/L，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院；(5)调谐液：Ce、Co、Li、Mg、Y、Tl，均1μg/L，Agillent；(6)内标：Bi、Ge、In、Lu、Rh、Sc、Tb，均100mg/L(临用时稀释至1mg/L)，Agillent。
2方法
2.1细菌培养
将以上6个菌株的瓷珠接种于30ml营养肉汤中，37℃震荡培养24h，12000r/min离心3min，弃去上清液，用超纯水反复洗涤三次后，将菌残渣放置于-70℃过夜，然后将其置于冷冻离心机中-40℃，抽取36h备用。同时进行肉汤空白实验。
2.2细菌消解
称取10mg-20mg菌体于聚四氟乙烯罐中，加入2.0ml硝酸，1.0ml过氧化氢，超纯水2.0ml，混匀，浸泡30min，将消解罐放入微波消解仪180℃消解20min。消解完毕后用超纯水定容至10ml，混匀备用。
2.3仪器检测参数如表1所示：
表1电感耦合等离子体质谱仪检测参数
3检测结果及分析
3.1检测结果
将制备好的样液进行检测，每个细菌测定6次，得到28种无机元素(Na，K，Mg，Al，Ca，Fe，Zn，B，Mn，Cu，As，Se，Mo，Cd，Ba，Pb，Th，U，Be，V，Cr，Co，Ni，Ag，Sn，Sb，Hg，Tl)的平均含量见表2所示。
表2：6种细菌的无机元素平均浓度及相对标准差(n＝6)
注：a，该指标无法计算或计算无意义。
3.2方法指标
3.2.1精密度
如表2所示，28种元素测定的相对标准偏差(RSDs，n＝6)在1.1～7.9范围内，均小于8％，说明测定的精密度良好。
3.2.2内标回收率
用Sc，Ge，In，Tb，Bi元素作为内标以校正待测元素测定结果，仪器自动计算出内标元素的回收率，可用于评价样品基质效应。内标回收率结果见图1，平均回收率均在80％-120％范围内。
3.3测定结果分析
3.3.1元素含量分析
根据元素检测结果，按照元素浓度的范围可以将其分为四个组，分组情况见表3。
表3各浓度范围的元素种类
由上表可以看出，高浓度组的元素主要是K、Na等，这些元素是微生物细胞的主要元素，是己糖磷酸化酶、核酸聚合酶等活性中心组分，叶绿素和细菌叶绿素成分。其次，细菌生长繁殖和许多生理过程中，对Mg，Al，Ca，Fe，Zn需求较多，可能贮存以备用等。有的重金属如Cr，Co，Ni，Ag，Cd，Sb，Hg具有毒性，对细菌生长不利，故不易被细菌吸收，检出浓度极低。
3.3.2结合图2对各细菌的特征元素进行分析
对于副溶血弧菌，B为其特征元素，其含量远高于其他细菌。特别是和其有相似症状的金黄色葡萄球菌比较，副溶血弧菌含量约为金黄色葡萄球菌的5倍左右。
对于金黄色葡萄球菌，Cu为其特征元素，其含量高于其他细菌。含量最接近的为蜡样芽胞杆菌，仅为其的一半。
对于福氏志贺氏菌，Th为其特征元素，其含量高于其他细菌。志贺氏菌和沙门氏菌引起的食物中毒发病时间均为8h～24h，且症状均比较相识，不易区分。但福氏志贺氏菌中Th含量大于0.8mg/kg，沙门氏菌中Th的含量低于0.1mg/kg，可以作为区分。
对于蜡样芽孢杆菌，Na为其特征元素，其含量高于其他细菌。蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌食物中毒的症状均为强烈的呕吐，且开始发病的时间均比较短，不易区分。可以利用其中Na含量的巨大差异对其进行鉴别。
对于大肠杆菌，K为其特征元素，其含量高于其他细菌。大肠杆菌为条件致病菌，引起食源性疾病需要满足一定的条件。含量最接近的为蜡样芽胞杆菌，约为其的一半。
对于鼠伤寒沙门氏菌，B的含量远低于其他细菌。Pb的含量高于其他细菌，但与蜡样芽孢杆菌中的含量比较接近。在实际鉴定中，最好将这两种元素结合起来判断。
因此副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的特征元素分别为B、Cu、Th、Na、K、Pb。
4待测细菌检测：
最后将待测细菌进行所述接种培养后再将细菌通过上述的方法消解、定容，并通过电感耦合等离子体质谱仪检测待测细菌中特征元素的含量即可对上述细菌进行初步的筛查和鉴别。B、Cu、Th、Na、K、Pb特征元素能够结合临床症状，分别用于副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的鉴别。

Claims (10)

1.一种筛检细菌的方法，其特征在于：通过检测细菌中的特征元素，从而实现细菌的快速筛查和鉴别。
2.根据权利要求1所述的一种筛检细菌的方法，其特征在于：通过一种或多种所述特征元素对细菌进行鉴别、筛查。
3.根据权利要求1或2所述的一种筛检细菌的方法，其特征在于具体步骤为：将已知细菌接种培养后，再将细菌消解、定容，通过电感耦合等离子体质谱仪检测细菌中常见无机元素的含量，然后对各种细菌中元素的含量进行对比区分，含量明显区别于其他菌的元素选为特征元素，最后将待测细菌进行接种培养后再将细菌消解、定容，并通过电感耦合等离子体质谱仪检测待测细菌中特征元素的含量进行细菌的筛查和鉴别。
4.根据权利要求3所述的一种筛检细菌的方法，其特征在于所述已知菌株和待测菌株的接种培养具体步骤为：将菌株的雌株接种于营养肉汤中，37℃震荡培养24h，12000r/min离心3min，弃去上清液，用超纯水反复洗涤三次后，将菌残渣放置于-70℃过夜，然后将其置于冷冻离心机中-40℃，抽取36h备用。
5.根据权利要求3所述的一种筛检细菌的方法，其特征在于所述已知菌株和待测菌株消解的具体步骤为：将菌体移入聚四氟乙烯罐中，加入2.0ml硝酸，1.0ml过氧化氢，超纯水2.0ml，混匀，浸泡30min，将聚四氟乙烯罐放入微波消解仪中，180℃消解20min。
6.根据权利要求3所述的一种筛检细菌的方法，其特征在于：所述常见无机元素包括Na、K、Mg、Al、Ca、Fe、Zn、B、Mn、Cu、As、Se、Mo、Cd、Ba、Pb、Th、U、Be、V、Cr、Co、Ni、Ag、Sn、Sb、Hg、Tl。
7.一种采用特征元素筛检六种致病菌的方法，其特征在于：采用特征元素筛检金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和蜡样芽孢杆菌的方法。
8.根据权利要求7所述的采用特征元素筛检六种致病菌的方法，其特征在于具体方法为：将金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、副溶血弧菌和蜡样芽孢杆菌接种培养后，再将细菌消解、定容，通过电感耦合等离子体质谱仪检测细菌中28种无机元素的含量，即Na、K、Mg、Al、Ca、Fe、Zn、B、Mn、Cu、As、Se、Mo、Cd、Ba、Pb、Th、U、Be、V、Cr、Co、Ni、Ag、Sn、Sb、Hg和Tl，然后对六种细菌中所述无机元素的含量进行对比区分，其中含量明显区别于其他菌的元素选为特征元素，最后将待测细菌进行接种培养后再将细菌消解、定容，并通过电感耦合等离子体质谱仪检测待测细菌中特征元素的含量进行细菌的筛查和鉴别。
9.根据权利要求8所述的采用特征元素筛检六种致病菌的方法，其特征在于所述已知菌株和待测菌株的接种培养具体步骤为：将菌株的雌株接种于营养肉汤中，37℃震荡培养24h，12000r/min离心3min，弃去上清液，用超纯水反复洗涤三次后，将菌残渣放置于-70℃过夜，然后将其置于冷冻离心机中-40℃，抽取36h备用。
10.根据权利要求8所述的采用特征元素筛检六种致病菌的方法，其特征在于所述已知菌株和待测菌株消解的具体步骤为：将菌体移入聚四氟乙烯罐中，加入2.0ml硝酸，1.0ml过氧化氢，超纯水2.0ml，混匀，浸泡30min，将聚四氟乙烯罐放入微波消解仪中，180℃消解20min。
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