CN104498486A - 黄瓜抗白粉病基因pm-h的Indel标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明“黄瓜抗白粉病基因pm-h的Indel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。与黄瓜抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记，其中所述标记的引物的核苷酸序列为：pm-hIndel36-F/pm-hIndel36-R:GGTTTGTTGGTATGAAGAAGG/GGGATTGAAGAGAATATACTCC；所述Indel标记引物扩增的与黄瓜抗白粉病基因pm-h连锁的特征条带为170bp，核苷酸序列见Seq ID No.1；所述Indel标记引物扩增的与黄瓜感白粉病基因PM-H连锁的特征条带为164bp，核苷酸序列见Seq ID No.2。采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断其是否对白粉病具有抗性，该标记具有高效、限制少的优点，对选育抗白粉病的黄瓜材料提高了效率，缩短了育种周期。

Description

黄瓜抗白粉病基因pm-h的Indel标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术辅助育种技术领域，特别涉及一种黄瓜抗白粉病基因pm-h的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。

背景技术

黄瓜白粉病是一种广泛发生的世界性病害，是黄瓜主要叶部病害之一。具有潜育期短，再侵染频繁、流行性强和周年发生等特点。在我国，春保护地和夏秋露地黄瓜，每年都因白粉病的发生造成大量减产。在黄瓜的整个生长期，白粉病均可发生，一般在生长的中、后期比较严重。发病初期在叶正面上形成小白粉斑，呈放射状扩展，粉斑不断扩展，后期数个病斑连片，覆盖整个叶面、叶背、叶柄及茎部。在发病的晚期，病部白粉加厚，转为淡灰色，叶片组织变黄干枯，最终失去光合作用功能。

目前，在黄瓜上已经挖掘了一些抗白粉病的种质资源，开展了相关遗传和分子生物学研究，但是前人的研究主要集中在幼苗和叶片抗白粉病方面。对于黄瓜抗白粉病的报道较少。在遗传方面，国外学者Shanmugasundarum等用对白粉病具有完全抗性的黄瓜自交系P1212233、P123514和感病亲本杂交，F1为感病，F2群体出现了抗病和感病分离，分离比例表现为完全抗病：中抗：感病＝1:3:12，结论认为抗性由1对隐性主基因s(后替换为pm-h)，1对显性基因R和1对显性抑制基因I控制。其中，s是抗白粉病的主基因，决定下胚轴及抗性；构成叶部抗性基础的是R基因，且只有当s基因在纯合状态下才能够表达出抗性；I基因为抑制基因，它的存在使植株只能表现出部分抗性，但其对s基因的表达不会产生影响。从而设想P1212233基因型为RRssii，感病亲本基因型为rrSSII。Walters et al(2011)也指出pm-h是一个单隐性基因。在黄瓜抗白粉病的分子生物学研究方面仅见一篇报道。He et al(2013)用抗白粉病的WI2757和感白粉病的True Lemon为亲本，构建F2群体和F2：3家系，获得与pm-h连锁的两个侧翼SSR标记，连锁距离为2.6cM和5cM。可见，目前报道的与黄瓜白粉病抗性连锁的标记只有SSR标记，并未见其他类型标记(如Indel、SNP等)的研究。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种与黄瓜抗白粉病基因pm-h紧密连锁的Indel标记，并提供了该标记在筛选抗白粉病和感白粉病的黄瓜种质资源上的应用。

本发明的技术方案如下：

一种与黄瓜抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记，其特征在于：所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：

pm-hIndel36-F/pm-hIndel36-R:

GGTTTGTTGGTATGAAGAAGG/GGGATTGAAGAGAATATACTCC

所述引物扩增的与黄瓜抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记特征条带为170bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；

所述引物扩增的与黄瓜感白粉病基因PM-H连锁的Indel标记特征条带为164bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

所述的Indel标记在筛选具有抗白粉病基因pm-h的黄瓜种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用所述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：

pm-hIndel36-F/pm-hIndel36-R:

GGTTTGTTGGTATGAAGAAGG/GGGATTGAAGAGAATATACTCC

(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；

(3)从电泳检测结果中筛选出现与抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记特征条带一致的材料，所述与抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记特征条带为170bp，其核苷酸序列如Seq IDNo.1所示。

所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/μl DNA模板，正反向引物各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。

所述DNA模板为黄瓜材料的基因组DNA；所述正反向引物的核苷酸序列如下：

pm-hIndel36-F/pm-hIndel36-R:

GGTTTGTTGGTATGAAGAAGG/GGGATTGAAGAGAATATACTCC

所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

所述凝胶电泳检测指，采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。

本发明以抗白粉病高代自交系WI2757与感白粉高代自交系Wis.SMR18为亲本构建F1、F2、BC1P1、BC1P2群体，通过田间病圃自然发病鉴定，对黄瓜抗白粉病基因pm-h进行了遗传分析。以F2群体为作图材料，利用BSA法和SSR及Indel标记技术，实现pm-h基因在染色体上的遗传定位，并获得紧密连锁的Indel标记pm-hIndel36，与pm-h的遗传距离为3cM。所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜抗白粉病基因pm-h连锁的特征条带为170bp，核苷酸序列如Seq ID No.1；所述Indel标记特异性引物扩增的与黄瓜感白粉病基因PM-H连锁的特征条带为164bp，核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

本发明通过利用K8×K18(K8抗白粉病；K18感白粉病)构建的包含85个株系的重组自交系群体(RILs)进行验证，结果表明pm-h Indel36验证的正确率为81.8％.

本试验不仅为黄瓜抗白粉基因pm-h的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有抗白粉基因的黄瓜新品种提供了高效的途径。本发明基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有特定白粉病抗性的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用所述Indel标记的特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条170bp条带，这种为隐型纯合材料(抗白粉病)；另一种是170bp条带和164bp条带都出现，这种是显性杂合材料(感白粉病)；第三种是仅仅出现164bp条带，这种为显性纯合材料(感白粉病)。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行白粉抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。

附图说明

图1.采用本发明所述的pm-h Indel36标记的特异性引物验证不同群体的黄瓜材料的电泳检测结果；其中红色字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。

生物材料的来源和记载出处

本研究所用的试验材料为黄瓜纯合自交系WI2757和Wis.SMR18。以WI2757为母本，Wis.SMR18为父本杂交，获得F1，自交获得F2群体，F1分别与WI2757和Wis.SMR18回交获得BC1P1、BC1P2群体。本研究所用的验证群体是利用K8×K18(K8抗白粉病；K18感白粉病)构建的包含85个株系的重组自交系群体(RILs)。

WI2757(P1)：欧洲温室型黄瓜雌性系，生长偏弱，侧枝发达，抗白粉病。连续坐果多，瓜长10厘米左右，表面多刺，无苦味，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《Hortscience》第33卷第6期第1050-1052页上发表的文章《Independence of the mjnematode resistance gene from 17gene loci in cucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

Wis.SMR18(P2)：美加工型黄瓜自交系，生长势强，侧枝较发达，感白粉病。瓜长15厘米左右，表面稀刺，果肉致密、硬度大，为现有已知品种。在Walters和Wehner等人于1998年在《Hortscience》第33卷第6期第1050-1052页上发表的文章《Independence of the mjnematode resistance gene from 17gene loci in cucumber》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

K8：华北型密刺黄瓜自交系，生长势强，耐低温弱光，分枝性弱，节间中等，感白粉病。瓜长30厘米左右，白刺、密，瘤极小，无棱，无纹。为现有已知品种。在张圣平等人于2011年在《中国农业科学》第44卷第17期第3584-3593页上发表的文章《黄瓜白粉病抗性基因的QTL定位》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

K18：华北型密刺黄瓜自交系，生长势较强，耐低温弱光，分枝性弱，节间较短，感白粉病。瓜长33厘米左右，白刺、密，瘤中小，无棱，少纹。为现有已知品种。在张圣平等人于2011年在《中国农业科学》第44卷第17期第3584-3593页上发表的文章《黄瓜白粉病抗性基因的QTL定位》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

Indel标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用primer 3.0软件设计，并由上海生工公司合成。

主要试剂

SSR引物来自国际黄瓜基因组计划(ICUGI)；PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq Green Master Mix；

凝胶电泳使用康润公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。

实施例1.黄瓜抗白粉病基因pm-h的Indel标记pm-hIndel36的获得

步骤1.黄瓜白粉病抗性鉴定

本试验以黄瓜高代自交系WI2757(抗病)和Wis.SMR18(感病)为母本和父本，自交获得F1、F2群体，F1与亲本回交获得BC1P1、BC1P2群体。2014年春季，在中国农业科学院蔬菜花卉研究所顺义基地大棚种植六世代群体，于生长后期进行病情调查。病情分有和无两种情况，有病的为感病植株，无病的为抗病植株。

根据田间调查结果，用SAS9.2软件进行数据统计分析，判断分离比例。

结果显示：后代F1均表现感病；在196个F2单株中，感病植株有144株，抗病植株有52株，经卡方检测，符合3:1比例；BC1P1有88株，感病植株有43株，抗病植株有45株，经卡方检测，符合1:1比例；BC1P2有87株，全部表现为感病。表明在该群体中白粉抗性受一对隐性基因pm-h控制。

步骤2.DNA提取和分子标记分析

取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及F2群体各单株的基因组DNA。

PCR反应体系为：总反应体系10μL,3μL DNA(5.0ng·μL-1)，正向和反向引物(50ng·μL-1)各1μL，5μL GoGreen Master Mix(Promega公司产品)。

引物使用黄瓜全基因测序开发的SSR引物(Ren et al.，2009；Cavagnaro et al.，2010)。

PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，16℃forever。

扩增产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h5min，电泳后银染显色，统计带型。

步骤3.初步定位的SSR分子标记筛选、数据统计及连锁图构建

共显性标记的统计方法：与母本(WI2757)一致的带型记为a，与父本(Wis.SMR18)一致的带型记为b，杂合的带型记为h。显性标记的统计方法：若母本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为d，和父本带型一致的记为b；若父本为显性标记，则分离群体中和母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为c，未扩增出的或模糊不清的记为u。

结果显示：

根据He et al(2013)的研究，pm-h基因初步定位在5号染色体上，我们用5号染色体上的194对SSR引物对P1(WI2757)和P2(Wis.SMR18)进行筛选，其中在两个亲本间表现多态的引物有33对，多态率17.01％。结合BSA法建池，进一步筛选得到了10个SSR多态性标记。又用抗感池进一步筛选He et al(2013)等报道的与pm-h基因位于同一连锁群上的10对标记，得到6个多态性标记。

利用筛选出的多态性标记对WI2757×Wis.SMR18组合的F2群体进行分析，结合调查性状数据利用Joinmap4.0构建连锁图。结果16个标记和目标性状(抗白粉)基因pm-h被定位在同一连锁群上(LOD＝10)。

将本试验得到的连锁图与已发表的黄瓜遗传图谱(Zhang et al.，2012)比较，发现本连锁群的16个标记均分布在第5染色体，据此证实pm-h基因在第5染色体上。

步骤4.Indel标记开发及pm-h连锁群分子标记加密

针对初定位的染色体区段，结合黄瓜基因组序列的数据，利用primer 3.0软件在目标区段(约2.01M)共设计了220对SSR标记引物和106对Indel标记引物，对连锁群进行分析标记加密。用双亲结合BSA法建池筛选出有多态性的有30对标记。通过分析所有多态性标记的物理位置以及是否位于同一scaffold，最终用同一scaffold(scaffold000003)上的标记得到一个总长度为12.8cM包含14个标记(初定位的其中5对+新设计的9对)的连锁群，获得与黄瓜抗白粉基因pm-h连锁距离为3.0cM的Indel标记pm-hIndel36。

步骤5.PCR扩增所得差异片段的回收纯化及测序

(1)目的片段的回收

采用煮沸法。具体操作为：先从胶上将目标条带挖下来装入1.5mL的Eppendorf管内，向管内加入100μL超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95℃水浴锅(或PCR仪)中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行PCR扩增，剩余产物置-20℃保存备用。

(2)目的片段的纯化

用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜放置，1,2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。

(3)目的片段与载体的连接

反应体系为10μL：PMD18-T Vector1.0μL；Ligation bufferⅠ5.0μL；目的片段4.0μL。

在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16℃连接约1h，过夜也不影响连接效率。

(4)连接产物的转化

1)取出感受态细胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；

2)感受态(50μL)+5μLSolutionA+4μLSolutionB+46μL预冷去离子水；

3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1.5mL离心管，每管加入105μL，再加入5μL的目的DNA，轻旋混匀；

4)42℃水浴热激90s，注意不要晃动离心管；

5)快速将管转移到冰浴器中，使细胞冷却3～5min；

6)加入500μL LB液体培养基。在37℃，150rpm摇床上预培养1h；

7)将菌液涂布到含有100μg·mL-1Amp、25μg·mL-1IPTG和40μg·mL-1X-GAL的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；

8)倒置平板，37℃培养12～16h。

(5)重组质粒的蓝白斑筛选

经37℃培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中，37℃，150rpm过夜培养。

(6)菌落PCR的检测

吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μL PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，与PCR Marker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。

(7)克隆后载体的测序与分析

取3个阳性克隆菌液在甘油(330μL甘油中加入1000μL菌液)中各保存两份，一份-20℃保藏，一份送去测序。

其中pm-hIndel36标记引物pm-hIndel36-F/pm-hIndel36-R扩增出的与黄瓜抗白粉病基因pm-h连锁的特征片段的核苷酸序列如Seq ID No.1所示；与黄瓜感白粉病基因PM-H连锁的特征片段的核苷酸序Seq ID No.2所示。

实施例2.与黄瓜pm-h基因连锁的pm-hIndel36标记的验证

用对实施例1获得的与pm-h基因连锁的Indel标记pm-hIndel36对K8×K18含85个株系的RIL群体进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1中步骤2中的PCR扩增和检测方法。

6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的部分结果如图1所示，在这85个株系中共有69个株系的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，经计算准确率为81.18％。

Claims (6)

1.一种与黄瓜抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记，其特征在于：所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：

pm-hIndel36-F/pm-hIndel36-R:

GGTTTGTTGGTATGAAGAAGG/GGGATTGAAGAGAATATACTCC

所述引物扩增的与黄瓜抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记特征条带为170bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；

所述引物扩增的与黄瓜感白粉病基因PM-H连锁的Indel标记特征条带为164bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

2.权利要求1所述的Indel标记在筛选具有抗白粉病基因pm-h的黄瓜种质资源中的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用所述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩增；所述Indel标记的引物的核苷酸序列如下：

pm-hIndel36-F/pm-hIndel36-R:

GGTTTGTTGGTATGAAGAAGG/GGGATTGAAGAGAATATACTCC

(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；

(3)从电泳检测结果中筛选出现与抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记特征条带一致的材料，所述与抗白粉病基因pm-h连锁的Indel标记特征条带为170bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其中所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/μl DNA模板，正反向引物各5ng/μl，0.5μl/μl GoGreen Master Mix，其余为双蒸水。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述DNA模板为黄瓜材料的基因组DNA；所述正反向引物的核苷酸序列如下：

pm-hIndel36-F/pm-hIndel36-R:

GGTTTGTTGGTATGAAGAAGG/GGGATTGAAGAGAATATACTCC 。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其中所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其中所述凝胶电泳检测指，采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。