CN101956005B

CN101956005B - 一种荧光标记的插入缺失遗传多态性位点复合扩增系统及其应用

Info

Publication number: CN101956005B
Application number: CN2010102529172A
Authority: CN
Inventors: 赵书民; 李成涛; 张素华
Original assignee: EXPERT TESTIMONY SCIENCE-TECHNOLOGY INST JUDICAL DEPARTMENT
Current assignee: ACADEMY OF FORENSIC SCIENCE
Priority date: 2010-08-13
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: CN101956005A

Abstract

本发明属于生物学检测技术领域，具体为一种荧光标记的插入缺失遗传多态性位点复合扩增系统及其应用。本发明包括：35个InDel位点的选择，35个InDel位点的PCR扩增引物的设计，PCR引物的荧光素标记的匹配，35个InDel位点的复合扩增与检测等。该系统可复合扩增分析35个插入缺失遗传多态性位点。这35个InDel位点分别用FAM、HEX、TAMRA和ROX四种不同颜色的荧光素标记。基于本发明的复合扩增系统，可制成试剂盒，作为有中国特色的InDel位点荧光复合扩增试剂盒，用于三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别、疾病诊断和人类学等领域中。

Description

一种荧光标记的插入缺失遗传多态性位点复合扩增系统及其应用

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，涉及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记，尤其涉及一种通过复合扩增35个插入缺失遗传多态性标记(Insertion/Deletion, InDel)来进行的荧光标记复合扩增系统及其应用。

背景技术

STR基因座（short tandem repeat, STR）是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，其核心序列为2-7bp，重复次数通常在15-30次。STR基因座的高度多态性和其在基因传递过程中遵循孟德尔共显性遗传规律等特点，使得PCR-STR复合扩增荧光检测技术已经成为国际法医学界不可或缺的一项重要技术手段，在各国的罪犯DNA数据库建设、个体识别以及亲权鉴定等司法实践中发挥着越来越重要的作用。但随着人们对STR基因座的广泛应用和了解，STR的一些缺陷愈显突出，主要体现在以下几方面：一、STR基因座的突变率较高，原本很稀有的突变问题正在成为常见事件，这一问题已经引起广泛关注；二、STR基因座一般有多个等位基因，等位基因间长度差别大，PCR扩增产物一般较长，不易实现多个基因座的复合扩增；三、具备法医学应用价值的STR基因座数量十分有限。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)作为第三代遗传标记，由于自发突变率明显低于STR基因座(10^-8 vs10^-3)，且位点多为二等位基因，分型是定性问题，更易于实现自动化。此外，对于单个SNP位点，其扩增产物可以很短，容易实现多个位点复合扩增，有利于降解检材、石蜡包埋肿瘤组织等的分型，其应用于法医学实践的优越性已经越来越明确。SNP在美国“9.11”事件遇难者身份识别中已发挥了重要作用。目前国际法医遗传学界已达成了一种初步共识，即SNP可能是替代STR的理想的遗传多态性标记。但是在以往关于SNP的研究中，选择的SNP位点均是经典的二等位基因SNP，是单个碱基的替换或颠换，采用的技术平台无论是Minisequencing(核心是单碱基延伸)、连接反应还是质普分析，要么需要特殊仪器设备(如SNPStream、MALDI-TOF质普仪)，要么核心技术为国外技术公司掌握(如SNPlex)，均不利于在常规的法医学实验室推广应用。

插入/缺失多态性(Insertion/Deletion, InDel)作为一种特殊类型的二等位基因SNP，由于兼具SNP和STR的特征、并可直接采用现已广泛应用的STR分型技术平台，而受到了国内外法医遗传学者的关注。国外学者如Pereira等人与Edelmann等人于2009年分别建立了一个包含38个常染色体InDel位点和26个X染色体InDel位点的可用于个体识别目的的复合扩增体系，该体系采用多色荧光标记，毛细管电泳，依靠插入缺失片段的大小就可以实现快速、准确的进行分型，体现出了InDel遗传标记在法医学中应用的优越性。目前，针对中国人群开发的一种荧光标记的插入缺失遗传多态性标记复合扩增系统尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种在中国人群中具有高个体识别率的InDel位点并建立相应的荧光标记复合扩增系统。

本发明的另一个目的在于提供上述复合扩增系统在为三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别、疾病诊断和人类学等领域中的应用。

本发明建立了一种荧光标记的插入/缺失多态性遗传标记（InDel）复合扩增系统，该系统可同时对35个 InDel位点进行分析。这35个InDel位点分别为：InDel-01（rs2307507）、InDel-02（rs2307963）、InDel-03（rs2308276）、InDel-04（rs2307975）、InDel-05（rs2308292）、InDel-06（rs1160953）、InDel-07（rs1160980）、InDel-08（rs1610903）、InDel-09（rs1610949）、InDel-10（rs1611088）、InDel-11（rs2307661）、InDel-12（rs2308116）、InDel-13（rs2308139）、InDel-14（rs1610906）、InDel-15（rs16458）、InDel-16（rs2307783）、InDel-17（rs10666410）、InDel-18（rs34535242）、InDel-19（rs2307850）、InDel-20（rs16721）、InDel-21（rs35248926）、InDel-22（rs35833136）、InDel-23（rs16660）、InDel-24（rs2307805）、InDel-25（rs2308232）、InDel-26（rs2067373）、InDel-27（rs3049448）、InDel-28（rs2307537）、InDel-29（rs3032356）、InDel-30（rs1610878）、InDel-31（rs2307561）、InDel-32（rs34999022）、InDel-33（rs2308278）、InDel-34（rs3034941）、InDel-35（rs34543832）。（注：括号中的rs号表示该位点在dbSNP数据库的编号）。本发明人经过深入的研究，发现该35个InDel位点在中国汉族、回族、蒙古族、藏族、维吾尔族人群中具有高度的遗传多态性和较高的鉴别力。

一、本发明复合扩增系统中35个InDel位点的选择

(1) InDel位点的筛选原则

InDel位点的筛选原则如下：

Figure 2010102529172100002DEST_PATH_IMAGE001

InDel等位基因片段长度差异(插入或缺失的碱基)≥3bp且＜30bp。

② 为尽可能避免筛选的InDel位点与某些特殊的疾病表型相关联，限制其为内含子区域；

③ 数据库中该位点的最低等位基因频率(Minor Allele Frequency, MAF)介于0.30～0.50(以东亚人群为基准，兼顾其他人种)

④ 散布于人类全部22条常染色体；

同一条染色体上的InDel位点间距不小于5Mb；

总位点数不少于30个，累积个体识别率达到0.9999以上；

同一条染色体上InDel位点不能形成连锁，且在中国汉族人群中的分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡。

本发明的35个InDel位点散布于22条常染色体上、互不连锁。

(2) 多重PCR引物的荧光标记

由于需要对35个InDel位点进行复合扩增，并对等位基因片段长度差异和扩增子长度的限制，多重PCR体系构建时要进行多重荧光标记本发明采用5色荧光标记，在选择荧光标记时考虑以下要素：

① 每种荧光素的激发光光谱间隔应尽可能均匀，且其间隔最好是不少于20nm，以达到最佳的分离效果；

② 一种荧光素的激发光光谱与另一种荧光素的吸收光光谱尽可能不重叠，以减少相互间的干扰；

③ 荧光素可通过商业途径获得，不受专利保护；

④ 由于未来的应用主要依据美国AB公司的遗传分析仪，要求所选择的荧光素在美国AB公司的遗传分析仪上适用。

本发明的35个InDel位点分别采用FAM、HEX、TAMRA和ROX四种不同颜色的荧光素标记（第五种荧光用于内标的标记如LIZ、SIZ等）。具体为：FAM标记InDel-03、InDel-07、InDel-09、InDel-10、InDel-13、InDel-17、InDel-19、InDel-21、InDel-22、InDel-25、InDel-26和InDel-35，共12个位点；HEX标记InDel-04、InDel-06、InDel-08、InDel-11、InDel-18、InDel-23、InDel-28、InDel-33和InDel-34，共9个位点；TAMRA标记InDel-01、InDel-05、InDel-12、InDel-15、InDel-16、InDel-20、InDel-24和InDel-30，共8个位点；ROX标记InDel-02、InDel-14、InDel-27、InDel-29、InDel-31和InDel-32，共6个位点。

本发明人的研究表明，可以在一个PCR单管中实现复合扩增，扩增效率高，无相互干扰。

二、本发明体系中35个InDel位点的复合扩增与检测

本发明的复合扩增系统是采用复合PCR技术在同一PCR反应管中同时扩增上述35个InDel位点，从而可同时分析多个常染色体的InDel位点。

复合扩增体系中的InDel位点被位于该位点两侧的一对引物扩增，其中每对引物中的引物正链的5′端用相应的荧光素标记即用FAM、HEX、TAMRA和ROX标记，全部35个InDel位点的引物按照比例混合在一个试管中。

1、PCR反应体系

反应体系总体积为12-25μL，包括PCR反应缓冲液（Buffer）1-2.5μL，引物混合物（Primer pair Mix）1-3μL，DNA聚合酶1-2.5 U，模板DNA1-3μL，超纯水补足至总体积。

2、PCR扩增参数

在9700或其他型号的PCR仪上进行扩增，多重PCR扩增参数为：95℃ 11min；94℃ 30sec、57℃ 90sec、72℃、90sec，共进行30个循环；60℃延伸60min。

3、结果分析

① 样品制备

混匀后瞬时离心，在96孔板中，每孔加10.0μL混合液，再加PCR产物1μL，短暂离心，95℃变性4 min，放置冰盒中冷却3 min，装入3100或3130等型号遗传分析仪中进行电泳。

② 电泳参数的设置

按照遗传分析仪的操作说明书进行样本表的编写，在样本表中，电泳参数的设置如下：Dye Set 为G5，Run Module选择“GeneScan36vb_POP4 Default”。

③ 结果分析

采用GeneMapper ID v3.1软件或GeneMapper ID v3.2或GeneMapper ID v3.3。

本发明的荧光标记的InDel位点复合扩增系统可以制成试剂盒，为法医学亲权鉴定、个体识别等领域提供一种新的检测系统，为人类学、医学遗传学等领域提供新的技术手段。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、高灵敏度：本发明研制的35个InDel位点荧光复合扩增系统在模板量为200pg时仍可检出全部的35个InDel位点。

2、高个体识别率：本发明研制的这35个InDel位点在上述5个民族的累积个体识别效能(CDP值)分别达到了0.999999999999841、0.999999999999690、0.999999999999709、0.999999999999772和0.999999999999854，这表明该InDel系统完全适用于中国这5个主要民族个体的法医学DNA鉴定。

3、本发明所研制的35个InDel位点荧光复合扩增系统已在本实验室用于实际检案，结果表明该系统多态性高、稳定性、重复性好，分型结果准确，能满足实际需要。

4、本发明在国内首先研制出一组35个InDel位点在单一反应管中实现复合扩增的五色荧光标记复合扩增检测系统。

5、本发明的荧光标记引物复合扩增技术快速、简便，PCR产物可用310、3100、3130等遗传分析仪电泳，结果自动分析，能标准化，可以保证不同实验室数据比较的正确性。

6、本发明可制备一套试剂盒，可进行商品化，可以填补国内没有InDel位点荧光复合扩增试剂盒的空白，也可补充目前STR荧光检测试剂盒的不足，作为有中国特色的InDel位点荧光复合扩增试剂盒，可用于三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别、疾病诊断和人类学等领域中。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明作进一步阐述，该实施例仅仅是用于举例说明的目的而决非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1 应用InDel位点荧光复合扩增系统进行亲子鉴定和个体识别

操作步骤：

1、DNA提取

Chelex-100法提取基因组DNA：在1.5mL离心管中加1mL 双蒸水,然后加入3μL全血或3×3mm血斑，小心混匀;室温保温30min, 间歇振荡；14,000 r/min离心5min；小心移去上清液。在沉淀中加入10% Chelex 100 (100mesh) 200μL；56℃保温30min；高速振荡5-10Sec；沸水浴8min；14,000 r/min离心5min，取上清液用于PCR扩增。

2、PCR扩增

反应总体积为15.0μL，包括PCR反应缓冲液（Buffer）7.5μL，引物混合物（Primer pair Mix）3.0μL，DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 3.0μL，超纯水1μL。

上述引物混合物中，各个基因座的引物序列及其荧光标记如表1所示。

表1 InDel位点及其引物序列和荧光标记

InDel位点	引物序列	荧光标记
			InDel-01	F: 5’-AGATGAAGGTGGGGCTATTGAGAA-3’	TAMRA
	R: 5’-TGCATAAAACCCTATTAAGCTATGAAAG-3’
			InDel-02	F: 5’-ATGCTGGAAAGGTGGTGCCTAAACT-3’	ROX
	R: 5’-TCCTTGAAATAGTCCTTGGGCTGGT-3’
			InDel-03	F: 5’-CTTTGTCCAAGAAGTTGCCTGAGTA-3’	FAM
	R: 5’-TGCATGGAATTTCTCCATTTGAGAC-3’
			InDel-04	F: 5’-AGTCTGTTAGTTCTGTGGCTGTCAA-3’	HEX
	R: 5’-TTTCTTGCCTCTTCACTTTTGCTAG-3’
			InDel-05	F: 5’-TCCAAGTAAGAATCAAAATAATGAGACC-3’	TAMRA
	R: 5’-TTCAAAACCAAACTGTCCAGAACG-3’
			InDel-06	F: 5’-GTATAGATGATGCTGATTAAATCTTTGG-3’
	R: 5’-CATGAAGCTAAGTGTACAGGATCAAAT-3’	HEX
			InDel-07	F: 5’-TTCCCCATTCCTACTCTGACTCCT-3’	FAM
	R: 5’-AAAATATGCCCTTGATTATGTTGC-3’
			InDel-08	F: 5’-CCCATACACCACCATCCCACAT-3’	HEX
	R: 5’-GGAAGGGTAAAATGCCACAAGC-3’
			InDel-09	F: 5’-TAGAAAGAGGTTCTGCCCAAGTTGTT-3’	FAM
	R: 5’-ATAAGCAAATTCCCACTTATACAGCA-3’
			InDel-10	F: 5’-CTAAGATAGGTTAAGTAATTTGCCGAAGT-3’	FAM
	R: 5’-GGATTTTGGAATCAAGTAGAGCTGG-3’
			InDel-11	F: 5’-TATTGTATTATTTAGGGATCACGCAG-3’	HEX
	R: 5’-AAGTGTCTCCTCGTGTCTTTCGTAAC-3’
			InDel-12	F: 5’-TTGTTGCCAAATACTGTCAATGCTAC-3’	TAMRA
	R: 5’-CAGAACTACCAGGGCTGTAAGTTCTG-3’
			InDel-13	F: 5’-ATCATTGTGGCTTCACTACAGATAATA-3’	FAM
	R: 5’-TTTGATTAGCTTTAACTTCCTCACTTT-3’
			InDel-14	F: 5’-TAGGTGGCTACCGTAAATCAAGTTCTCA-3’	ROX
	R: 5’-ATCTGTTTGGATGTTTTGTTATTGCAGG-3’
			InDel-15	F: 5’-CTACCAATTAACAGTCTCAAAGTTTTACA-3’	TAMRA
	R: 5’-GGCAAATATGTATACTTTGATTATTACTCAT-3’
			InDel-16	F: 5’-GTTTGGCTTTGTTTGATTTCTGTTG-3’
	R: 5’-TGGTGGTCAATGCCTTTGTTCAG-3’	TAMRA
			InDel-17	F: 5’-GGCCCAGATGTTGGTCCATAGTCTC-3’
	R: 5’-TGTGCCTAGTCCTGCTCTGAGATAA-3’	FAM
			InDel-18	F: 5’-ACAAAGACATCAAAGTAGCTTCCAAAATC-3’	HEX
	R: 5’-GTATTTACATAAGCCTCCTTCTGTGGTCA-3’
			InDel-19	F: 5’-TTTTACTGAGATGCCCAACCTGC-3’	FAM
	R: 5’-CAATGATTTTGTCACCGTTTCCT-3’
			InDel-20	F: 5’-GCACCTCTGGGGTTACAGGTACA-3’
	R: 5’-TGACTTCTGGCTCATCGCCTTAC-3’	TAMRA
			InDel-21	F: 5’-AAGGAGGGCAGGGCTCATAG-3’	FAM
	R: 5’-CTTCTGGCGGACCACAAACA-3’
			InDel-22	F: 5’-TGTCTTTCTCCCCTTTAAGTTCTGAG-3’	FAM
	R: 5’-TTCTGTAATCCTCTTGCTGTCCTTCT-3’
			InDel-23	F: 5’-AAATCTCATAGTAAGGCAGGACAGG-3’	HEX
	R: 5’-GAGGTGGTGACTATCCCTTTGGTAC-3’
			InDel-24	F: 5’-AGTAATTGAGCCATACTACCCGAACT-3’	TAMRA
	R: 5’-AATCCATGTAAAACCTGATAACCCA-3’
			InDel-25	F: 5’-TGTCCTTTGGGTTAATCTAAATGGT-3’	FAM
	R: 5’-TTACTTCCTATTCTCCTTGCTTCGT-3’
			InDel-26	F: 5’-TAACTGACATGTAGCTAATACTGATACGCAC-3’	FAM
	R: 5’-AGAAAGGAAATAACATGTACCAGCAATTC-3’
			InDel-27	F: 5’-GGAAACCTATAAGCCAGGAAGTAGGA-3’
	R: 5’-ACAAATATGTAGAGTGCAAGGGAGCA-3’	ROX
			InDel-28	F: 5’-TCAAAGCACTACGTGTAACAGCAAA-3’	HEX
	R: 5’-ACATTCCAGGCGAAGACAGAAGATA-3’
			InDel-29	F: 5’-ATGGAGCCACTTCCTTAACCCCTCA-3’	ROX
	R: 5’-CCATTCAATTGCCTTTGACCCACA-3’
			InDel-30	F: 5’-TAGGCAATAGTAAGAAGCACAGATACC-3’	TAMRA
	R: 5’-CTCGGCAGTTAATGACAGTGATGT-3’
			InDel-31	F: 5’-AAGCAAAGAATATCATTCCTGCACTGC-3’	ROX
	R: 5’-GGGCCACAAATTTTATCTATCTCATCC-3’
			InDel-32	F: 5’-CTAAAAGGCTAAGATTAACTAATGGCTCT-3’	ROX
	R: 5’-AAAGGAAATGTAGTACAGAAAGGTAACAT-3’
			InDel-33	F: 5’-AAGACAGTGAGGAGTAGATGTTCCAGAC-3’	HEX
	R: 5’-GCTTCCCTTTGATTTTATTACCGTCTAT-3’
			InDel-34	F: 5’-CCACACAAAAGGAACTGTAGATTTATTACT-3’	HEX
	R: 5’-CCTAGGCTGGATTCGGCATCTC-3’
			InDel-35	F: 5’-ACAACAGAGCAGAGGTCTTCCAGC-3’	FAM
	R: 5’-CTGCATTCTTCAAATGAGATTACTTTTC-3’

上述35对引物依次记为SEQ.ID.NO.1 --- SEQ.ID.NO.35。

3、PCR扩增参数：在9700 PCR仪上进行扩增，PCR扩增参数为：95℃ 11min；94℃ 30sec、57℃ 90sec、72℃、90sec，共进行30个循环；60℃延伸60min。

4、3100遗传分析仪电泳：按照遗传分析仪的操作说明书进行样本表的编写，在样本表中，电泳参数的设置如下：Dye Set 为G5，Run Module选择“GeneScan36vb_POP4 Default”。

本发明的35个InDel位点已经在申请人实验室应用于群体遗传学调查并获得中国汉族、回族、维吾尔族、蒙古族、藏族人群的分型结果，证明这些位点的多态性较高，适合于中国人群的检测，并应用到实际检案中取得了理想的结果。

SEQ.ID.NO.1 F: 5’-AGATGAAGGTGGGGCTATTGAGAA-3’

R: 5’-TGCATAAAACCCTATTAAGCTATGAAAG-3’

SEQ.ID.NO.2 F: 5’-ATGCTGGAAAGGTGGTGCCTAAACT-3’

R: 5’-TCCTTGAAATAGTCCTTGGGCTGGT-3’

SEQ.ID.NO.3 F: 5’-CTTTGTCCAAGAAGTTGCCTGAGTA-3’

R: 5’-TGCATGGAATTTCTCCATTTGAGAC-3’

SEQ.ID.NO.4 F: 5’-AGTCTGTTAGTTCTGTGGCTGTCAA-3’

R: 5’-TTTCTTGCCTCTTCACTTTTGCTAG-3’

SEQ.ID.NO.5 F: 5’-TCCAAGTAAGAATCAAAATAATGAGACC-3’

R: 5’-TTCAAAACCAAACTGTCCAGAACG-3’

SEQ.ID.NO.6 F: 5’-GTATAGATGATGCTGATTAAATCTTTGG-3’

R: 5’-CATGAAGCTAAGTGTACAGGATCAAAT-3’

SEQ.ID.NO.7 F: 5’-TTCCCCATTCCTACTCTGACTCCT-3’

R: 5’-AAAATATGCCCTTGATTATGTTGC-3’

SEQ.ID.NO.8 F: 5’-CCCATACACCACCATCCCACAT-3’

R: 5’-GGAAGGGTAAAATGCCACAAGC-3’

SEQ.ID.NO.9 F: 5’-TAGAAAGAGGTTCTGCCCAAGTTGTT-3’

R: 5’-ATAAGCAAATTCCCACTTATACAGCA-3’

SEQ.ID.NO.10 F: 5’-CTAAGATAGGTTAAGTAATTTGCCGAAGT-3’

R: 5’-GGATTTTGGAATCAAGTAGAGCTGG-3’

SEQ.ID.NO.11 F: 5’-TATTGTATTATTTAGGGATCACGCAG-3’

R: 5’-AAGTGTCTCCTCGTGTCTTTCGTAAC-3’

SEQ.ID.NO.12 F: 5’-TTGTTGCCAAATACTGTCAATGCTAC-3’

R: 5’-CAGAACTACCAGGGCTGTAAGTTCTG-3’

SEQ.ID.NO.13 F: 5’-ATCATTGTGGCTTCACTACAGATAATA-3’

R: 5’-TTTGATTAGCTTTAACTTCCTCACTTT-3’

SEQ.ID.NO.14 F: 5’-TAGGTGGCTACCGTAAATCAAGTTCTCA-3’

R: 5’-ATCTGTTTGGATGTTTTGTTATTGCAGG-3’

SEQ.ID.NO.15 F: 5’-CTACCAATTAACAGTCTCAAAGTTTTACA-3’

R: 5’-GGCAAATATGTATACTTTGATTATTACTCAT-3’

SEQ.ID.NO.16 F: 5’-GTTTGGCTTTGTTTGATTTCTGTTG-3’

R: 5’-TGGTGGTCAATGCCTTTGTTCAG-3’

SEQ.ID.NO.17 F: 5’-GGCCCAGATGTTGGTCCATAGTCTC-3’

R: 5’-TGTGCCTAGTCCTGCTCTGAGATAA-3’

SEQ.ID.NO.18 F: 5’-ACAAAGACATCAAAGTAGCTTCCAAAATC-3’

R: 5’-GTATTTACATAAGCCTCCTTCTGTGGTCA-3’

SEQ.ID.NO.19 F: 5’-TTTTACTGAGATGCCCAACCTGC-3’

R: 5’-CAATGATTTTGTCACCGTTTCCT-3’

SEQ.ID.NO.20 F: 5’-GCACCTCTGGGGTTACAGGTACA-3’

R: 5’-TGACTTCTGGCTCATCGCCTTAC-3’

SEQ.ID.NO.21 F: 5’-AAGGAGGGCAGGGCTCATAG-3’

R: 5’-CTTCTGGCGGACCACAAACA-3’

SEQ.ID.NO.22 F: 5’-TGTCTTTCTCCCCTTTAAGTTCTGAG-3’

R: 5’-TTCTGTAATCCTCTTGCTGTCCTTCT-3’

SEQ.ID.NO.23 F: 5’-AAATCTCATAGTAAGGCAGGACAGG-3’

R: 5’-GAGGTGGTGACTATCCCTTTGGTAC-3’

SEQ.ID.NO.24 F: 5’-AGTAATTGAGCCATACTACCCGAACT-3’

R: 5’-AATCCATGTAAAACCTGATAACCCA-3’

SEQ.ID.NO.25 F: 5’-TGTCCTTTGGGTTAATCTAAATGGT-3’

R: 5’-TTACTTCCTATTCTCCTTGCTTCGT-3’

SEQ.ID.NO.26 F: 5’-TAACTGACATGTAGCTAATACTGATACGCAC-3’

R: 5’-AGAAAGGAAATAACATGTACCAGCAATTC-3’

SEQ.ID.NO.27 F: 5’-GGAAACCTATAAGCCAGGAAGTAGGA-3’

R: 5’-ACAAATATGTAGAGTGCAAGGGAGCA-3’

SEQ.ID.NO.28 F: 5’-TCAAAGCACTACGTGTAACAGCAAA-3’

R: 5’-ACATTCCAGGCGAAGACAGAAGATA-3’

SEQ.ID.NO.29 F: 5’-ATGGAGCCACTTCCTTAACCCCTCA-3’

R: 5’-CCATTCAATTGCCTTTGACCCACA-3’

SEQ.ID.NO.30 F: 5’-TAGGCAATAGTAAGAAGCACAGATACC-3’

R: 5’-CTCGGCAGTTAATGACAGTGATGT-3’

SEQ.ID.NO.31 F: 5’-AAGCAAAGAATATCATTCCTGCACTGC-3’

R: 5’-GGGCCACAAATTTTATCTATCTCATCC-3’

SEQ.ID.NO.32 F: 5’-CTAAAAGGCTAAGATTAACTAATGGCTCT-3’

R: 5’-AAAGGAAATGTAGTACAGAAAGGTAACAT-3’

SEQ.ID.NO.33 F: 5’-AAGACAGTGAGGAGTAGATGTTCCAGAC-3’

R: 5’-GCTTCCCTTTGATTTTATTACCGTCTAT-3’

SEQ.ID.NO.34 F: 5’-CCACACAAAAGGAACTGTAGATTTATTACT-3’

R: 5’-CCTAGGCTGGATTCGGCATCTC-3’

SEQ.ID.NO.35 F: 5’-ACAACAGAGCAGAGGTCTTCCAGC-3’

R: 5’-CTGCATTCTTCAAATGAGATTACTTTTC-3’

SEQUENCE LISTING

<110> 司法部司法鉴定科学技术研究所

<120> 一种荧光标记的插入缺失遗传多态性位点复合扩增系统及其应用

<130> 001

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 1

agatgaaggt ggggctattg agaatgcata aaaccctatt aagctatgaa ag 52

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 2

atgctggaaa ggtggtgcct aaacttcctt gaaatagtcc ttgggctggt 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 3

ctttgtccaa gaagttgcct gagtatgcat ggaatttctc catttgagac 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 4

agtctgttag ttctgtggct gtcaatttct tgcctcttca cttttgctag 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 5

tccaagtaag aatcaaaata atgagacctt caaaaccaaa ctgtccagaa cg 52

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 6

gtatagatga tgctgattaa atctttggca tgaagctaag tgtacaggat caaat 55

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 7

ttccccattc ctactctgac tcctaaaata tgcccttgat tatgttgc 48

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 8

cccatacacc accatcccac atggaagggt aaaatgccac aagc 44

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 9

tagaaagagg ttctgcccaa gttgttataa gcaaattccc acttatacag ca 52

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 10

ctaagatagg ttaagtaatt tgccgaagtg gattttggaa tcaagtagag ctgg 54

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 11

tattgtatta tttagggatc acgcagaagt gtctcctcgt gtctttcgta ac 52

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 12

ttgttgccaa atactgtcaa tgctaccaga actaccaggg ctgtaagttc tg 52

<210> 13

<211> 54

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 13

atcattgtgg cttcactaca gataatattt gattagcttt aacttcctca cttt 54

<210> 14

<211> 56

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 14

taggtggcta ccgtaaatca agttctcaat ctgtttggat gttttgttat tgcagg 56

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 15

ctaccaatta acagtctcaa agttttacag gcaaatatgt atactttgat tattactcat 60

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 16

gtttggcttt gtttgatttc tgttgtggtg gtcaatgcct ttgttcag 48

<210> 17

<211> 50

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 17

ggcccagatg ttggtccata gtctctgtgc ctagtcctgc tctgagataa 50

<210> 18

<211> 58

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 18

acaaagacat caaagtagct tccaaaatcg tatttacata agcctccttc tgtggtca 58

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 19

ttttactgag atgcccaacc tgccaatgat tttgtcaccg tttcct 46

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 20

gcacctctgg ggttacaggt acatgacttc tggctcatcg ccttac 46

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 21

aaggagggca gggctcatag cttctggcgg accacaaaca 40

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 22

tgtctttctc ccctttaagt tctgagttct gtaatcctct tgctgtcctt ct 52

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 23

aaatctcata gtaaggcagg acagggaggt ggtgactatc cctttggtac 50

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 24

agtaattgag ccatactacc cgaactaatc catgtaaaac ctgataaccc a 51

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 25

tgtcctttgg gttaatctaa atggtttact tcctattctc cttgcttcgt 50

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 26

taactgacat gtagctaata ctgatacgca cagaaaggaa ataacatgta ccagcaattc 60

<210> 27

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 27

ggaaacctat aagccaggaa gtaggaacaa atatgtagag tgcaagggag ca 52

<210> 28

<211> 50

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 28

tcaaagcact acgtgtaaca gcaaaacatt ccaggcgaag acagaagata 50

<210> 29

<211> 49

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 29

atggagccac ttccttaacc cctcaccatt caattgcctt tgacccaca 49

<210> 30

<211> 51

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 30

taggcaatag taagaagcac agataccctc ggcagttaat gacagtgatg t 51

<210> 31

<211> 54

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 31

aagcaaagaa tatcattcct gcactgcggg ccacaaattt tatctatctc atcc 54

<210> 32

<211> 58

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 32

ctaaaaggct aagattaact aatggctcta aaggaaatgt agtacagaaa ggtaacat 58

<210> 33

<211> 56

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 33

aagacagtga ggagtagatg ttccagacgc ttccctttga ttttattacc gtctat 56

<210> 34

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 34

ccacacaaaa ggaactgtag atttattact cctaggctgg attcggcatc tc 52

<210> 35

<211> 52

<212> DNA

<213> InDel位点及其引物序列和荧光标记

<400> 35

acaacagagc agaggtcttc cagcctgcat tcttcaaatg agattacttt tc 52

Claims

1.一种荧光标记的InDel位点复合扩增系统，其特征在于所述的InDel位点为如下35个：InDel-01（rs2307507）、InDel-02（rs2307963）、InDel-03（rs2308276）、InDel-04（rs2307975）、InDel-05（rs2308292）、InDel-06（rs1160953）、InDel-07（rs1160980）、InDel-08（rs1610903）、InDel-09（rs1610949）、InDel-10（rs1611088）、InDel-11（rs2307661）、InDel-12（rs2308116）、InDel-13（rs2308139）、InDel-14（rs1610906）、InDel-15（rs16458）、InDel-16（rs2307783）、InDel-17（rs10666410）、InDel-18（rs34535242）、InDel-19（rs2307850）、InDel-20（rs16721）、InDel-21（rs35248926）、InDel-22（rs35833136）、InDel-23（rs16660）、InDel-24（rs2307805）、InDel-25（rs2308232）、InDel-26（rs2067373）、InDel-27（rs3049448）、InDel-28（rs2307537）、InDel-29（rs3032356）、InDel-30（rs1610878）、InDel-31（rs2307561）、InDel-32（rs34999022）、InDel-33（rs2308278）、InDel-34（rs3034941）、InDel-35（rs34543832），括号中的rs号表示该位点在dbSNP数据库的编号。

2.根据权利要求1所述的荧光标记InDel位点复合扩增系统，其特征在于所述35个InDel位点是在一个复合扩增体系中同时扩增。

3.根据权利要求1所述的荧光标记InDel位点复合扩增系统，其特征在于所述35个InDel位点引物分别用FAM、HEX、TAMRA和ROX四种荧光素标记。

4.根据权利要求3所述的荧光标记InDel位点复合扩增系统，其特征在于四种荧光素标记标记InDel位点引物，具体如下：FAM标记InDel-03、InDel-07、InDel-09、InDel-10、InDel-13、InDel-17、InDel-19、InDel-21、InDel-22、InDel-25、InDel-26和InDel-35；HEX标记InDel-04、InDel-06、InDel-08、InDel-11、InDel-18、InDel-23、InDel-28、InDel-33和InDel-34；TAMRA标记InDel-01、InDel-05、InDel-12、InDel-15、InDel-16、InDel-20、InDel-24和InDel-30；ROX标记InDel-02、InDel-14、InDel-27、InDel-29、InDel-31和InDel-32。

5.根据权利要求4所述的荧光标记的InDel位点复合扩增系统，其特征在于InDel位点及其引物序列和荧光标记如下：

InDel位点引物序列荧光标记 InDel-01 F: 5’-AGATGAAGGTGGGGCTATTGAGAA-3’ TAMRA R: 5’-TGCATAAAACCCTATTAAGCTATGAAAG-3’ InDel-02 F: 5’-ATGCTGGAAAGGTGGTGCCTAAACT-3’ ROX R: 5’-TCCTTGAAATAGTCCTTGGGCTGGT-3’ InDel-03 F: 5’-CTTTGTCCAAGAAGTTGCCTGAGTA-3’ FAM R: 5’-TGCATGGAATTTCTCCATTTGAGAC-3’ InDel-04 F: 5’-AGTCTGTTAGTTCTGTGGCTGTCAA-3’ HEX R: 5’-TTTCTTGCCTCTTCACTTTTGCTAG-3’ InDel-05 F: 5’-TCCAAGTAAGAATCAAAATAATGAGACC-3’ TAMRA R: 5’-TTCAAAACCAAACTGTCCAGAACG-3’ InDel-06 F: 5’-GTATAGATGATGCTGATTAAATCTTTGG-3’ R: 5’-CATGAAGCTAAGTGTACAGGATCAAAT-3’ HEX InDel-07 F: 5’-TTCCCCATTCCTACTCTGACTCCT-3’ FAM R: 5’-AAAATATGCCCTTGATTATGTTGC-3’ InDel-08 F: 5’-CCCATACACCACCATCCCACAT-3’ HEX R: 5’-GGAAGGGTAAAATGCCACAAGC-3’ InDel-09 F: 5’-TAGAAAGAGGTTCTGCCCAAGTTGTT-3’ FAM R: 5’-ATAAGCAAATTCCCACTTATACAGCA-3’ InDel-10 F: 5’-CTAAGATAGGTTAAGTAATTTGCCGAAGT-3’ FAM R: 5’-GGATTTTGGAATCAAGTAGAGCTGG-3’ InDel-11 F: 5’-TATTGTATTATTTAGGGATCACGCAG-3’ HEX R: 5’-AAGTGTCTCCTCGTGTCTTTCGTAAC-3’ InDel-12 F: 5’-TTGTTGCCAAATACTGTCAATGCTAC-3’ TAMRA R: 5’-CAGAACTACCAGGGCTGTAAGTTCTG-3’ InDel-13 F: 5’-ATCATTGTGGCTTCACTACAGATAATA-3’ FAM R: 5’-TTTGATTAGCTTTAACTTCCTCACTTT-3’ InDel-14 F: 5’-TAGGTGGCTACCGTAAATCAAGTTCTCA-3’ ROX R: 5’-ATCTGTTTGGATGTTTTGTTATTGCAGG-3’ InDel-15 F: 5’-CTACCAATTAACAGTCTCAAAGTTTTACA-3’ TAMRA R: 5’-GGCAAATATGTATACTTTGATTATTACTCAT-3’ InDel-16 F: 5’-GTTTGGCTTTGTTTGATTTCTGTTG-3’ R: 5’-TGGTGGTCAATGCCTTTGTTCAG-3’ TAMRA InDel-17 F: 5’-GGCCCAGATGTTGGTCCATAGTCTC-3’ R: 5’-TGTGCCTAGTCCTGCTCTGAGATAA-3’ FAM InDel-18 F: 5’-ACAAAGACATCAAAGTAGCTTCCAAAATC-3’ HEX R: 5’-GTATTTACATAAGCCTCCTTCTGTGGTCA-3’ InDel-19 F: 5’-TTTTACTGAGATGCCCAACCTGC-3’ FAM R: 5’-CAATGATTTTGTCACCGTTTCCT-3’ InDel-20 F: 5’-GCACCTCTGGGGTTACAGGTACA-3’ R: 5’-TGACTTCTGGCTCATCGCCTTAC-3’ TAMRA InDel-21 F: 5’-AAGGAGGGCAGGGCTCATAG-3’ FAM R: 5’-CTTCTGGCGGACCACAAACA-3’ InDel-22 F: 5’-TGTCTTTCTCCCCTTTAAGTTCTGAG-3’ FAM R: 5’-TTCTGTAATCCTCTTGCTGTCCTTCT-3’ InDel-23 F: 5’-AAATCTCATAGTAAGGCAGGACAGG-3’ HEX R: 5’-GAGGTGGTGACTATCCCTTTGGTAC-3’ InDel-24 F: 5’-AGTAATTGAGCCATACTACCCGAACT-3’ TAMRA R: 5’-AATCCATGTAAAACCTGATAACCCA-3’ InDel-25 F: 5’-TGTCCTTTGGGTTAATCTAAATGGT-3’ FAM R: 5’-TTACTTCCTATTCTCCTTGCTTCGT-3’ InDel-26 F: 5’-TAACTGACATGTAGCTAATACTGATACGCAC-3’ FAM R: 5’-AGAAAGGAAATAACATGTACCAGCAATTC-3’ InDel-27 F: 5’-GGAAACCTATAAGCCAGGAAGTAGGA-3’ R: 5’-ACAAATATGTAGAGTGCAAGGGAGCA-3’ ROX InDel-28 F: 5’-TCAAAGCACTACGTGTAACAGCAAA-3’ HEX R: 5’-ACATTCCAGGCGAAGACAGAAGATA-3’ InDel-29 F: 5’-ATGGAGCCACTTCCTTAACCCCTCA-3’ ROX R: 5’-CCATTCAATTGCCTTTGACCCACA-3’ InDel-30 F: 5’-TAGGCAATAGTAAGAAGCACAGATACC-3’ TAMRA R: 5’-CTCGGCAGTTAATGACAGTGATGT-3’ InDel-31 F: 5’-AAGCAAAGAATATCATTCCTGCACTGC-3’ ROX R: 5’-GGGCCACAAATTTTATCTATCTCATCC-3’ InDel-32 F: 5’-CTAAAAGGCTAAGATTAACTAATGGCTCT-3’ ROX R: 5’-AAAGGAAATGTAGTACAGAAAGGTAACAT-3’ InDel-33 F: 5’-AAGACAGTGAGGAGTAGATGTTCCAGAC-3’ HEX R: 5’-GCTTCCCTTTGATTTTATTACCGTCTAT-3’ InDel-34 F: 5’-CCACACAAAAGGAACTGTAGATTTATTACT-3’ HEX R: 5’-CCTAGGCTGGATTCGGCATCTC-3’ InDel-35 F: 5’-ACAACAGAGCAGAGGTCTTCCAGC-3’ FAM R: 5’-CTGCATTCTTCAAATGAGATTACTTTTC-3’

。

6.一种基于权利要求1—5之一所述荧光标记的InDel位点复合扩增系统的试剂盒，其特征在于包括：PCR反应体系，反应体系总体积为12-25μL，其中，PCR反应缓冲液 1-2.5μL，引物混合物1-3μL，DNA聚合酶1-2.5 U，模板DNA1-3μL，其余为超纯水；

所述引物混合物包括InDel位点及其引物序列和荧光标记，具体对应如下：

。

7.根据权利要求1至5之一所述的荧光标记的InDel位点复合扩增系统，在三联体亲子鉴定、二联体亲子鉴定、祖孙鉴定、同胞鉴定以及个体识别中的应用。