CN114438173B - 同时检测60个InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时检测60个InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及应用。包括InDel分子标记组合和InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒。所述试剂盒可同时检测59个InDel遗传多态性位点及Amelogenin性别鉴定位点，是目前用毛细管电泳法一次反应同时检测常染色体InDel位点、Y染色体InDel位点以及性别鉴定位点个数最多的复合扩增检测试剂盒；试剂盒所采用的扩增体系，扩增产物的长度均小于220bp，片段较短，适用对高度降解的检材进行分型判别，因此适用于人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别等应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种同时检测60个InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及应用。
背景技术
基因组差异主要包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，短串联重复序列(short tandem repeat，STR)，插入缺失(insertion and deletion，InDel)等形式，目前法医学应用研究主要集中在STR的研究，随着千人基因组计划和个人基因组计划等工程的研究进展，目前在基因组定位的SNP已达千万以上。由于SNP具有的高密度、低突变率和分型方法的高通量等特性，使SNP也成为法医学应用研究热点。与STR和SNP研究相比，InDel受到关注相对较小，InDel是在DNA序列中，因1个或几个碱基对的插入、缺失或移位而产生的多态性。因为SNP和STR特征以及分型技术同样适用于InDel的研究，所以InDel受到了越来越多的国内外法医学者的共同关注。
InDel多态性是人类基因组中一种特殊类型的二等位基因遗传标记，表现为基因组中插入或缺失了不同大小的小片段。InDel作为新一代的法医遗传学鉴定标记，兼具STR和SNP的优点。与STR相比，InDel突变频率较低，约为10-8，比STR小几个数量级，相对比较稳定
目前市面上已有少量应用InDel遗传标记辅助检测的产品，但是由于检测位点数量不足，所以这些产品的检测精度仍然难以让用户满意。为此，开发一款适用于中国人群、包含位于不同染色体上、更多数目的InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，对于我国法医学、群体遗传学等研究及应用具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供同时检测60个InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
本发明的第一方面在于提供了一种用于人类染色体DNA分型的InDel分子标记组合。所述InDel分子标记组合包括57个常染色体InDel位点、2个Y染色体InDel位点以及1个性别鉴定位点；InDel位点包括：rs34421865、rs3076465、rs34287950、rs151335218、rs5787309、rs67405073、rs60867863、rs71852971、rs769299、rs10590825、rs79225518、rs140683187、rs57981446、rs145191158、rs10626599、rs112879447、rs10607699、rs35309403、rs145577149、rs113011930、rs35453727、rs5897566、rs1160980、rs77206391、rs35464887、rs67100350、rs538690481、rs67939200、rs66739142、rs3217112、rs59841142、rs145010051、rs66477007、rs142221201、rs67426579、rs145941537、rs67365630、rs3064355、rs60564093、rs34076006、rs3834231、rs61490765、rs72085595、rs76158822、rs67487831、rs66595817、rs35065898、rs76041101、rs199815934、rs34529638、rs67264216、rs3067397、rs11277697、rs72031009、rs33971783、rs146875868、rs34419736、rs77635204、rs561160795；1个性别鉴定位点为Amel。所述InDel分子标记组合综合了我国人群的生活环境、种族起源、表型特征差异等综合数据，切合我国不同地域人群的外形特征、生理指标，可以为检测样本的来源推断提供准确的数据支持。
本发明的第二方面在于提供一种InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒。所述试剂盒包括扩增前述InDel分子标记组合的引物混合物。通过复合扩增待检测样本中的59个InDel遗传多态性位点及Amelogenin性别鉴定位点，能够提供更多的样本来源信息，有助于提高判断精度。
进一步，各所述引物对中至少有一条引物的5’端标记有荧光染料。将所述引物混合物分为五组，同一组标记相同的荧光染料，各组标记的荧光染料互不相同。这样的配置可以获得五色荧光系统，提高鉴定效率。
所述引物混合物的具体引物信息及荧光染料分组如表1所示：
表1引物序列信息
进一步，所述试剂盒至少还包括Reaction Mix、热启动U-Taq酶、sdH2O等多重荧光PCR所需的试剂。所述Reaction Mix包括：Mg2+、dNTPs、Tris-HCl、BSA(牛血清白蛋白)、KCl。
所述试剂盒所检测的样本来自采集唾液(唾液斑)、毛发、人体组织、血液(血斑)、精液(精斑)等。可通过磁珠法、硅膜法或苯酚氯仿抽提法等方法进行提取及定量。其反应体系的复合扩增程序包括：95℃维持5min；94℃维持30s，60℃维持60s，62℃维持60s，28个循环；72℃维持20min。
本发明的第三方面在于提供上述InDel分子标记组合或InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒在人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别中的应用。
本发明包括以下有益效果：
1、可同时检测59个InDel遗传多态性位点及Amelogenin性别鉴定位点，是目前用毛细管电泳法一次反应同时检测常染色体InDel位点、Y染色体InDel位点以及性别鉴定位点个数最多的复合扩增检测试剂盒；
2、本发明建立的扩增体系，扩增产物的长度均小于220bp，片段较短，适用对高度降解的检材进行分型判别；
本发明开发的试剂盒适用于中国人群，为实际法医个人识别和亲子鉴定提供了新的辅助检测手段。
附图说明
图1是实施例1中InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒的检测位点排布图；
图2是实施例1中Allellic ladder电泳图谱；
图3是实施例2中退火温度梯度测试图谱；
图4是实施例4中对降解样品的等位基因检出率折线图；图中标记为“InDel60”的是实施例1所提供试剂盒的等位基因检出率，图中标记为“AGCU 21+1”的是市售试剂盒的等位基因检出率。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒的构建
(1)复合扩增检测系统位点的排布
从东亚人群中多态性高的常染色体InDel和Y染色体InDel作为候选位点，建立单位点检测体系。使用候选InDel位点分别在多个样本中进行分型，进一步筛选出单位点检验中多态性高、检验效果好的57个常染色体InDel位点、2个Y-InDel位点：rs34421865、rs3076465、rs34287950、rs151335218、rs5787309、rs67405073、rs60867863、rs71852971、rs769299、rs10590825、rs79225518、rs140683187、rs57981446、rs145191158、rs10626599、rs112879447、rs10607699、rs35309403、rs145577149、rs113011930、rs35453727、rs5897566、rs1160980、rs77206391、rs35464887、rs67100350、rs538690481、rs67939200、rs66739142、rs3217112、rs59841142、rs145010051、rs66477007、rs142221201、rs67426579、rs145941537、rs67365630、rs3064355、rs60564093、rs34076006、rs3834231、rs61490765、rs72085595、rs76158822、rs67487831、rs66595817、rs35065898、rs76041101、rs199815934、rs34529638、rs67264216、rs3067397、rs11277697、rs72031009、rs33971783、rs146875868、rs34419736、rs77635204、rs561160795。构建的检测位点排布如图1所示。
(2)复合扩增引物设计及反应体系中引物浓度的优化
引物设计时通过NCBI中的PRIMER-BLAST功能考虑引物扩增特异性，通过数据库中的其他物种基因组数据考虑所设计的这些基因座引物的种属特异性，采用多重PCR扩增体系，每组PCR的引物之间在混合体系中将存在一定的干扰，因此必须根据检测方法的需要，设计大量的引物对进行实验筛选，并通过专业的引物设计软件考虑多重PCR的多组引物之间的干扰和平衡，调整引物，从中选择出最佳的组合，经过不断的扩增—优化—扩增的循环实验，得到了特异高效扩增60个基因座的60对引物，其具体序列表1所示。对于同时扩增60个基因座的复合扩增体系，为实现较高的扩增均衡度，对复合扩增体系中60对引物的浓度配比不断调整，逐步提高其扩增的均衡度，最终得到最优的引物浓度。
(3)复合扩增体系和程序的建立
本实施例所述60个InDel标记的检测体系如表2所示：
表2检测体系及加样体积
其中Reaction Mix包括：Mg2+、dNTPs、Tris-HCl、BSA(牛血清白蛋白)和KCl；人基因组DNA来自采集唾液(唾液斑)、毛发、人体组织、血液(血斑)、精液(精斑)等，用磁珠法，硅膜法，苯酚氯仿抽提法等方法进行提取及定量。
扩增程序如表3所示：
表3复合扩增程序
(4)分析方法的建立与复合扩增产物的检测
本发明还提供了用于分析的等位基因分型标准物，等位基因分型标准物由各个基因座引物分别扩增对应等位基因片段的产物混合组成，图2为Allellic ladder电泳图谱。扩增产物在遗传分析仪上荧光检测，由去离子甲酰胺与分子量内标SIZ-500组成上样混合物，将1μL PCR产物或等位基因分型标准物与上样混合物混合，为了避免产生气泡，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，使用遗传分析仪进行电泳检测。建立3130系列、3100系列、3500系列遗传分析仪光谱校正(Matrix)文件；采用上述型号遗传分析仪对60个InDel遗传标记进行分型检测；通过毛细管电泳获得各标记不同等位基因的电泳迁移参数，并以此为基础，根据GeneMapper软件的格式要求编写相应的Bin文件和Panel文件，创建电泳分析方法。将InDel标记中的插入(Insertion)等位基因命名为I，缺失(Deletion)等位基因命名为D。
实施例2，复合扩增体系的扩增程序退火温度梯度测试
利用实施例1提供的试剂盒进行退火温度梯度测试，以标准基因组DNA9948作为模板配制反应体系，扩增程序退火温度分别设定为58℃、59℃、60℃和61℃，按照实施例1的检测体系及程序进行测试，电泳及检测在ABI 3130XL遗传分析仪上进行。结果如图3所示，退火温度从58℃到61℃，均能检出全部峰型，未出现漏检的情况；退火温度降低，出现基因座内不均衡现象；退火温度升高，部分基因座扩增效率降低，退火温度在60℃时，各位点均能正常出峰，且色间峰高的均衡性良好。
实施例3，应用复合扩增试剂盒进行亲缘关系鉴定
案件样本为一对待检测的疑似亲缘关系的父子样本，利用实施例1提供的试剂盒对2份血卡样本进行60个InDel遗传多态性位点复合扩增，使用9948细胞系样品作为阳性对照。血卡样本直接进行PCR扩增，按照实施例1中的检测体系及程序，将1μL PCR产物与上样混合物混合，为了避免产生气泡，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，使用遗传分析仪ABI 3130XL进行电泳检测，用GeneMapper软件分析实验数据得到分型结果，如表4所示：
表4分型检测结果
结果显示，儿子与父亲在每个InDel位点上均有一个相同的等位基因，由于儿子染色体位点的等位基因应一半来自母亲，一半来自父亲，因此判定本案例“不排除该儿子与父亲存在亲子关系”。
实施例4，灵敏度试验
对一系列人工降解DNA样本进行了测试。取浓度为1.0ng/μL的对照9948细胞系样品与DNaseⅠ(Thermo Fisher Scientific)分别制备孵育0、2.5、5.0、10.0和15.0min的人工降解样品(孵育0min的样品即为未添加DNaseⅠ)。采用EDTA溶液终止降解反应；然后分别使用实施例1提供的试剂盒和无锡中德美联生物技术有限公司的AGCU 21+1 STR试剂盒进行测试对比。
结果如图4所示，当孵育时间为0～2.5min时，AGCU 21+1 STR试剂盒均能获得完整图谱。当酶处理5min后，AGCU 21+1 STR试剂盒的等位基因检出率为93.16％；孵育10min后，AGCU 21+1 STR试剂盒的等位基因检出率降至81.20％；孵育15分钟后，AGCU 21+1 STR试剂盒的等位基因检出率只有44.44％。而实施例1提供的试剂盒在酶处理0～10min的样本时，等位基因检出率均为100％；当酶处理15min时才开始出现个别等位基因缺失，但仍然保持99.61％的高检出率。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东华美众源生物科技有限公司
<120> InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒及应用
<130> 2021
<160> 120
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggatcaagaa gaggactgta agagc 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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tattcaatat gccatcagca gtca 24
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<212> DNA
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gtgctatttt aactcaagtt ttgctg 26
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<213> 人工序列
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<400> 5
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tacaagcaca aatgaacaag ggc 23
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<213> 人工序列
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ggacttctct agggtctatc cagct 25
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gcataataat aacttgtcta tgtcccaac 29
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tctaatccct cttggaagac tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cacaggagaa ggatttcaga cctac 25
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tccgaaatgg acaatacaat agaaat 26
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gatatccaag gactcaaaac attctc 26
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gcctgacagc cactaccaat aac 23
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ctatgcaagt tgtttacagt gtttctc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggattttaaa actaaagcat atttgggagg 30
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tggtgtgaga gccgagaagg 20
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atcagggttc ctctcaggct cc 22
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gtgaaaagta tcctaaggca tttgat 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aatgggagca atttgaatat agcc 24
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcacaatgct ctaggacttg gagatag 27
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtaattggaa tcatagaccc tcacc 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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catgatcgtg ttactgtgct ttt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtccctaatt gcagatgaca tga 23
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<211> 23
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actattgtct gacatccatg ggg 23
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attattctga ctacgtggga ggct 24
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gacaatgctc tgttcttact gga 23
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<211> 24
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acacagatgg tagttttggc agga 24
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<213> 人工序列
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aactcccagg ctgatggtga c 21
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agatgaggct tagagagctt agtgc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agctctacaa tcagtgaaaa cttgg 25
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<213> 人工序列
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aagcaggcaa ggagctagga g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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accttaaaga agcgagctga taag 24
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cagcctgaaa taggccatga gt 22
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<213> 人工序列
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acatggcagt gtttttccac atac 24
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attagtaaaa taatatgagg gacgtaaagc 30
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gcagatctgt gaagttacct tgc 23
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tctgggtcag caaactagag ca 22
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agagtggaat tcaccagtag ttacc 25
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tgaaacatgt ccagcaacag aag 23
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<213> 人工序列
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catctttaag tctcctggtt gggt 24
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gaacagctgc tacttgccag g 21
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tttccccatt cctactctga ctcct 25
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gcccttgatt atgttgcaat atttatag 28
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tcccagggat atactaccaa gca 23
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agatttgtgg ggaatgtcgc 20
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gtgctttgtt cactttgatt gctc 24
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ttttccacct gagtctattc catta 25
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ttccattgac cctttatgac cac 23
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cattaatttt tgaatgaagc gagaact 27
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<213> 人工序列
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tgccatactt tctgcatttt tctt 24
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<213> 人工序列
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agccatactt tctgcatttt tctt 24
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<212> DNA
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gactctgtgc ttgccctgat g 21
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gcagtgcctt cccaaaatca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cacaactact ggcttactgg atatgac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgaaaatcac agtctaaacc aggg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acctatccta caaacagatt ttcagtc 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
gctaatgttt atctgcaggg cat 23
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ttctgtcctc tctttgctac cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acatgacttt cccaggatca ca 22
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
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actgagggaa gtgagggagc gcagga 26
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aggtctatgt gtgctggggg a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
cttctagctt ctgggttgtg aataat 26
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
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tgacaaggtc taagaaagga aaatg 25
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cttgccagca tttgagaaaa gga 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gttaatgcga tctagtggta agtcc 25
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<211> 23
<212> DNA
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cctatttctt tgaccatctt tttgattc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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attagagcca cagacacaag gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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accattgtat aggtaagcaa gcag 24
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tctgaagatg tgacaaccga ctg 23
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tctgaagatg tgacaaccga ctg 23
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gtggttgcca aaggtttcag a 21
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attatttatc caccgttatg gtgtctt 27
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<213> 人工序列
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tcagccctcc tgggtctc 18
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<213> 人工序列
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attgcaggtt ctggggctct c 21
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ggagtcaaca agcagcattc agt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agttaagtaa tttacctcac ccat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gggaaatttg ggtgctagtc ct 22
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<211> 22
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<213> 人工序列
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gggaaatttg ggtgctagtc ct 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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tccagtgctt tccagtaatt ttcaa 25
<210> 84
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
gaagctattt ttggtgggta tgaattg 27
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
cacaggtctt ggtgcttata ggag 24
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
aaatgtagtg ggaagatggc c 21
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gtcatttcgt cttcaggagt ttg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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acaatcatga aatcacttca agg 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgcctgcact ggctgtactt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggtggaggtt gtaggtagtc gata 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tagttcctca catgccccct 20
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aattacagtc ctcccgctcc 20
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<213> 人工序列
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tgtctaggaa ggcactctgt tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagaaatgac ttcccatagt ccc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atcaacattt catttctaac acacca 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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attaaaggac tttggtggaa ttttga 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acccaaatca actcaactcc ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atttactgat acctttgttt ctgttcattc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccctgggctc tgtaaagaat ag 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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gcagagctta aactgggaag ctg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgaatggcag gcagacgaag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtcctcaata aacataccat ttcttcc 27
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<212> DNA
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agggtgtgga gaaacaggag ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aacgtgcctg gcctatttta gttag 25
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
aatcctgctt gctaaaccac ct 22
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
gtattattgc ttcactccat ccagg 25
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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ttggttatgc attttggtgc ct 22
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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tttaatgaag gtcaatgaag acgca 25
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<213> 人工序列
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ctcatgcagt tgtggaagta aaatt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccttcagtgg caggtgttca a 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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agaccatcac ccacagagca ac 22
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<211> 25
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aagaaggtgt gaggagaata gtggc 25
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<212> DNA
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cctcttgtga tactgcctca ttct 24
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tggtggaggc tcaatcagtc ttt 23
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actaatgtga tgtggcgaat aagc 24
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<400> 119
tgtaatgccc ttcttctttg tct 23
<210> 120
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
ataggataaa gaaacaagac ccaatg 26
Claims (6)
1.一种InDel遗传多态性位点复合扩增试剂盒，其特征在于，包括扩增57个常染色体InDel位点、2个Y染色体InDel位点及Amelogenin鉴定位点的引物混合物，各InDel位点在dbSNP数据库中的编号分别为：rs34421865、rs3076465、rs34287950、rs151335218、rs5787309、rs67405073、rs60867863、rs71852971、rs769299、rs10590825、rs79225518、rs140683187、rs57981446、rs145191158、rs10626599、rs112879447、rs10607699、rs35309403、rs145577149、rs113011930、rs35453727、rs5897566、rs1160980、rs77206391、rs35464887、rs67100350、rs538690481、rs67939200、rs66739142、rs3217112、rs59841142、rs145010051、rs66477007、rs142221201、rs67426579、rs145941537、rs67365630、rs3064355、rs60564093、rs34076006、rs3834231、rs61490765、rs72085595、rs76158822、rs67487831、rs66595817、rs35065898、rs76041101、rs199815934、rs34529638、rs67264216、rs3067397、rs11277697、rs72031009、rs33971783、rs146875868、rs34419736、rs77635204、rs561160795，所述引物混合物包括序列如SEQ ID NO.001至SEQ ID NO.120所示的核苷酸片段，所述引物混合物的各条所述核苷酸片段的浓度分别为：SEQ ID NO.001和SEQ ID NO.002的引物对浓度为0.040μM；SEQ ID NO.003和SEQ ID NO.004的引物对浓度为0.044μM；SEQ ID NO.005和SEQ ID NO.006的引物对浓度为0.046μM；SEQ ID NO.007和SEQID NO.008的引物对浓度为0.020μM；SEQ ID NO.009和SEQ ID NO.010的引物对浓度为0.040μM；SEQ ID NO.011和SEQ ID NO.012的引物对浓度为0.058μM；SEQ ID NO.013和SEQID NO.014的引物对浓度为0.163μM；SEQ ID NO.015和SEQ ID NO.016的引物对浓度为0.077μM；SEQ ID NO.017和SEQ ID NO.018的引物对浓度为0.064μM；SEQ ID NO.019和SEQID NO.020的引物对浓度为0.128μM；SEQ ID NO.021和SEQ ID NO.022的引物对浓度为0.040μM；SEQ ID NO.023和SEQ ID NO.024的引物对浓度为0.032μM；SEQ ID NO.025和SEQID NO.026的引物对浓度为0.082μM；SEQ ID NO.027和SEQ ID NO.028的引物对浓度为0.030μM；SEQ ID NO.029和SEQ ID NO.030的引物对浓度为0.115μM；SEQ ID NO.031和SEQID NO.032的引物对浓度为0.107μM；SEQ ID NO.033和SEQ ID NO.034的引物对浓度为0.096μM；SEQ ID NO.035和SEQ ID NO.036的引物对浓度为0.096μM；SEQ ID NO.037和SEQID NO.038的引物对浓度为0.144μM；SEQ ID NO.039和SEQ ID NO.040的引物对浓度为0.048μM；SEQ ID NO.041和SEQ ID NO.042的引物对浓度为0.088μM；SEQ ID NO.043和SEQID NO.044的引物对浓度为0.077μM；SEQ ID NO.045和SEQ ID NO.046的引物对浓度为0.154μM；SEQ ID NO.047和SEQ ID NO.048的引物对浓度为0.192μM；SEQ ID NO.049和SEQID NO.050的引物对浓度为0.038μM；SEQ ID NO.051和SEQ ID NO.052的引物对浓度为0.053μM；SEQ ID NO.053和SEQ ID NO.054的引物对浓度为0.058μM；SEQ ID NO.055和SEQID NO.056的引物对浓度为0.031μM；SEQ ID NO.057和SEQ ID NO.058的引物对浓度为0.041μM；SEQ ID NO.059和SEQ ID NO.060的引物对浓度为0.053μM；SEQ ID NO.061和SEQID NO.062的引物对浓度为0.034μM；SEQ ID NO.063和SEQ ID NO.064的引物对浓度为0.128μM；SEQ ID NO.065和SEQ ID NO.066的引物对浓度为0.064μM；SEQ ID NO.067和SEQID NO.068的引物对浓度为0.051μM；SEQ ID NO.069和SEQ ID NO.070的引物对浓度为0.067μM；SEQ ID NO.071和SEQ ID NO.072的引物对浓度为0.058μM；SEQ ID NO.073和SEQID NO.074的引物对浓度为0.038μM；SEQ ID NO.075和SEQ ID NO.076的引物对浓度为0.064μM；SEQ ID NO.077和SEQ ID NO.078的引物对浓度为0.075μM；SEQ ID NO.079和SEQID NO.080的引物对浓度为0.058μM；SEQ ID NO.081和SEQ ID NO.082的引物对浓度为0.084μM；SEQ ID NO.083和SEQ ID NO.084的引物对浓度为0.096μM；SEQ ID NO.085和SEQID NO.086的引物对浓度为0.045μM；SEQ ID NO.087和SEQ ID NO.088的引物对浓度为0.080μM；SEQ ID NO.089和SEQ ID NO.090的引物对浓度为0.048μM；SEQ ID NO.091和SEQID NO.092的引物对浓度为0.038μM；SEQ ID NO.093和SEQ ID NO.094的引物对浓度为0.083μM；SEQ ID NO.095和SEQ ID NO.096的引物对浓度为0.096μM；SEQ ID NO.097和SEQID NO.098的引物对浓度为0.077μM；SEQ ID NO.099和SEQ ID NO.100的引物对浓度为0.038μM；SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.102的引物对浓度为0.038μM；SEQ ID NO.103和SEQID NO.104的引物对浓度为0.038μM；SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.106的引物对浓度为0.038μM；SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.108的引物对浓度为0.034μM；SEQ ID NO.109和SEQID NO.110的引物对浓度为0.096μM；SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.112的引物对浓度为0.036μM；SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.114的引物对浓度为0.038μM；SEQ ID NO.115和SEQID NO.116的引物对浓度为0.067μM；SEQ ID NO.117和SEQ ID NO.118的引物对浓度为0.106μM；SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.120的引物对浓度为0.064μM，各所述引物对中至少有一条引物的5’端标记有荧光染料，所述引物混合物分为五组，
第一组：如SEQ ID NO.001至SEQ ID NO.028所示的核苷酸片段；
第二组：如SEQ ID NO.029至SEQ ID NO.048所示的核苷酸片段；
第三组：如SEQ ID NO.049至SEQ ID NO.072所示的核苷酸片段；
第四组：如SEQ ID NO.073至SEQ ID NO.094所示的核苷酸片段；
第五组：如SEQ ID NO.095至SEQ ID NO.120所示的核苷酸片段；
同一组标记相同的荧光染料，各组标记的荧光染料互不相同。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自FAM、HEX、SUM、LYN或PUR。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一组采用FAM荧光染料标记，所述第二组采用HEX荧光染料标记，所述第三组采用SUM荧光染料标记，所述第四组采用LYN荧光染料标记，所述第五组采用PUR荧光染料标记。
4.根据权利要求1至3任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括Mg2+、dNTPs、Tris-HCl、BSA、KCl、热启动U-Taq酶或sdH2O中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，反应体系的复合扩增程序包括：95℃维持5min；94℃维持30s，60℃维持60s，62℃维持60s，28个循环；72℃维持20min。
6.权利要求1至5任一项所述的试剂盒在人类个体识别、亲权鉴定以及降解检材识别中的应用。
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| CN114438173A (zh) | 2022-05-06 |
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