CN111201318A

CN111201318A - 甘蓝植物的变异体检测方法

Info

Publication number: CN111201318A
Application number: CN201880065977.8A
Authority: CN
Inventors: 泉田敦; 铃木隆夫; 平本哲也
Original assignee: Sakata Seed Corp
Current assignee: Sakata Seed Corp
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2020-05-26
Also published as: KR20200053500A; BR112020003129A2; ZA202001441B; CA3073173A1; EP3670657A4; RU2020110813A3; EP4219758A1; AU2018318559A1; CL2020000385A1; WO2019035480A1; RU2020110813A; US20210164057A1; EP3670657A1; JPWO2019035480A1; JP2023060024A; MX2020001675A; US11932912B2; TW201920684A

Abstract

本发明涉及甘蓝(Brassica oleracea)植物的非整倍体的检测方法，所述方法包括下述工序：将从来源于被测甘蓝植物的试样中提取的DNA作为模板，使用对甘蓝植物的2条以上染色体各自具有特异性的DNA标记，实施实时PCR，根据得到的DNA标记间的扩增量的相对差来检测染色体的非整倍性。根据本发明，能够在种子的质量管理、育种研究的过程中，在具有常见分子生物学手段的实验室等中简便、准确且迅速地检验甘蓝品种中可能产生的变异体(染色体非整倍体)。

Description

甘蓝植物的变异体检测方法

对相关申请的引用

本申请基于作为在先日本专利申请的日本特愿2017-157384号(申请日：2017年8月17日)主张优先权权益，日本特愿2017-157384号的全部公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及甘蓝(Brassica oleracea)作物变异体(染色体非整倍体(aneuploid))的检测方法。详细而言，本发明涉及针对甘蓝(以下有时简称为“B.oleracea”)作物中由于非整倍体而呈现出各种异常形态的个体、在任何生长期中均能够利用分子生物学手段准确且迅速地对它们进行分类并检测的方法。

背景技术

十字花科植物是起源于中近东、地中海沿岸的植物种，芸薹(Brassica)属植物中包含农业上极为重要的作物。其中，甘蓝种是极为重要的植物种，其包括B.oleraceavar.capitata(卷心菜)、B.oleracea var.italica(西兰花)、B.oleracea var.botrytis(花椰菜)、B.oleracea var.gemmifera(抱子甘蓝)、B.oleracea var.gongyloides(苤蓝)、B.oleracea var.acephara(叶牡丹、羽衣甘蓝)、及B.oleracea var.albograbra(芥蓝)等。

一般而言，对于甘蓝作物，已培育出利用了自交不亲和性(selfincompatibility，SI)或细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)性质的杂种第一代交配(F1)植物。F1品种与原生品种、固定种相比，显示出适应环境的优异能力、品种内的高度一致性，因此商业性利用价值高，在许多国家得到利用。

另一方面，报道了即使是继承了双亲基因的F1品种，也会以一定的频率出现呈现异于寻常的形态的个体(文献V.Ruffio-Chable等，(2000)(非专利文献1))。通常，这样的变异个体作为农产品的价值极低，通常无法成为作为蔬果的出货对象。另外，在商品种子之中产生大量上述显示变异的个体时，很可能发展成商业上的重大问题，因此，种苗公司有时也需要将该批次废弃等应对措施。

关于产生这样的变异体的原因，长期以来并未被阐明，仅有如下猜测：可能是采种时或蔬果栽培中的环境造成影响，或者突变、表观遗传变异等造成影响。

另外，前述的变异体问题在向农家销售种子的种苗公司的质量管理现场也是极为棘手的问题。生产·销售F1种子的种苗公司会以商品种子的纯度检验为目的实施利用DNA标记、同工酶的检验。然而，这些变异个体就基因型而言显示为F1型，因此通常无法检测出来。因此，在检查现场，长期以来期待检验方法的开发。

此外，在育种研究中，也需要改良品种特性以使得不会产生大量如上所述的变异个体。然而，如上所述的变异体在幼苗期难以从外观进行判断。因此，为了准确地计测变异体的产生率，需要在场圃大规模展开，由熟练的育种人员仔细地对各个体的特性进行调查。但是，这样的种植(grow out)检验具有依赖于主观的一面，存在结果因判定人员而异的隐忧。此外，取决于植物的生长期、栽培环境，即使是熟练的育种人员也可能难以准确地进行判断，鉴于这样的背景，长期以来，种苗公司期待开发出使用幼苗的简易检验方法。

例如，文献V.Chable等，(2009)(非专利文献2)中，记载了花椰菜F1品种中出现的异常形态由非整倍体导致的可能性。作为检测这样的非整倍体的常见方法，报道了一些使用流式细胞仪的实验例。

然而，使用流式细胞仪的方法不易准确地检测1条染色体的差别，即使设置内源性对照，仍然可能发生如文献N.Roux等，(2003)(非专利文献3)中公开的数据那样变得难以判断的情况。另外，染色体的大小存在差异，最大的染色体与最小的染色体的基因组量之比有时达到近2倍。增加了较小的染色体的情况下，正常个体和非整倍体所显示的峰的差异极小，因此不易作出判断，检测灵敏度对结果的可靠性造成的影响较大。

因此，使用流式细胞仪的方法存在于通常的实验室中无法实施大规模的检验等问题。

另外，使用流式细胞仪的方法中，即使构建了可靠度高的实验体系，仍然存在以下问题：在多条染色体中产生非整倍性的植物的情况下，例如，对于1号染色体三体型(Trisomy)和2号染色体单体型(Monosomy)组合而成的非整倍体的情况，结果会因核中包含18条染色体而将其判定为正常个体，等等。

此外，使用流式细胞仪的简易检验中，难以鉴定是哪条染色体中产生了非整倍性。取决于形成三体型的染色体，存在西兰花的2号、7号染色体三体型、花椰菜的1号、2号、7号染色体三体型这样尽管成熟期略有偏差、但能毫无问题地收获蔬果的类型，也存在作为非整倍体不会立即导致商品价值减弱的情况。因此，在现场，能够个别地判别三体型的类型是重要的。另外，从改进育种的观点考虑，哪条染色体容易三体型化也是重要的信息，因此，期待开发出能够简便地对各条染色体的详细的非整倍性进行分析的检验方法。

在此前已报道过在植物中利用PCR进行的使用了DNA标记的基因型判别方法。例如，日本专利第3836451号(专利文献1)中公开了与辣椒属植物辛辣成分产生相关的基因型的判定方法。然而，据本申请的发明人所知，迄今为止尚未报道其在十字花科植物的变异体的检验方法中的应用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第3836451号

非专利文献

非专利文献1：V.Ruffio-Chable等，ISHS Acta Horticulturae 539(2000)p89，Developmentally“Aberrant”plants in F1 hybrids of Brassica oleracea.

非专利文献2：V.Chable等，Euphytica 170(2009)p275，“Aberrant”plants incauliflower：2.Aneuploidy and global DNA methylation.

非专利文献3：N.Roux等，Plant Cell Report 21(2003)p483，Rapid detectionof aneuploidy in Musa using flow cytometry.

非专利文献4：I.Parkin等，Genetics 171(2005)p765，Segmental structure ofthe Brassica napus genome based on comparative analysis with Arabidopsisthaliana.

非专利文献5：X.Cheng等，Theoretical Applied Genetics 118(2009)p1121，Development and genetic mapping of microsatellite markers from genome surveysequences in Brassica napus

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于上述以往的问题点，即，提供能够在种子的质量管理、育种研究的过程中准确且迅速地检验甘蓝品种中可能产生的变异体(染色体非整倍体)的方法。另外，这样的方法可在具有常见分子生物学手段的实验室等中简易地实施。

用于解决课题的手段

对此，本申请的发明人为了响应种子质量管理和育种研究这两方面的高要求而进行了深入研究，结果通过使用实时PCR，得以在甘蓝种中成功实现了对全部染色体的非整倍体的准确且迅速的检验。根据该方法，只要是具备实时PCR的研究室就能够容易地实施，能够简易地检测变异体。另外，该方法针对由于非整倍体而呈现出各种异常形态的个体，在任何生长期中均能够利用分子生物学手段准确且迅速地对它们进行分类并检测。

即，根据本发明，可提供以下的发明。

<1>甘蓝植物的非整倍体的检测方法，所述方法包括下述工序：

将从来源于被测甘蓝植物的试样中提取的DNA作为模板，使用对甘蓝植物的2条以上染色体各自具有特异性的DNA标记，实施实时PCR，根据得到的DNA标记间的扩增量的相对差来检测染色体的非整倍性。

<2>前述<1>的方法，其包括下述工序：

作为所述DNA标记，使用对甘蓝植物的1号染色体至9号染色体的全部染色体各自具有特异性的DNA标记，

判定被测植物是否为针对全部染色体之中的任何染色体的非整倍体。

<3>前述<1>或<2>的方法，其中，使用下述引物作为所述DNA标记，所述引物仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性，且在该染色体DNA存在时能使得PCR反应导致的扩增产物生成。

<4>前述<1>～<3>中任一项的方法，其中，作为所述DNA标记，使用：

(i)引物，其仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性，且在该染色体DNA存在时能使得PCR反应导致的扩增产物生成；和

(ii)探针，其对与所述(i)的任意一条染色体DNA相同的染色体DNA具有特异性，且能检测基于所述(i)的引物的PCR反应导致的扩增产物。

<5>前述<3>或<4>的方法，其中，使用能与通过PCR反应合成的双链DNA结合而发出荧光的嵌入剂，或者，使用经荧光色素修饰从而能通过PCR延伸反应发出荧光的探针。

<6>前述<1>～<5>中任一项的方法，其中，使用通过实时PCR得到的荧光信号的增加作为检测染色体的非整倍体的指标。

<7>前述<1>～<6>中任一项的方法，其中，使用1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物作为所述DNA标记。

<8>前述<1>～<7>中任一项的方法，其中，使用1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物、和1种以上具有序列号19～27所示的碱基序列的探针作为所述DNA标记。

<9>用于检测甘蓝植物的非整倍体的引物组(primer set)，其包含至少1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物。

<10>用于检测甘蓝植物的非整倍体的引物与探针的组合，其包含：

至少1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物；和

至少1种以上具有序列号19～27所示的碱基序列的、经荧光色素修饰的探针。

<11>甘蓝作物的育种方法，其包括下述工序：使用前述<1>～<8>中任一项的检测方法，针对甘蓝植物的每个株系来评价所述株系各染色体的非整倍体产生频率，由此选出非整倍体产生率低的株系。

<12>甘蓝种子的质量管理方法，其包括使用前述<1>～<8>中任一项的检测方法来检验甘蓝植物的种子中所含的非整倍体的混入率的工序。

<13>甘蓝植物的质量管理方法，其包括使用前述<1>～<8>中任一项的检测方法来检验甘蓝植物中所含的非整倍体的混入率的工序。

发明效果

根据本发明的检验方法，能够简便且准确地确定变异体产生率及各变异体的未来形态，并能够实现商品种子的纯度检验、及对各育种株系的变异体产生频率的检验。结果，能够高效且迅速地在早期提供稳定供给质量良好的种子、以及培育性质良好的株系的手段。

附图说明

[图1]示出了从西兰花的品种产生的非整倍体(aneuploid)的表型。图中，(A)表示正常的个体(正常(Normal))，(B)表示1号染色体三体型(三体型(Trisomy))(+C1)，(C)表示2号染色体三体型(+C2)，(D)表示3号染色体三体型(+C3)，(E)表示4号染色体三体型(+C4)，(F)表示5号染色体三体型(+C5)，(G)表示6号染色体三体型(+C6)，(H)表示7号染色体三体型(+C7)，(I)表示8号染色体三体型(+C8)，以及(J)表示9号染色体三体型(+C9)。

[图2]示出了实施基于实时PCR的定量分析的情况下的扩增曲线的图像。图以6号染色三体型的情况为例。可知向PCR的反应液中加入的模板的DNA量恒定时，例如在6号染色体三体型(Trisomy)的情况下，位于6号染色体上的标记的扩增曲线比正常个体(正常)更早上升。

[图3]示出了非整倍体的检测例。即，示出了通过实施实时PCR得到的基于染色体标记的扩增的相对定量的计算结果的一例。如图所示，以西兰花F1品种96个个体作为材料，运行利用4号染色体标记、及6号染色体标记的多重PCR来实施试验的情况下，以4号染色体上的标记为基准对6号染色体上的标记进行相对定量，结果能够鉴定6号染色体三体型及4号染色体三体型。

[图4]示出了在三体型植物的花粉母细胞中观察到的染色体的显微镜照片。如图所示，使用显微镜观察了花粉母细胞减数分裂第一次分裂中期的细胞，结果，正常型(正常)的染色体(2n＝18)观察到9条二价染色体，与之相对，三体型植物的染色体(2n+1)观察到9条二价染色体外加1条染色体(箭头)。

[图5]示出了从花椰菜的品种产生的非整倍体的表型。图中，(A)表示正常的个体(正常)，(B)表示1号染色体三体型(+C1)，(C)表示2号染色体三体型(+C2)，(D)表示4号染色体三体型(+C4)，(E)表示6号染色体三体型(+C6)，(F)表示7号染色体三体型(+C7)，以及(G)表示9号染色体三体型(+C9)。

[图6]示出了从卷心菜的品种产生的变异体。图中，(A)表示正常的个体(正常)，(B)表示1号染色体三体型(+C1)，(C)表示2号染色体三体型(+C2)，(D)表示4号染色体三体型(+C4)，(E)表示5号染色体三体型(+C5)，(F)表示6号染色体三体型(+C6)，(G)表示7号染色体三体型(+C7)，(H)表示8号染色体三体型(+C8)，以及(I)表示9号染色体三体型(+C9)。另外，(J)表示在1号染色体及2号染色体中产生了非整倍性的个体(+C1，+C2)，(K)表示在1号染色体及8号染色体中产生了非整倍性的个体(+C1，+C8)，以及(L)表示在5号染色体及8号染色体中产生了非整倍性的个体(+C5，+C8)。

[图7]示出了从西兰花、花椰菜、及卷心菜的各品种产生的非整倍体的表型的特征。但是，这些特征涉及在针对本文采用的各品种的本次实施例的试验中观察到的一部分表型特征，对于各植物种、非整倍体而言，并非一定能够一般化地进行表征。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

如前文所述，本发明涉及下述方法：甘蓝植物的非整倍体的检测方法，其包括下述工序：将从来源于被测甘蓝植物的试样中提取的DNA作为模板，使用对甘蓝植物的2条以上染色体各自具有特异性的DNA标记，实施实时PCR，根据得到的DNA标记间的扩增量的相对差来检测染色体的非整倍性。根据本发明的优选方式，检测方法中使用的染色体数目为3条以上，按更优选而言的顺序为4条以上、5条以上、6条以上、7条以上、8条以上，最优选使用针对全部9条染色体的标记。

因此，优选的是，本发明的方法包括下述工序：作为前述DNA标记，使用对甘蓝植物的1号染色体至9号染色体的全部染色体各自具有特异性的DNA标记，判定被测植物是否为针对全部染色体之中的任何染色体的非整倍体。

本发明中，甘蓝(Brassica oleracea)植物表示芸薹属植物中的甘蓝种的植物，本文中，包括B.oleracea var.capitata(卷心菜)、B.oleracea var.italica(西兰花)、B.oleracea var.botrytis(花椰菜)、B.oleracea var.gemmifera(抱子甘蓝)、B.oleraceavar.gongyloides(苤蓝)、B.oleracea var.acephara(叶牡丹、羽衣甘蓝)、及B.oleraceavar.albograbra(芥蓝)等。优选的是，本发明中，甘蓝植物为西兰花、花椰菜、卷心菜。

此处，“非整倍体”或“变异体”表示甘蓝植物中的任一种染色体数目存在异常，即染色体数目的异常(aneuploidy)。甘蓝植物的染色体为2n＝18，因此，正常的植物的情况下，在1个细胞中，9种染色体各存在2条。另一方面，非整倍体、即非整倍性植物、例如1号染色体三体型(trisomy)的情况下，1号染色体增加至3条，从而可以说在1号染色体存在异常。根据植物种类、生长情况等，也可能存在非整倍体的个体可被允许作为农产品、蔬果的情况，但通常而言，变异个体大多作为农产品的价值极低，多数情况下无法成为作为蔬果的出货对象。因此，能够迅速且简便地实施非整倍体的检测的方法是重要的。

本发明的检测方法中，首先，准备希望判断是否为非整倍体的被测甘蓝植物，从来源于该被测甘蓝植物的试样中提取DNA，将其用作PCR中的模板。

此处，DNA的提取方法只要是作为核酸提取方法而被本领域技术人员所知的方法，则可利用任何方法。本发明中，可将所提取的粗提(crude)DNA直接作为PCR的模板使用，也可使用例如苯酚/氯仿法、利用表面活性剂的细胞裂解、利用蛋白酶的细胞裂解、利用玻璃珠的物理性破坏方法、反复冻融的处理方法、及它们的组合来进行DNA的提取。另外，也可使用由试剂制造商销售的各种DNA提取试剂盒，例如QIAGEN Plant mini Kit(QIAGEN GmbH公司制)等。利用这些方法提取的DNA优选保持为适合作为PCR的模板使用的状态，优选例如溶解于合适的缓冲液并于低温下保存。得到的DNA的纯度可通过使用分光光度计测定230、260、及280nm的吸光度来检验。从实施PCR的方面考虑，优选260/230nm的吸光度比为2.0以上，260/280nm的吸光度比为1.8～2.0。另外，对于得到的DNA溶液，可使用针对植物共通具有的内源基因的引物对(primer pair)来实施PCR，确认发生扩增。

本发明的检测方法中，将从来源于被测甘蓝植物的试样中提取的DNA作为模板，使用能对甘蓝植物的各染色体的一部分进行扩增的DNA标记，实施实时PCR。详细而言，作为DNA标记，使用对甘蓝植物的2条以上染色体各自具有特异性的2种以上DNA标记，实施实时PCR。更详细而言，作为DNA标记，使用对甘蓝植物的1号染色体至9号染色体的全部染色体之中的2条以上染色体各自具有特异性的2种以上DNA标记，实施实时PCR。

作为此处使用的DNA标记，只要是位于甘蓝植物的任一条染色体上、且在染色体基因组内作为单拷贝存在、不受存在于其他染色体上的序列影响的标记即可，没有特别限定。本发明中，通过使用这样的标记，从而能够实施基于实时PCR的相对定量，针对甘蓝的各种作物实施非整倍体的检验。

因此，也即，该标记优选为仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性、且在该染色体DNA存在时能使得PCR反应导致的扩增产物生成的引物。此处，所谓仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性，表示仅对9种染色体中的任意一条染色体具有特异性、而对其他染色体不具有特异性，在该特异的染色体DNA存在时，引物能使得PCR反应导致的扩增产物生成。例如，所使用的DNA标记可包含下述引物：所述引物仅对1号染色体的DNA具有特异性、且在该1号染色体DNA存在时能经由PCR反应生成扩增产物。

关于此处使用的引物的设计，本领域技术人员可适当制备，以使其仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性、且在该染色体DNA存在时能使得PCR反应导致的扩增产物生成。若举出具体例，通过参考后述实施例1的记载，本领域技术人员可适当制备所期望的引物。

本发明中，通过使用具有如上所述的性质的引物来实施实时PCR，能够检验非整倍体，而作为一个优选方式，可举出嵌入剂法。嵌入剂法中，被添加至PCR反应液中的嵌入剂与通过PCR反应合成的双链DNA结合而发出荧光，因此，若发生基于引物的延伸反应而生成扩增产物，则会发出荧光。通过对荧光进行检测，能够测定DNA标记间的扩增量的相对差。

作为嵌入剂，可使用例如SYBR Green I。

作为嵌入剂法的具体方式，向PCR反应液中加入

(i)仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性、且在该染色体DNA存在时能使得PCR反应导致的扩增产物生成的引物；和

(ii)嵌入剂，

每个循环测定在PCR中的延伸反应步骤中发出的荧光信号，计算相对定量。由此，能够测定DNA标记间的扩增量的相对差。

作为本发明中的另一个优选方式，可举出探针法，其中使用能检测基于具有上述性质的引物经由PCR反应产生的扩增产物的探针。作为可使用的探针，只要能检测目标扩增产物即可，没有特别限定，优选使用经荧光色素修饰从而能通过PCR延伸反应发出荧光的标记探针。关于相对定量的计算方法，可通过测定在PCR的延伸反应时发出的荧光，基于与嵌入剂法同样的原理进行。另外，较之嵌入剂法而言，探针法中，能够降低检测到非特异性PCR产物的风险。

作为探针法的具体方式，使用

(ii)探针，其对与前述(i)的任意一条染色体DNA相同的染色体DNA具有特异性，且能检测基于前述(i)的引物的PCR反应导致的扩增产物，

作为荧光标记探针，优选用荧光物质和猝灭物质进行了双重标记的TaqMan探针。就TaqMan探针而言，通常，用荧光物质(报告荧光色素)修饰核酸探针的5’末端，用猝灭物质(猝灭荧光色素)修饰3’末端。作为报告荧光色素的例子，可举出Cy3、Cy5、6-FAM(6-羧基荧光素)、TET(6-羧基-4，7，2’，7’-四氯荧光素)、HEX(6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素)等荧光素系荧光色素。作为猝灭荧光色素的例子，有时也使用6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)等罗丹明系荧光色素，但在实施多重PCR时，优选选择BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、Eclipse等暗猝灭剂。本发明中，例如，可优选使用在5’末端用FAM、HEX、Cy5这3种荧光色素标记、在3’末端用BHQ-1、BHQ-3这2种猝灭剂标记而得到的水解探针。

因此，本发明的检测方法中，优选的是，使用能与通过PCR反应合成的双链DNA结合而发出荧光的嵌入剂，或者，使用经荧光色素修饰从而能通过PCR延伸反应发出荧光的探针。

使用经荧光色素修饰的探针的情况下，可利用标记有不同种类的荧光色素的探针，将数种标记混合而实施多重PCR。与前述的方法同样地，可以根据各荧光探针发出的荧光信号，针对被测试样的各个体及各标记，测定DNA标记间的扩增量的相对差，此时，在多重PCR的情况下，能够将相同反应液中的1个标记设定为内源性对照而计算相对定量，减少实验误差，从而能够提高结果的可靠性。

因此，根据本发明的进一步优选的方式，实施基于探针法的多重PCR。

因此，根据本发明的一个优选方式，本发明的检测方法中，使用通过实时PCR得到的荧光信号的增加作为检测染色体的非整倍体的指标。

需要说明的是，作为引物或探针的寡核苷酸可通过作为寡核苷酸的合成方法而在本技术领域中已知的方法、例如磷酸三乙酯(phosphotriethyl)法、磷酸二酯(phosphodiester)法等，利用通常所使用的DNA自动合成装置进行合成。

根据本发明的更优选方式，作为DNA标记，可使用具有序列号1～18所示的碱基序列的引物中的一种以上，进一步优选地，可使用后述表1中记载的引物中的一种以上。另外，根据本发明的其他更优选方式，可使用具有序列号1～18所示的碱基序列的引物中的一种以上、和具有序列号19～27所示的碱基序列的探针中的一种以上，进一步优选地，可使用表1中记载的引物中的一种以上、和表2中记载的探针中的一种以上。这些标记是与1号～9号这9种染色体对应的标记。

此处，所谓DNA标记“具有”碱基序列，是指该标记具有该碱基序列。本发明中，DNA标记如前文所述，对规定的染色体的DNA具有特异性，因此，意味着只要具有作为其标记的性质，则DNA标记可将所对应的碱基序列内的碱基的任意一个或数个(例如，1个、2个或3个，优选为1个或2个，更优选为1个)进行取代、缺失、添加或删除，或者，可以是包含所对应的碱基序列作为一部分、且保持规定的性质的序列。这样的情况下，用语“具有”可语义转换为“包含”。另外，针对允许取代、缺失、添加或删除1个碱基的情况，可将“具有”语义转换为“实质上由......组成”。

根据本发明的其他更优选方式，作为DNA标记，可使用具有序列号1～18所示的碱基序列的引物对中的一种以上，进一步优选地，可使用后述表1中记载的引物对中的一种以上。另外，根据本发明的其他更优选方式，可使用具有序列号1～18所示的碱基序列的引物对中的一种以上、和与其对应的具有序列号19～27所示的碱基序列的探针，进一步优选地，可使用表1中记载的引物对中的一种以上、和表2中记载的探针中的一种以上。

根据本发明的进一步更优选的方式，DNA标记分成以下3组进行使用，从而能够实施更加准确且稳定的检验。

·6号染色体标记、4号染色体标记、及2号染色体标记；

·9号染色体标记、3号染色体标记、及8号染色体标记；以及

·1号染色体标记、5号染色体标记、及7号染色体标记。

本发明中，就实时PCR法而言，除了使用上述的引物对和探针以外，基于例如实验医学别册从原理上清楚理解的实时PCR实验指南(実験医学別冊原理からよくねかるリアルタイムPCR実験ガイド)(羊土社)、Saiki RK，等，Science，230：1350-1354(1985)、植物细胞工学别册、植物的PCR实验方案(植物

胞工学別冊、植物のPCR実験プロトコル)、岛本功·佐佐木卓治监修(1995年)等中记载的常规方法，使用市售的实时PCR试剂盒、实时PCR装置，按照其中附带的操作说明书实施即可。

作为实时PCR装置，可使用例如LightCycler 480System II(Roche公司制)等。另外，此时，作为反应试剂，可使用例如“Premix Ex Taq(Perfect Real Time)”(Takara Bio公司制)等，但不特别限定于此。

首先，将通过上述操作得到的DNA试样作为模板，使用本发明中的规定的引物或引物对实施PCR。就PCR扩增而言，除了使用前述的引物或引物对以外没有特别限定，可按照常规方法实施。就PCR条件(变性、退火、延伸各步骤的温度及时间、以及循环数等)、PCR反应液的组成(模板DNA量、缓冲液的种类、引物浓度、DNA聚合酶的种类、浓度、dNTP浓度、氯化镁浓度等)而言，本领域技术人员可通过预实验等合适地选择及设定能够在使用了前述的引物或引物对的PCR中以所期望的高灵敏度得到PCR扩增产物这样的条件。另外，DNA聚合酶、dNTP浓度、氯化镁浓度等大致得到优化的实时PCR用反应混合物(master mix)已有市售，因此也可适当使用这些。

如前文所述，甘蓝的染色体为2n＝18，因此，正常的植物的情况下，在1个细胞中，9种染色体各存在2条。另一方面，非整倍性植物、例如1号染色体三体型的情况下，1号染色体增加至3条。将从这些植物中提取的DNA作为模板，使用表1、或表1和表2中记载的DNA标记实施实时PCR时，在准确地统一了向反应液中加入的DNA量的情况下，1号染色体三体型中，相对于正常个体而言，位于1号染色体上的标记的扩增曲线在较早的循环中上升，也即，阈值循环值(Ct值，由荧光强度得到的标记的扩增曲线与按照某一定的基准设定的阈值线的交点)变低。

若示出具体例，也如图2所示，向PCR的反应液中加入的模板的DNA量恒定时，例如在6号染色体三体型(Trisomy)的情况下，位于6号染色体上的标记的扩增曲线比正常个体(正常)更早上升。

然而，在实际的检验现场中，难以准确地使许多被测试样的DNA量一致。因此，不使DNA量一致，而是对各染色体的标记的扩增进行相对定量，从它们的相对差能够推定各染色体的数目，并能够判定三体型等非整倍性。

为了将该方法广泛应用于甘蓝种，需要于甘蓝种内不存在SNPs的共通区段处设计用于PCR的引物等，本申请的发明人进行了深入研究，结果成功设计了能够广泛应用于甘蓝种、且能实施基于多重PCR的高效检验的DNA标记。由此发明出了本发明的检测方法。

因此，本发明的检测方法中，如前文所述，使用对染色体具有特异性的DNA标记，实施实时PCR，根据得到的DNA标记间的扩增量的相对差来检测染色体的非整倍性。

此处，得到的DNA标记间的扩增量的相对差可通过下述方式确认：针对对被测甘蓝植物的2条以上染色体各自具有特异性的DNA标记实施实时PCR，作为结果，将每个染色体标记的相对扩增量进行比较。即，通过对针对多个染色体标记的扩增量进行相对定量，从而在其中任一条染色体存在异常的情况下，在来自该染色体的标记的扩增量、与来自除该染色体以外的正常的染色体的标记的扩增量之间产生明显的差异，据此能够检测非整倍体的存在。

关于标记的扩增量，可利用标记的扩增曲线进行确认。标记的扩增曲线可基于通过PCR反应测定的荧光强度而容易地制作。

实施扩增量的相对差的测定、即相对定量的情况下，优选利用针对标记得到的扩增曲线。例如，将扩增曲线与按照某一定的基准设定的阈值线的交点作为阈值循环值(Ct值)，与其他染色体的标记所显示的Ct值进行比较，由此能够推定目标染色体的数目。另外，从寻求更稳定的结果的观点考虑，可以对扩增曲线进行二次微分，采用成为最大值的部分的循环值，将其与其他染色体的标记所显示的值进行比较，由此推定目标染色体的数目(二次微分法)。

本发明中，关于被测试样的各个体及各标记所显示的Ct值，采用如上所述地通过二次微分法算出的值，基于利用ΔΔCt法的相对定量能够推定作为对象的基因组区段的拷贝数比。

换言之，根据本发明的检测方法的优选方式的一部分也可以具体表述为如下的(a)法及(b)法。

(a)在PCR反应液中混合SYBR Green I等荧光色素，通过PCR将各染色体的标记分开地进行扩增。根据SYBR Green I等荧光色素发出的信号，检测被测试样的各个体及各标记的Ct值，基于利用ΔΔCt法等的相对定量而推定作为对象的基因组区段的拷贝数比的方法。

(b)利用标记有不同种类的荧光色素的探针，将数种标记混合而实施多重PCR。根据荧光探针发出的荧光信号，检测被测试样的各个体及各标记的Ct值，基于利用ΔΔCt法等的相对定量而推定作为对象的基因组区段的拷贝数比的方法。

需要说明的是，此处，前述(a)法可使用比较廉价的试剂实施，另一方面，由于分开地实施全部染色体的PCR，因此存在试验次数增加的趋势。前述(b)法需要合成荧光探针，另一方面，能够以内源性对照作为基准来实施相对定量，也能够减少实验次数。

上述的引物、引物对、及探针也可制成试剂盒。本发明的试剂盒至少包含上述引物或引物对、或者引物或引物对和探针即可，也可根据需要而包含：作为PCR的阳性对照的包含靶序列的DNA分子、DNA提取用试剂、PCR用缓冲液、DNA聚合酶等PCR用试剂、标记物质、说明书等。

因此，根据本发明的其他优选方式，可提供用于检测甘蓝植物的非整倍体的引物组，其包含至少1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物。另外，根据本发明的另一其他优选方式，可提供用于检测甘蓝植物的非整倍体的引物与探针的组合，其包含：至少1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物；和至少1种以上具有序列号19～27所示的碱基序列的、经荧光色素修饰的探针。

通过使用本发明的非整倍体的检测方法，能够针对甘蓝植物的每个株系来评价该株系各染色体的非整倍体产生频率。通过利用这一点，能够进一步利用本发明提供甘蓝作物的育种方法，其包括选出非整倍体产生率低的株系的工序。

另外，可提供甘蓝种子的质量管理方法，其包括通过使用根据本发明的非整倍体的检测方法来检验甘蓝植物的种子中所含的非整倍体的混入率的工序。

一直以来，通过种植检验来检验种子中所含的非整倍体比率，因此，需要用于栽培的大规模场圃面积和数月的生长时间。此外，若不是熟练的检验者，则无法导出准确的结果。利用根据本发明的种子的质量管理方法，能够以节省的空间实施非整倍体率的检验，并能够得到迅速且准确的结果。

可提供甘蓝植物的质量管理方法，其包括通过使用根据本发明的非整倍体的检测方法来检验甘蓝植物中所含的非整倍体的混入率的工序。

利用根据本发明的甘蓝植物的质量管理方法，也可将刚刚发芽的子叶作为材料进行检验。此外，若在定植期之前实施非整倍体检验，则可仅选定正常个体进行栽培，其结果是，能够从几乎全部植物体收获正常的蔬果。

实施例

通过下述的实施例具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。例如，提取DNA的被测试样无论是怎样的生长阶段均可，可使用种子、子叶、真叶、根、任何组织。关于DNA的提取方法，也不需要特殊的方法，纯化至能没有问题地实施PCR的程度即可。关于荧光色素，只要是实时PCR法中使用的普通色素，则无论怎样的荧光色素均可使用。

需要说明的是，本发明的方法如以下实施例中所示，显示了即使在作为不同作物的西兰花、花椰菜、及卷心菜中，也能够使用共通的标记检测非整倍体，证明了其是通用性高的标记。另外，除了这些实施例以外，本申请的发明人还在许多株系中确认了能够实施本方法，本方法不受以下实施例中使用的株系的任何限定。

实施例1：标记的制备

使用OPERON公司的RAPD(随机扩增多态性DNA，Random Amplified PolymorphicDNA)引物(10mer)、及本申请的发明人所设计的SRAP(相关序列扩增多态性，SequenceRelated Amplified polymorphism)引物，将西兰花F2群体的DNA作为模板实施PCR，由此构建甘蓝的连锁遗传图。

然后，将本申请的发明人所构建的连锁遗传图与文献I.Parkin等，Genetics 171(2005)p765(非专利文献4)、文献X.Cheng等，Theoretical Applied Genetics 118(2009)p1121(非专利文献5)、及NCBI中登录的公共信息进行比较，从而对位于各连锁群(LinkageGroup)的标记与公共的连锁遗传图的关系进行分析。

此外，由于位于各染色体上的标记需要以能用于任何甘蓝种的方式进行改造，因此，从卷心菜、西兰花、花椰菜的广大范围的遗传资源中选定特征性株系，将它们的DNA作为模板来鉴定不存在SNPs的区段，再次设计引物。

使用这些标记，将在制备标记的过程中鉴定的1号染色体～9号染色体中的各染色体为三体型的9种三体植物(图1)作为模板实施PCR，确认没有能对判定造成影响的来自其他染色体的非特异性扩增后，作为对各染色体具有特异性的标记进行操作。

进一步地，为了实施更加简便且稳定的多重荧光探针法，设计标记有FAM、HEx、Cy5这3种荧光色素的水解探针，并以设计出即使将3种标记混合于1种反应液中(即将6种引物与3种探针混合)也能互不干涉地显示稳定结果的引物及探针作为目标。一般而言，实施多重PCR时，会发生引物二聚体的形成、其他引物与扩增DNA片段的退火等复杂的反应，针对粗提模板DNA，难以构建稳定地检测染色体数目为2条和3条的区别(1.5倍量的差)的系统。然而，本申请的发明人反复改良标记序列，进行深入研究，结果成功设计出表1及表2所示的标记。

此外，通过将得到的9种染色体的标记分成3组(每组3种)，从而得以实施更加准确且稳定的检验(参见后述实施例4)。

[表1]

表1PCR用引物的序列表

序列号	名称	染色体	序列
				Seq ID-1	BoCl-Fw	C1	CTGGCAAATGTAAGCCCTTTCT
Seq ID-2	BoCl-Rv	C1	CTTGTCTTATTACAGCAGATGCATTC
				Seq ID-3	BoC2-Fw	C2	CGCCATTGCTTTCTCTCTACTCT
Seq ID-4	BoC2-Rv	C2	GAAGAGGAAGGACTCGAGGAAG
				Seq ID-5	BoC3-Fw	C3	CTTAGGATTCGGGTTCGTTTG
Seq ID-6	BoC3-Rv	C3	GCCGTAAGATTTCAAAGAGACTTC
				Seq ID-7	BoC4-Fw	C4	CGTCTCTTGTGGTGGTTGAAG
Seq ID-8	BoC4-Rv	C4	TCAACTTCATCTGCTTGGTAATG
				Seq ID-9	BoC5-Fw	C5	AGCACATCATCCCCCATACTT
Seq ID-10	BoC5-Rv	C5	CAGTCTCTCTcTCCTTGATGACG
				Seq ID-11	BoC6-Fw	C6	AGGAAGAGGAAATTGTCATTCG
Seq ID-12	BoC6-Rv	C6	GTGACCGTTGCAGCAGATAA
				Seq ID-13	BoC7-Fw	C7	AAGAAATTAGCCACAAGTCGTAAATA
Seq ID-14	BoC7-Rv	C7	ACGTGAATGATGGATATTTCATCTC
				Seq ID-15	BoC8-Fw	C8	AAAGCTCGTGAAGCAAATACTACC
Seq ID-16	BoC8-Rv	C8	GAAGCATACCAGGAGGGAAATAA
				Seq ID-17	BoC9-Fw	C9	GCCATCGCGAATCAAAGATA
Seq ID-18	BoC9-Rv	C9	ATTTGGTATTTTGCAGGCTACAG

[表2]

表2荧光探针的序列表

序列号	名称	染色体	序列	荧光标记的例子
					Seq ID-19	BoCl-prb	C1	CACTTGTAAAACATGGGTTTGATCAAAAGA	5’-FAM，3’-BHQ1
Seq ID-20	BoC2-prb	C2	TCCTCTACTTCCACCCCATCTGCC	5’-Cy5，3’-BHQ3
					Seq ID-21	BoC3-Prb	C3	CCGATCTGAAAAGGGAGCTAACGAC	5’-HEX，3’-BHQ1
Seq ID-22	BoC4-Prb	C4	TTGCAGCAAGGAGCTTAGACCACAG	5’-HEX，3’-BHQ1
					Seq ID-23	BoC5-Prb	C5	TCICGAGAAATCTCATCGCTGCTTG	5’-HEX，3’-BHQ1
Seq ID-24	BoC6-Prb	C6	TTCTCAGAGCTGTTCCCTCCTCCAC	5’-FAM，3’-BHQ1
					Seq ID-25	BoC7-Prb	C7	TTGCACCACCGTTACCTTTTAACACAA	5’-Cy5，3’-BHQ3
Seq ID—26	BoC8-Prb	C8	TGTTTTGTTTGGTGGGCAAATCTCTT	5'-Gy5，3’-BHQ3
					Seq ID-27	BoC9-Prb	C9	TGGAGATCTTCCACCTCATCTTGGA	5’-FAM，3’-BHQ1

图2示出了与利用了实时PCR的相对定量相关的基本原理。

向PCR的反应液中加入的模板的DNA量恒定时，例如在6号染色体三体型的情况下，位于6号染色体上的标记的扩增曲线比正常个体更早上升。进行相对定量的情况下，将该扩增曲线与按照某一定的基准设定的阈值线的交点作为Ct值，与其他染色体的标记所显示的Ct值进行比较，由此能够推定目标染色体的数目。

图3示出了通过实施实时PCR得到的相对定量的计算结果的一例。此处的试验中，以西兰花F1品种96个个体作为材料，使用4号染色体标记、及6号染色体标记实施了基于荧光探针法的多重PCR。作为实时PCR仪，使用了Roche公司的“LightCycler 480System II”，作为反应试剂，使用了Takara Bio公司的“Premix Ex Taq(Perfect Real Time)”。图中的X轴表示个体编号，Y轴表示以4号染色体标记作为基准、利用ΔΔCt法计算6号染色体标记的相对定量而得到的值。

供试的96个个体之中，88个个体的正常型显示1左右的值，5个个体的6号染色体三体型显示1.4左右的值，3个个体的4号染色体三体型显示0.7左右的值。就将PCR的扩增效率设为每1个循环为2倍的情况下的理论值而言，6号染色体三体型为1.5，4号染色体三体型为0.66，因此，实测值是与它们接近的值。

实施例2西兰花的三体型植物的染色体观察

将通过实时PCR被判定为三体型的植物之中的6号染色体三体型、7号染色体三体型、及2号染色体三体型作为材料，观察染色体。

从长度为1～2mm的西兰花的花蕾中取出花药，使用1％乙酸地衣红溶液染色，观察花粉母细胞的减数分裂第一次分裂中期(MI期)的染色体。

结果如图4中所示。

如图4中所示，正常个体的染色体(2n＝18)观察到9条二价染色体，与之相对，三体型植物的染色体(2n+1)观察到9条二价染色体外加1条染色体(箭头)。

实施例3西兰花中的变异体检测例

将坂田种苗株式会社正在开发的西兰花F1品种“SBR-48”的种子播种于育苗托盘中，从发芽的445个个体的子叶中提取DNA，使用对各染色体具有特异性的标记，实施基于SYBR法的实时PCR。

具体而言，作为对各染色体具有特异性的标记，使用具有序列号1～18所示的碱基序列的引物，向通常的PCR反应液中加入终浓度为1/20000的SYBR Green I(自Roche公司获得)作为嵌入剂，实施PCR。实时PCR使用Roche公司的“LightCycler 480System II”，PCR条件如下：于95℃孵育1分钟后，进行40个循环的三步PCR(95℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒)。SYBR Green I的信号测定使用了激发波长为465nm、检测波长为510nm的滤波器。

基于通过二次微分法得到的Ct值，以9号染色体的标记作为基准，利用ΔΔCt法计算相对定量。

结果如表3中所示。

然后，对上述表3的结果按染色体分别进行总结，结果表明，以表4那样的比率包含各非整倍体。

需要说明的是，虽然本实施例中未出现3号染色体三体型，但如图1中所示，偶尔也会出现3号染色体三体型(关于各染色体三体型的表型的特征，如图7中所示)。需要说明的是，本申请的发明人已另行确认了所设计的将3号染色体三体型也包括在内的标记没有问题。

[表3-1]

表3西兰花F1品种中的非整倍体检验结果(基于SYBR法的PCR所得到的厚始数据(ΔΔCt计算值))

[表3-2]

[表3-3]

[表3-4]

[表3-5]

[表3-6]

[表3-7]

[表4]

表4西兰花F1品种的基于SYBR法的非整倍体检验结果(总结)

	植物体的敷量	比率(％)
			正常(Normal)	418	93.9％
非整倍体(+C1)	2	0.4％
			非整倍体(+C2)	5	1.1％
非整倍体(+C3)	0	0.0％
			非整倍体(+C4)	1	0.2％
非整倍体(+C5)	0	0.0％
			非整倍体(+C6)	5	1.1％
非整倍体(+C7)	5	1.1％
			非整倍体(+C8)	0	0.0％
非整倍体(+C9)	3	0.7％
			非整倍体(其他)	6	1.3％

实施例4花椰菜中的变异体检测例

将坂田种苗株式会社正在开发的花椰菜F1品种“SCF-30”的种子播种于育苗托盘中，从发芽的654个个体的子叶中提取DNA，使用对各染色体具有特异性的标记，实施基于荧光探针法的实时PCR。

具体而言，如下所述地实施。

与前述的实施例3同样地操作，从花椰菜的子叶中提取DNA。

作为对染色体具有特异性的标记，分成以下3个组合，实施PCR试验。

·6号染色体标记、4号染色体标记、及2号染色体标记的三重标记(triplex)；

·9号染色体标记、3号染色体标记、及8号染色体标记的三重标记；以及

·1号染色体标记、5号染色体标记、及7号染色体标记的三重标记。

需要说明的是，关于此处所使用的染色体标记，针对各染色体使用了表1及表2中所示的引物及探针。例如，1号染色体标记使用了具有序列号1及2所示序列的引物、和具有序列号19所示序列的探针。

关于实时PCR，使用与实施例3相同型号的仪器，PCR条件如下：于95℃孵育1分钟后，进行40个循环的两步PCR(95℃ 15秒、60℃ 45秒)。FAM、HEX、Cy5的信号测定分别使用了激发波长为465nm、533nm、618nm、检测波长为510nm、580nm、660nm的滤波器。

基于通过二次微分法得到的Ct值，分别以2号染色体、8号染色体、7号染色体的各标记作为内源性对照，利用ΔΔCt法计算相对定量。

结果如表5中所示。

然后，对上述表5进行总结，结果表明，以表6那样的比率包含各非整倍体。

此外，针对该实验中被推定为非整倍体的植物，为了调查后来的表型而在场圃中进行栽培。结果，与西兰花同样地，各非整倍体分别显示出特征性外观(图5)(关于各染色体三体型的表型的特征，如图7中所示)。

根据以上的结果，花椰菜中也与西兰花同样地出现非整倍体，可见该方法是用于检测这些非整倍体的有效手段。

[表5-1]

表5花椰菜F1品种中的非整倍体检验结果(基于荧光探针法的多重PCR所得到的原始数据(ΔΔCt计算值))

[表5-2]

[表5-3]

[表5-4]

[表5-5]

[表5-6]

[表5-7]

[表5-8]

[表6]

表6花椰菜F1品种的基于TaqMan法的非整倍体检验结果(总结)

	植物体的数量	比率(％)
			正常(Normal)	542	96.1％
非整倍体(+C1)	4	0.7％
			非整倍体(+C2)	5	0.9％
非整倍体(+C3)	0	0.0％
			非整倍体(+C4)	1	0.2％
非整倍体(+C5)	0	0.0％
			非整倍体(+C6)	7	1.2％
非整倍体(+C7)	2	0.4％
			非整倍体(+C8)	0	0.0％
非整倍体(+C9)	1	0.2％
			非整倍体(其他)	2	0.4％

实施例5卷心菜中的变异体检测例

从坂田种苗株式会社正在开发的卷心菜F1品种“SCB-81”的栽培场圃中，选出收获期中的外观显示出与正常不同的形态的个体，从成熟叶片中提取DNA，使用与前述实施例4完全相同的方法进行非整倍体的分析。

结果如表7中所示。

其结果是，除3号染色体以外的三体型植物全部被检测出来，表明了在卷心菜中，大部分变异个体的原因也是染色体的非整倍性。

上述情况证明，根据本发明的方法不仅对于西兰花、花椰菜有效，对于卷心菜的变异个体分析也是有效的。

图6是拍摄各种非整倍体的外观而得到的(关于各染色体三体型的表型的特征，如图7中所示)。如图6、表7中所示，除了代表性的三体型以外，还存在于多条染色体中产生了非整倍性的个体。

[表7]

表7卷心菜F1品种中的非整倍体检验结果(基于荧光探针法的多重PCR所得到的原始敷据(ΔΔCt计算值))

Claims

1.甘蓝(Brassica oleracea)植物的非整倍体的检测方法，所述方法包括下述工序：

2.如权利要求1所述的方法，其包括下述工序：

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，使用下述引物作为所述DNA标记，所述引物仅对甘蓝植物的任意一条染色体DNA具有特异性，且在该染色体DNA存在时能使得PCR反应导致的扩增产物生成。

4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，作为所述DNA标记，使用：

5.如权利要求3或4所述的方法，其中，使用能与通过PCR反应合成的双链DNA结合而发出荧光的嵌入剂，或者，使用经荧光色素修饰从而能通过PCR延伸反应发出荧光的探针。

6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，使用通过实时PCR得到的荧光信号的增加作为检测染色体的非整倍体的指标。

7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，使用1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物作为所述DNA标记。

8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，使用1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物、和1种以上具有序列号19～27所示的碱基序列的探针作为所述DNA标记。

9.用于检测甘蓝植物的非整倍体的引物组，其包含至少1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物。

10.用于检测甘蓝植物的非整倍体的引物与探针的组合，其包含：

至少1种以上具有序列号1～18所示的碱基序列的引物；和

11.甘蓝作物的育种方法，其包括下述工序：使用权利要求1～8中任一项所述的非整倍体的检测方法，针对甘蓝植物的每个株系来评价所述株系各染色体的非整倍体产生频率，由此选出非整倍体产生率低的株系。

12.甘蓝种子的质量管理方法，其包括使用权利要求1～8中任一项所述的非整倍体的检测方法来检验甘蓝植物的种子中所含的非整倍体的混入率的工序。

13.甘蓝植物的质量管理方法，其包括使用权利要求1～8中任一项所述的非整倍体的检测方法来检验甘蓝植物中所含的非整倍体的混入率的工序。