MXPA05010113A - Vacunas y mutantes del virus de enfermedad infecciosa bursal. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un mutante del IBDV clasico que comprende adicionalmente, los epitopes 67 neutralizantes del virus (especificos para la variante-E del IBDV).

Description

VACUNAS Y MUTANTES DEL VIRUS DE ENFERMEDAD INFECCIOSA BURSAL Antecedentes de la Invención La presente invención se refiere a un muíante del virus de la enfermedad infecciosa bursal clásica (IBDV) y una vacuna que comprende dicho mutante IBDV clásico. El virus de la enfermedad infecciosa bursal (IBDV) es un miembro de la familia de Birnaviridae. Los virus de esta familia tienen una organización genómica muy similar, y un ciclo de replicación similar. Los genomas de estos virus consisten de dos segmentos (A y B) de un RAN de hilo doble (ds). El segmento más grande A codifica una poliproteína, la cual es disociada mediante la autoproteolisis para formar las proteínas maduras del virus VP2, VP3 y VP4. Siendo el VP2 y el VP3 las proteínas estructurales principales del virión. La VP2 es el inmunogen principal protector del huésped de los birnavirus, y contiene las regiones inmunogénicas responsables de la inducción de los anticuerpos neutralizantes del virus. Para el IBDV, existen dos serotipos, el serotipo 1 y el 2. Los dos serotipos pueden ser diferenciados por pruebas de neutralización de virus (VN). Los virus del serotipo 1 han mostrado ser patogénicos para los pollos, mientras que el IBDV del serotipo 2 solamente ocasiona una enfermedad sub- aguda en los pavos. La enfermedad infecciosa bursa! (IBD) también denominada enfermedad de Gumboro, es una infección viral altamente contagiosa aguda en los pollos que tienen un tejido linfoide en su objetivo principal con un tropismo selectivo de células de la bursa de Fabricius. El índice de morbidad en las crías susceptibles es alto, con una pérdida de peso rápida e índices de mortalidad de moderada a alta. Los pollos que se recuperan de esta enfermedad pueden tener deficiencias inmunológicas debido a la destrucción de la bursa de Fabricius, la cual es esencial para el mecanismo de defensa del pollo. El virus IBD ocasiona la inmunosupresión severa en los pollos más jóvenes de 3 semanas de edad e incluye lesiones bursales en los pollos hasta de 3 meses de edad. Por muchos años la enfermedad podía ser evitada induciendo niveles altos de anticuerpos en las reproducciones de los pollos mediante la aplicación de la vacuna inactivada, a pollos que habían sido preparados con una vacuna del IBDV vivo atenuado. Esto ha mantenido pérdidas económicas ocasionadas por el IBD hasta en un mínimo. Los anticuerpos maternos en los pollos derivados de los progenitores vacunados evitan la infección temprana con el IBDV y disminuyen los problemas asociados con la inmunosupresión. Además, las vacunas vivas atenuadas también han sido utilizadas exitosamente en las crías de pollos comerciales después que han declinado los anticuerpos maternos. Históricamente, el virus IBD consistía de solamente un tipo que es conocido como el virus IBD "clásico". Sin embargo, a mediados de 1980, se observó una enfermedad aguda en las crías vacunadas con vacunas basadas en el IBDV clásico, en particular en los Estados Unidos de Norteamérica. Se descubrió que esta enfermedad era ocasionada por el virus IBD que tenía una formación inmunogénica diferente. Estos nuevos virus probablemente surgieron como un resultado del arrastre genético. La emergencia de estas cepas del IBDV "variantes" denominadas requerían el diseño de nuevos programas de vacunación contra el IBD, debido a que las sepas de las vacunas del IBDV clásicas no podían inducir una protección cruzada adecuada. Los subtipos de variantes más importantes de los IBDVs del serotipo 1 identificadas en el pasado eran las variantes Delaware-E, GLS, RS/593 y DS326. Las cepas variantes pueden ser identificadas y distinguidas de las cepas clásicas por una prueba de neutralización del virus, y un panel de anticuerpos monoclonales de RT-PCR. La variante de Delaware-E fue reportada por Rosenberger et al. en (Proc. 20th Nati. Meet. on Poultry Health and Condemnations; Ocean City, MD, EUA, páginas 94 a 101, 1985) y Snyder et al. en (Avian Diseases 32., páginas 535 a 539, 1985). El virus GLS fue aislado en los Estados Unidos de Norteamérica en 1987 y el DS326 (similar al GLS) fue aislado en los Estados Unidos de Norteamérica en 1988 (Snyder et al., Arch. Virol. 127, páginas 89 a 101, 1992 y por Van Loon et al. en Actas del Simposio Internacional de la enfermedad infecciosa bursal y anemia infecciosa en los pollos, Rauischholzhausen, Alemania, páginas 179 a 187, 1994). La cepa RS/593 (similar a la variante E) también fue aislada en los Estados Unidos de Norteamérica en 1993, (Snyder, et al. en Actas del Simposio Internacional de la enfermedad infecciosa bursal y la anemia infecciosa en los pollos, Rauischholzhausen, Alemania, páginas 65 a 70, 1994).

Un panel de anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus (moab) generalmente utilizados en la técnica en un ensayo de inmuno enzima de captura del antigen (AC-ELISA) para identificar los diferentes tipos de IBDV. El patrón de reactividad de estos moabs con las cepas del IBDV existentes se resume en la tabla 1 siguiente.

Tabla V. Cepas diferentes del IBDV variante determinadas por el patrón del panel del anticuerpo moab. Cepal-Moab? 8 B69 R63 10 BK9 67 57 44A1 179 Clásico + + + + - - - + + Variante de + + + + + + Delaware (-E) RS/5S3 + - - - - + - - + GLS + - - + - - + + + DS326 + - - + - - + - Los moabs del VN R63 y B69 neutralizan las cepas del IBDV clásicos en altos títulos, el moab B69 se enlaza específicamente en las cepas clásicas, el moab BK9 se enlaza únicamente a las cepas de la variante E de Delaware. Una reacción positiva del moab 57 puede ser utilizada para separar las cepas GLS y DS326 de las cepas clásicas y de la variante de Delaware. Estos y otros moabs generalmente son utilizados en el campo para distinguir entre las cepas IBDV (variante) determinando el patrón de reacción del panel de moabs disponibles. Los hibridomas que secretan los moabs también están disponibles en el ATCC (Rockville, USA), bajo los siguientes números de acceso: R63 (HB-9490), 8 (HB-10174), B29 (HB-9746), BK-9 (HB-10157), 67 (HB-11122), 57 (HB- 0 56), B69 (HB-9437) y 179 (HB-10 58). Las cepas variantes del IBDV y los hibridomas también se consiguen de la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos del Instituto Pasteur, Paris, Francia, bajo los siguientes números de acceso: DS 326 (1-910), GLS (I-792 y I-793) y el moab 10 (1-2812). Aunque la importancia de algunas regiones y aminoácidos diferentes dentro de la proteína VP2 del IBDV para la variación antigénica entre las cepas del IBDV han sido propuestas (Vakharia et al., Virus Research 31_, páginas 265 a 273, 1994 y Snyder et al., Avian Diseases 38., páginas 701 a 707, 1994), la presencia obligatoria de todos los aminoácidos para la formación de los epítopes neutralizantes del IBDV no ha sido determinada todavía. En la publicación Virus Research 49, páginas 131 a 137, 1997, Vakharia et al., reportaron que la prolina de los aminoácidos está presente en la variante E del IBDV. En la solicitud de patente internacional WO 95/26196 Vakharia et al., sugirió que el involucramiento de los aminoácidos 286 (lie), 318 (Asp) y 323 (Glu) en el contexto del enlace de una proteína de la variante E del VP2 con el moab 67. Además, se describen diferencias múltiples de las secuencias de aminoácidos entre las proteínas VP2 del VP2 clásico y de la variante del IBDV. Las posiciones de los aminoácidos 222 (Pro), 249 (Gln) y 254 (Gly) fueron consideradas importantes para la formación del epítope B69 en la proteína VP2 del GLS. La Patente Europea 1170302 (Akzo Nobel N.V.) describe la preparación de una variante del muíante E. IBDV con una inmunogenicidad mejorada contra las cepas del IBDV clásicas. Este muíante del IBDV fue introducida mediante la introducción de muíaciones en la región de codificación del VP2 de la varianfe E en los codones de los aminoácidos 253 (Gln a His), 284 (Ala a Thr) y 254 (Ser a Gly), 270 (Ala a Thr). Ninguno de esíos muíanles de la varianíe E del IBDV expresan la proteína VP2 que se enlaza con el moab B69. Sin embargo, no se describe en esía paíenle información que permiía la generación de un mutaníe IBDV clásico que también exprese el epítope neutralizante de la variante E del virus. Dicho mutante sería muy útil en vacunas para inducir la protección contra la enfermedad ocasionada tanto por las cepas clásicas del IBDV, como las variantes en el campo. En la presente invención se ha construido un nuevo mutante de IBDV basado en un IBDV clásico introduciendo mutaciones en la región de codificación del VP2 tales como la proteína VP2 expresada por el virus que comprende el epítope de neutralización del virus 67 que es típico para las variantes del IBDVs. Los inventores descubrieron que en el contexto de una proteína VP2 clásica la reactividad con el moab 67 es influenciada por las secuencias de aminoácidos aproximadamente separadas 100 aminoácidos. Además, la presunción hecha por Vakharia et al., de que los aminoácidos 286 (lie), 318 (Asp) y 323 (Glu) influyen en la presencia del epítope 67 no es correcta. De hecho, los inventores han descubierto que la emergencia del epítope 67 en el contexto de una proteína VP2 del IBDV clásico depende del intercambio de prolina en la posición 222 a serina o treonina y de la presencia de ciertas secuencias de aminoácidos en las posiciones del 318 al322. El intercambio de prolina a serina o treonina a la posición 222 en la presencia de las secuencias de aminoácidos que se presentan de manera natural en una proteína VP2 de IBDV clásica con las posiciones del 318 al 323 (Gly-Gly-GIn-Ala-Gly-Asp) conducen al surgimiento del epítope 67 en una proteína VP2 del IBDV clásico . Por lo tanto, la presente invención proporciona un muíante del virus clásico de la enfermedad infecciosa bursal que expresa una proteína VP2 que se enlaza con un anticuerpo monoclonal (moab) B69, caracterizado porque la proteína VP2 también se enlaza con el moab 67, secretado por el hibridoma de las líneas celulares HB-9437 y HB-11122, depositadas en el ATCC, Rockville, EUA, respectivamente. La proteína VP2 del IBDV consiste de 512 aminoácidos y está localizada en la poliproteína en las posiciones de aminoácidos del 1 al 512. Las secuencias de nucleótidos de (del segmento A completo que comprende) la región de codificación VP2 y las secuencias de aminoácidos correspondientes de la proteína VP2 de muchas cepas del IBDV clásico ha sido determinada (Patente Norteamericana No. 5,871,744, Patente Europea EP 887,412 para D78; NCBI GeneBank). Todos los moabs conocidos que muestran las propiedades neutralizantes del virus, incluyendo el moab B69 es específico para las cepas del IBDV clásicas, son cultivadas exclusivamente contra la proteína VP2, y reconocen los epítopes de pendientes de la conformación. La comparación de muchas secuencias de aminoácidos del VP2 clásico y variante, en particular de la variante E y GLS, se describen en la publicación de Vakharia et al. en (1994, mencionada anteriormente), y en la publicación de Heine et al. en (J. Gen. Virol. 72., páginas 1835 a 1843, 1991 ). Aunque la variación biológica entre las cepas del virus existen dentro del tipo clásico de las cepas IBDV la secuencia de aminoácidos de la proteína VP2 es fuertemente conservada. La homología de aminoácidos entre las secuencias de aminoácidos clásicas del VP2 varia entre un 98% y el 99.4% en la longitud total de la proteína (basada en la comparación con la secuencia del aminoácido del VP2 de la cepa del IBDV D78). Una región central con la proteína VP2 fue identificada, la cual contiene la parte más variable del VP2. Esta región está localizada en las posiciones de aminoácidos del 206 al 350 (Bayliss et al., J. Gen. Virol. TV, páginas 1303 a 1312, 1987) y la homología de aminoácidos entre las secuencias de aminoácidos VP2 clásicas dentro de esta región varía entre el 95.9% y 97.9% (basada en una comparación con una secuencia de aminoácidos del VP2 de la cepa del IBDV D78). En esta región central están identificadas dos regiones hipervariables, en las posiciones del 212 al 224 y del 314 al 326, en la cual ocurren la mayor parte de los cambios de aminoácidos entre los tipos diferentes de cepas de IBDV (Vakharia et al., 1994, mencionado anteriormente). No obstante esto, las cepas IBDV más clásicas comprenden una secuencia de aminoácidos en la región del 200 al 230 que es idéntica a la del VP2 a la de la cepa IBDV D78: Ser-Asp-Arg-Pro-Arg-Val-Tyr-Thr-lle-Thr-Ala-Ala-Asp-Asp-Tyr-GIn-Phe-Ser-Ser-Gln-Tyr-Gln-Pro-Gly-Gly-Val-Thr-Ile-Thr-Leu-Phe (SEQ ID no. 19). Las secuencias son analizadas en la presente descripción con el Paquete de Wisconsin, versión 8 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Por lo tanto, un IBDV clásico es definido en la presente descripción, como un IBDV aislado que comprende una región de codificación VP2 que expresa una proteína VP2 que puede enlazarse con el moab B69. Más en particular, se define un IBDV clásico como un IBDV aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de VP2 en las posiciones del 200 al 230 que es la misma a la de la cepa D78 (SEQ ID no. 19). La reacción de un moab con el IBDV puede ser determinada por medio de una prueba de AC-ELISA que generalmente es utilizada en la técnica para este propósito, tal como lo describen (Snyder et al. (1992, mencionado anteriormente), y van der Marel et al. en (Dtsch. Tierartzl. Wschr. 9_7, páginas 81 a 83, 1990). Alternativamente, la reacción de un IBDV con un moab también puede ser determinada por medio de un ensayo de inmunof luorescencia tal y como se describe en el ejemplo 1. Un muíante de IBDV clásico preferido de acuerdo con la presente invención, expresa una proteína VP2 que además del moab B69 y el moab B67 se enlaza con el moab R63, secretado por la línea celular del hibridoma HB-9490, depositada en el ATCC, Rockville, EUA. El moab R63 puede neutralizar tanto las cepas clásicas como las de la variante E del IBDV. La presente invención identifica por primera vez cuales residuos de aminoácidos en el contexto de una proteína VP2 clásica que son requeridos y suficientes para (i) la formación de un epítope neutralizante que se enlaza con el moab R63 (clásico y variante E), (¡i) la formación adicional de un epítope neutralizante que se enlaza con el moab 67 (variante E) y (Mi) para la formación adicional de un epítope neutralizante que se enlaza con el moab 57 (GLS). Los inventores prepararon un número de mutantes de IBDV tal y como se definieron anteriormente introduciendo mutaciones en la región de codificación de la proteína VP2 de una cepa de IBDV clásica (ejemplo 1). Los resultados obtenidos demuestran que se pueden replicar epítopes idénticos mediante secuencias de aminoácidos diferentes, mientras que otras secuencias de aminoácidos fallan en generar las epítopes de la variante. Por lo tanto, existe una capacidad específica de codificación para un epítope específico. Un resumen de las secuencias de aminoácidos importantes que son requeridas para la replicación apropiada para los epítopes 67, 57 y R63 se presentan en la tabla 2 (SEQ ID No.'s 1-5, 6-9 y 10-18, respectivamente). La información proporcionada en la tabla 2 permite que un experto en la técnica genere mutantes de IBDV clásicos con capacidad de expresar una proteína VP2 que además del epítope neutralizante del virus B69 comprende también un epítope neutralizante del virus 67 que es específico para las cepas del IBDV de la variante E.

Tabla 2: Resumen de aminoácidos esenciales para la replicación del epítope.

Por lo tanto, un muíante IBDV clásico particularmenfe preferido es un muíaníe que se enlaza con el anlicuerpo moab B69 y el aníicuerpo moab 67, y comprende una o más mutaciones en una región de codificación VP2 clásica de modo que la región de codificación comprende, (i) un codón para el aminoácido en la posición 222 de codificación de serina o treonina, y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de la SEQ ID. no. 1 a 5 en las posiciones del 318 a 323. Se ha descubierto que la secuencia de amino ácidos en las posiciones del 318 al 323 como se muestran en la tabla 2 dieron como resultado una reaplicación apropiada del epítope 67 solamente en el caso en que el aminoácido de la posición 222 (prolina) fue cambiado a serina o treonina, implicando que la replicación apropiada del epítope es influenciada por los aminoácidos localizados 100 posiciones separadas. Aunque el amino ácido en la posición 330 no es crítico, un muíante IBDV ventajoso comprende además un codón que codifica el aminoácido arginina o serina en esta posición. Una propiedad ventajosa adicional de un muíante IBDV clásico como se definió anteriormeníe es de modo íal que un muíante también expresa una proteína VP2 que tiene una secuencia de aminoácidos requerida para la replicación apropiada del epítope neuíralizador del virus R63. Se ha demosfrado en la tabla 2 en el ejemplo 1, que un IBDV que expresa una proteína VP2 que tiene una secuencia de aminoácidos en las posiciones del 318 al 323 como se muestra en cualquiera de las SEQ ID nos. del 14 al 15 y del 17 al 18 (además de una serina o treonina en la posición 222) muestra el epítope R63 pero falla en mostrar el epítope 67. Una observación sorprendente adicional hecha por los inventores es que un intercambio de un amino ácido en la región de codificación VP2 en las posiciones del 318 al 323 de una cepa IBDV clásica da como resultado una disminución de las propiedades de proliferación de dichos mutantes. Dichos mutantes muestran un fenotipo atenuado para los pollos y puede ser utilizado de manera provechosa como candidatos para la vacuna con propiedades de seguridad mejoradas, en particular, en vacunas que son administradas por medio de la ruta in ovo. Por lo tanto la presente invención también proporciona un mutante IBDV clásico que comprende una o más mutaciones en una región de codificación VP2 clásica de modo que la región de codificación comprende una secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos en posiciones del 318 al 323 que es diferente a la secuencia de aminoácidos natural Gly-Gly-GIn-Ala-Gly-Asp (SEQ ID no. 1). Preferentemente, estos mutantes IBDV clásicos comprenden una secuencia de aminoácidos en estas posiciones como se muestran en cualquiera de las SEQ ID Nos. 2 al 9 y del 11 al 18, opcionalmente junto con un aminoácido en una posición 222 y/o 330 tal y como se definió anteriormente.

Un muíante IBDV clásico de acuerdo con la presente invención puede ser preparado introduciendo las mutaciones requeridas en una región de codificación VP2 derivada de cualquier cepa del IBDV clásico que se puede aislar del campo o ser utilizado en vacunas. Las cepas IBDV clásicas incluyen las cepas IBDV bien conocidas, presentes en las vacunas que se consiguen comercialmente, tales como las cepas D78, PBG98, 228E y 89-03 (Intervet International B.V.). La cepa D78 del IBDV (Patente Norteamericana No. 4,530,831) también se puede conseguir en el ATCC bajo el número de acceso VR-2041. La secuencia de nucleótidos del segmento A completo de la cepa D78 incluyendo la región de codificación VP2, y la secuencia de aminoácidos de la (poli)proteína correspondiente se describen en la Patente Norteamericana No. 5,871,744 y la Solicitud Europea 887,412. En particular, un muíante IBDV clásico se proporciona de modo que comprende una o más muíaciones en la región de codificación VP2 de la sepa D78 del IBDV clásico. Un mutaníe IBDV clásico preferido adicional de acuerdo con la presenfe invención comprende la estructura genética completa del segmento A de la cepa IBDV clásica, incluyendo la región de codificación VP2 clásica mutada como se describió anteriormente. Más en particular, un muíante IBDV clásico como se definió aníeriormente es derivado de la cepa D78 del IBDV. Sin embargo, un muíante IBDV clásico de acuerdo con la presente invención también puede estar basado en la estructura genética de una cepa IBDV variante tal como una variante E, o una cepa GLS. En dicho muíante IBDV clásico "quimérico" las secuencias codificadoras VP2 en la esfrucíura genélica del segmento A de una cepa IBDV variante son reemplazadas por las secuencias de codificación del VP2 clásico relevantes correspondientes que comprenden adicionalmente las mutaciones deseadas que son responsables de los nuevos epítopes de la variante en el muíante IBDV clásico. La generación de un muíante IBDV clásico de acuerdo con la presente invención puede ser lograda por medio del sisíema de cARN infeccioso recientemente establecido para el IBDV (Mundí y Vakharia, Proc. Naíl. Acad. Sci. USA 93.. páginas 11131 a 11136, 1996). Este sistema de genética inversa proporciona la posibilidad de introducir mutaciones en un genoma de ARN del IBDV. El paso más importaníe en esíe sisíema genético inverso es proporcionar los clones del cADN de longitud completa de los segmentos A y B del IBDV, incluyendo los nucleótidos de los extremos 5'- y 3'-, de ambos de esíos segmenios. Después de los procedimieníos de clonación, las secuencias de longitud completa del segmenío A y B son enlazadas de manera operable a un promotor el cual puede enlazar una polimerasa de ARN dependiente del ADN, tal como la polimerasa 17, SP6 ó T3, siendo preferido el promotor T7. La polimerasa dependiente del ADN puede describir el cARN viral de los clones de cADN de longitud completa del segmento A y B, respectivamente. Este cARN puede inducir la replicación del virus y el aislamiento del virus viable. Este procedimiento puede ser realizado con cualquier IBDV que ocurre de manera natural. El sistema de genética inverso ha sido descrito para diferentes cepas de IBDV tales como la cepa D78 (Yao et al., J. Virol. 72, páginas 2647 a 2657, 1998), la cepa HK46 (Lim et al., J. Virol. 73, páginas 2854-2862, 1999), la cepa CEF 94 (Boot et al., Virology 265. páginas 330 a 341, 1999) y la cepa UK661 (van Loon et al., J. Gen. Virol. 83, páginas 121 a 129, 2002). Las mutaciones deseadas pueden ser introducidas en el genoma del IBDV por medio de métodos generalmente conocidos en la técnica para este propósito. En particular, las mutaciones son introducidas por medio de mutagénesis dirigida al sitio. Los métodos para la introducción de una mutación en el genoma del IBDV se describen aquí, pero también son utilizadas generalmente en la técnica (Mundt y Vakharia, 1996, mencionado anteriormente; Yao et al., J. Virology 72, páginas 2647 a 2654, 1998; Mundt et al., 1999, mencionado anteriormente; la solicitud de Patente Europea No. 1170302; las ediciones de Protocolos Actuales en Biología Molecular, y ediciones de: F. M. Ausubel et al., Wiley N.Y., edición de 1995, páginas de la 8.5.1. a 8.5.9. y la publicación de Kunkel et al. en Methods in Enzymology vol. 154, páginas 376 a 382, 1987). Los números aquí utilizados para indicar las posiciones de aminoácidos se refieren a la numeración de los aminoácidos en la poliproteína del IBDV como se utilizan generalmente en la técnica. Los números que indican las posiciones de los nucleótidos están basados en la secuencia completa de nucleótidos del segmento A del genoma del IBDV tal y como lo describieron Mundt and üller en (J. Gen. Virol. 77. páginas 437 a 443, 1995; número de acceso al NCBI X 84034). El segmento B del muíante del IBDV clásico de acuerdo con la presente invención puede ser derivado de cualquier cepa IBDV, preferentemente de una cepa de IBDV clásico, y más preferentemente de la cepa D78 ó P2 (Patente Norteamericana No. 5,871,744 y Solicitud de Patente Europea No. EP 887412). Como se demostró en los ejemplos, el mutante IBDV clásico de acuerdo con la presente invención muestra una formación inmunogénetica que no es observada antes para las cepas IBDV clásicas. El nuevo mutante IBDV clásico puede formar la base de un nuevo tipo de vacunas contra el IBDV que puede proteger efectivamente, a los pollos contra las condiciones de enfermedad resultantes de la infección tanto por las cepas del IBDV clásicas como variantes. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es una vacuna para utilizarla en la protección de los pollos contra la enfermedad causada por la infección por el IBDV, caracterizada en que la vacuna comprende un mutante IBDV clásico como se definió anteriormente junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. El mutante de IBDV clásico puede ser incorporado en la vacuna como un virus vivo atenuado o inactivado. Una vacuna de acuerdo con la presente invención puede ser preparada mediante métodos convencionales tales como por ejemplo, los métodos generalmente usados para las vacunas contra el IBDV vivo e inactivado disponibles comercialmente. Brevemente, un substrato susceptible es inoculado con un mutante del IBDV clásico de acuerdo con la presente invención, y propagado hasta que el virus es replicado hasta un título infeccioso deseado después de lo cual el material que contiene el IBDV es cosechado, opcionalmente inactivado, y mezclado con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Cualquier substrato que pueda soportar la replicación de los IBDVs puede ser utilizado para preparar una vacuna de acuerdo con la presente invención, incluyendo los cultivos celulares primarios (de aves) tales como, las células del fibroblasto del embrión de pollo (CEF), o las células del hígado del embrión de pollo (CEL), las líneas celulares de mamífero tales como la línea celular VERO, o la línea celular BGM-70, o las líneas celulares de aves tales como QT-35, QM-7 ó LMH. Generalmente, después de la inoculación de las células, el virus es propagado durante un período de 3 a 14 días, después del cual el sobrenadante del cultivo celular es recolectado, y si se desea filtrado o centrifugado con el objeto de remover los desechos celulares. El muíante de IBDV clásico también puede ser propagado en los huevos de pollo embrionados. Si se desea, la atenuación del IBDV clásico puede ser obtenida mediante el paso en serie estándar del virus en los cultivos celulares, por ejemplo, en los cultivos celulares primarios o las líneas celulares establecidas mencionadas anteriormente (Bayyari et al., Avian Diseases 40. páginas 516 a 532, 1996; Tsai et al., Avian diseases 3_6, páginas 415 a 422, 1992). Alternativamente, el IBDV clásico puede ser propagado ¡n vivo en pollos infectados seguido por el aislamiento de bursa de Fabricius de estos animales infectados, mezclándola con un diluyente y homogenizando la mezcla. El IBDV propagado de esta manera generalmente forma la base de una vacuna inactivada.

La vacuna de acuerdo con la presente invención que contiene el virus vivo puede ser preparada y comercializada en la forma de una suspensión, o en una forma liofilizada y adicionalmente contiene un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable acostumbrado utilizado para dichas composiciones. Los vehículos incluyen estabilizadores, conservadores y reguladores. Los estabilizadores adecuados son, por ejemplo, SPGA, carbohidratos (tales como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano, glutamato o glucosa), proteínas (tales como suero de leche seca, albúmina o caseína), o los productos de degradación de los mismos. Los reguladores adecuados son por ejemplo, fosfatos de metal alcalino. Los conservadores adecuados son timerosal, merthiolate y gentamicina. Los diluyentes incluyen agua, regulador acuoso (tal como solución salina regulada) alcoholes y polioles (tales como glicerol). Si se desea, las vacunas vivas de acuerdo con la presente invención pueden contener un adyuvante. Los ejemplos de los compuestos adecuados y composiciones con actividad adyuvante son los mismos que se mencionarán más adelante. Aunque la administración por medio de inyección, por ejemplo, intramuscular, subcutánea o ¡n ovo de la vacuna viva de acuerdo con la presente invención es posible, la vacuna es administrada preferentemente por medio de una ruta de aplicación masiva no costosa generalmente utilizada para la vacunación de IBDV. Para la vacunación del IBDV esta ruta incluye tomar agua, y la vacunación por medio de rocío y aerosol. Alternativamente, la presente invención proporciona una vacuna que comprende la variante IBDV en una forma inactivada (exterminada). Una ventaja de una vacuna de IBDV inactivada son los altos niveles de anticuerpos protectores de larga duración que pueden ser obtenidos. El objetivo de la inactivación del virus recolectado después del paso de propagación es eliminar la reproducción del virus. En general, esto se puede lograr mediante medios químicos o físicos bien conocidos en la técnica. Una vacuna que contiene un IBDV variante inactivado puede, por ejemplo, comprender uno o más de los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables anteriormente mencionados adecuados para este propósito. Preferentemente, una vacuna inactivada de acuerdo con la presente invención comprende uno o más compuestos con actividad adyuvante. Los compuestos o composiciones adecuados para este propósito incluyen hidróxido de aluminio, -fosfato u -óxido, emulsión de aceite en agua o agua en aceite basada en, por ejemplo, un aceite mineral, tal como Bayol F® o Marcol 52® o un aceite vegetal tal como acetato de vitamina E, y saponinas.

La vacuna de acuerdo con la presente invención comprende una dosificación efectiva del muíante IBDV clásico como el compuesto activo, por ejemplo, una cantidad de material inmunizante contra el IBDV que inducirá la inmunidad en las aves vacunadas contra el reto por un virus virulento. La inmunidad es definida en la presente descripción como la inducción de un nivel significativamente más alto de protección en una población de aves después de la vacunación comparada con un grupo sin vacunar. Generalmente, la vacuna viva de acuerdo con la presente invención puede ser administrada en una dosis de 10° a 109 de TCID50 por animal, preferentemente en una dosis en un rango de 103 a 106 de TCID50 por animal. Las vacunas inactivadas pueden contener el equivalente antigénetico de 106 a 1010 de TCID50 por animal. Las vacunas inactivadas generalmente son administradas por la vía parenteral, por ejemplo, intramuscular o subcutánea. Aunque la vacuna contra el IBDV de acuerdo con la presente invención puede ser utilizada efectivamente en pollos, también otras aves tales como pavos, aves de guinea y perdices, pueden ser vacunados de manera exitosa con la vacuna. Los pollos incluyen pollos para azar, pollos, animales de reproducción y animales ponederos. La edad de los animales que reciben una vacuna viva o inactivada de acuerdo con la presente invención es la misma a la edad de los animales que reciben las vacunas contra el IBDV vivas e inactivadas convencionales. Por ejemplo, los pollos para azar (libres de los anticuerpos MDA derivados maternalmente) pueden ser vacunados a la edad de un día o in ovo, mientras que los pollos para azar con niveles altos de MDA son preferentemente vacunados a una edad de 2 a 3 semanas. El material para las aves ponederas o aves de reproducción con bajos niveles de MDA pueden ser vacunados a una edad de 1 a 10 días, seguido por vacunas de refuerzo con vacunas inactivadas a las edades de 6 a 12 semanas, y de 16 a 20 semanas. La presente invención también incluye vacunas de combinación que comprenden, además del muíante contra el IBDV clásico descrito anteriormente, uno o más componentes de vacunas de otros patógenos infecciosos para las aves. De preferencia, la vacuna de combinación comprende adicionalmente una o más cepas de vacunas para los virus de la enfermedad de Mareks (MDV), el virus de bronquitis infecciosa (IBV), virus de la enfermedad Newcastle (NDV), virus del síndrome de caídas de huevos (EDS), virus de la rinotraqueitis del pavo (TRTV), o reovirus. Descripción Detallada de la Invención EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de mutantes contra el IBDV clásico y la determinación de la reactividad del anticuerpo monoclonal Materiales y Métodos Generación del Segmento A mutado Para los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio pD78A (Mundt y Vakharia, mencionado anteriormente, 1996; la Solicitud Europea EP 887412) fueron utilizados. Para este fin, el pD78A fue disociado del EcoRI/Kpnl, y el segmento A que comprende el fragmento fue ligado en el pBlueScript KS + disociado correctamente para obtener el pSK+-D78A. Después de la preparación de un solo sitio de hilo de ADN los experimentos conducidos fueron realizados de acuerdo con el método de Kunkel et al. (mencionado anteriormente, 1987) utilizando los oligonucleótidos especificados en la tabla 3. Los oligonucleótidos Mut1, Mut2, Mut3, Mut4, Mut5, Mut6, Mut7, Mut8, Mut9, Mut10, Mut11, fueron utilizados para generar los plásmidos mutados pMutl, pMut2, pMut3, pMut4, pMut5, pMut6, pMut7, pMut8, pMut9, pMutIO y pMut11, respectivamente. Utilizando estos once plásmidos mutados de un ADN de un solo hilo se prepararon y utilizaron junto con un ADN de un solo hilo del pSK+-D78A en experimentos de mutagénesis dirigida al sitio. Estos experimentos se realizaron con uno (P222S ó R339S) o dos oligonucleótidos (P222S y R339S) en un experimento para obtener uno o dos intercambios de los tripletes básicos. Los plásmidos mutagenizados obtenidos (mostrados en la tabla 4) fueron elaborados en secuencias y utilizados para experimentos posteriores. Transfeccion del cARN, ensayos de ¡nmunofluorescencia y paso del virus generado Para la transcripción ¡n vitro, los plásmidos que contienen el pD78A y los plásmidos mutagenizados fueron ünealizados mediante la disociación con BsrG I. pP2B (Mundt & Vakharia, mencionada anteriormente, 1996; Solicitud de Patente Europea EP 887412) fueron ünealizados utilizando el Pst I. Tratamiento adicional del ADN linealizado, la trascripción y la transfeccion del ARN en las células del BHK 21 se llevó a cabo como lo describió Mundt (J. Gen. Virol. 80., páginas 2067 a 2076, 1999). Para el ensayo de ¡nmunofluorescencia, se cultivaron células BHK21 en placas de cultivo de tejidos de 24 depósitos que fueron transfectadas, y 24 horas después de la transfeccion de acetona/metanol (50%/50%) fijado durante 5 minutos y secado. Las células fijadas fueron incubadas con los anticuerpos monoclonales 67, B69, 57, R63 y suero anti-IBDV de conejo (Mundt et al., J. Gen. Virol. 76, páginas 437 a 443, 1995), respectivamente, diluidos en solución salina regulada por fosfato (PBS) durante 30 minutos, y enjuagados tres veces con PBS. Las células ahora fueron incubadas durante 30 minutos, en un IgG anti-conejo cabra conjugado con DTAF diluido con PBS, o DTAF conjugado con IgG anti-ratón cabra (Dianova, Hamburgo, Alemania) seguido por tres lavados utilizando PBS y un lavado con agua destilada. Después de secar las células al aire se montaron en el 2.5% de 1.4.-Diazobiciclo(2.2.2.)-octano (DABCO, Sigma, Deisenhofen, Alemania) con un contenido de PBS, y 90% de glicerol. La fluorescencia fue visualizada utilizando un microscopio de fluorescencia inmerso. Para el paso del virus generado se cultivaron células BHK21 en placas de cultivo de tejido en 6 depósitos que fueron transfectadas en paralelo a los experimentos de transfección en las placas de cultivos de tejidos de 24 depósitos e incubadas por un período de 24 a 48 horas. Después de la congelación/descongelación a una temperatura de -70° durante por lo menos una hora el sobrenadante obtenido fue centrifugado en 6400 x g durante 10 minutos, y pasado sobre las células QM cultivadas en un matraz de cultivo de tejidos de 25 cmz hasta que fue visible el CPE. El sobrenadante fue obtenido como se describió anteriormente, se formaron alícuotas y se almacenó a una temperatura de -70°C. Para el análisis de la viabilidad y presencia de reactividad con las células QM mmAb cultivadas en las placas de cultivo de tejidos de 24 depósitos fueron infectadas con un alícuota e incubadas durante 24 horas. El ensayo de inmunofluorescencia se realizó como se describió anteriormente.

Análisis de proliferación del virus generado en el cultivo celular Para monitorear el CEC reproducido en las placas de cultivo de tejidos de 24 depósitos las cuales se infectaron con el IBDV seleccionado en un MOI de 1 durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Después, el inoculo fue removido, las células fueron lavadas con medio y 1ml del medio fue agregado. Los sobrenadantes fueron recolectados por separado Inmediatamente después (0 h), y después de las horas 8, 12, 16, 24 y 36 de la incubación a una temperatura de 37°C, y almacenados a una temperatura de -70°C. los títulos del virus fueron obtenidos mediante la determinación del TCID50 utilizando las células QM (células del músculo del Codorniz) cultivadas en placas de cultivo de tejidos de 96 depósitos. Para este fin, los sobrenadantes se descongelaron y fueron titulados en los pasos Iog10. 100 I de cada una de la dilusión apropiada se envasaron en pipetas en cuatro pipetas en una placa de tejido celular seguido por la adición de 100µ? de una suspensión de células QM (106 células/ml). Las placas fueron incubadas a una temperatura de 37°C. Después de cinco días los depósitos con el CPE fueron determinados como positivos, y el TCID50 fue determinado después del Spaerman (Brit. J. Psychol.., 2, páginas 227 a 242, 1908) y el Karber (Arch. Exp. Path. Pharmak., 162, páginas 480 a 487, 1931 ). Los valores promedio y las desviaciones estándar de los tres experimentos independientes fueron calculados. Resultados Influencia del intercambio de aminoácidos en la región variable del VP2 en la reactividad de los anticuerpos monoclonales Los aminoácidos localizados en la secuencia de la cepa D78 en la posición 222 (prolina), 318 (glicina), 321 (alanina), y 323 (aspartato) fueron intercambiados con aminoácidos de serina, treonina (P222S, P222T), aspartato, asparagina (G318D, G318N, glutamato (A321E), y glutamato (D323E), respectivamente, en combinaciones diferentes (ver tabla 4). El intercambio de prolina en la posición 222 a serina dio como resultado una reactividad adicional del anticuerpo moab 67 si la secuencia aa de un doble aa de la posición 318 a 323 fue las siguientes combinaciones: GGQAGD, DGQAGD, DGQAGE, GGQAGE, NGQAGE. Las combinaciones restantes de la secuencia aa de la posición 318 a 323 (DGQEGD, DGQEGE, GGQEGD, GGQEGE, NGQAGD, NGQEGD, NGQEGE) parece prevenir la replicación del epítope caracterizado por el anticuerpo moab 67, aún si la prolina en la posición 222 fue intercambiada por serina. El enlace del anticuerpo moab 57 fue detectado después del intercambio del aa 321 de alanina a glutamato, independientemente si el amino ácido 222 (prolina), 318 (glicina), y 323 (aspartato). Pero el intercambio de arginina a serina en la posición 330 influyó en la presencia del epítope 57. En este caso si el intercambio realizado (R330S) fue realizado en la presencia de la combinación DGQEGD, NGQEGD y NGQEGE, respectivamente, no se detectó reactividad con el anticuerpo moab 57 después de los experimentos de co-transfección. En contraste, el intercambio R330S no mostró influencia en la reactividad con el anticuerpo moab 57 en presencia de la combinación GGQEGD. La presencia de la reactividad del anticuerpo moab 57 y R63 excluida entre ellas en los experimentos realizados ya que si el epítope 57 estaba presente, el epítope R63 estaba ausente. Además la reactividad con el anticuerpo moab R63 después de los experimentos de co-transfección fue registrado después del uso de plásmidos que codifican las combinaciones GGQAGD, DGQAGD, DGQAGE, GGQAGE, NGQAGD y NGQAGE del aa 318 al 323 localizado en la región VP2 independiente de si el aa 222 (prolina) o aa 330 (arginina) fue intercambiado. La proteína traducida del cANR de los plásmidos que codifican las secuencias de aminoácidos DGQEGE ó GGQEGE de la posición 318 a la 323 del gen de la poliproteína reaccionó solamente con el anticuerpo moab 69. En este caso también el intercambio del aa 222 y/o 330 parece no tener influencia en la reactividad. Después de que todas las células de los experimentos de transfección fueron congeladas/descongeladas, y obtenidos los sobrenadantes, estos fueron pasados. En cada caso, el virus viable fue generado indicando que los aminoácidos mutagenizados realizados no tenían influencia en la viabilidad e infectividad del cultivo celular del virus. Análisis de la proliferación en el cultivo celular Para probar si el intercambio de aminoácidos influye en la proliferación del virus mutado, se analizaron varios IBDV mutados (D78, Mut1, Mut2, PS-D78, PS-Mut1, PS-Mut2, Mut10, Mut11). Para este fin, se seleccionaron IBDV generados los cuales contienen el mismo patrón de reactividad cuando el panel utilizó el anticuerpo moab. Tal y como se muestra en la figura, la proliferación del virus fue influida por el intercambio de los aminoácido de los intercambios en ciertas regiones. El intercambio de aminoácidos 222 de prolina a serina no mostró influencia en la proliferación en el cultivo celular. En contraste, el intercambio en la región del aminoácido 318 al 323 influyó en la proliferación de los mutantes investigados. Estos mutantes se proliferan en títulos más bajos en todos los puntos del tiempo investigados indicando que la región del aa 318 al aa 323 no es de importancia para la proliferación en el cultivo celular.

Tabla 3: Oligonucleótidos utilizados en la mutagénesis dirigida al sitio.

Tabla 4: Resultados de la mutagénesis dirigida al sitio, experimentos de transfección, y ensayo de inmunofluorescencia. Oligo- aa- 57 R63 67 B69 Viable SEQ ID Plásmidos0 nucleótidos secuenciac No. pD7SA GGQAGD - + - + + 1 P222S pD78A-P222S GGQAGD - + + + + 1 P222T pD78A-222T GGQAGD 1 R330S pD78A- R330S GGQAGD - + - + + 1 P222S, pD78A-P222S GGQAGD + + + + 1 R330S R330S Mut1 pMutl DGQAGD - + - + + 3 Mut1, P222S pMut1-P222S DGQAGD - + + + + 3 Mut1, R330S p ut1-R330S DGQAGD - + - + + 3 Mut1, P222S, pMutl- P222S - DGQAGD + + + 3 R330S R330S Mut2 p u!2 DGQAGE - + - + + 4 Mut2, P222S p ut2-P222S DGQAGE - + + + 4 Mut2, P222T pMut2-P222T DGQAGE 4 Mut2, R330S pMut2-R330S DGQAGE- - + - + + 4 Mut2, P222S, pMut2- P222S - DGQAGE + + + + 4 R330S R330S Mut3 pMut3 DGQEGD + - - + + 7 Mut3, P222S pMut3-P222S DGQEGD + - - + + 7 Mut3, R330S pMut3-R330S DGQEGD - + - + + 7 ut4 p ut4 DGQEGE - - - + + 34 Mut4, P222S pMut4-P222S DGQEGE - - - + + 34 Mut4, R330S pMut4-R330S DGQEGE - - - + 34 Mut5 pWlut5 GGQAGE - + - + + 2 Mut5, P222S pMut5-P222S GGQAGE - + + + 2 Mut5, P222T pMut5-P222T GGQAGE 2 Mut5, R330S pMut5-R330S GGQAGE - + - + + 2 Mut6 pMut6 GGQEGD + - - + + 6 Mut6, P222S pMut6-P222S GGQEGD + - - + + 6 Mut6, R330S pMut6-R330S GGQEGD + - - + + 6 Mut7 p ut7 GGQEGE - - - + + 35 Mut7, P222S pMut7-P222S GGQEGE - + - + + 35 Mut7, R330S pMut7-R330S GGQEGE - - - + + 35 Mut8 p trt8 MGQAGD - + - + + 15 Mut8, P222S pMut8-P222S NGQAGD - + - + + 15 Mut8, R330S pMut8-R330S MGQAGD - - + + 15 Mut9 pMut9 NGQAGE - - + + 16 Mut9, P222S p ut9-P222S NGQAGE - + + + 16 Mut9, P222T p ut9-P222T NGQAGE 16 Mut9, R330S p ut9-R330S f!GQAGE - + - + + 16 Mut'iO pMuflO HGQEGD - - + + 8 MutlO, pMut10-222S MGQEGD + + + 8 P222S MutlO, p ut10-330S MGQEGD + + + 8 R330G Mut 1 pMut1 MGQEGE - - + + 9 utH, pMut'M-222S NGQEGE + + + 9 P222S Mut11 , pMut 1-330S NGQEGE + - + + 9 R330S a Oligonucleótidos utilizados para los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio. D Plásmidos mutagenizados obtenidos utilizados para experimentos de transfección. c Secuencia de aminoácidos localizada en las posiciones de aminoácidos del 318 al 323 se muestran con un código de una sola letra, y los aminoácidos intercambiados en comparación con la secuencia D78 están escritos con negritas.

Ejemplo 2 Propiedades antigénicas de los mutantes de IBDV clásico Material v Métodos Caracterización del virus mutante mediante el ensayo de neutralización Para probar si el virus generado fue neutralizado por los ensayos de neutralización del anticuerpo monoclonal se realizaron esencialmente como lo describen (Schróder et al., J. Gen. Virol., 81_, páginas 533 a 540, 2000). Brevemente, se envasó en pipetas "???µ? de una solución de virus con un contenido de 750 TCID50/1 ??µ?, en cada depósito en una placa de cultivo de tejido de 96 depósitos con excepción del primer depósito de cada fila. Entonces, se envasaron en pipetas 100µ? de cualquiera de los anticuerpos diferentes (67, B69, 57, R63), o el suero anti-IBDV de conejo policlonal en el primer depósito vacío de cada fila. Para los depósitos que contienen el anticuerpo, se agregaron entonces 100 µ? de suspensión del virus con un contenido de 1500 TCiD5o/1 ??µ?. Después de mezclar el virus se hicieron diluciones del suero en serie, mediante la transferencia en serie de 10?µ?/depósito. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se agregaron 100µ? de células QM (10s células/ml) a cada depósito y se incubaron a una temperatura de 37°C. Seis días después, se marcaron los depósitos por la presencia del CPE. Para este punto final de la prueba VN para una muestra de suero fue determinado como que era recíproca de la dilución más alta, expresada en el log2, en la cual no era visible el CPE. Resultados Propiedades antigénicas en el ensayo de neutralización Para probar si los mutantes generados podrían ser neutralizados por los ensayos de neutralización de anticuerpos monoclonales apropiados se realizaron. Para este ensayo, se seleccionaron pares del virus los cuales mostraron ya sea un patrón mAb diferente basado en un intercambio de aminoácidos (D78, PS-D78; Mut1, PS- ut1; Mut2, PS- ut2), o el mismo patrón pero secuencias de aminoácidos diferentes (D78, Mut1, Mut2,; PS-D78; PS-Mut1, PS-Mut2; Mut10, Mut11). Los resultados mostraron (tabla 5) que ocurrió la neutralización en la mayor parte de los casos (D78, ut1, Mut2, PS-D78, PS-Mut1, PS-Mut2, Mut11) en el mismo patrón que en el ensayo de fluorescencia. Una excepción fue el Mut11, el cual no fue neutralizado por el mAb 57, aunque fue positivo en el ensayo de fluorescencia indicando que el epítope estaba presente pero que perdió su propiedad de neutralización.

Tabla 5: Ensayo de neutralización de los mutantes IBDV utilizando suero policlonal, y anticuerpos monoclonales IBDV recombinante utilizado en el ensayo de neutralización. D resultados del patrón del panel en el ensayo de inmunofluorescencia indirecto utilizando los anticuerpos moabs (57, R63, 67, B69) tal y como se muestra en la tabla 4. c En el ensayo de neutralización cuatro anticuerpos moabs (57, R63, 67, B69), y un suero anti-IBDV de conejo policlonal. d título de neutralización en log„ del suero diluido.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Un muíante del virus de la enfermedad infecciosa bursal clásico (IBDV) que expresa una proteína VP2 que se enlaza con un anticuerpo monoclonal (moab) B69, caracterizado porque la proteína VP2 también se enlaza con el anticuerpo moab 67, secretado por las líneas celulares del hibridoma HB-9437 y HB-11122, depositadas en el ATCC, Rockville, EUA, respectivamente.
2. 2. El muíante de IBDV clásico tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la proíeína VP2 se enlaza con el aníicuerpo moab B69, moab 67 y moab R63 seleccionado de la línea celular del hibridoma HB-9490, deposiíado en el ATCC, Rockville, EUA.
3. 3. Un muíanle del IBDV clásico íal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el mufaníe comprende una o más mutaciones en la región de codificación del VP2 clásico de modo que la región de codificación comprende, (i) un codón para el aminoácido en la posición 222 que codifica serina o treonina, y (i¡) una secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID. Nos. del 1 al 5 en las posiciones del 318 al 323.
4. 4. Un mutante IBDV clásico íal y como se describe en la reivindicación 3, caracterizado porque la región de codificación comprende un codón para el aminoácido en la posición 330 que codifica arginina o serina.
5. 5. Un muíante IBDV clásico tal y como se describe en las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizada porque el muíante comprende una o más mutaciones, en la región de codificación del VP2 de la cepa D78 del IBDV.
6. 6. Un muíante IBDV clásico tal y como se describe en las reivindicaciones de la 1 a la 5, caracterizado porque el muíante comprende un segmento genómico A, del IBDV clásico preferentemeníe la cepa D78 del IBDV.
7. 7. Una vacuna para uíilizar la proíección de aves confra la enfermedad ocasionada por la infección por el virus IBDV, caracíerizada porque la vacuna comprende un mufaníe del IBDV clásica íal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, junio con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
8. 8. Una vacuna íal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el muíante de IBDV clásico se encuentra en una forma viva.
9. 9. Una vacuna tal y como se describe en la reivindicación 7 ó 8, caracterizado porque la vacuna comprende además uno o más componentes de vacuna para oíros paíógenos infecciosos para las aves.
10. 10. Una vacuna íal y como se describe en las reivindicaciones de la 7 a la 9, caracterizado porque la vacuna comprende un adyuvante.
11. 11. Un método para la preparación de un muíante de IBDV clásico tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado porque el muíante de IBDV clásico es propagado en un cultivo celular y posteriormente recolectado del cultivo celular.
12. 12. Un método para la preparación de una vacuna tal y como se describe en las reivindicaciones de la 7 a la 10, caracterizado porque el mutaníe de IBDV clásico tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6 es mezclado con un vehículo o diiuyente farmacéuticamente aceptable.
13. 13. Un método para la preparación de un muíante del virus de la enfermedad infecciosa bursal clásico (IBDV) que expresa una proteína VP2 que se enlaza con el anticuerpo monoclonal (moab) B69 y el moab 67, secretado por las líneas celulares del hibridoma HB-9437, y HB-11122, depositado en el ATCC, Rockvllle, EUA, respectivameníe, caracterizado porque una o más mutaciones son introducidas en la región de codificación del VP2 de una cepa de IBDV clásico de modo que, (i) un codón para el aminoácido en la posición 222 codifica serina o treonina, y (ii) una secuencia de nucleóíidos que codifica la secuencia de aminoácidos para las posiciones de la 318 a 323 codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID Nos. de la 1 a la 5.
14. 14. El método tal y como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la mutación es introducida en el codón para el aminoácido en la posición 222 en una región de codificación del VP2 de una cepa de IBDV clásica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID No. 1.
15. 15. Un método tal y como se describe en la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque la proteína VP2 también se enlaza con el anticuerpo moab R63, secretado por la línea de células del hibridoma HB-9490, depositadas en el ATCC, Rockville, EUA.
16. 16. Un método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 13 a la 15, caracterizado porque la región de codificación del VP2 comprende un codón para la secuencia de aminoácidos en la posición 330 que codifica arginina o serina.
17. 17. Un método tal y como se describe en las reivindicaciones de la 13 a la 17, caracterizado porque son introducidas una o más mutaciones en la región de codificación del VP2 de la cepa D78 del IBDV.
18. 18. Un método tal y como se describe en las reivindicaciones de la 13 a la 17, caracterizado porque son introducidas una o más mutaciones en un segmento A genómico de un IBDV clásico, preferentemente la cepa D78 del IBDV.
19. 19. Un método para la preparación de una vacuna para utilizarla en la protección de las aves contra la enfermedad ocasionada por la infección del virus IBDV, caracterizada porque el mutante del IBDV clásico es preparado de acuerdo con el método tal y como se describe en las reivindicaciones de la 13 a la 18, es mezclado con un vehículo y un diluyente farmacéuticamente aceptable.