JPH05194597A - 防御抗原性を有する伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ｉｂｄｖ）の粒子製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 伝染性ファブリキュウス嚢病ウイルス（ＩＢ
ＤＶ）の感染防御に有効なワクチン、及びその製造法、
並びに上鶏の血液又は体液中のＩＢＤＶ抗体の存在を検
出する検査診断方法を提供する。 【構成】 ＩＢＤＶの開裂型ウイルス構造蛋白質（ＶＰ
２，ＶＰ３，ＶＰ４）の全部又はこれらの少なくともい
ずれか一つをコードする遺伝子を組み込んだベクターを
宿主細胞で発現させ、得られた蛋白質粒子を有効成分と
してワクチンを製造する。また上記蛋白質粒子を用い
て、鶏の血液又は体液中のＩＢＤＶ抗体の存在を免疫学
的に検出することで鶏のＩＢＤＶ感染を検査診断する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビルナウイウイルス科
に属する伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤ
Ｖ）の開裂型ウイルス構造蛋白質（ＶＰ２，ＶＰ４，Ｖ
Ｐ３）の全部、又はその一部から成る蛋白質粒子、その
蛋白質粒子の製造法、及びその粒子の利用方法に関する
ものであり、更に詳しくは、ＩＢＤＶを構成する蛋白質
であるＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４の各蛋白質をコ−ドする
第一分節ｃＤＮＡ全域、若しくはその一部の遺伝子を組
み込んだ発現ベクタ−を導入した細胞を培養し、発現さ
せ、前駆体蛋白質を開裂させることにより得られる成熟
蛋白質によって構成される粒子を製造する方法、そのよ
うにして製造された粒子を有効成分とするワクチン、及
び検査診断薬に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（Ｉ
ＢＤＶ）は１９６２年に初めて分離、報告されたウイル
スである。本ウイルスは弱齢の鶏（３週齢以下）に対し
てファブリキウス嚢の萎縮を引き起こす。一般的には、
この段階での死亡率は１０％またはそれ以下でそれほど
重大ではない。しかし、ファブリキウス嚢の萎縮に伴っ
て鶏の免疫抑制が現れ、２次感染による死亡率は無視で
きない程に上昇する。本ウイルス病は現在、世界中に蔓
延していると考えられているが、ワクチンが開発され、
その計画的利用によりわが国での大規模な発生はしばら
くの間収まっていた。近年、欧州で報告があった死亡率
の高い新しい型のＩＢＤＶの発生がわが国にも認めら
れ、より効果的なワクチンが求められるようになってい
る。

【０００３】本病による養鶏業界の経済的損失を最小限
度にとどめるには、多量の効果的で安価なワクチンの供
給と接種されたワクチンが鶏に有効に働いたか否かを迅
速に判定する検査が非常に重要である。現在までの細胞
培養による製造方法では、人手にたよるところが多く大
規模化、低価格化には限界がある。同様に、診断薬の安
定供給と高品質化にも限界がある。

【０００４】

【従来の技術】ところで、従来のワクチン、診断法と組
換えウイルスについては以下の様にまとめられる。

【０００５】（１）ＩＢＤＶワクチン ＩＢＤＶ感染症の制御はワクチン接種に大きく基づてい
る。ＩＢＤＶの発症防御は特に影響の大きい弱齢の鶏に
対して重要である。当初は野外で流行しているウイルス
の懸濁液をそのまま幼雛に接種することで野外の需要に
対応していた［エドガ−（Ｅｄｇａｒ）、Ｓ．Ａ．とチ
ョ−（Ｃｈｏ）、Ｙ．、ポウルトリ−・サイエンス（Ｐ
ｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．）、４４：１３６６（１９６５）、
スネデッカ−（Ｓｕｎｅｄｅｋｅｒ）、Ｃ．ら、アビア
ン・ディジ−ズ（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）、１
１：５１９−５２８（１９６７）］。これらのワクチン
は野外でのＩＢＤＶの発生を減少させるのには成功した
が、ファブリキウス嚢の萎縮、体重減少と時には接種し
た鶏を死亡させたりした［エドガ−（Ｅｄｇａｒ）、
Ｓ．Ａ．とチョ−（Ｃｈｏ）、Ｙ．、ポウルトリ−・サ
イエンス（Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．）、５２：４９２−４
９７（１９７３）］。そこでこれらのワクチンの使用は
ＩＢＤＶで汚染している地域で、且つ親鶏の雛への移行
抗体がある場所に限定して使われることになった。

【０００６】その後、鶏胚や培養細胞に順化したウイル
ス株が副作用のない新しいワクチンとして期待とともに
開発され始めた［ウインタ−フィ−ルド（Ｗｉｎｔｅｒ
ｆｉｅｌｄ），Ｒ．Ｗ．アビアン・ディジ−ズ（Ａｖｉ
ａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）、１３：５４８−５５７（１９
６９）、ライナルディ−（Ｒａｉｎａｌｄｉ）、Ａ．
ら、アビアン・パソロジ−（Ａｖｉａｎ Ｐａｔ
ｈ．）、３：５１−５７（１９７４）、ルカ−ト（Ｌｕ
ｋｅｒｔ）、Ｐ．Ｄ．ら、アメリカン・ジャ−ナル・オ
ブ・ベテリナリ−・リサ−チ（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｖｅｔ．
Ｒｅｓ）、３６：５３９−５４０（１９７５）など］。
しかしながら、こうして開発されたワクチンのうちのい
くつかは幼雛に接種すると依然として臨床症状や、ファ
ブリキウス嚢の障害を示した［ホプキンス（Ｈｏｐｋｉ
ｎｓ）、Ｉ．Ｇ．ら、リサ−チ・ベテリナリ−・サイエ
ンス（Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．）、２７：２６０−２
６１（１９７９）、エドワ−ズ（Ｅｄｏｗａｒｄｓ）、
Ｓ．Ａ．ら、リサ−チ・ベテリナリ−・サイエンス（Ｒ
ｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．）、３２：７９−８３（１９８
２）］。他のいくつかのワクチンは期待通りに弱毒化さ
れた。すなわち、臨床症状は全く示さず、ファブリキウ
ス嚢の障害は全くないか非常に軽微であり、且つ免疫抑
制作用を示さなかった［マスケット（Ｍｕｓｋｅｔ
ｔ）、Ｊ．Ｃ．ら、ベテリナリ−・リサ−チ（Ｖｅｔ．
Ｒｅｓ．）、１０４：３３２−３３４（１９７９）］。
これらの弱毒化されたワクチンは移行抗体のない雛には
非常に有効であった。ところが、移行抗体をもった雛に
はワクチンが無力化される事が至る所で報告され始めた
［マスケット（Ｍｕｓｋｅｔｔ）、Ｊ．Ｃ．ら、ベテリ
ナリ−・リサ−チ（Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．）、１０４：３３
２−３３４（１９７９）、イデ（Ｉｄｅ）、Ｐ．Ｒ．、
カナディアン・ベテリナリ−・ジャ−ナル（Ｃａｎ．
Ｖｅｔ．Ｊ．）、２０：３５−４０（１９７９）、ウッ
ド（Ｗｏｏｄ）、Ｇ．Ｗ．ら、アビアン・パソロジ−
（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ．）、１０：３６５−３７３
（１９８１）］。

【０００７】これらの結果は、弱毒化ワクチンの使用に
関してジレンマを生じさせている。即ち、自分で抗体を
産生できない頃の幼雛には親を免疫して移行抗体で病気
を防止できるが、移行抗体のある雛をワクチンで免疫す
ることはできないので、移行抗体の消失する頃からの感
染が問題になる。一方、移行抗体のない幼雛は抗体産生
のできる頃からの免疫は可能であるが、それ以前の頃の
感染が問題になる。また、移行抗体のある幼雛に対して
は病原性の残っているワクチン株を使うことにより、免
疫を与えることが可能であるが、実際には野外で移行抗
体のレベルを１羽毎に測定するのは不可能であり、すべ
ての鶏にこのワクチンを投与すると移行抗体価の低い固
体にワクチン自身の副作用が現れてしまう弊害がある。

【０００８】（２）診断法 ＩＢＤＶの診断は通常ファブリキウス嚢からのウイルス
分離と血清学的な試験によって行なわれている。血清学
的診断法としてはファブリキウス嚢の乳剤を抗原として
用いたゲル内沈降反応と蛍光抗体法が古くから用いられ
ている［イデ（Ｉｄｅ）、Ｐ．Ｒ．、 カナディアン・
ジャ−ナル・オブ・コンパラティブ・メディスン（Ｃａ
ｎ．Ｖ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．）、３９：１８３−１９０
（１９７５）］。また、ウイルス中和抗体価の測定も診
断法として利用されている［フィリプス（Ｐｈｉｌｌｉ
ｐｓ）、Ｗ．Ｅ．Ｊｒ．、アビアン・ディジ−ズ（Ａｖ
ｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ） ２５：１０９３−１０９７
（１９８１）］。高感度血清診断法としてＥＬＩＳＡ
（Ｅｎｚｉｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ
ｅｎｔ Ａｓｓａｙ）も近年ではよく利用されている
［マ−カッド（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）、Ｗ．Ｗ．ら、ア
ビアン・ディジ−ズ（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）
２４：３７５−３８５（１９８０）］。迅速で簡単で再
現性の高い判定方法として向流電気泳動法も試みられて
いる［バ−グ（Ｂｅｒｇ）、Ｎ．Ｗ．、アビアン・パソ
ロジ−（Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈ．） １１：６１１−６
１４（１９８２）］。

【０００９】ウイルスの検出や量を測定する手段とし
て、鶏に感染させＩＤ₅₀を求める方法や発育鶏卵に感染
させＥＩＤ₅₀が用いられている。近年、より短時間で感
度よく測定できる方法としてウイルスの核酸を検出する
ＤＮＡプロ−ブ法が報告されている［デイビス（Ｄａｖ
ｉｓ）、Ｖ．Ｓ．とボイル（Ｂｏｙｌｅ）、Ｊ．Ａ．、
アビアン・ディジ−ズ（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）
３４：３２９−３３５（１９９０）、ヘンダ−ソン
（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）、Ｋ．Ｓ．とジャックウッド
（Ｊａｃｋｗｏｏｄ）、Ｄ．Ｊ．、アビアン・ディジ−
ズ（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ） ３４：７４４−７
４８（１９９０）、ジャックウッド（Ｊａｃｋｗｏｏ
ｄ）、Ｄ．Ｊ． ベテリナリ−・マイクロバイオロジ−
（Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．） ２４：２５３−２
６０（１９９０）］。また、この技術の延長としてＰＣ
Ｒ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）の応用も考えられている［デイビス（Ｄａｖｉ
ｓ）、Ｖ．Ｓ．とボイル（Ｂｏｙｌｅ）、Ｊ．Ａ．、ア
ナリティカル・バイオケミストリ−（Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉ．） １８９：３５−３９（１９９０）］。

【００１０】（３）組換えウイルス ＩＢＤＶの主要なウイルス構成蛋白質をコ−ドする第一
分節の遺伝子配列はいくつかの株で報告されている［ハ
ドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）、Ｐ．Ｊ．ら、ヌクレイック・
アシッド・リサ−チ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）
１４：５００１−５０１２（１９８６）、キ−ベンジ
（Ｋｉｂｅｎｇｅ）、Ｆ．Ｓ．Ｂ．ら、ジャ−ナル・オ
ブ・ジェネラル・ビロロジ−（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．） ７１：５６９−５７７（１９９０）、ベイリス
（Ｂａｙｌｉｓｓ）、Ｃ．Ｄ．ら、ジャ−ナル・オブ・
ジェネラル・ビロロジ−（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）
７１：１３０３−１３１２（１９９０）］。その内、
ＩＢＤＶの００２−７３株のｃＤＮＡ断片が大腸菌［ア
ザッド（Ａｚａｄ）、Ａ．Ａ．ら、ビロロジ−（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ） １４９：１９０−１９８（１９８６）、
アザッド（Ａｚａｄ）、Ａ．Ａ．ら、ビロロジ−（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ） １６１：１４５−１５２（１９８
７）、特表平３−５００６０１］や酵母［マックレディ
（Ｍａｃｒｅａｄｉｅ）、Ｉ．Ｇ．ら、ワクチン（Ｖａ
ｃｃｉｎｅ） ８：５４９−５５２（１９９０）］を宿
主として蛋白質発現に用いられている。発現した蛋白質
はいずれも有効成分としてＶＰ２蛋白質あるいはその１
部を含み、鶏にウイルス中和抗体を誘導することがで
き、この抗体を受動的に他の鶏に移すとその鶏をＩＢＤ
Ｖの感染から防御することが報告されている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従来の方法によるＩＢ
ＤＶのワクチン製造には、生ワクチンと不活化ワクチン
の２種類の物がある。生ワクチンの場合は接種量が少な
くてすむという長所があるものの、厳密な安全性と有効
性及び使用方法の検討が重要になる。一方、不活化ワク
チンの場合は安全性が高いという長所があるが、ウイル
スの有効成分を破壊せずに効果的に不活化する検討や十
分な免疫を与えるためにはかなりの量が必要になり、最
小有効量試験が重要になる。こういった基準を達成し
て、使用されている現在のワクチンは疾病の予防に効果
をあげているものの、依然として小数の鶏には生ワクチ
ン使用による副作用や不十分な不活化ワクチン接種によ
る病気の発生が知られている。また、企業努力による製
品の価格低下にも、このような時間と人手のかかる製法
では限界があると考えられる。また、最近野外では接種
にかける手間を減らすために多価ワクチンを望む声が大
きい。そうした多価ワクチンに対応するためには効力が
高く、安定性があり、安全性の高いワクチン製造が必須
になるが、こうしたワクチン開発はかなり高価なものに
なろう。

【００１２】また、現在のＩＢＤＶ検査の主流は中和抗
体価の検査とＥＬＩＳＡであるが、中和抗体の測定は非
常に感度が高く、特異性が高いという長所があるもの
の、鶏胚初代継代細胞を使うため、簡便性にかける欠点
がある。また、この検査には数日を要し、たとえば、中
和抗体検査に使うウイルスと実際に鶏が感染したウイル
スが抗原的にかけ離れていると検定できないという欠点
を持っている。ＥＬＩＳＡによる抗体検査は簡便で再現
性が高く、比較的中和抗体価との関連も高いということ
で利用が多い。ところが、ＥＬＩＳＡに用いる抗原には
ＩＢＤＶを増やして抗原を調製しているため、いくつか
の問題点が指摘できる。非特異的な抗体との反応を防ぐ
ためにはウイルスをかなり精製しなければならないが、
安定的に高純度のウイルスを製造することは困難であ
り、できても非常に高いものになってしまう。現在、核
酸を利用した優れたウイスル同定法が開発されている
が、こういった技法は実験室レベルでの診断には利用さ
れるだろうが、実際には野外を含めて抗体検査の方が需
要は大きい。

【００１３】組換えＤＮＡ技法は感染ウイルスを使わな
いで安全に大量のワクチンを製造できる方法であるが、
現在の報告段階では量的にも、効力的にも不十分であ
り、おおいに改良の余地がある。

【００１４】そこで以上のような問題点を鑑み、本発明
者はかかる従来技術の下で、鋭意研究を重ね、ＩＢＤＶ
の不活化ワクチンであるＩＱ株の第１分節遺伝子のｃＤ
ＮＡを作製し、組換えバキュロウイウルスを築築した。
組換えバキュロウイルス感染細胞内では挿入したＩＢＤ
Ｖ由来遺伝子からの蛋白質の発現が見られた。この蛋白
質は感染細胞中に蓄積するのみならず、培養上清に粒子
状に産生されることを見い出した。すなわち、ＩＢＤＶ
ｃＤＮＡ組換えバキュロウイルス感染細胞の培養液中に
は、粒子状に自己集合したＩＢＤＶ抗原蛋白質が多量に
放出されていた。この粒子を鶏に免疫原として接種した
ところＩＢＤＶの感染から鶏を防御することが認められ
た。また、同様にこの粒子をＥＬＩＳＡの抗原として用
いたところ、ＩＢＤＶに対する中和抗体価とこのＥＬＩ
ＳＡの値に相関関係が高いことが見いだされた。かかる
知見に基づいて本発明を完成するに至ったものであり、
本発明の目的は、上記の手法に基づいて防御抗原性を有
するＩＢＤＶの粒子状構成蛋白質の製法を提供するもの
である。

【００１５】

【課題を解決するための手段】上記した目的の実現のた
めになされた本発明の防御抗原性を有するＩＢＤＶの粒
子状構成蛋白質の製法の特徴は、ＩＢＤＶの第１分節ｃ
ＤＮＡを組み込んだ組換えバキュロウイルスを感染させ
た細胞の培養上清中に発現蛋白質が自己集合した粒子が
大量に放出され、この放出粒子にＩＢＤＶに対する防御
免疫原性があるというものである。

【００１６】本発明においてベクタ−に組み込まれる遺
伝子はＩＢＤＶに分類されるウイルスならば特に株の限
定はされないが、特には００２−７３株［フィルス（Ｆ
ｉｒｔｈ）、Ｋ．Ｊ．、オ−ストラリアン・ベテリナリ
−・ジャ−ナル（Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．Ｊ．）、５０：１
２８−１３０（１９７４）、ＳＴ−Ｃ株［ロ−ゼンバ−
ガ−（Ｒｅｓｅｎｂｅｒｇｅｒ）、Ｊ．Ｋ．ら、アビア
ン・ディジ−ズ（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ） １
９：７１７−７２９（１９７５）］、５２／７０株［バ
イグレイブ（Ｂｙｇｒａｖｅ）、Ａ．Ｃ．とファラ−
（Ｆａｒａｇｈｅｒ）、Ｊ．Ｔ．、ベテリナリ−・リコ
−ド（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ８６：７５
８−７５９（１９７０）］などの強毒株、ウズラや鶏の
発育卵や培養細胞などに順化した弱毒株等があげられ
る。

【００１７】本発明においてＩＢＤＶ遺伝子とは、特に
ＩＢＤＶが有する２分節の２本鎖ＲＮＡゲノムのうちの
長い方の分節、すなわち第１分節の全体、あるいはその
１部または変異物や改変物をいい、実質的に自己開裂す
るウイルス蛋白質をコ−ドしている塩基配列を示す。こ
の遺伝子は特に感染臓器、感染培養細胞あるいはその上
清から得たＩＢＤＶからｃＤＮＡを公知の方法により逆
転写酵素を利用して逆転写して得たのでなくとも、化学
的に人工合成したものであっても実質的にコ−ドする遺
伝子がＩＢＤＶの蛋白質に対応するものであれば構わな
い。

【００１８】本発明において用いるベクタ−は、宿主細
胞（菌）内で蛋白質を発現させることのできるものであ
れば特に限定はされなが、用いられるベクタ−の具体例
としてはｐＧＥＭ−ＥＸ、ｐＴａｃ、ｐＫＫ２３３など
の大腸菌発現ベクタ−、ｐＰＬ−λなどの大腸菌ファ−
ジ系ベクタ−、ｐＳＶＬ、ｐＫＳＶ、ｐＭＡＭなどの大
腸菌−培養細胞シャトルベクタ−、またはワクチニア、
バキュロ等のウイルスベクタ−などが例示される。

【００１９】本発明においてＩＢＤＶ遺伝子を組込んだ
発現ベクタ−で形質転換された宿主細胞は、挿入した開
裂蛋白質前駆体が発現され、自己開裂して各々の成熟蛋
白質（ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４）へとプロセッシングさ
れていく。自己開裂は大腸菌の内部でも［ジャガディシ
ュ（Ｊａｇａｄｉｓｈ）、Ｍ．Ｎ．ら、ジャ−ナル・オ
ブ・ビロロジ−（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ） ６２：１０８４−
１０８７（１９８８）］、真核生物の細胞内でも観察さ
れる。開裂した各々の蛋白質はＩＢＤＶが感染した鶏の
細胞内でウイルス構成蛋白質が集合してウイルス粒子を
作るがごとく自己集合して粒子を形成する。この時、宿
主として大腸菌あるいは酵母を選んだ場合は細胞内に粒
子が蓄積するが、動物培養細胞や昆虫細胞を選んだ場合
は、ＩＢＤＶが感染細胞から放出されるがごとく細胞培
養液中に粒子が放出されてくる。宿主細胞の培養方法は
細胞を培養できるものであるならば特に限定されない
が、培養フラスコによる静置培養、ロ−ラーボトルによ
る回転培養、スピンナ−フラスコ等による懸濁培養等が
例示できる。

【００２０】本発明における発現組換え蛋白質は細胞内
または細胞培養液中あるいはその両方に得られ、この発
現蛋白質の精製は発現蛋白質が自己集合して粒子を形成
する性質を利用して遠心分離、ゲル濾過カラム、電気泳
動などの手法により簡単に単離することができる。発現
組換え蛋白質をＩＢＤＶ用ワクチンとして用いるには、
特に濃縮あるいは精製の操作なしに感染細胞の抽出物あ
るいは感染培養上清をそのまま使用しても防御効果が得
られるが、より好ましくは精製粒子を用いたほうがよ
い。鶏には公知の方法により免疫ができ、燐酸アルミニ
ウムゲルアジュバント、水酸化アルミニウムゲルアジュ
バント、オイルアジュバントと混合して免疫する方法が
例示できる。検査用の抗原として発現組換え蛋白質を用
いるにも感染細胞の抽出物あるいは感染培養上清を用い
ることができるが、検査時の好ましからぬ反応をなくす
ために精製粒子の使用が勧められる。検査の方法として
は抗原を固相化させたＥＬＩＳＡによる発色あるいは発
光による測定法、ＲＩＡによる放射活性測定法、ラテッ
クス粒子による凝集反応法、対向電気泳動法、ゲル内沈
降反応法などが例示される。

【００２１】

【作用】特表平３−５００６０１で示されたＶＰ２単
身、あるいはエピト−プの１部を用いた利用法は抗原の
安定性、あるいは抗原を精製する方法に困難が見いださ
れるが、本発明の粒子はより物理化学的に安定であり、
より好ましくは精製が非常に容易な事である。このため
ワクチンとして利用するにあたって、いくつかの特長が
容易に推定できる。

【００２２】１．構造がウイルス粒子と似通っているた
めに抗原刺激が接種された動物に対してウイルス粒子で
免疫したのと同様に効率的に行われる。

【００２３】２．安定な構造をしていることから接種さ
れた動物の体内で分解しにくく、抗原刺激がウイルス粒
子で免疫したのと同様に長期にわたっておこなわれる。

【００２４】３．大量発現が可能なことからより低価格
でワクチンを製造できる。

【００２５】４．簡単な工程で濃縮できることから接種
量の少ないワクチンを製造でき、接種労力が軽減され
る。

【００２６】５．簡単な工程で精製できることから接種
時の好ましからざる副反応を抑えることができる。以上
のような長所から、本組換え発現蛋白質を用いたワクチ
ン製造法はワクチン製造会社とワクチン使用者に非常に
有効な手段を提供するものである。

【００２７】また、抗体検査試薬用抗原として利用する
にあたっても同様にいくつかの長所が容易に推定され
る。

【００２８】１．大量の抗原を提供でき、多くの検査に
対応できる。

【００２９】２．抗原の濃縮が簡単な工程でおこなえ、
品質の均一性を保て、広範囲な検査法に応用できる。

【００３０】３．簡単な工程で精製できることから、供
雑物による検査時の好ましからざる反応を抑えることが
でき、検査精度を向上させ得る。

【００３１】４．構造がウイルス粒子と似通っているた
めに、ウイルス粒子を抗原に用いたときと同様に立体構
造を認識するような抗体とも反応し、検査精度を落とす
ことはない。以上のうような特長から、本組換え発現蛋
白質を用いた検査試薬用抗原製造法はＩＢＤＶワクチン
非接種地域においては広範囲にＩＢＤＶの発生状況調査
を、ＩＢＤＶワクチン接種地域においては免疫が成立し
ているかどうかを調査する手段を提供するものである。

【００３２】

【実施例】以下に本発明を図面に示す実施例に基づいて
説明する。

【００３３】なお本例では配列番号１の塩基配列を有す
るＩＢＤＶのＩＱ株を用いた。

【００３４】（１）ＩＢＤＶ第一分節ｃＤＮＡの作製
（図１参照） 培養細胞に順化したＩＢＤＶのＩＱ株を培養上清から遠
心分離により精製し、プロテア−ゼＫ消化後にウイルス
遺伝子ＲＮＡを常法によりフェノ−ル、クロロホルム抽
出した。すでに報告されているＩＢＤＶ各株の塩基配列
［ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）、Ｐ．Ｊ．ら、ヌクレイッ
ク・アシッド・リサ−チ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓ．） １４：５００１−５０１２（１９８６）、キ−
ベンジ（Ｋｉｂｅｎｇｅ）、Ｆ．Ｓ．Ｂ．ら、ジャ−ナ
ル・オブ・ジェネラル・ビロロジ−（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉ
ｒｏｌ．） ７１：５６９−５７７（１９９０）、ベイ
リス（Ｂａｙｌｉｓｓ）、Ｃ．Ｄ．ら、ジャ−ナル・オ
ブ・ジェネラル・ビロロジ−（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．） ７１：１３０３−１３１２（１９９０）］を基
に約５００ベ−ス間隔で１８ベ−スのプライマ−をＤＮ
Ａ合成機（ミリジェン社製）で自動化学合成した。この
プライマ−を用いてＩＢＤＶより抽出したＲＮＡを鋳型
として常法通りに逆転写酵素でｃＤＮＡを作製した。得
られたｃＤＮＡを複製の忠実度にすぐれたベントＤＮＡ
ポリメラ−ゼ（ニュ−イングランドバイオラボ社製）を
用いて、９５℃１分、５０℃２分、７２℃５分で１５サ
イクルのポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行いｃＤＮ
Ａを増幅させた。この結果、ＩＢＤＶの第一分節遺伝子
は４つの部分的に重なりあったｃＤＮＡとして得られ
た。

【００３５】（２）ＩＢＤＶ第一分節ｃＤＮＡのクロ−
ニング（図１参照） この増幅ｃＤＮＡの末端をクレノ−酵素（ベ−リンガ−
マンハイム社製）で処理し、末端を平滑化し、続いてポ
リヌクレオチドカイネ−ス（東洋紡社製）にて末端を燐
酸化した。クロ−ニングベクタ−としてｐＧＥＭ−３Ｚ
（プロメガ社製）を制限酵素ＳｍａＩで完全消化後、バ
クテリアルアルカリフォスファタ−ゼ（宝酒造社製）を
用いて末端を脱燐酸化させた。このベクタ−と増幅ｃＤ
ＮＡを等量混合しＴ４ＤＮＡライゲ−ス（ベ−リンガ−
マンハイム社製）を用いて結合させ、続いて大腸菌ＪＭ
１０９株を形質転換させてそれぞれの組換え体を得た。
４種類に分断されてクロ−ニングされたｃＤＮＡをそれ
ぞれに特異的な制限酵素を用いて常法に乗っ取って切断
と再結合を繰り返し、ひとつながりにつなぎ合わされた
再構築組換えベクタ−ｐＧＥＭ−ＶＰ０を得た。ｐＧＥ
Ｍ−ＶＰ０が正しく再構築されたかどうかはダイデオキ
シ法で塩基配列を決定することにより確認した。

【００３６】（３）組換えバキュロウイルス作製用トラ
ンスファ−ベクタ−への再クロ−ニング（図２参照） バキュロウイルストランスファ−ベクタ−ｐＡｃＹＭ１
を制限酵素ＳｍａＩで切断後、バクテリアルアルカリフ
ォスファタ−ゼ（宝酒造社製）を用いて末端を脱燐酸化
させた（ｐＡｃＹＭ１／ＳｍａＩ／ＢＡＰ）。ｐＧＥＭ
−ＶＰ０を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後、末端をクレノ
−酵素（ベ−リンガ−マンハイム社製）で処理し、末端
を平滑化した。さらに、ＩＢＤＶのｃＤＮＡ断片（ＶＰ
０）とｐＧＥＭ部分をアガロ−スゲル電気泳動で分離
し、ＶＰ０ＤＮＡ部分のみをゲルから単離した。ｐＡｃ
ＹＭ１／ＳｍａＩ／ＢＡＰとＶＰ０ＤＮＡを等量混合
し、常法に従い大腸菌を形質転換して組換え体ｐＡｃＹ
Ｍ１−ＶＰ０を得た。

【００３７】（４）組換えバキュロウイルスの作出 ２５２のカルチャ−ボトルに培養されたＳｆ２１細胞に
バキュロウイルス（ＡｃＮＰＶ）を０．１ｐｆｕ／ｃｅ
ｌｌで細胞に感染させ、４５分後に前記組換えプラスミ
ッドｐＡｃＹＭ１−ＶＰ０ＤＮＡを燐酸カルシュウム法
で細胞にトランスフェクションした。その後、２８℃で
９６時間細胞を静置培養し、その培養上清を採取し４℃
で保存した。続いて、採取した培養上清を１００倍から
１万倍に希釈して、直径３．５ のペトリ皿に培養した
Ｓｆ２１細胞、約１０６個に感染させ、１．５％のアガ
ロ−スゲルを重層した。７２時間静置培養後、上から
０．５％ニュ−トラルレッドを滴下し、さらに２４時間
培養を続けた。感染後、９６時間でペトリ皿内の細胞に
はウイルス感染による明瞭なプラックが出現した。組換
えバキュロウイルスは外来遺伝子が挿入されるとポリヘ
ドリン蛋白質の発現が無くなることから、ニュ−トラル
レッドで染まっていないポリヘドリン欠損プラックをパ
スツ−ルピペットで単離して、スクリ−ニングとクロ−
ニングをおこなった。続いて、得られた組換えバキュロ
ウイルスのクロ−ンをＳｆ２１細胞に再び感染させ、９
６時間後の感染細胞をＳＤＳ電気泳動にかけたところ、
挿入した遺伝子に相当する産物が蛋白質のバンドとして
認めらることが確認され、このクロ−ンをｒＡｃＮＰＶ
−ＶＰ０と命名した。

【００３８】（５）組換えバキュロウイルスの発現 ｒＡｃＮＰＶ−ＶＰ０をＳｆ２１細胞に１０ｐｆｕ／ｃ
ｅｌｌで感染させると２４時間目から４８時間にわたっ
て感染細胞内、培養上清に多くの発現蛋白質が認められ
た。発現した蛋白質はジャガディシュ（Ｊａｇａｄｉｓ
ｈ）、Ｍ．Ｎ．ら［ジャ−ナル・オブ・ビロロジ−
（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ） ６２：１０８４−１０８７（１９
８８）］が大腸菌で報告したのと同様に感染Ｓｆ２１細
胞内でも前駆体蛋白質（ＶＰ０）が自己開裂し、それぞ
れの蛋白質（ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４）に成熟している
ことが認められた（図３Ａレ−ン２）。これらの蛋白質
はＩＢＤＶに感染した鶏の血清と反応することから（図
３Ｂレ−ン５と７参照）、もともとのウイルスの抗原性
を保持していると考えられた。このような蛋白質は非感
染のＳｆ２１細胞（図３Ａレ−ン３参照）や野生型のバ
キュロウイルス感染細胞（図３Ａレ−ン１参照）にはい
っさい認められなかった。さらに、培養上清中に見られ
る蛋白質も同様に成熟しており、細胞内で自己開裂した
後、細胞外に放出されたと考えられた（図３Ｂレ−ン２
と６参照）。この培養液中にみられる成熟蛋白質は１５
０００回転、１５分の遠心で沈澱部分に回収されること
から、塊をつくっていることが推定された。そこでこの
培養上清を１５％と６０％のシュ−クロ−スステップ密
度勾配に重層し、ＴＳＴ２８ロ−タ−（コントロン社
製）で２５０００回転で２時間遠心した。遠心後、各分
画に組換え蛋白質があるかどうかをＳＤＳ−ゲル電気泳
動にて確認したところ、最上層分画（図４レ−ン５参
照）や１５％層分画（図４レ−ン６参照）には認めらな
かったが、６０％層分画には組換え蛋白質が認められた
（図４レ−ン７参照）。このような蛋白質は野生型のバ
キュロウイルス感染細胞の培養上清を同様の処理をして
も見られなかった（図４レ−ン２〜４参照）。そこで、
この分画を常法によりメンブラン上でネガティブ染色
し、電子顕微鏡で観察したところ、非常に大きな中空の
粒子構造が認められた（図５Ａ〜Ｃ参照）。このような
粒子は同様な精製方法で得られるバキュロウイルス粒子
（図５Ｄ〜Ｅ）とは異なっており、発現蛋白質由来であ
ることが判った。

【００３９】（６）発現粒子構造物の防御免疫原性（表
１参照） ＡｃＮＰＶ−ＶＰ０感染細胞の培養上清を４８時間後に
採取して遠心分離し、粒子構造物を粗精製した。これを
抗原として３週齢のＳＰＦ鶏（日生研社製）４羽に１０
μｇを、さらに４羽にはその１／１０量の１μｇをフロ
インドのコンプリ−トアジュバントと供に初回免疫し
た。また、陽性対照として市販のＩＢＤＶ不活化ワクチ
ン（日生研社製）を用法に従って鶏４羽に免疫し、陰性
対照として非免疫鶏４羽を他に準備した。２週後に再び
同様に２回目の免疫を行った。その２週後に５０ＥＩＤ
₅₀のＩ株ＩＢＤＶで全鶏を攻撃した。攻撃後、１週目に
鶏を解剖し、攻撃ウイルスによるファブリキウス嚢（以
下「Ｆ嚢」と略記する）の組織病変を比較した。

【００４０】非免疫鶏４羽はいずれも攻撃により著しい
Ｆ嚢の萎縮が認められ、Ｆ嚢体重比は１．４から２．４
の値を示した。一方市販のＩＢＤＶワクチンを接種した
４羽中３羽はまったく萎縮が認めれず、Ｆ嚢体重比は
３．５から９．１の値を示し、病理解剖学的にも正常で
あった。残りの１羽はわずかながら萎縮が認められたも
のの組織の色は正常と変わり無かった。発現粒子１０μ
ｇで免疫した鶏４羽はいずれもＦ嚢の萎縮は認められ
ず、Ｆ嚢体重比は４．５から１２．５の値を示した。発
現粒子１μｇで免疫した鶏４羽については、その内２羽
にはＦ嚢の萎縮が認められなかったが、残りの２羽には
萎縮が認められた。このことより、組換えにより発現し
た粒子構造物は鶏にＩＢＤＶ対する防御能を付与するこ
とが明かとなった。また、その防御能の与え方には抗原
量依存性があることが示された。

【００４１】

【表１】

【００４２】（７）発現蛋白質を用いた抗体検査（表２
参照） ｒＡｃＮＰＶ−ＶＰ０を感染させたＳｆ２１細胞の培養
上清を４８時間目に採取し、同様に遠心分離により発現
組換え粒子構造物を精製した。この蛋白質を常法に従い
ＥＬＩＳＡ用プレ−ト（ファルコン社製）に一つの穴
（ウエル）あたり０．１μｇになるように５０ｍＭ炭酸
緩衝液で希釈し、凍結乾燥法でプレ−トに抗原を固相化
した。使用直前に３％スキムミルクで各ウエルを３７
℃、１時間ブロッキングしたのち、抗体検査に用いた。
用いた抗体として予め中和抗体価の解っている鶏免疫血
清を使用した。それぞれの中和抗体価は常法によりプラ
ック減少法により測定した。

【００４３】ブロッキング液を洗い流した後、それぞれ
の抗体を生理燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で２００倍から２倍
段階希釈し、各ウエルに５０μｌづつ加え、３７℃、１
時間反応させた。続いて、抗体希釈液を洗い流し、西洋
ワサビのパ−オキシダ−ゼ（ＨＲＰＯ）標識された抗鶏
イムノグロブリン抗体を加え、再び３７℃で１時間反応
させた。未反応の標識抗体を洗い流した後、酵素の発色
試薬（ＡＢＴＳ）と過酸化水素を加えて発色させた。発
色の程度はプレ−トリ−ダ−（インタ−メッド社製）を
用いて測定した。その結果、中和抗体価４０９６倍の鶏
血清では８００倍希釈までが非常に強く反応し、測定値
は２以上になった。一方、中和抗体価１０２４倍の鶏血
清は２００倍希釈までが非常に強く反応し、測定値は２
以上になった。ところが、中和抗体価４倍以下の鶏血清
は２００倍希釈ではほとんど発色を示さなかった。以上
の事からＩＢＤＶに対する抗体価を測定するための抗原
としてもこの組換え発現蛋白質は有効であることが判明
した。

【００４４】

【表２】

【００４５】

【配列表】配列番号：１ 配列の型：核酸 配列 10 20 30 40 50 60 AGTAGAGATCAGACAAACGATCGCAGCGATGACAAACCCGTCAGATCAAGCCCAACAGAT MetThrAsnProSerAspGlnAlaGlnGlnIle 70 80 90 100 110 120 TGTTCCGTTTATACGGAGCCTTCTGATGCCAACAACCGGACCGGCGTCCATTCCGGACGA ValProPheIleArgSerLeuLeuMetProThrThrGlyProAlaSerIleProAspAsp 130 140 150 160 170 180 CACCCTGGAGAAGCACACTCTCAGGTCGGAGACTTCAACCTACAATTTGACTGTGGGGGA ThrLeuGluLysHisThrLeuArgSerGluThrSerThrTyrAsnLeuThrValGlyAsp 190 200 210 220 230 240 CACAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTCTTCCCTGGATTCCCTGGATCAATTGTGGGTGCTCA ThrGlySerGlyLeuIleValPhePheProGlyPheProGlySerIleValGlyAlaHis 250 260 270 280 290 300 CTACACACTGCAGAGCAATGGGAACTACAAGTTCGATCAGATGCTCCTGACTGCCCAGAA TyrThrLeuGlnSerAsnGlyAsnTyrLysPheAspGlnMetLeuLeuThrAlaGlnAsn 310 320 330 340 350 360 CCTACCGGCCAGTTACAACTACTGCAGGTTAGTGAGTCGGAGTCTCACAGTGAGGTCAAG LeuProAlaSerTyrAsnTyrCysArgLeuValSerArgSerLeuThrValArgSerSer 370 380 390 400 410 420 CACACTCCCTGGTGGCGTTTATGCACTAAACGGCACCGTAAACGCCGTGACCTTCCAAGG ThrLeuProGlyGlyValTyrAlaLeuAsnGlyThrValAsnAlaValThrPheGlnGly 430 440 450 460 470 480 AAGCCTGAGTGAACTGACAGATGTTAGCTACAATGGGTTGATGTCTGCAACGGCCAACAT SerLeuSerGluLeuThrAspValSerTyrAsnGlyLeuMetSerAlaThrAlaAsnIle 490 500 510 520 530 540 CAACGACAAAATTGGGGATGTCCTGGTAGGGGAAGGGGTCACCGTCCTCAGCCTACCCAC AsnAspLysIleGlyAspValLeuValGlyGluGlyValThrValLeuSerLeuProThr 550 560 570 580 590 600 ATCATATGATCTTGGGTATGTGCGACTTGGTGACCCCATTCCTGCTATAGGGCTTGACCC SerTyrAspLeuGlyTyrValArgLeuGlyAspProIleProAlaIleGlyLeuAspPro 610 620 630 640 650 660 AAAAATGGTAGCCACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACCATAACTGCAGC LysMetValAlaThrCysAspSerSerAspArgProArgValTyrThrIleThrAlaAla 670 680 690 700 710 720 CGATGATTACCAATTCTCATCACAGTACCAATCAGGTGGGGTAACAATCACACTGTTCTC AspAspTyrGlnPheSerSerGlnTyrGlnSerGlyGlyValThrIleThrLeuPheSer 730 740 750 760 770 780 AGCCAACATTGATGCCATCACAAGCCTAAGCGTTGGAGGAGAGCTCGTGTTCAAAACAAG AlaAsnIleAspAlaIleThrSerLeuSerValGlyGlyGluLeuValPheLysThrSer 790 800 810 820 830 840 TGTCCATAGCCTTGTACTGGGCGCCACCATCTATCTTATAGGATTTGATGGGACTACGGT ValHisSerLeuValLeuGlyAlaThrIleTyrLeuIleGlyPheAspGlyThrThrVal 850 860 870 880 890 900 AACCACCAGAGCTGTGGCCGCGAACAATGGGCTGACGACTGGCACCGACAATCCTATTCC ThrThrArgAlaValAlaAlaAsnAsnGlyLeuThrThrGlyThrAspAsnProIlePro 910 920 930 940 950 960 ATTCAATCTTGTGTTTCCGACCCATGAGATAACCCAGCCAATCACATCCATCAAACTGGA PheAsnLeuValPheProThrHisGluIleThrGlnProIleThrSerIleLysLeuGlu 970 980 990 1000 1010 1020 GATAATGACCTCCAAAAGTGGTGGTCAAGCTGGGGATCAGATGTCATGGTCGGCAAGTGG IleMetThrSerLysSerGlyGlyGlnAlaGlyAspGlnMetSerTrpSerAlaSerGly 1030 1040 1050 1060 1070 1080 GAGCCTAGCAGTGACAATCCATGGTGGCAACTATCCAGGGGCCCTCCGTCCCGTCACACT SerLeuAlaValThrIleHisGlyGlyAsnTyrProGlyAlaLeuArgProValThrLeu 1090 1100 1110 1120 1130 1140 AGTAGCCTACGAAAGAGTGGCAACAGGATCCGTCGTTACAGTCGCTGGGGTGAGCAACTT ValAlaTyrGluArgValAlaThrGlySerValValThrValAlaGlyValSerAsnPhe 1150 1160 1170 1180 1190 1200 CGAGCTGATCCCAAATCCCGAACTAGCAAAGAACCTGGTTACAGAATACGGCCGATTTGA GluLeuIleProAsnProGluLeuAlaLysAsnLeuValThrGluTyrGlyArgPheAsp 1210 1220 1230 1240 1250 1260 CCCAGGAGCCATGAACTACACAAAATTGATACTGAGTGAGAGGGACCGTCTTGGCATCAA ProGlyAlaMetAsnTyrThrLysLeuIleLeuSerGluArgAspArgLeuGlyIleLys 1270 1280 1290 1300 1310 1320 GACCGTCTGGCCAACAAGGGAGTACACTGACTTTCGTGAGTACTTCATGGAAGTGGCTGA ThrValTrpProThrArgGluTyrThrAspPheArgGluTyrPheMetGluValAlaAsp 1330 1340 1350 1360 1370 1380 CCTCAACTCTCCCCTGAAGATTGCAGGAGCATTTGGCTTCAAGGACATAATCCGGGCCAT LeuAsnSerProLeuLysIleAlaGlyAlaPheGlyPheLysAspIleIleArgAlaIle 1390 1400 1410 1420 1430 1440 AAGGAGGATAGCTGTGCCGGTGGTCTCTACATTGTTCCCACCTGCCGCTCCCCTAGCCCA ArgArgIleAlaValProValValSerThrLeuPheProProAlaAlaProLeuAlaHis 1450 1460 1470 1480 1490 1500 TGCAATTGGGGAAGGTGTAGACTACCTGCTGGGCGATGAGGCACAAGCTGCTTCAGGGAC AlaIleGlyGluGlyValAspTyrLeuLeuGlyAspGluAlaGlnAlaAlaSerGlyThr 1510 1520 1530 1540 1550 1560 TGCTCGAGCCGCGTCAGGAAAAGCAAGAGCTGCCTCAGGTCGCATAAGGCAGCTGACTCT AlaArgAlaAlaSerGlyLysAlaArgAlaAlaSerGlyArgIleArgGlnLeuThrLeu 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CGCCGCTGACAAGGGGTACGAGGTAGTCGCGAATCTATTCCAGGTGCCCCAGAATCCCGT AlaAlaAspLysGlyTyrGluValValAlaAsnLeuPheGlnValProGlnAsnProVal 1630 1640 1650 1660 1670 1680 AGTCGACGGGATTCTTGCTTCACCTGGGGTACTTCGCGGTGCACACAACCTCGACTGCGT ValAspGlyIleLeuAalSerProGlyValLeuArgGlyAlaHisAsnLeuAspCysVal 1690 1700 1710 1720 1730 1740 GCTAAGGGTGGGCGCCACGCTATTCCCTGTGGTCATTACGACAGTGGAAGACGCCATGAC LeuArgValGlyAlaThrLeuPheProValValIleThrThrValGluAspAlaMetThr 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ACCCAAAGCACTGAACAGCAAAATGTTTGCTGTCATTGAAGGCGTGCGAGAAGACCTCCA ProLysAlaLeuAsnSerLysMetPheAlaValIleGluGlyValArgGluAspLeuGln 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ACCTCCATCTCAAAGAGGATCTTTCATACGAACTCTCTCCGGACATAGAGTCTATGGATA ProProSerGlnArgGlySerPheIleArgThrLeuSerGlyHisArgValTyrGlyTyr 1870 1880 1890 1900 1910 1920 TGCTCCAGATGGGGTGCTTCCACTGGAGACTGGGAGAGACTACACTGTTGTCCCAATAGA AlaProAspGlyValLeuProLeuGluThrGlyArgAspTyrThrValValProIleAsp 1930 1940 1950 1960 1970 1980 TGATGTCTGGGACGACAGCATTATGCTGTCCAAAGACCCCATTCCTCCTATTGTGGGAAA AspValTrpAspAspSerIleMetLeuSerLysAspProIleProProIleValGlyAsn 1990 2000 2010 2020 2030 2040 CAGTGGCAACCTAGCCATAGCCTACATGGATGTGTTTCGACCCAAAGTTCCCATCCATGT SerGlyAsnLeuAlaIleAlaTyrMetAspValPheArgProLysValProIleHisVal 2050 2060 2070 2080 2090 2100 GGCTATGACAGGAGACCTCAACGCTTGGGGCGAGATTGAGAAAGTAAGCTTCAGAAGCAC AlaMetThrGlyAspLeuAsnAlaTrpGlyGluIleGluLysValSerPheArgSerThr 2110 2120 2130 2140 2150 2160 CAAGCTCGCCACTGCACACCGACTTGGCCTCAGGTTGGCTGGTCCCGGAGCATTCGATGT LysLeuAlaThrAlaHisArgLeuGlyLeuArgLeuAlaGlyProGlyAlaPheAspVal 2170 2180 2190 2200 2210 2220 AGACACCGGGCCCAACTGGGCAACGTTCATCAAACGCTTCCCCCACAATCCACGCGACTG AspThrGlyProAsnTrpAlaThrPheIleLysArgPheProHisAsnProArgAspTrp 2230 2240 2250 2260 2270 2280 GGACAGGCTCCCCTACCTCAACCTCCCATACCTTCCACCCAATGCAGGACGCCAGTACCA AspArgLeuProTyrLeuAsnLeuProTyrLeuProProAsnAlaGlyArgGlnTyrHis 2290 2300 2310 2320 2330 2340 CCTTGCCATGGCTGCATCAGAGTTCAAAGAGACCCCTGAACTCGAGAGCGCCGTCAGAGC LeuAlaMetAlaAlaSerGluPheLysGluThrProGluLeuGluSerAlaValArgAla 2350 2360 2370 2380 2390 2400 CATGGAAGCAGCAGCCAACGTGGACCCACTATTCCAATCTGCACTCAATGTGTTCATGTG MetGluAlaAlaAlaAsnValAspProLeuPheGlnSerAlaLeuAsnValPheMetTrp 2410 2420 2430 2440 2450 2460 GCTGGAAGAGAATGGGATTGTGTCTGATATGGCCAACTTCGCACTCAGCGACCCGAACGC LeuGluGluAsnGlyIleValSerAspMetAlaAsnPheAlaLeuSerAspProAsnAla 2470 2480 2490 2500 2510 2520 CCATCGGATGCGAAATTTTCTTGCAAACGCACCACAAGCAGGTAGCAAGTCGCAAAGAGC HisArgMetArgAsnPheLeuAlaAsnAlaProGlnAlaGlySerLysSerGlnArgAla 2530 2540 2550 2560 2570 2580 CAAGTACGGGACAGCAGGCTACGGAGTGGAGGCCCGGGGCCCCACTCCAGAGGAAGCTCA LysTyrGlyThrAlaGlyTyrGlyValGluAlaArgGlyProThrProGluGluAlaGln 2590 2600 2610 2620 2630 2640 GAGGGAAAAAGATACACGGATCTCAAAGAAGATGGAGACTATGGGCATCTACTTTGCAAC ArgGluLysAspThrArgIleSerLysLysMetGluThrMetGlyIleTyrPheAlaThr 2650 2660 2670 2680 2690 2700 ACCGGAATGGGTAGCACTCAATGGGCACCGAGGGCCAAGCCCCGGCCAGCTAAAGTACTG ProGluTrpValAlaLeuAsnGlyHisArgGlyProSerProGlyGlnLeuLysTyrTrp 2710 2720 2730 2740 2750 2760 GCAGAACACACGGGAAATACCGGACCCAAACGAGGACTATCTAGACTACGTGCATGCAGA GlnAsnThrArgGluIleProAspProAsnGluAspTyrLeuAspTyrValHisAlaGlu 2770 2780 2790 2800 2810 2820 GAAGAGCCGGTTGGCATCAGAAGAACAAATCATAAGGGCAGCCACGTCGATCTACGGGGC LysSerArgLeuAlaSerGluGluGlnIleIleArgAlaAlaThrSerIleTyrGlyAla 2830 2840 2850 2860 2870 2880 TCCAGGACAGGCAGAGCCACCCCAGGCTTTCATAGACGAAGTTGCTAAAGTCTATGAAAT ProGlyGlnAlaGluProProGlnAlaPheTleAspGluValAlaLysValTyrGluIle 2890 2900 2910 2920 2930 2940 CAACCATGGGCGTGGCCCAAACCAAGAACAGATGAAAGATCTGCTCTTGACTGCGATGGA AsnHisGlyArgGlyProAsnGlnGluGlnMetLysAspLeuLeuLeuThrAlaMetGlu 2950 2960 2970 2980 2990 3000 GATGAAGCATCGCAATCCCAGGCTGGCTCCACCAAAGCCCAAGCCAAAACCCAATGCTCC MetLysHisArgAsnProArgLeuAlaProProLysProLysProLysProAsnAlaPro 3010 3020 3030 3040 3050 3060 AACACAGAGACCCCCTGGTCGGCTGGGCCGCTGGATCAGGACTGTCTCTGATGAGGACCT ThrGlnArgProProGlyArgLeuGlyArgTrpIleArgThrValSerAspGluAspLeu 3070 3080 TGAGTGAGGCTCCTGGGAGTCTCCCGA Glu***

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明の実施例におけるＩＢＤＶの第一
分節ｃＤＮＡのクロ−ニングと組み換えベクタ−の構築
手順を示したものである。すなわち、ｃＤＮＡのクロ−
ニングには８種類のプライマ−（図中三角矢印）を用
い、Ａ、Ｂ、ＣとＤの４つの部分にわけて、第一分節Ｒ
ＮＡ（ＬＳ−ＲＮＡ）をｃＤＮＡ化し、それぞれのｃＤ
ＮＡ断片はｐＧＥＭベクタ−にクロ−ニングし、図中に
表記してある制限酵素によるＤＮＡの切断とＴ４ＤＮＡ
ライゲ−スによるＤＮＡの結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を
繰り返して、４つの断片を１つの断片（ＶＰ０）に再構
築した事を示したものである。

【図２】図２は得られたＩＢＤＶのｃＤＮＡ断片を組換
えバキュロウイルス作製用トランスファ−ベクタ−に再
構築する手順を示したものである。すなわち、図中に表
記している制限酵素でｃＤＮＡを切り出した後、末端を
クレノ−酵素（Ｋｌｅｎｏｗ Ｅｎｚｙｍｅ）で平滑化
（Ｆｉｌｌ−ｉｎ）し、トランスファ−ベクタ−に断片
を挿入したことを示している。

【図３】図３は組換えバキュロウイルス感染細胞におい
て産成される蛋白質を示したものであり、Ａはクマシ−
ブリリアントブル−で染色したＳＤＳ−１２．５％ゲル
電気泳動像を示している。図中レ−ン１は野生型バキュ
ロウイルス感染細胞、レ−ン２は組換えバキュロウイル
ス感染細胞、レ−ン３は非感染細胞、レ−ン４は分子量
マ−カ−を泳動したものである。Ｂは同様の電気泳動
後、フィルタ−にウエスタンブロティングしたものであ
り、図中レ−ン１から５まではＩＢＤＶ感染鶏血清と反
応させたもので、レ−ン６から８までは抗体と反応させ
ずにアミドブラックでフィルタ−を染色したものであ
る。図中レ−ン２と６は組換えバキュロウイルス感染細
胞の培養上清、レ−ン３は非感染細胞の培養上清、レ−
ン４は非感染細胞、レ−ン５と７は組換えバキュロウイ
ルス感染細胞、レ−ン８は分子量マ−カ−を泳動したも
のである。

【図４】図４は組換えバキュロウイルス感染細胞の培養
上清に産成される組換え蛋白質について遠心分離の結果
を示したものであり、図中レ−ン２から４は野生型バキ
ュロウイルス感染細胞の培養上清、レ−ン５から７は組
換えバキュロウイルス感染細胞の培養上清を遠心分離
後、ＳＤＳ−１２．５％ゲル電気泳動したものである。
レ−ン１は分子量マ−カ−、レ−ン２と５は遠心の最上
層分画、レ−ン３と６は１５％シュ−クロ−ス分画、レ
−ン４と７は６０％シュ−クロ−ス分画をそれぞれ電気
泳動したものである。

【図５】図５は組換えバキュロウイルス感染細胞培養上
清に現れる粒子構造物をネガティブ染色後、電子顕微鏡
で観察した結果を示している。図中ＡからＣまでは組換
えバキュロウイウルス由来、ＤとＥは野生型バキュロウ
イルス由来であり、図中の太線は５００μｍのスケ−ル
を表している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/41 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの開
   裂型ウイルス構造蛋白質（ＶＰ−２，ＶＰ−４，ＶＰ−
   ３）の全部、又は該開裂型ウイルス構造蛋白質のうちの
   （ＶＰ−２，ＶＰ−４，ＶＰ−３）の少なくともいずれ
   か一つと、免疫学的に反応する部分を含むことを特徴と
   する蛋白質粒子。
2. 【請求項２】 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（Ｉ
   ＢＤＶ）の開裂型ウイルス構造蛋白質の全部、又は該開
   裂型ウイルス構造蛋白質のうちの（ＶＰ−２，ＶＰ−
   ４，ＶＰ−３）の少なくともいずれか一つの部分、をコ
   −ドする遺伝子を組み込んだベクタ−を、宿主細胞に導
   入して発現させ、発現したＩＢＤＶの構造蛋白質を自己
   集合させることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質粒
   子の製造法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の蛋白質粒子を有効成分
   とする鶏の伝染性ファブリキウス嚢病に対する抗ＩＢＤ
   Ｖワクチン。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の蛋白質粒子を抗原とし
   て、被検体の鶏から採取した血液中又は体液中の成分と
   この抗原とを免疫学的に反応させ、該血液中又は体液中
   のＩＢＤＶ抗体の存在を免疫学的に検出することを特徴
   とする鶏のＩＢＤＶ感染を検査診断する方法。