ES2588023T3

ES2588023T3 - Antígenos de Haemophilus influenzae y los correspondientes fragmentos de ADN

Info

Publication number: ES2588023T3
Application number: ES09159896.1T
Authority: ES
Inventors: Josée Hamel; France Couture; Bernard R. Brodeur; Denis Martin; Catherine Ouellet; Mireille Tremblay; Annie Charbonneau; Catherine Vayssier
Original assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Current assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date: 2000-10-02
Filing date: 2001-10-02
Publication date: 2016-10-28
Anticipated expiration: 2021-10-02
Also published as: EP2088197A2; CY1117746T1; SI2270171T1; EP2088197A3; PT2088197T; US20040171802A1; EP1322762A2; ES2435923T3; DK2270171T5; PT2270171E; DK2270171T3; EP2270171A3; EP2270171A2; CA2424275A1; WO2002028889A3; EP2088197B8; SI2088197T1; JP2004509647A; BR0114403A; EP2270171B1

Abstract

Una composición de vacuna que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido aislado que se escoge de entre: (a) un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; (b) un polipéptido aislado que consiste una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; (c) un polipéptido aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; (d) un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10; (e) un polipéptido aislado que es un análogo de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10, en el que el análogo tiene menos de 20 sustituciones o eliminaciones de restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; (f) un fragmento inmunogénico que consiste en al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10, en el que el fragmento inmunogénico puede dar lugar a una respuesta inmunitaria contra Haemophilus influenzae; (g) el polipéptido aislado de (a), (b), (c), (d), o (e), en el que el resto Met del extremo N se ha eliminado; y (h) el polipéptido aislado de (a), (b), (c), (d), o (e), en el que la secuencia de aminoácidos secretora se ha eliminado, en la que el polipéptido aislado puede dar lugar a una respuesta inmunitaria contra Haemophilus influenzae.

Description

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influenzae no tipable. En una realización adicional, el Haemophilus influenzae es un Haemophilus influenzae tipable.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica de la invención para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección por Haemophilus que comprende la administración a dicho individuo de una cantidad profiláctica o terapéutica de la composición.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de los polipéptidos de Haemophilus de la invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para el diagnóstico y en particular el tratamiento de la infección por H. influenzae. Los anticuerpos adecuados se pueden determinar utilizando procedimientos de selección apropiados, por ejemplo, midiendo la capacidad de un anticuerpo para proteger pasivamente contra la infección por H. influenzae en un modelo de ensayo. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón que se describe en el ejemplo del presente documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o un fragmento de unión al antígeno del mismo y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen mamífero y más específicamente de origen murino, de rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo, o si se desea, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo recombinante. La expresión anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se produjo utilizando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden ser policlonales o preferentemente monoclonales. Puede ser específico para varios epítopos asociados con los polipéptidos de H. influenzae, pero preferentemente es específico para uno.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de una composición farmacéutica de la invención para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección por Haemophilus que comprende la administración a dicho individuo de una cantidad profiláctica o terapéutica de la composición.

A menos de que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habituado en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Aislamiento de polipéptidos de H. influenzae no tipable (NTHI) e identificación de genes que codifican estos polipéptidos

Aislamiento de los polipéptidos de NTHI expuestos en la superficie

Cepas bacterianas

Los aislados clínicos de H. influenzae 12085 y 10095 no tipables fueron proporcionados por D. M. Granoff (St-Louis, Missouri) y B-20, A18, A108, C-98, C-26 y B-31 por el Centre de Recherche en Infectiologie du Centre Hospitalier de l’Université Laval.

El H. influenzae 12085 no tipable se aisló de la sangre de un niño con infección del tracto respiratorio inferior en Pakistán.

Se utilizó Escherichia coli DH5α (GIBCO BRL, Burlington, Ontario) como cepa huésped para el ADN recombinante. Se utilizó E. coli XL1-Blue MRF’ (Stratagene, LaJolla, California) como cepa huésped para la infección con el vector fago Express ZAP lambda. Se utilizó E. coli XLOLR (Stratagene) como la cepa huésped para la infección con Express ZAP lambda filamentoso escindido in vivo.

Antisueros

Se produjeron los antisueros de ratón siguiendo intervalos de inmunización subcutánea cada tres semanas con proteínas de la membrana externa en presencia de adyuvantes completo e incompleto de Freund (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá). Los sueros se recolectaron 21 días después de la tercera inmunización.

Se seleccionaron cuatro antisueros humanos basándose en su reactividad por ELISA y transferencia de Western en

H. influenzae 12085 no tipable inactivado por calor.

Construcción y exploración de una biblioteca de H. influenzae

El ADN de H. influenzae 12085 no tipable se extrajo utilizando un kit de extracción genómico (QIAgen). El ADN se digirió parcialmente con Tsp509I y se ligó en los brazos del fago Express ZAP-λ (Stratagene) digerido con EcoRI. La unión se empaquetó in vitro con extractos Gigapack de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Stratagene). Los fagos recombinantes se colocaron en placas sobre E. coli XL1-Blue MRF’ a una densidad de 2,5 x 104 UFP/150 mm (de diámetro) de placa. Después de ocho horas de incubación, se depositaron discos de nitrocelulosa en las placas y las elevaciones resultantes se procesaron por inmunotransferencia con sueros de ratón y humano. Los clones positivos se extrajeron y se purificaron en placa. Los plásmidos recombinantes pBK-CMV que codifican los genes de Haemophilus de interés se recuperaron del bacteriófago purificado utilizando el fago auxiliar filamentoso ExAssist y la cepa XLOLR de E. coli resistente a lambda por escisión in vivo.

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Identificación de antígenos

Los análisis SDS-PAGE e inmunotransferencia de los lisados de estas E. coli recombinantes mostraban que cada clon expresaba uno o más polipéptidos que reaccionaban con los sueros de ratón o humanos.

Secuenciación de ADN y análisis de secuencia

5 Los clones genómicos se secuenciaron con el kit de secuenciación Taq DyeDeoxy Terminator Cycle (Applied Biosystem, Foster City, California). Se diseñaron varios cebadores internos para secuenciar adicionalmente en las inserciones clonadas. El ensamblaje de secuencia se llevó a cabo utilizando el software Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan) y se llevó a cabo el análisis de la secuencia con el software McVector (Oxford Molecular Ltd., Campbell, California).

10 Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la clonación de genes de H. influenzae no tipable en un vector de expresión.

Las regiones codificantes de los genes de H. influenzae no tipable BVH-NTHI1 a BVH-NTHI12 (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 y 23) se amplificaron por PCR (sistema PCR ADN Thermal Cycler GeneAmp 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN de la cepa 12085 de H. influenzae no tipable utilizando los siguientes 15 oligonucleótidos cebadores que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción NcoI (CCATGG), NdeI (CAT-ATG), SalI (GTCGAC) o XhoI (CTCGAG) (Tabla 1). Los productos de la PCR se purificaron con geles de agarosa utilizando un kit de extracción QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se digirieron con las endonucleasas de restricción adecuadas (Pharmacia Canada Inc, Baie d’Urfé, Canada). Los vectores pET (Novagen, Madison, Wisconsin) se digirieron de otra manera y se purificaron de 20 los geles de agarosa utilizando un kit de extracción QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de la PCR digeridos se unieron con el vector de expresión pET restringido con las enzimas. Los productos unidos se transformaron en la cepa HD5α de E. coli [Φ80dlacZΔM15Δ (lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) deoR thi-1 supE44 λ-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan D. (1985) En: DNA Cloning. D.M. Glover, ed., IRL Press, Washington D.C. vol. 1 pp. 109-135).

25 Los plásmidos que contenían el gen recombinante (rpET) se purificaron utilizando el kit QIAgen (Chatsworth, California) y las inserciones de ADN se secuenciaron (kit de secuenciación Taq Dye Deoxy Terminator Cycle, ABI, Foster City, California).

Tabla 1. Listado de los oligonucleótidos cebadores para la clonación del ADN.

Grupo de cebadores de PCR: Seq. ID. Secuencia 5’-3’ Posición de nucleótidos* Sitios de restricción Vector de clonación-Cepa

HAMJ342-HAMJ343: 25 26 CAAGGCGTTTTCATATG CCTGTCATTCGGCAGG CTAATTGACCTCGAGTT TTGCTGCTTTTAATTCT TGATAATATTG 1-1137 NdeI XhoI pET21-b+ Tuner(DE 3)

HAMJ345-HAMJ344: 27 28 GTAAGGAAACATACATA TGAAAAAACTTTTAAAA ATTAGTG TTAGAGACTCGAGTTTA GCTAAACATTCTATGTA GCTATC 1-1005 NdeI XhoI pET21-b+ BL21 (DE3)

HAMJ348-HAMJ349: 29 30 CCTAACATTGACATATG CTTATGAAACTAAAAGC AACA TCAATATCTCGAGTTTA CCATCAACACTCACACC 1-1647 NdeI XhoI pET21-b+ AD494 (DE 3)

HAMJ346-HAMJ399: 31 32 CTAATAAGGAAAACCAT ATGATGAACAGACGTCA TTTTATTC GACCTAGCTCGAGTTTA GATAAATCAATTTGATA CACTG 1-1971 NdeI XhoI pET21-b+ Tuner (DE 3)

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(continuación)

HAMJ376: 33 CATAAGGAGTAACATAT 1-480 NdeI pET21-b+ Tuner(DE 3)

HAMJ377: GAAAAAAATTATTTTAA CATTATC

34: GTGCAGATTCTCGAGTT TTTTATCAACTGAA XhoI

HAMJ460: 35 CTGGACAGACCATATGC CTTCTGATTTAGTCGC 2-936 NdeI pET21-b+

HAMJ461: CTAAATTGAGCTCGAGA Tuner(DE 3)

36: TTAGTTTTTAATTTACT CC XhoI

HAMJ458: 37 CTTTCTTATAGCATATG AAGAAATTTTTAATTGC GATT 1-1041 NdeI pET21-b+ Tuner (DE 3) pLysS

HAMJ459: 38 CTTCCGCACTCGAGTTT GGCATTTTTC XhoI

HAMJ477: 39 GGAAGGAGCTAGCATGA AAATGAAAAAATTTATT 1-939 NheI pET21-b+ Tuner (DE 3)

HAMJ478: 40 TTGATACTCTCGAGTTT ATTAAAATACTG XhoI

HAMJ481: 41 CTTTAATCACATATGAC TATGTTTAAAAAAATCT CTG 1-534 NdeI pET21-b+

HAMJ482: 42 CACCAATCTCGAGTTTA GATGTACAGGCTT XhoI

HAMJ78: 43 ACCCGCATGGCTGTTCA AATCTACTTGGTAG 75-1728 NcoI pET32-c+

HAMJ79: 44 ACTCGTCGACTTAGTTT GCAACTGGTACAAT SalI AD494(DE 3)

HAMJ414: 45 GATTAGGGAAAACATAT GATTAGGAAACTTATGA A 1-3336 NdeI pET21-b+

HAMJ415: 46 CCATAATTTGCTCGAGT TTTTTTACATCAAC XhoI XhoI

HAMJ450: 47 GGAAGGAGCTAGCATGA AATTAAAACAACTTTTT G 1-816 NheI pET21-b+ Tuner (DE 3)

HAMJ411: 48 GTGCGGTAGCTCGAGCC AACCTTTTAC XhoI

* La posición de nucleótido indica el resultado de la clonación, es decir, la longitud y la posición en la Figura 1 de los productos de la PCR.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la amplificación por PCR y la secuenciación del gen BVH-NTHI1 de otras cepas de H. influenzae y la evaluación del nivel de conservación molecular de este gen.

Las respectivas regiones codificantes del gen BVH-NTHI1 de H. influenzae se amplificaron por PCR (Sistema de PCR 2400 DNA Thermal Cycler GeneAmp Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico utilizando los siguientes oligos: HAMJ342 (5’-CAAGGCGTTTTCATATGCCTGTCATTCGGCAGG -3’); HAMJ343 (5’

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Claims

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