MXPA01009688A - Compuestos novedosos. - Google Patents

Abstract

Se describe polipeptidos CASB619 y polinucleotidos y metodos para producir dichos polipeptidos mediante tecnicas recombinantes. Tambien estan descritos metodos para utilizar polipeptidos CASB619 y polinucleotidos en diagnosticos; y vacunas para tratamiento profilactico y terapeutico de canceres, en particular canceres de ovarios y de colon, enfermedades autoinmunologicas y condiciones relacionadas.

Description

COMPUESTOS NOVEDOSOS La presente invención se refiere a polinucleótidos, denominados en la presente polinucleótidos CASB619, a los péptidos codificados por ellos (en la presente denominados polipéptidos CASB619), a materiales recombinantes y a métodos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para usar dichos polipéptidos y polinucleótidos, que incluyen el tratamiento de cáncer, en particular cáncer de colon, y enfermedades autoinmunológicas y otras condiciones relacionadas. En otro aspecto, ia invención se refiere a métodos para identificar agonistas y antagonistas/inhibidores, utilizando los materiales provistos por la invención y para tratar condiciones asociadas con el desequilibrio de polipéptido CASB619 con los compuestos identificados. En otro aspecto más, la invención se refiere a análisis de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con la actividad o los niveles impropios de polipéptido CASB619. Se cree que los polipéptidos y los polinucleótidos de la presente invención son inmunógenos importantes para inmunización profiláctica o terapéutica específica contra tumores, debido a que son expresados específicamente o fuertemente sobre-expresados en tumores, en comparación con las células normales y, de tal manera, pueden ser escogidos como blancos por mecanismos inmunológicos específicos para el antígeno, lo que conduce a la destrucción de la célula tumoral. También pueden ser usados para diagnosticar la ocurrencia de células tumorales. Además, su expresión impropia en ciertas circunstancia puede provocar la inducción de respuestas autoinmunológicas, impropias desde el punto de vista inmune, lo que podría corregirse mediante vacunación apropiada usando los mismos polipéptidos o polinucleótidos. En este sentido, las actividades biológicas más importantes para nuestro propósito son las actividades antigénicas e ¡nmunogénicas del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de la presente invención también puede exhibir por lo menos otra actividad biológica de un polipéptido CASB619, que podría considerarlo como un blanco para una intervención terapéutica o profiláctica diferente de la ligada con la respuesta inmunológica. En un primer aspecto, la presente invención se refiere a los polipéptidos CASB619. Dichos péptidos incluyen los polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, y todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad, y lo que más se prefiere, por lo menos 97-99 por ciento de identidad, con la que aparece en SEQ ID NO: 2, en toda la longitud de SEQ ID NO: 2. Dichos polipéptidos incluyen aquellos que comprenden el aminoácido de SEQ ID NO: 2. Otros péptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos aislados, en los que la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad y, lo que más se prefiere, por lo menos 97-99 por ciento de identidad, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en toda la longitud de SEQ ID NO: 2. Dichos polipéptidos incluyen el polipéptido de SEQ ID NO: 2. Otros péptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos aislados, codificados por un polinucleótido, que comprenden la secuencia contenida en SEQ ID NO: 1. La ¡nvención provee también un fragmento inmunogénico de un polípéptido CASB619, que es una porción contigua del polipéptido CASB619 que tiene las mismas propiedades inmunogénicas, o similares, que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Esto quiere decir que el fragmento (de ser necesario cuando está acoplado a un portador) es capaz de elevar la respuesta inmunológica que reconoce el polipéptido CASB619. Dicho fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido CASB619 que carece de una secuencia encabezadora N-terminal, un dominio de transmembrana o un dominio de ancla C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de CASB619 de acuerdo con la presente ¡nvención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad y, lo que más se prefiere, por lo menos 97-99 por ciento de identidad, con el de SEQ ID NO: 2, en toda la longitud de SEQ ID NO: 2. Los fragmentos de péptido que incorporan un epítope de CASB619 típicamente comprenderán por lo menos siete, de preferencia nueve o diez aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 2. Los epítopes preferidos están mostrados en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 68. Los péptidos que incorporan estos epítopes forman un aspecto preferido de la presente invención. Los mimótopos, que tienen las mismas características que estos epítopes, y los inmunógenos que comprenden dichos mimótopos, que generan una respuesta inmunológica que reaccionará cruzadamente con un epítope, en el contexto de la molécula CASB619, forman parte también de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención incluye péptidos aislados que incluyen estos epítopes, por sí mismos, y cualquier mimótopo de ellos. El significado de mimótopo está definido como una entidad que es suficientemente similar al epítope CASB619 natural, como para ser capaz de ser reconocido por los anticuerpos que reconocen la molécula natural (Gheysen, H. M. y coautores, 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, simposio de Ciba Foundation 119, páginas 130-149; Gheysen, H. M., 1986, Molecular Immunology, 23,7, 709-715); o son capaces de elevar los anticuerpos, cuando están acoplados a un portador adecuado; anticuerpos que reaccionan cruzadamente con la molécula natural. Los mimótopos de péptido de los epítopes identificados arriba pueden ser diseñados para un propósito particular, mediante la adición, omisión o sustitución de aminoácidos seleccionados. De tal manera, los péptidos de la presente invención pueden ser modificados para los propósitos de facilitar la conjugación a un portador proteínico. Por ejemplo, puede ser conveniente para ciertos métodos de conjugación química, incluir una cisteína terminal en el epítope. Adicionalmente puede ser conveniente que los péptidos conjugados a un portador proteínico incluyen un extremo hidrófobo distal del extremo conjugado del péptido; de modo que el extremo libre no conjugado del péptido permanezca asociado a la superficie de la proteína portadora. Esto reduce los grados de conformación de libertad del péptido y, de tal manera, aumenta la probabilidad de que esté presente el péptido en una conformación que se parezca lo más posible a la del péptido que se encuentra en el contexto de la molécula entera. Por ejemplo, se puede alterar los péptidos para que tengan una cisteína N-terminal y un apéndice amidado hidrófobo C-terminai. Alternativamente, se puede efectuar la adición o sustitución de una forma D-estereoisomérica de uno o más de los aminoácidos, para crear un derivado benéfico, por ejemplo, para aumentar la estabilidad del péptido. Quienes son expertos en la materia se dará cuenta de que dichos péptidos modificados, o mimótopos, podrían ser un mimótopo total o parcialmente sin péptido, donde los residuos constitutivos no están confinados necesariamente a los veinte aminoácidos que ocurren en la naturaleza. Adicionalmente, éstos pueden ser ciclizados mediante técnicas conocidas en el arte, para restringir el péptido a una conformación que se parezca mucho a su forma cuando la secuencia de péptido está en el contexto de la molécula entera. Un método preferido para ciclizar un péptido comprende la adición de un par de residuos cisteína, para permitir la formación de un puente disulfuro. Adicionalmente, quienes sean expertos en la materia se darán cuenta de que los mimótopos o inmunógenos de la presente invención pueden ser mayores que los epítopes identificados más arriba, y que, de esa manera, pueden comprender las secuencias aquí descritas. Consecuentemente, los mimótopos de la presente invención pueden consistir de la adición de extensiones N-terminales y/o C-term¡nales, de otros muchos residuos naturales, en uno o en ambos extremos. Los mimótopos de péptido también pueden ser secuencias "retro" de las secuencias naturales, por cuanto se invierte la orientación de la secuencia; o, alternativamente, las secuencias pueden estar comprendidas, totalmente o por lo menos en parte, de aminoácidos D-estereoisoméricos (secuencias "inverso"). Además, las secuencias de péptido pueden ser de naturaleza retro-inverso, por cuanto la orientación de la secuencia está invertida, y los aminoácidos están en la forma D-estereoisomérica. Dichos péptidos retro-inverso tienen la ventaja de ser no autónomos y, de tal manera, pueden resolver problemas de auto-tolerancia en el sistema inmunológico. Alternativamente, los mimótopos de péptido pueden ser identificados usando anticuerpos que sean capaces por sí mismos de unirse a los epítopes de la presente invención, utilizando técnicas tales como la tecnología de exhibición de fago (EP 0 552 267 B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias de péptido que imitan la estructura de los péptidos naturales y, por consiguiente, son capaces de unirse a anticuerpos de péptido antinaturales; pero no necesariamente pueden compartir homología de secuencia significativa con ei péptido natural. Esta propuesta puede tener ventajas significativas al permitir la posibilidad de identificar un péptido que tenga propiedades inmunogénicas incrementadas, o puede resolver cualquier problema de tolerancia a auto-antígeno, potencial, que pudiera estar asociado con el uso de la secuencia de péptido natural. Adicionalmente, esta técnica permite la identificación de un patrón de reconocimiento para cada péptido natural, en términos de sus propiedades químicas compartidas entre las secuencias de mimótopo reconocidas. Se puede llevar a cabo el acoplamiento covalente del péptido al portador inmunogénico de una manera bien conocida en la técnica. Así, por ejemplo, es posible, para el acoplamiento covalente directo, es posible utilizar una carbodiimida, un glutaraldehído o un éster de (N-[gamma- maleimidobutiriloxijsuccinimida, utilizando enlazadores heterobifuncionales comunes, obtenibles en el comercio, como CDAP y SPDP (usando las instrucciones del fabricante). Después de la reacción de acoplamiento, se puede aislar fácilmente el inmunógeno y se lo puede purificar por medio de un método de diálisis, un método de filtración en gel, un método de fraccionación, etc. Los tipos de portadores usados en los inmunógenos de la presente ¡nvención serán fácilmente reconocidos por quienes sean expertos en la materia. La función del portador es proveer el auxilio de citocina a fin de ayudar a inducir una respuesta inmunológica contra el péptido. Una lista no exhaustiva de portadores que pueden ser usados en la presente ¡nvención incluyen: hemocianína de lapa ojo de cerradura (KLH, acrónimo por su designación en inglés: Keyhole Limpet Haemocyanin); albúminas de suero, tal como albúmina de suero bovino (BSA, acrónimo por su designación en inglés: Bovine Serum Albumin); toxinas bacterianas inactivadas, tales como toxinas de tétanos (TT y de difteria (DT), o sus fragmentos recombinantes (por ejemplo, el dominio 1 del fragmento C de TT, o el dominio de traslocación de DT); o el derivado de proteína purificado (PPD, por su designación en inglés: Purified Protein Derivative) de tuberculina. Alternativamente, los mimótopos o epítopes pueden estar directamente conjugados con portadores liposómicos, que pueden comprender adicionalmente inmunógenos capaces de proveer auxilio de célula T. Es preferible que la razón de mimótopos a portador sea del orden de 1:1 a 20:1 y, de preferencia, cada portador debe llevar entre 3 y 15 péptidos. En una modalidad de la invención un portador preferido es la proteína D de Haemophilus influenzae (EP 0594 610 B1). La proteína D es una proteína que se une a IgD, procedente de Haemophilus influenzae y ha sido patentada por Forsgren (WO 91/18926, EP 0 594 610 B1, concedida). En algunas circunstancias, por ejemplo, en los sistemas de expresión inmunogénicos recombinantes, puede ser conveniente utilizar fragmentos de proteína D, por ejemplo, proteína D 1/3 (que comprende los 100-110 aminoácidos del terminal N de la proteína D (GB 9717953.5)). Otro método preferido para presentar los péptidos de la presente ¡nvención es en el contexto de una molécula de fusión recombinante. Por ejemplo, EP 0 421 635 B describe el uso de partículas quiméricas de núcleo de hepadnavirus y antígeno, para presentar secuencias de péptido en una partícula similar a un virus. En tal carácter, los ¡nmunógenos de la presente invención pueden comprender péptidos presentados en partículas quiméricas que consisten del antígeno para el núcleo de hepatitis B. Adicionalmente, las proteínas de fusión recombinantes pueden comprender los mimótopos de la presente invención y una proteína portadora, tal como NS1 del virus de la influenza. Para cualquier proteína expresada de manera recombinante, que forma parte de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el inmunógeno también forma un aspecto de la presente ¡nvención. Los péptidos usados en la presente invención pueden ser sintetizados fácilmente mediante procedimientos de fase sólida, bien conocidos en la técnica. Se puede llevar a cabo las síntesis adecuadas utilizando procedimientos "T-boc" o "F-moc". Se puede sintetizar los péptidos cíclicos por medio del procedimiento en fase sólida, empleando el procedimiento "F-moc" bien conocido y resina de poliamida, en un aparato totalmente automático. Alternativamente, quienes sean expertos en la materia conocerán los procedimientos de laboratorio necesarios para llevar a cabo manualmente el proceso. Las técnicas y los procedimientos para la síntesis en fase sólida están descritos en Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, por E. Atherton y R. C. Sheppard, publicado por IRL en Oxford University Press (1989). Alternativamente se puede producir los péptidos mediante métodos recombinantes, que incluyen expresar las moléculas de ácido nucleico que codifican los mimótopos en una línea de células de bacterias o de mamíferos, y luego purificar el mimótopo expresado. Las técnicas para la expresión recombinante de péptidos y proteínas son conocidas en el arte, y están descritas en Maniatis, T., Fritsch, E. F. y Sambrook y coautores, Molecular cloning, a laboratory manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). Los polipéptidos o el fragmento inmunogénico de la invención puede estar en la forma de la proteína "madura" o puede ser parte de una proteína mayor, tal como un precursor o una proteína de fusión. Frecuentemente es ventajoso incluir una secuencia adicional de aminoácido que contenga secuencias secretora o encabezadora, prosecuencias, secuencias que ayuden a la purificación, tales como múltiples residuos histidina, o una secuencia adicional para estabilidad durante la producción recombinante. Adicionalmente, también está considerada la adición de polipéptido exógeno o de un apéndice lípido o de secuencias de polinucleótido para incrementar el potencial inmunogénico de la molécula final. En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles, producidas por ingeniería genética, que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento de él, y varias porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, en particular ígG 1 , cuya fusión tiene lugar en la región de gozne. En una modalidad particular, se puede eliminar la parte Fe simplemente por incorporación de una secuencia de división, que se puede dividir con el factor Xa de coagulación de la sangre. Adicionalmente esta invención se refiere a procesos para la preparación de estas proteínas de fusión por medio de ingeniería genética, y a su uso para selección de fármacos, diagnóstico y terapia. Otro aspecto de la invención se refiere también a los polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión. Se puede encontrar ejemplos de la tecnología de proteínas de fusión en las solicitudes de patente internacional WO 94/2945 y WO 94/22914. Las proteínas pueden estar conjugadas químicamente o expresadas como proteínas de fusión recombinantes, lo que permite aumentar los niveles que se van a producir en un sistema de expresión, en comparación con la proteína no fundida. El participante de la fusión puede ayudar a proveer epítopes de auxiliar T (participante de fusión inmunológica), de preferencia epítopes de auxiliar T reconocidos por humanos, o bien ayudar a expresar la proteína. Es preferible que el participante en la fusión sea tanto un participante en la fusión inmunológica como un participante incrementador de expresión. Los participantes en la fusión incluyen la proteína D de Haemophilus influenzae B y la proteína no estructura del virus de influenza NS1 (hemaglutinina). Otro participante en la fusión inmunológica es la proteína conocida como LYTA. De preferencia se usa la porción terminal C de la molécula. Lyta se deriva de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alaninamidasa, la amidasa LYTA (codificada por el gene lytA {Gene, 43 (1986) páginas 265-272}, una autolisina que degrada específicamente ciertas ligaduras en el esqueleto del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad a la colina o a ciertos análogos de colina, tales como DEAE. Esta propiedad ha sido explotada para el desarrollo de plásmidos que expresa C-LYTA de E. coli, útiles para la expresión de proteínas de fusión. La purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en su extremo amino, ha sido descrita [Biotechnology, 10 (1992) páginas 795-798]. Es posible usar la porción repetida de la molécula Lyta encontrada en el extremo C-terminal, partiendo del residuo 178, por ejemplo, los residuos 188-305. La presente ¡nvención incluye también variantes de los polipéptidos mencionados con anterioridad, es decir, polipéptidos que varían con respecto a los referentes en las sustituciones de aminoácido conservadoras, mediante lo cual se sustituye un residuo por otro con características similares. Son típicas de esas sustituciones, entre Ala, Val Leu e lie, entre Ser y Thr, entre los residuos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln, y entre los residuos básicos Lys y Arg, o los residuos aromáticos Phe y Tyr. Se prefiere en particular las variantes en las que varios aminoácidos, 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 o 1 son sustituidos, omitidos o añadidos, en cualquier combinación. Se puede preparar los polipéptidos de la presente ¡nvención de cualquier manera adecuada. Dichos polipéptidos incluyen los polipéptidos aislados que ocurren en la naturaleza, los polipéptidos producidos de manera recombinante, los polipéptidos producidos de manera sintética, o los polipéptidos producidos mediante una combinación de esos métodos. Los medios para preparar esos polipéptidos son bien entendidos en el arte.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos CASB619. Dichos polinucleótidos incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad, con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; en toda la longitud de SEQ ID NO: 2. En este sentido, los polipéptidos que tienen por lo menos 97 por ciento de identidad son sumamente preferidos, mientras que los que tienen por lo menos 98-99 por ciento de identidad son más fuertemente preferidos, y los que tienen por lo menos 99 por ciento de identidad son ios que tienen la mayor preferencia de todos. Dichos polinucleótidos incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos contenida en SEQ ID NO: 1, que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2. Otros polinucleótidos de la presente ¡nvención incluyen los polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad, con respecto a una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2, en toda la región codificadora. Con respecto a esto, se prefieren con mucho los polinucleótidos que tienen por lo menos 97 por ciento de identidad, mientras que son todavía más preferidos aquellos que tienen por lo menos 98-99 por ciento de identidad, y los que tienen por lo menos 99 por ciento de identidad son los más preferidos de todos. Otros nucleótidos adicionales de la presente invención incluyen los polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad, con la secuencia SEQ ID NO: 1, en toda la longitud de SEQ ID NO: 1. A este respecto, los polinucleótidos que tienen por lo menos 97 por ciento de identidad son altamente preferidos, mientras que los que tienen por lo menos 98-99 por ciento de identidad son todavía más preferidos, y los que tienen por lo menos 99 por ciento de identidad son los más preferidos de todos. Dichos polinucleótidos incluyen un polinucleótido que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 1, así como el polinucleótido de SEQ ID NO: 1. Dicho polinucleótido puede ser insertado en un plásmido adecuado o en un vector de microorganismo recombinante, y puede ser usado para inmunización. (Véase, por ejemplo, Wolff y coautores, Science 247: 1465-1468 (1990); Corr y coautores, J. Exp. Med. 184: 1555-1560 (1996); Doe y coautores, Proc. Nati. Acad. Sci., 93: 8578-8583 (1996)). La invención provee también polinucleótidos que son complementarios de todos los polinucleótidos arriba descritos. La invención provee también un fragmento de un polinucleótido CASB619 que cuando es administrado a un sujeto, tiene las mismas propiedades inmunogénicas que el polinucleótido de SEQ ID NO: 1. La invención provee también un polinucleótido que codifica un fragmento inmunológico de un polipéptido CASB619 como se definió más atrás. La secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 1 muestra homología con el cromosoma 1 de Homo sapiens, clon RP4-641D22, mapa p13.1-13.3 (acceso AL157901). La secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADNc y comprende una secuencia codificadora de polipéptido (nucleótidos 1 a 3043) que codifica un polipéptido de 1013 aminoácidos, el polipéptido de la SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica polipéptido, contenida en SEQ ID NO: 1, o puede ser una secuencia diferente a la contenida en SEQ ID NO: 1, que, como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, codifica también el polipéptido de SEQ ID NO: 2. El polipéptido de SEQ ID NO: 2 no está relacionado con ninguna otra proteína conocida. Los polipéptidos preferidos y los polinucleótidos de la presente ¡nvención se espera que tengan, entre otras, funciones/ propiedades biológicas similares a las de sus polipéptidos y polinucleótidos homólogos. Adicionalmente, los polipéptidos preferidos, los fragmentos inmunológicos y los polinucleótidos de la presente ¡nvención tienen por lo menos una actividad de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 2, según sea apropiado. La presente ¡nvención se refiere también a otras secuencias parciales o incompletas de polinucleótido y de polipéptido que fueron identificadas primeramente antes de terminar las secuencias de longitud completa correspondientes de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Consecuentemente, en otro aspecto, la presente ¡nvención provee un polinucleótido aislado que: a) comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad, y lo que más se prefiere, por lo menos 97-99 por ciento de identidad con respecto a SEQ ID NO: 3, en toda la longitud de SEQ ID NO: 3. b) tiene una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad, y lo que más se prefiere de todo, por lo menos 97-99 por ciento de identidad con respecto a SEQ ID NO: 1, en toda la longitud de SEQ ID NO: 3. c) el polinucleótido de SEQ ID NO: 3; o d) una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad; y lo que más se prefiere, por lo menos 97-99 por ciento de identidad, con respecto a la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 4, en toda la longitud de SEQ ID NO: 4, así como el polinucleótido de SEQ ID NO: 3. La presente invención provee adicionalmente un polipéptido que: a) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad, lo más preferible, por lo menos 97- 99 por ciento de identidad, con respecto a la SEQ ID NO: 2, en toda la longitud de SEQ ID NO: 4; b) tiene una secuencia de aminoácido que tiene por io menos 70 por ciento de identidad, de preferencia por lo menos 80 por ciento de identidad, más preferible, por lo menos 90 por ciento de identidad, todavía más preferible, por lo menos 95 por ciento de identidad, y lo que se prefiere más que todo, por lo menos 97-99 por ciento de identidad, con respecto a la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, en toda la longitud de SEQ ID NO: 4; c) comprende el aminoácido de SEQ ID NO: 4; y d) es el polipéptido de SEQ ID NO: 4; así como los polipéptidos codificados por un polinucleótido que comprende la secuencia contenida en SEQ ID NO: 3. La secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de péptido codificada por ella, se derivan de las secuencias EST (acrónimo por su designación en inglés: Expressed Sequence Tag). Quienes son expertos en la materia reconocen que inevitablemente habrá algunos errores en la lectura de la secuencia de nucleótido en las secuencias EST (véase Adams, M. D. y coautores, Nature 377 (suplemento) 3, 1995). Consecuentemente, la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 3 y la secuencia de péptido codificada a partir de ella, están sujetas a las mismas limitaciones inherentes con respecto a ia precisión de la secuencia. Adicionalmente, la secuencia de péptido codificada por SEQ ID NO: 3 comprende una región de identidad o de homología cercana y/o de similitud estructural cercana (por ejemplo, una diferencia de aminoácido conservador) con la proteína homologa más cercana o estructuralmente similar. Los polinucieótidos de la presente invención pueden ser obtenidos usando técnicas comunes y corrientes de clonación y de selección, a partir de un banco de ADNc derivado de ARNm en células de cáncer de colon humano (por ejemplo, Sambrook y coautores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser obtenidos de fuentes naturales, como bancos de ADN genómico, o pueden ser sintetizados usando técnicas bien conocidas y comercialmente disponibles. Cuando se usa los polinucleótidos de la presente ¡nvención para la producción recombinante de los polipéptidos de la presente ¡nvención, el polinucleótido puede incluir la secuencia codificadora para el polipéptido maduro, por sí misma, o bien la secuencia codificadora para el polipéptido maduro en el marco de lectura con otras secuencias codificadoras, tales como las que codifican una secuencia encabezadora o secretora, una secuencia pre-proteínica, pro-proteínica o prepro-proteínica, u otras porciones de péptido de fusión. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia marcadora que facilite la purificación del polipéptido fundido. En ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido hexa-histidínico, tal como el provisto en el vector pQE (Quiagen, Inc.) y descrito en Gentz y coautores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1989) 86: 821-824, o es un marbete HA. El polinucleótido también puede contener secuencias 5' y 3', tales como las secuencias transcritas, no trasladadas, señales de empalme y de poliadenilación, sitios de unión ribosómica y secuencias que estabilicen el ARNm. Otras modalidades de la presente invención incluyen variantes de polipéptido que codifican los polinucleótidos, que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y en la que varios residuos de aminoácido, por ejemplo de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3 o de 1 a 2 o un residuo de aminoácido están omitidos o añadidos, en cualquier combinación. Los polinucleótidos que son idénticos o suficientemente idénticos a una secuencia de nucleótido contenida en SEQ ID NO: 1 pueden ser usados como sondas de hibridación para ADNc y ADN genómico, o como sensibilizadores para una reacción de amplificación de ácido nucleico (RCP), para aislar los ADNc de longitud completa y los clones genómicos que codifican los polipéptidos de la presente invención, y para aislar el ADNc y los clones genómicos de otros genes (incluyendo los genes que codifican los parálogos de fuentes humanas y los ortólogos y parálogos de especies diferentes a la humana), que tienen una elevada similitud de secuencia con SEQ ID NO: 1. Típicamente estas secuencias de nucleótido tienen una identidad de 70 por ciento, de preferencia una identidad de 80 por ciento, más preferible, una identidad de 90 por ciento, muy preferible, una identidad de 95 por ciento con respecto al referente. Las sondas o los sensibilizadores generalmente comprenderán por lo menos 15 nucleótidos, de preferencia por lo menos 30 nucleótidos y pueden tener por lo menos 50 nucleótidos. Las sondas particularmente preferidas tendrán entre 30 y 50 nucleótidos. Los sensibilizadores particularmente preferidos tendrán entre 20 y 25 nucleótidos. En particular se podría usar polipéptidos o polinucleótidos derivados de secuencias de origen animal homólogo, como inmunógenos, para obtener una respuesta inmunológica de reacción cruzada con el gene humano. Se puede obtener un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo los homólogos de especies diferentes a la humana, mediante un proceso que comprende los pasos de: seleccionar un banco apropiado, bajo condiciones de hibridación estrictas, con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un fragmento de ella; y aislar el ADNc de longitud completa y los clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótido. Esas técnicas de hibridación son bien conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de hibridación estrictas, preferidas, incluyen la incubación durante la noche a 42°C en una solución que comprende: 50 por ciento de formamida, 5x de SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de potasio (pH 7.6), solución de Denhardts 5x, sulfato de dextrano al 10 por ciento y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón sometido a esfuerzo cortante; seguida por lavado de los filtros en 0.1x de SSC, aproximadamente a 65°C. De tal manera, la presente invención incluye también polinucleótidos obtenibles seleccionando un banco apropiado, bajo condiciones de hibridación estrictas, con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de ella.

Quien sea experto en la materia apreciará que, en muchos casos, una secuencia de ADNc aislada estará incompleta, ya que la región que codifica el polipéptido está cortada en el extremo 5' del ADNc. Hay varios métodos disponibles y bien conocidos por los expertos en la materia, para obtener los ADNc de longitud completa, o prolongar los ADNc cortos; por ejemplo, los basados en el método de amplificación rápida de los extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman y coautores, PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathón™ (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más cortos. En la tecnología Marathón™, se ha preparado los ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido seleccionado y una secuencia "adaptadora" ligada en cada extremo. A continuación se lleva a cabo la amplificación de ácido nucleico (RCP) para amplificar el extremo 5' "faltante" del ADNc, utilizando una combinación de sensibilizadores oligonucleótidos específicos para el gene y específicos para el adaptador. Luego se repite la reacción de RCP utilizando sensibilizadores "encestados", es decir, sensibilizadores diseñados para fijarse dentro del producto amplificado (típicamente un sensibilizador específico para el adaptador, que se fija adicionalmente en 3' de la secuencia del adaptador, y un sensibilizador específico para el gene, que se fija adicionalmente 5' en la secuencia del gene conocida). Los productos de esta reacción pueden ser analizados entonces mediante secuenciación del ADN y un ADNc de longitud completa puede ser construido ya sea uniendo el producto directamente al ADNc existente, para dar una secuencia completa, o bien llevando a cabo una RCP de longitud completa, separada, usando la nueva información de secuencia para el diseño del sensibilizador 5'. Se puede preparar los polipéptidos recombinantes de la presente invención mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, a partir de células anfitrionas formadas por ingeniería genética, que comprenden sistemas de expresión.

Consecuentemente en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un sistema de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención, a células anfitrionas que están tratadas por ingeniería genética, con dichos sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención, mediante técnicas recombinantes. También se puede emplear los sistemas de translación libres de células, para producir dichas proteínas, usando los ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Para la producción recombinante, las células anfitrionas pueden ser tratadas por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de ellos, para los nucleótidos de la presente ¡nvención. La introducción de polinucleótidos en las células anfitrionas se puede efectuar mediante métodos descritos en muchos manuales de laboratorio comunes y corrientes, tales como en Davis y coautores, Basic Methods in Molecular Biolog (1986), y en Sambrook y coautores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Dichos métodos preferidos incluyen, por ejemplo, la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transvección, la microinyección, la transfección mediada por lípido, la electroporación, la transducción, la carga de embarazo, la introducción por balística o la infección. Se prefiere que las proteínas de la invención sean coexpresadas con tioredoxina en trans (TIT). La coexpresión de tioredoxina en trans, en oposición a cis, se prefiere para mantener el antígeno libre de tioredoxina, sin necesidad de proteasa. La coexpresión con tioredoxina facilita la solubilización de las proteínas de la invención. La coexpresión con tioredoxina también tiene impacto importante sobre el rendimiento de la purificación de proteína, sobre la solubilidad y la calidad de la proteína purificada. Los ejemplos representativos de anfitriones apropiados incluyen las células bacterianas, tales como células de Streptococci, Staphylococcl, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis; células fúngales, como células de levadura y células de Aspergillus; células de insectos, como células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9; células animales, como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y células de meianoma de Bowes; así como células de vegetales.

Se puede usar una gran variedad de sistemas de expresión, por ejemplo, sistemas cromosómícos, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus, como baculovirus, virus de papova, tales como SV40, virus de vacunas, adenovirus, virus de viruela aviaria, virus de seudo-rabia y retrovirus; y vectores derivados de sus combinaciones, tales como los derivados de elementos genéticos plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Los sistemas de expresión pueden contener regiones de control que regulen y a la vez que engendren expresión. En general se puede usar cualquier sistema o vector que sea capaz de mantener, propagar o expresar un polinucleótido, para producir un polipéptido en un anfitrión. Se puede insertar la secuencia de nucleótido apropiada en un sistema de expresión por medio de cualquiera de entre una variedad de técnicas bien conocidas y rutinarias, tales como, por ejemplo, las señaladas en Sambrook y coautores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (supra). Se puede incorporar señales de secreción apropiadas en el polipéptido deseado para permitir la secreción de la proteína trasladada, hacia el lumen del retículo endoplásmico, el espacio periplásmico o el medio ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas para el polipéptido o pueden ser señales heterólogas. El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o un bacteria. Se puede insertar el gene de interés en la genoma de u virus o una bacteria vivos, recombinantes. La inoculación y l infección in vivo con este vector vivo conducirá a la expresión i vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunológicas. Los virus y las bacterias usados para este fin son, por ejemplo, lo virus de viruela (por ejemplo, vacunas, viruela aviaria, viruela d canario), alfa-virus (virus de Sindbis, virus forestal de Semliki, virus de encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus adeno asociado, picornavirus (virus de polio, rinovirus), virus de herpes (virus de varicela zóster, etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o atenuados de diversas maneras a fin de obtener vacunas vivas. Dichas vacunas también forman parte de la invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser recuperados y purificados a partir de cultivos celulares recombinantes, mediante métodos bien conocidos, que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía por cambio de anión o de catión, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad, cromatografía en hidroxiapatita y cromatografía en lectina. Es muy preferible que se emplee la cromatografía por afinidad de metal ¡ónico (IMAC, acrónimo por su designación en inglés: Ion Metal Affinity Chromatography) para la purificación. Se puede emplear técnicas bien conocidas para volver a plegar las proteínas a fin de regenerar la conformación activa, cuando se desnaturaliza el polipéptido durante la síntesis ¡ntracelular, el aislamiento y/o la purificación. Otro aspecto importante de la invención se refiere a un método para inducir, reforzar o modular una respuesta inmunológica en un mamífero, que comprende inocular al mamífero con un fragmento o con la totalidad dei polipéptido o polinucleótido de la invención, adecuado para producir respuesta inmunológica de anticuerpo y/o de célula T, para la profilaxis o para el tratamiento terapéutico de cáncer y de enfermedades autoinmunológicas y condiciones relacionadas. Otro aspecto más de la invención se refiere a un método para inducir, reforzar o modular la respuesta inmunológica en un mamífero, que comprende suministrar un polipéptido de la presente invención por medio de un vector o una célula que dirige la expresión del polinucleótido y codificar el polipéptido in vivo a fin de inducir dicha respuesta inmunológica para producir respuestas inmunológícas para la profilaxis o el tratamiento de dicho mamífero contra las enfermedades. Otro aspecto más de la invención se refiere a una formulación inmunológica/de vacuna (una composición) que, cuando es introducida a un anfitrión mamífero induce, refuerza o modula una respuesta inmunológica en ese mamífero con respecto a un polipéptido de la presente ¡nvención; donde la composición comprende un polipéptido o un polinucleótido de la invención o un fragmento inmunológico del mismo, tal como se definió aquí con anterioridad. La formulación de vacuna puede comprender adicionalmente un portador adecuado. Puesto que se puede descomponer dicho polipéptido en el estómago, se prefiere que se le administre parenteralmente (por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen las soluciones para inyección estériles, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostatos y solutos, que hacen isotónica la formulación con la sangre del receptor; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesadores. Se puede presentar las formulaciones en recipientes de una sola dosis o de dosis múltiples; por ejemplo, ampolletas y frascos sellados, y se los puede almacenar en condición secada por congelación, que únicamente requiere la adición del portador líquido estéril, antes del uso. Otro aspecto más de la invención se refiere a la inducción in vitro de respuestas ¡nmunológicas a un fragmento o a la totalidad del polipéptido o del polinucleótido de la presente ¡nvención, o una molécula que comprende el polipéptido o polinucleótido de la presente invención, usando células procedentes del sistema inmunológico de un mamífero, y reinfundir esas células inmunológicas activadas del mamífero, para el tratamiento de la enfermedad. La activación de las células procedentes del sistema inmunológico se logra mediante la incubación in vitro con el polipéptido o polinucleótido enteros de la presente ¡nvención, o una molécula que comprende el polipéptido o el polinucleótido de la presente invención en presencia o ausencia de diversas moléculas ¡nmunomoduladoras. Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere a la inmunización de un mamífero por administración de antígeno que presenta células modificadas mediante una carga in vitro con parte del polipéptido de la presente invención, o la totalidad de él, o bien una molécula que comprende el polipéptido de la presente invención, y administrado in vivo de una manera inmunógena. Alternativamente, las células que presentan antígeno pueden ser trasfectadas in vitro con un vector que contiene un fragmento del polinucleótido de la presente invención, o la totalidad de él, o bien una molécula que comprende el polinucleótido de la presente invención, de manera que exprese el correspondiente polipéptido y administrado in vivo de una manera inmunógena. La formulación de vacuna de la invención también puede incluir sistemas adyuvantes para incrementar la ¡nmunogenicidad de la formulación. Es preferible que el sistema adyuvante eleve preferencialmente un tipo TH1 de respuesta. Una respuesta inmunológica puede distinguirse ampliamente en dos categorías extremas, que son una respuesta inmunológica humoral o mediada por célula (caracterizadas tradicionalmente por mecanismos de protección efectores de anticuerpo y celulares, respectivamente), y respuestas ¡nmunológicas del tipo TH2 (respuesta humoral). Las respuestas ¡nmunológicas extremas del tipo TH1 pueden ser caracterizados por ia generación de linfocitos T citotóxicos, específicos para el antígeno, restringidos por haplotipo, y respuestas naturales de células asesinas naturales. En los ratones, las respuestas del tipo TH1 frecuentemente se caracterizan por la generación de anticuerpos del subtipo lgG2a, mientras que en los humanos, corresponden a anticuerpos del tipo IgGl. Las respuestas inmunológicas del tipo TH2 están caracterizadas por la generación de una escala amplia de ¡sotipos de inmunoglobulina, que incluyen en los ratones IgG 1 , IgA e IgM. Se puede considerar que la fuerza accionadora detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunológicas son las citocinas. Los niveles elevados de citocinas del tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunológicas mediadas por células para el antígeno dado, mientras que los niveles elevados de las citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunológicas humorales para el antígeno. La diferencia de las respuestas inmunológicas del tipo TH1 y del tipo TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmunológica que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de lo que se describió en los clones de célula T CD4 + ve de mundo por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. y Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional propertles. Annual Review of Immunology, 7, páginas 145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 están asociadas con la producción de citocinas INF-gamma e IL-2 por linfocitos T. Frecuentemente otras citocinas directamente asociadas con la inducción de respuestas inmunológicas del tipo TH1 no son producidas por células T, tales como IL-12. En contraste, las respuestas de tipo TH2 están asociadas con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13. Se sabe que ciertos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para estimular ya sea respuestas de citocina de tipo TH1 o bien de tipo tH2. Tradicionalmente los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmunológica después de la vacunación o de la infección incluye la medición directa de la producción de citocinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de restimulación con antígeno y/o la medición de la razón igG1:lgG2 de respuestas de anticuerpo específicas al antígeno. Así, el adyuvante de tipo TH1 es uno que, de preferencia estimula las poblaciones de célula T aisladas para producir niveles elevados de citocinas de tipo TH1 cuando se vuelve a estimular con antígeno in vitro, y promueve el desarrollo de respuestas de inmunoglobulina específicas tanto para linfocitos T CD8 + citotóxicos como para inmunoglobulina específica para ei antígeno, asociadas dichas respuestas con el isotipo de tipo TH1.

Los adyuvantes que son capaces de estimulación preferencial de la respuesta de célula TH1 están descritos en la solicitud de patente internacional No. WO 94/00153 y WO 95/17209. El lípido A monofosforílico 3-des-O-acilado (3D-MPL) es uno de esos adyuvantes. Se conoce de GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de lípido A monofosforílico 3-des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas, y es fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida de lípido A monofosforílico 3-des-O-acilado está descrita en la patente europea 0 689454 B1 (SmithKiine Beecham Biologicals SA). De preferencia las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas de manera estéril a través de una membrana de 0.22 miera (patente europea No. 0 689,454). 3D-MPL estará presente en la escala de 10 µg-100 µg, de preferencia de 25 a 50 µg por dosis, donde el antígeno estará presente típicamente en una escala de 2 a 50 µg por dosis. Otro adyuvantes preferido comprende QS21, una fracción no tóxica, purificada por Hplc, derivada de la corteza de Quyillaja saponara Molina. Opcionalmente se puede mezclar éste con el lípido A monofosforílico 3-des-O-acilado, opcionalmente junto con un portador. El método de producción de QS21 está descrito en la patente estadounidense No. 5,057,540. Las formulaciones adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21 han sido descritas previamente (WO 96/33739). Se ha demostrado que dichas formulaciones que comprenden QS21 y colesterol son adyuvantes estimulantes de TH1 exitosos cuando se los formula junto con un antígeno. Más adyuvantes que son estimulantes preferenciales de la respuesta de células TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias CpG sin metilar, como se describe en WO 96/02555. También están contempladas combinaciones de diferentes adyuvantes estimulantes TH1, tales como los mencionados más atrás, ya que proveen un adyuvante que es estimulante preferencia! de la respuesta de células TH1. Por ejemplo, QS21 puede ser formulado junto con 3D-MPL. La razón QS21.-3D-MOL típicamente será del orden de 1:10 a 10:1, de preferencia 1:5 a 5:1 y con frecuencia sustancialmente 1:1. La escala preferida para la sinergia óptima es 2.5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21. De preferencia también está presente un portador en la composición de vacuna de acuerdo con la ¡nvención. El portador puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio. Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa-tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido los antígenos presentes en la composición de vacuna de acuerdo con la invención se combinan con QS21 y 3D-MPL en dicha emulsión.

Adicionalmente la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina. Típicamente, para administración humana, estarán presentes QS21 y 3D-MPL en una vacuna, en la escala de 1 µg-200 µg, tal como 10-100 µg, de preferencia 10 a 50 µg por dosis. Típicamente la emulsión de aceite en agua comprenderá de 2 a 10 por ciento de escualeno, de 2 a 10 por ciento de alfa-tocoferol y de 0.3 a 3 por ciento de Tween 80. Se prefiere que la razón de escualeno:alfa-tocoferol sea igual a o menor que 1; ya que esto provee una emulsión más estable. También puede estar presente Span 85 a un nivel de 1 por ciento. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan adicionalmente un estabilizador. Las emulsiones de aceite en agua, no tóxicas, de preferencia contienen un aceite no tóxico, por ejemplo, escualano o escualeno, un emulsificante, por ejemplo Tween 80, en un portador acuoso. El portador acuoso puede ser, por ejemplo, salina regulada con fosfato. Una formulación adyuvante particularmente potente, que comprende QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua, está descrita en WO 95/17210. La presente invención también provee una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular antígenos útiles para tratar cánceres, enfermedades autoínmunológicas y condiciones relacionadas. Dicha composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante inductor de TH-1, tal como se describió anteriormente aquí. Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos en ia forma de sensibilizadores derivados de los polinucleótidos de la presente invención, y de polipéptidos en la forma de anticuerpos o reactivos específicos para el polipéptido de la presente invención, como reactivos de diagnóstico. La identificación de marcadores genéticos o bioquímicos en la sangre o los tejidos, que permitirá la detección de cambios muy tempranos en la trayectoria de la carcinogénesis, ayudará a determinar el mejor tratamiento para el paciente. Los marcadores de tumor subrogados, tales como la expresión de polinucieótido, pueden ser usados para diagnosticar diferentes formas y estados de cáncer. La identificación de los niveles de expresión de los polinucleótidos de la invención será útil tanto para determinar la etapa del trastorno canceroso como para determinar la naturaleza del tejido canceroso. El proceso de determinación de etapa vigila el avance del cáncer y es determinado por la presencia o ausencia de tejido maligno en las áreas sometidas a biopsia. Los polinucleótidos de la invención pueden ayudar a perfeccionar el proceso de determinación de etapa, identificando marcadores para la agresividad de un cáncer, por ejemplo, la presencia en diferentes áreas del cuerpo. La determinación del grado del cáncer describe qué tanto se parece un tumor al tejido normal de su mismo tipo y esto se determina mediante la morfología de sus células y otros marcadores de diferenciación. Los polinucleótidos de la invención pueden ser útiles para determinar el grado de tumor, ya que pueden ayudar a determinar el estado de diferenciación de las células de un tumor. Los análisis de diagnóstico ofrecen un proceso para diagnosticar o determinar la susceptibilidad a los cánceres, a las enfermedades autoinmunológicas y condiciones relacionadas, por medio del diagnóstico usando métodos que comprenden determinar, a partir de una muestra derivada de un sujeto, un nivel anormalmente disminuido o incrementado de polipéptido o de ARNm. Este método de diagnóstico se conoce como expresión diferencial. La expresión de un gene particular se compara entre un tejido enfermo y un tejido normal. Se compara una diferencia entre el gene relacionado con el polinucleótido, el ARNm o la proteína en ambos tejidos, por ejemplo, en el peso molecular, la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, o en la abundancia relativa, lo que indica un cambio en el gene, o un gene que lo regula, en el tejido del humano en el que se sospechó la existencia de la enfermedad. Se puede medir la expresión disminuida o incrementada en el nivel de ARN. Se aisla primero ARN poliA de los dos tejidos y se puede efectuar la detección del ARNm codificado por un gene que corresponde a un polinucleótido expresado diferencialmente de la ¡nvención, por ejemplo, mediante hibridación in situ en secciones de tejido, RCP de transcriptasa inversa, utilizando las manchas de Northern que contienen poliA+ ARNm, o cualquier otro método de detección de ARN directa o indirecta. Una expresión incrementada o disminuida de un ARN dado en un tejido enfermo, en comparación con un tejido normal, sugiere que el trascrito y/o la proteína expresada juegan un papel en la enfermedad. De esa manera, la detección de un nivel mayor o menor de ARNm que corresponde a SEQ ID NO: 1 o 3, con respecto al nivel normal es indicativo de la presencia de cáncer en el paciente. Los niveles de expresión de ARNm en una muestra pueden ser determinados por la generación de un banco de marcadores de secuencia expresados (EST, acrónimo por su designación en inglés: Expressed Sequence Tag) de la muestra. La representación relativa de los EST en el banco puede ser usada para determinar la representación relativa del trascrito en la muestra de partida. El análisis EST de la prueba puede ser comparado entonces con el análisis EST de una muestra de referencia, para determinar los niveles de expresión relativa del polinucleótido de interés. Se puede llevar a cabo otros análisis de ARNm usando análisis en serie de la metodología de expresión de gene (SAGE, acrónimo por su designación en inglés: Serial Analysis of Gene Expression) (Velculescu y coautores, Al. Science (1995) 270:484), metodología de exhibición diferencial (por ejemplo, US 5,776,683) o análisis de hibridación, que se basa en la especificidad de las interacciones del nucleótido. Alternativamente, se podría hacer la comparación a nivel de la proteína. Se puede comparar los tamaños de proteína en los dos tejidos usando anticuerpos para detectar los péptidos en las manchas de Western de extractos de proteína procedentes de ambos tejidos. También se puede detectar los niveles de expresión y la localización subcelular inmunológicamente, utilizando anticuerpos para la proteína correspondiente. Otras técnicas de análisis que pueden ser usadas para determinar los niveles de una proteína tales como un polipéptido de la presente invención, en una muestra derivada de un anfitrión, son bien conocidas por quienes son expertos en la materia. Un nivel elevado o disminuido de expresión de polipéptido en el tejido enfermo, en comparación con el mismo nivel de expresión de proteína en el tejido normal indica que la proteína expresada puede estar implicada en la enfermedad. En los análisis de la presente invención se puede determinar el diagnóstico por medio de la detección de los niveles de expresión del producto gene codificado por al menos una secuencia señalada en SEQ ID NO: 1 o 3. Una comparación de los niveles de ARNm o de proteína en un tejido enfermo frente a un tejido normal se puede usar también para seguir el avance o la remisión de una enfermedad. Se puede analizar un gran número de secuencias de polinucleótido en una muestra, usando formaciones de polinucleótido. Éstas pueden ser usadas para examinar la expresión diferencial de genes y para determinar la función genética. Por ejemplo, se puede usar formaciones de las secuencias de polinucleótidos SEQ ID No: 1 o 3, para determinar si alguno de los polinucleótidos está expresado de manera diferencial entre una célula normal y una célula cancerosa. En una modalidad de la invención se puede construir una formación de sondas de oligonucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o 3, o fragmentos de ellas, para efectuar la selección eficiente, por ejemplo, de mutaciones genéticas. Los métodos de tecnología de formación son bien conocidos y tienen posibilidad de aplicación general, y pueden ser usados para responder una variedad de cuestiones en genética molecular, que incluyen la expresión del gene, el enlace genético y la capacidad de variación genética (véase, por ejemplo, M. Chee y coautores, Science, tomo 274, páginas 610-613 (1996)). "Diagnóstico", tal como se usa aquí, incluye la determinación de la suscepti ilidad de un sujeto a una enfermedad, la determinación acerca de si un sujeto tiene actualmente la enfermedad, y también la prognosis de un sujeto afectado por la enfermedad. La presente invención se refiere adicionalmente a un equipo de diagnóstico para llevar a cabo un análisis de diagnóstico, que comprende: a) un polinucleótido de la presente invención, de preferencia la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 1 o 3, o un fragmento de ella; b) una secuencia de nucleótido, complementaria de la de a); c) un polipéptido de la presente invención, de preferencia un polipéptido de SEQ ID NO: 2 o 4, o un fragmento de ellos; o d) un anticuerpo para un polipéptido de la presente invención, de preferencia para el polipéptido de SEQ ID NO: 2 o 4. Las secuencias de nucleótido de la presente invención también son valiosas para la localización cromosómica. La secuencia está destinada específicamente para, y se puede hibridar con, una ubicación particular en un cromosoma humano individual. El mapeo de las secuencias relevantes para los cromosomas, de acuerdo con la presente invención es un primer paso importante para correlacionar esas secuencias con la enfermedad asociada con el gene. Una vez que se ha mapeado una secuencia hasta una ubicación cromosómica precisa, se puede correlacionar la posición física de la secuencia en el cromosoma, con los datos del mapa genético. Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (obtenible en línea a través de la Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre los genes y las enfermedades que han sido mapeados a la misma región cromosómica, se identifica entonces por medio del análisis de enlace (coherencia de los genes físicamente adyacentes). Se puede determinar también las diferencias en la secuencia de ADNc o la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados.

Los polipéptidos de la invención o sus fragmentos o análogos, o las células que los expresan, también pueden ser usados como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para los polipéptidos de la presente invención. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad para los polipéptidos de la ¡nvención que su afinidad para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior. En otro aspecto, la invención provee un anticuerpo inmunoespecífico para un polipéptido de acuerdo con la invención, o un fragmento inmunológico del mismo, como se definió aquí con anterioridad. Se prefiere que el anticuerpo sea un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos de la presente ¡nvención pueden ser obtenidos administrando los polipéptidos o fragmentos que contienen el epítope, análogos o células, a un animal, de preferencia un animal no humano, utilizando protocolos rutinarios. Para la preparación de anticuerpos monoclonales se puede usar cualquier técnica que provea anticuerpos producidos por cultivos de línea de células continuas. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler, G y Milstein, C, Nature (1975) 256: 495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de célula B humana (Kozbor y coautores, Immunology Today (1983) 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé y coautores, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). También se puede adaptar las técnicas para la producción de anticuerpos de una sola cadena, tales como las descritas en la patente estadounidense No. 4,946,778 para producir anticuerpos de una sola cadena para los polipéptidos de esta ¡nvención. Además, se puede usar ratones transgénicos u otros organismos, incluyendo otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados. Se puede emplear los anticuerpos descritos arriba para aislar o identificar clones que expresen el polipéptido o purificar los polipéptidos mediante cromatografía por afinidad. El anticuerpo de la invención también puede ser empleado para prevenir o tratar el cáncer, en particular cáncer de ovarios y de colon, enfermedades autoinmunológicas y condiciones relacionadas. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para inducir o modular una respuesta inmunológica en un mamífero que comprende inocular el mamífero con un polipéptido de la presente invención, adecuado para producir respuesta inmunológica al anticuerpo y/o a célula T, para proteger o mejorar los síntomas o el avance de la enfermedad. Otro aspecto adicional de la invención se refiere a un método para inducir o modular la respuesta inmunológica en un mamífero, que comprende suministrar un polipéptido de la presente invención, por medio de un vector que dirige la expresión del polinucleótido y que codifica el polipéptido in vivo, a fin de inducir dicha respuesta inmunológica para producir el anticuerpo, para proteger el animal contra esas enfermedades. Se apreciará, por lo tanto, que la presente invención provee un método para tratar condiciones anormales tales como, por ejemplo, cáncer y enfermedades autoinmunológicas, en particular cáncer de ovarios y de colon, relacionados ya sea con la presencia de actividad de poiipéptido CASB619, un exceso de ella o la expresión deficiente del mismo. La presente invención provee adicionalmente un método para seleccionar compuestos para identificar aquellos que estimulen o que inhiban la función del polipéptido CASB619. En general, se puede emplear agonistas o antagonistas para propósitos terapéuticos y profilácticos, para enfermedades como las que han sido mencionadas aquí con anterioridad. Se puede identificar los compuestos a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bancos químicos y mezclas de productos naturales. Dichos agonistas, antagonistas o inhibidores, así identificados, pueden ser substratos, ligandos, receptores, enzimas, etc., naturales o modificados, según el caso, del polipéptido, o pueden ser miméticos estructurales o funcionales de los mismos (véase Coligan y coautores, Current Protocols in Immunology (1(2): capítulo 5 (1991)). Los métodos de selección serán conocidos por los expertos en la materia. Se puede encontrar más métodos de selección, por ejemplo, en D. Bennett y coautores, J. Mol. Recognition, 8: 52-58 (1995); y en K. Johanson y coautores, J. Biol. Chem. 270(16): 9459-9471 (1995) y las referencias que vienen allí. Así pues, la invención provee un método de selección para identificar compuestos que estimulen o que inhiban la función del polipéptido de la invención, que comprende un método seleccionado del grupo que consiste de: a) medir la unión de un compuesto candidato al polipéptido (o a las células o membranas que llevan el polipéptido) o una proteína de fusión del mismo, por medio de un marcador, directa o indirectamente asociado con el compuesto candidato; b) medir la unión de un compuesto candidato al polipéptido (o a Jas células o las membranas que llevan el polipéptido) o una proteína de fusión del mismo, en presencia de un competidor marcado. c) probar si el compuesto candidato da por resultado una señal generada por activación o inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados para las células o las membranas de célula que contienen el polipéptido; d) mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido de la reivindicación 1, para formar una mezcla; medir la actividad del polipéptido en la mezcla y comparar la actividad de la mezcla a una norma; o e) detectar el efecto de un compuesto candidato sobre la producción de ARNm que codifica el polipéptido y al polipéptido presente en las células, usando, por ejemplo, un análisis ELISA. Se puede usar el polipéptido de la invención para identificar los receptores unidos a la membrana o solubles, si los hay, por medio de técnicas de unión al receptor, comunes y corrientes, conocidas en este campo. También se puede usar métodos de selección bien conocidos para identificar agonistas y antagonistas del polipéptido de la invención, que compitan con la unión del polipéptido de la invención a sus receptores, si los hay. Así pues, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un equipo de selección para identificar agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, substratos, enzimas, etc., para polipéptidos de la presente invención, o compuestos que disminuyan o incrementen la producción de dichos polipéptidos, que comprende: a) un polipéptido de la presente invención; b) una célula recombinante, que expresa un polipéptido de la presente invención; c) una membrana de célula que expresa un polipéptido de la presente ¡nvención; o d) un anticuerpo para un polipéptido de la presente ¡nvención; siendo de preferencia dicho polipéptido el de SEQ ID NO: 2 Será fácilmente apreciado por quienes sean expertos en la materia que también se puede usar un polipéptido de la presente invención en un método para el diseño de base estructural, de un agonista, antagonista o inhibidor del polipéptido, mediante: a) determinar en el primer caso, la estructura tridimensional del polipéptido; b) deducir la estructura tridimensional para el sitio o los sitios reactivos o de unión probables de un agonista, antagonista o inhibidor; c) sintetizar los compuestos candidatos que se predice que van a unirse o a reaccionar con el sitio de unión o reactivo deducido; y d) probar si los compuestos candidatos en realidad son agonistas, antagonistas o inhibidores. También se puede emplear terapia con genes para efectuar la producción endógena del polipéptido CASB619 por las células relevantes en el sujeto. Para un resumen de la terapia con genes véase el capítulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches (y las referencias allí citadas), en Human Molecular Genetics, T. Strachan y A. P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1966). La preparación de vacunas está descrita en general en Pharmaceutical Biotechnology, tomo 61, Vaccine Design -the subunit and adjuvant approach, editado por Powell y Newman, Plenum Press, 1995; New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y otros, University Park Press, Baltimore, Maryland, E. U. A., 1978. La encapsulación dentro de liposomas está descrita, por ejemplo, por Fullerton, patente estadounidense No. 4,235,877. La conjugación de proteínas a macromoléculas está descrita, por ejemplo, por Likhite, patente estadounidense 4,372,945 y por Armor y coinventores, patente estadounidense No. 4,474,757. Se selecciona la cantidad de proteína en cada dosis de vacuna como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos colaterales adversos significativos en los vacunados típicos. Dicha cantidad variará, dependiendo de qué inmunógeno específico se emplee. En general, se espera que cada dosis comprenderá de 1 a 1000 µg de proteína, de preferencia de 2 a 100 µg, muy preferible, de 4 a 40 µg. Se puede determinar una cantidad óptima para una vacuna particular por medio de estudios normales, que comprenden la observación de los títulos de anticuerpo y otras respuestas en los sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir un refuerzo en alrededor de cuatro semanas. "Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" a partir del estado natural. Si una composición o sustancia "aislada" ocurren en la naturaleza, ha sido cambiada o retirada de su ambiente original, o ambas cosas. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presentes naturalmente en un animal vivo, no son un "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separados de los materiales coexistentes de su estado natural, está "aislado", conforme se emplea aquí ese término. "Polinucleótido" se refiere en general a cualquier poli-ribonucleótido o poli-desoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificados, que incluyen la regiones de un solo filamento o de doble filamento. "Variante" se refiere a un polinucleótido o un polipéptid que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, per que retiene sus propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótido de otr polinucieótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótido de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácido de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótido pueden dar por resultado sustituciones, adiciones, omisiones, fusiones y truncamientos de aminoácido en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, tal como se discute más abajo. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácido de otro polipéptido de referencia. En general, las diferentes están limitadas, de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante sean en su generalidad sumamente similares y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácido en una o más sustituciones, adiciones, omisiones, o en cualquier combinación de ellas. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no ser codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser uno que ocurra en la naturaleza, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se sabe que ocurra en la naturaleza. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos que no ocurren en la naturaleza pueden ser preparadas mediante técnicas de mutagénesis o por síntesis directa. "Identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, según se determina por comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptido o de polinucleótido, según el caso, tal como se determina por la igualación o coincidencia entre las cadenas de dichas secuencias. "Identidad" y "similitud" pueden ser calculadas fácilmente por medio de métodos conocidos, que incluyen, pero sin limitación, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Blocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, parte I, Griffin, A. M. y Griffin H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y en Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la máxima igualdad o coincidencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en los programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación a ellos: el paquete de programa GCG (Devereux, J. y coautores, Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)); BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul, S. F. y coautores, J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). El programa BLAST X está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. y coautores, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul S. y coautores, J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990). También se puede usar el algoritmo bien conocido de Smith Waterman, para determinar la identidad. Ei algoritmo preferido es FASTA. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencia de polipéptido o polinucleótido, usando este algoritmo, incluyen los siguientes: Penalización de separación: 12 Penalización de extensión de separación: 4 Tamaño de cifra: 2, máximo, 6. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencia de polipéptido con otros métodos, incluyen los siguientes: 1) Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48, 443-453 (1970). Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Hentikoff y Hentikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992); Penaiización de separación: 12 Penalización de longitud de separación: 4. Un programa útil con estos parámetros está disponible públicamente como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison, Wl, E. U: A. Los parámetros mencionados anteriormente son parámetros por defecto para las comparaciones de polipéptido (junto con ninguna penalización para las separaciones de extremo). Los parámetros preferidos para comparación de polinucleótido incluyen los siguientes 1) Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970). Matriz de comparación: igualaciones = + 10; desigualdades = 0. Penalización de separación: 50 Penalización de longitud de separación: 3 Un programa útil con estos parámetros es el que está disponible públicamente como programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison, Wl, E. U. A. Los parámetros mencionados más arriba son los parámetros por defecto para las comparaciones de polinucleótido. A manera de ejemplo, una secuencia de polinucleótido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 1, es decir, ser 100 por ciento idéntica, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones en el nucieótido, en comparación con la secuencia de referencia. Esas alteraciones son seleccionadas del grupo que consiste de por lo menos una omisión, sustitución de nucleótido, incluyendo transición y transversión, o inserción, y donde las alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótido de referencia, o en cualquier punto entre esas posiciones terminales, dispersadas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia, o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Se determina el número de alteraciones de nucleótido multiplicando el número total de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 por el porcentaje numérico de la respectiva identidad porcentual (dividido entre 100) y restando ese producto del número total de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o: Hn < Xn - (Xn • y). donde nn es el número de alteraciones de nucleótido; xn es el número total de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; e y es, por ejemplo, 0.70 para 70 por ciento, 0.80 para 80 por ciento, 0.85 para 85 por ciento, 0.90 para 90 por ciento, 0.95 para 95 por ciento, etc.; y donde cualquier producto no entero de xn e y se redondea al entero más cercano antes de restarlo de xn. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótido que codifican el polipéptido de SEQ ID NO: 2 pueden crear mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento de marco en esta secuencia codificadora y, de tal manera, alterar el polipéptido codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones. De manera similar, una secuencia de polipéptido de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de SEQ ID NO: 2; es decir, ser 100 por ciento idéntica, o puede incluir hasta un determinado número entero de alteraciones de aminoácido, en comparación con la secuencia de referencia , de modo que el porcentaje de identidad sea inferior a 100 por ciento. Tales a lteraciones son seleccionadas del grupo que consiste de por lo menos una omisión , sustitución , incluyendo sustitución conservadora y no conservadora, o inserción de aminoácido; y donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones del terminal amino o carboxi de la secuencia de polipéptido de referencia o en cualq u ier punto entre esas posiciones terminales, estar dispersas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia, o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácido para una identidad porcentual dada se determina multipl icando el n úmero total de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 por el porcentaje numérico de la respectiva identidad porcentual (dividida entre 100) y luego restando ese producto del número total de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; o na < Xa(Xa • y) , donde na es el número de alteraciones de aminoácido; xa es el número total de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e y es, por ejemplo, 0.70 para el 70 por ciento, 0.80 para el 80 por ciento, 0.85 para el 85 por ciento, etc. ; y donde cualq uier producto no entero de xa e y se redondea al entero más cercano, antes de restarlo de xa. "Homólogo" es un término genérico usado en la técnica para indicar una secuencia de polinucleótido o de polipéptido que posee un grado elevado de relatividad de secuencia con una secuencia del sujeto. Dicha relatividad puede ser cuantificada determinando el grado de identidad y/o de similitud entre las secuencias que están siendo comparadas, tal como se describió aquí con anterioridad. Están dentro de este término genérico los términos "ortólogo", que significa un pollnucleótido o polipéptldo que es funclonalmente equivalente de un polinucleótido o polipéptido en otra especie, y "parólogo", que significa una secuencia funclonalmente similar, cuando se considera dentro de la misma especie.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 ANÁLISIS DE RCP EN TIEMPO REAL (TR) Se usa RCP-TR, en tiempo real (U. Glbson, 1996, Genome Research:6, 996) para comparar la abundancia de trascrito de ARNm del antígeno candidato en tejidos de colon tumoral y de colon normal igualados, procedentes de pacientes múltiples. Además se evalúa los niveles de ARNm del gene candidato en un panel de tejidos normales, mediante esta propuesta. Se extrae el total de ARN de colon normal y de colon tumoral, a partir de biopsias congeladas, usando el reactivo TriPure (Boehringer). Se adquiere el ARN total de tejidos normales, comprándolo de InVitrogen o se extrae de biopsias congeladas usando el reactivo Tp'Pure. Se purifica ARNm poli-A+ procedente de ARN total, después de tratamiento con ADNasa, usando perlas magnéticas de oligo-dT (Dynal). Se efectúa la cuantlficación del ARNm mediante espectrofluorimetría (VersaFluor, BioRad) usando tinte Sybrll (Molecular Probes). Los sensibilizadores para la amplificación por RCP en tiempo real están diseñados con el programa de aplicación Primer Express de Perkin-Elmer, usando las opciones por defecto para las condiciones de amplificación TaqMan. Se ensambla las reacciones en tiempo real, de acuerdo con los protocolos comunes y corrientes de RCP usando 2 ng de ARNm purificado, para cada reacción. Se añade el tinte Sybrl (Molecular Probes) a una dilución final de 1/75,000 para detección en tiempo real. Se lleva a cabo la amplificación (40 ciclos) y la detección en un sistema Biosystems PE 7700 de Perkin-Elmer, usando los reglajes convencionales del instrumento. Se calcula los valores Ct usando el programa de aplicación Sequence Detector PE 7700. Se obtiene dos valores Ct para cada muestra de paciente: el colon tumoral Ct (CtT) y el colon normal igualado Ct (CtN). Los valores Ct obtenidos mediante RCP en tiempo real son relacionados mediante linealidad logarítmica con el número de copla de la plantilla de blanco. Como la eficiencia de la amplificación por RCP bajo las condiciones experimentales prevalentes está cercana a la eficiencia de amplificación teórica, 2(CtN-CtT) es un estimado de los niveles de trascrito relativos en los dos tejidos (o sea, exceso de expresión de ARNm plegado en el tumor). Se lleva a cabo reacciones de RCP en tiempo real en biopsias tomadas de 24 pacientes. Se calcula el nivel de exceso de expresión de ARNm como se describe, para cada paciente; y luego se calcula el nivel promedio de exceso de expresión de ARNm para el antígeno candidato y la proporción de pacientes que expresan excesivamente el antígeno candidato, a partir de la serle de datos. Se normaliza los valores individuales con respecto a la actlna en la misma muestra (razón), como se ve en la figura 1. Un valor de 1 corresponde así al mismo nivel de expresión de actina. Los resultados están mostrados a escala logarítmica. También se probó una serle de 48 muestras de tejido normal, que representan 28 tejidos diferentes, mediante el mismo procedimiento. Se comparó los valores Ct para el antígeno candidato con los de la actina, obtenidos con la misma muestra de tejido. Los resultados, normalizados con respecto a la actlna, están mostrados en la figura 2. Resultados de RCP en tiempo real, en muestras de cáncer de colon/colon normal. RESUMEN Pacientes que expresan Nivel promedio de exceso exceso de CASB619 de expresión. En tumores de colon (%) En tumores de colon (veces)) 16/24 (67%) 208 Conclusión: Se expresa excesivamente CASB619 en 67 por ciento de las muestras de cáncer de colon, con respecto al colon normal adyacente, a un régimen promedio de casi 200 veces.

La expresión en tejidos normales está restringida a otros tejidos del tracto digestivo, así como a la tráquea y los testículos, principalmente.

EJEMPLO 2 MICROAGRUPAMIENTOS DE ADN Se usa los microagrupamlentos de ADN para examinar los perfiles de expresión de ARNm de grandes colecciones de genes en muestras múltiples. Se usa esta información para complementar los datos obtenidos por RCP en tiempo real , y provee una med ida independiente de los niveles de expresión de gene en tu mores y en tejidos normales. Los ejemplos de tecnolog ías actuales para la prod ucción de microformaciones de ADN incluyen : 1 ) Las formaciones "GeneChip" de Affymetrix, en las que se sintetiza los oligonucleótidos sobre la superficie de la cápsula por medio de síntesis química en fase sólida, usando un proceso fotolitográfico; 2) tecnología de puntualización de ADN , en la que pequeños volú menes de una solución de ADN son depositados robóticamente y luego in movilizados sobre la superficie de una fase sólida (por ejemplo, vidrio). En ambos casos, se hibridan las cápsulas con AD Nc o ARNc, que se ha extra ído del tejido que Interesa (por ejemplo, tejido normal, tumor, etc.) y marcado con radiactividad o con una molécula informadora fluorescente. Se híbrida el material marcado a la cápsula y se determina la cantidad de sonda unida a cada secuencia en la cápsula, utilizando un explorador especializado. Se establece el experimento con un solo informador fluorescente (o radiactividad) o, alternativamente, se puede efectuar usando dos Informadores fluorescentes . En este último caso, cada una de las dos muestras se marca con una de las moléculas Informadoras . Las dos muestras marcadas son hibrldadas entonces competitivamente a las secuencias en la cápsula de ADN . Se determina la razón de las dos señales fluorescentes para cada secuencia en la cápsula. Esta razón es usada para calcular la abundancia relativa del trascrito en las dos muestras. Están disponibles protocolos detallados de numerosas fuentes , incluyendo DNA Microarrays: A practical approach. Schena M. Oxford University Press 1999, y en las páginas de la red http ://cmgm .stanford .ed u/pbrown/procotols/index.html; http://arrayit. com/D NA-Microarray-Protocols/, y en los distribuidores especializados.

EJEMPLO 3 PERFILES DE EST U na propuesta complementaria a la caracterización de la expresión de tejido de antígeno experimental es explorar la base de datos "Marcadores de Secuencia Expresados (EST, acrónimo por su designación en inglés: Expressed Sequence Tags) humanos. Los EST son pequeños fragmentos de ADNc hechos a partir de una colección de ARNm extraída de un tejido particular o de una línea de células particular. La base de datos provee normalmente una cantidad masiva de EST (106) procedente de varios cientos de bancos de tejido de AD Nc, que incluyen tejidos tumorales de diversos tipos y estados de enfermedad . Por medio de herramientas de informática (Blast) se lleva a cabo una búsq ueda comparativa de la secuencia CASB616 a fin de tener una visión adicional en la expresión del tejido.

DISTRIBUCIÓN DE EST EN CASB619 Acceso DbEST ID de banco ATG Descripción NCBI: 1202616 937 NCI_CGAP_Co2 (adenoma velloso de colon) NCBI: 1202659 937 NCI_CGAP_Co2 (adenoma velloso de colon) NCBI: 1208269 935 NCI_CGAP_Pr4.1 (intraepitelial prostático) NCBI: 1152744 888 NCI_CGAP:_Pr6 (neoplasia intraepitelial prostética) NCBI: 1157532 910 NCI_CGAP_Pr22 (próstata normal) NCBI: 1178873 882 NCI_CGAP_Co3 (12 colon tumorales reunidos) NCBI: 1040601 628 NHT de testículo NCBI: 1056221 628 NHT de testículo NCBI: 1298131 910 NCI_CGAP_Pr22 (próstata normal) NCBI: 976517 715 epidídimo NCBI: 1618753 417 tumor paratiroideo NCBI: 1737305 895 NCI_CGAP_Br2 (tejidos tumorales de mama reunidos) NCBI: 1738600 895 NCI_CGAP_Br2 (tejidos tumorales de mama reunidos) NCBI: 1767617 628 NHT de testículo NCBI: 1889992 424 corazón fetal NCBI: 1907671 628 NHT de testículo NCBI: 2074937 1076 NCI_CGAPJLu5 estafo visual NCBI: 2147596 1461 NCI_CGAP_Ut1 NCBI: 2147632 1461 NCI_CGAP_Ut1 NCBI: 2308815 1462 NCI_CGAP_Ut2 NCBI: 2441896 1410 NCI_CGAP_Pr28 NCBI: 2447648 1463 NCI_CGAP_Ut3 NCBI: 2381271 1461 NCI_CGAP_Ut1 NCBI: 2583781 1461 NCI_CGAP_Ut1 NCBI: 2583713 1461 NCI_CGAP_Ut1 NCBI: 2585593 1410 NCI_CGAP_Pr28 NCBI: 2587322 1463 NCI_CGAP_Ut3 NCBI: 2601136 1461 NCI_CGAP_Ut1 NCBI: 2824305 1463 NCI_CGAP_Ut3 NCBI: 3007221 1461 NCI_CGAP_Ut1 NCBI: 3078572 2301 NCI:CGAP_Pit1 NCBI: 30860989 1461 NCI_CGAP_Ut1 NCBI: 3087235 1461 NCI_CGAP_Nt1 NCBI: 3045696 1661 NCI_CGAP_Lu19 NCBI: 3218161 2467 NCI_CGAP_Co20 NCBI: 3291383 2508 NCI_CGAP:Sub3 NCBI: 3028913 2107 BT130 NCBI: 3655706 1447 NCI_CGAP_Co14 NCBI: 2553046 1728 Soares_Dieckgraefe_colon-NHCD NCBI: 979345 781 tumor endometrial NCBI: 3289738 2508 NCI_CGAP_Sub3 NCBI: 614598 464 ¿? NCBI: 978076 781 Tumor endometrial NCBI: 979070 781 tumor endometrial NCBI: 1616799 417 tumor paratiroides NCBI: 978445 781 tumor endometrial En resumen, el 93 por ciento de los EST que coinciden con CASB619 se originan de tejidos tumorales, tejidos fetales u órganos reproductores normales. Esto sugiere que este gene es expresado más frecuentemente en esos tejidos.

EJEMPLO 4 ANÁLISIS DE MANCHA NORTHERN-SOUTHERN Se amplifica cantidades limitadas de tumores mixtos y ADNc de colon normal, igualado, mediante RCP Advantage (véase más arriba). También se amplifica el ARN mensajero de tejidos normales múltiples, usando el mismo procedimiento. Se somete a electroforesis 1 µg de ADNc amplificado, en un gel al 1.2 por ciento de agarosa y se transfiere a una membrana de nylon. Se hibrida la membrana (sistema directo AlkPhos) con una sonda preparada usando un fragmento del ADNc de TAA candidato. El análisis Northern-Southern provee información acerca del tamaño de trascrito, la presencia de las variantes de empalme y la abundancia del trascrito en los tejidos tumorales y normales.

EJEMPLO 5 ANÁLISIS DE MANCHA NORTHERN Se produce manchas Northern de acuerdo con protocolos comunes y corrientes, utilizando 1 µg de ARNm poli A + . Se prepara sondas radiactivas usando el sistema Ready-to-Go (Pharmacia).

EJEMPLO 6 IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA DE ADNC DE LONGITUD COMPLETA Se construye bancos de ADNc de tumor del colon, usando el sistema Lambda Zap II (Stratagene) a partir de 5 µg de ARNm poli A+. Se sigue el protocolo suministrado, excepto que se usa Superscriptll (Life Technologies) para el paso de transcripción inversa. Se construye bancos sensibilizados con Oligo dT y sensibilizados aleatoriamente. Se extiende aproximadamente 1.5 x 106 fagos independientes para cada selección del banco. Se transfiere las placas de fago sobre filtros de nylon y se los híbrida usando una sonda de ADNc marcada con AlkPhos Direct. Se detecta los fagos positivos mediante quimioluminiscencia. Se extirpa el fago positivo de la placa de agar, se eluye en 500 µl de regulador SM y se confirma mediante RCP específica para el gene. Se convierte los fagos eluidos al bacteriófago M13 de un solo filamento mediante extirpación in vivo. Se convierte entonces el bacteriófago a ADN plásmido de doble filamento mediante infección de E. coli. Se forma a placas las bacterias infectadas y se somete a una segunda ronda de selección con la sonda de ADNc. Se purifica el ADN plásmido de los clones bacterianos positivos y se determina la secuencia de ambos filamentos. Cuando no se puede obtener el gene de longitud completa, directamente del banco de ADNc, se aisla la secuencia faltante usando tecnología RACE (Marathón Kit, ClonTech). Esta propuesta se basa en la transcripción inversa de ARNm en ADNc de doble filamento, ligando los enlazadores en los extremos del ADNc y amplificando la extremidad deseada del ADNc usando un sensibilizador específico para el gene y uno de los oligonucleótidos de enlazador. Los productos de RCP Marathón son clonados en un plásmido (pCRII-TOPO, InVitrogen). La secuencia obtenida (SEQ ID NO: 1) tiene un marco de lectura abierto putativo de 1013 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). Se sometió la secuencia de proteína deducida a algoritmos de predicción para la localización celular (PSORT: http://psor.nibb.ac.jp/ y ToPred: http://www.biokemi.su. se/~server/toppred2/toppred_source.html). CASB619 parece tener una señal de péptido y uno a tres dominios de transmembrana (predicción de baja seguridad). No se encontró ningún otro motivo ni dominio.

EJEMPLO 7 7.1 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTÍGENOS ESPECÍFICOS PARA EL TUMOR Se usa la expresión en anfitriones microbianos o, alternativamente, en transcripción/traslación in vitro para prod ucir el antígeno de la invención para fines de vacuna , y para producir fragmentos proteínicos o la proteína entera, para purificación rápida y generación de los anticuerpos necesarios para la caracterización de la prote ína expresada naturalmente por inmunohistoquímica o para el seguimiento de la purificación . Se puede expresar las proteínas recombinantes en dos anfitriones microbianos, E. coli y en levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae o en Pichia pastoris). Esto permite la selección del sistema de expresión con los mejores aspectos para la producción de este antígeno particular. En general, se expresará el antígeno recombinante en E. coll y se expresará la proteína reactiva en levadura. La estrategia de expresión comprende primero el diseño de la estructura primaria del antígeno recombinante. En general se coloca un participante de la fusión de expresión (EFP, acrónimo por su designación en inglés: Expression Fusión Partner) en la extremidad N-terminal para mejorar los niveles de expresión que también podrían incluir una región útil para modular las propiedades inmunogénicas del antígeno, un participante de fusión inmunológico (IFP, acrónimo por su designación en inglés: Immune Fusión Partner). Adicionalmente se incluye en el extremo C-terminal un participante de fusión por afinidad (AFP, acrónico por su designación en inglés: Affinity Fusión Partner), útil para facilitar la purificación ulterior. Cuando están disponibles las cepas recombinantes, se caracteriza el producto recombinante por evaluación del nivel de expresión y la predicción de solubilidad adicional de la proteína, mediante análisis del comportamiento en el extracto crudo. Después de desarrollarse en el medio de cultivo apropiado y de inducción de la expresión de proteína recombinante, se somete a análisis el total de extractos mediante SDS-PAGE. Se visualiza las proteínas recombinantes en geles teñidos y se las identifica mediante análisis de mancha Western, utilizando anticuerpos específicos. Una evaluación comparativa de las diferentes versiones del antígeno expresado permitirá la selección del candidato más promisorio que va a ser usado para purificación ulterior y evaluación inmunológica. El esquema de purificación sigue una propuesta clásica, basada en la presencia de un apéndice de afinidad His en la proteína recombinante En un experimento típico, se filtra las células rotas y se carga los extractos acelulares en una cromatografía por afinidad de ion metálico (IMAC; Ni + + NTA de Qiagen) q ue retendrá específicamente la proteína recombinante. Se eluye las proteínas retenidas mediante un gradiente de 0-500 mM de imidazol (posiblemente en presencia de un detergente) en un regulador fosfato. 7.2.- PRODUCCIÓN DE ANTICUERPO E INMUNOHISTOQUÍMICA Se puede usar cantidades pequeñas de proteína relativamente purificada para generar herramientas inmunológicas a fin de: a) detectar la expresión mediante ¡n munohistoqu ímica , en secciones de tejido normal o canceroso; b) detectar la expresión, y para seguir la proteína durante el proceso de purificación (ELISA/mancha Western); o c) caracterizar/cuantificar la proteína purificada (ELISA) . 7.2.1.- ANTICUERPOS POLICLONALES In m u n ización : Se in muniza 2-3 conejos ¡ntramuscularmente (I .M.) tres veces a intervalos de tres semanas, con 100 µg de proteína, formulados en el adyuvante 3D-MPL/QS21 . Tres semanas después de cada inmunización se toma muestras de sangre y se estima el título de anticuerpo en el suero, mediante ELISA, usando la proteína como antígeno de recubrimiento, siguiendo un protocolo común y corriente.

ELISA: Se reviste microplacas de 96 concavidades (Maxisorb Nunc) con 5 µg de proteína durante la noche a 4°C. Después de saturación durante una hora a 37°C con PBS NCS al 1%, se efectúa la dilución seriada de los sueros de conejo durante 1.5 horas a 37°C (comenzando a 1/10). Después de tres lavados en PBS Tween se añade antisuero biotinilado anti-conejo (Amersham, 1/5000). Se lava las placas y se añade estreptavidina acoplada con peroxidasa (1/5000) durante 30 minutos a 37°C. Después de lavar se añade 50 µl de TMB (BioRad) durante 7 minutos y se detiene la reacción con H2S04 0.2M. Se puede medir el OD a 450 nm y se calcula las diluciones de punto medio mediante SoftmaxPro. 7.2.2.- ANTICUERPOS MONOCLONALES Inmunización: Se inmuniza cinco ratones BALB/c tres veces, a intervalos de tres semanas, con 5 µg de proteína purificada. Se lleva a cabo sangrados 14 días después de II y 1 semana después de 3. Se prueba los sueros mediante ELISA sobre proteína purificada, usada como antígeno de revestimiento. Con base en esos resultados (dilución de punto medio > 10,000) se selecciona i un ratón para fusión.

Fusión / selección de HAT Se funde células de bazo con el mieloma SP2/0 de acuerdo con un protocolo común y corriente, usando PEG al 40% y DMSO al 5%. Luego se siembra las células en placas de 96 concavidades, a 2.5 x 104-105 células/concavidad, y se seleccionará ios clones resistentes en medio HAT. Se prueba el sobrenadante de estos hibridomas en cuanto a su contenido de anticuerpos específicos y, cuando es positivo, se le somete a dos ciclos de dilución limitada. Después de dos rondas de selección se escogió tres hibridomas para la producción de ascites. 7.2.3.- INMUNOHISTOQUÍMICA Cuando están disponibles los anticuerpos se lleva a cabo el inmunomanchado sobre secciones de tejido normal o canceroso, a fin de determinar: 0 el nivel de expresión del antígeno de la invención en tejido canceroso, con respecto al tejido normal; o 0 la proporción de cáncer de un determinado tipo, que expresa el antígeno; 0 si otros tipos de cáncer también expresan el antígeno; 0 la proporción de células que expresan el antígeno en un tejido canceroso. Preparación de muestra de tejido: Después de disecar se monta la muestra de tejido en un disco de corcho, en compuesto OCT y se congela rápidamente en isopentano previamente superenfriado en nitrógeno líquido (-160°C). Luego se conserva el bloque a -70°C hasta que se usa. Se efectúan secciones de 7-10 µm en una cámara criostática (-20 a -30°C). Tinción Se seca secciones de tejido durante cinco minutos a la temperatura ambiente (TA), se las fija en acetona durante 10 minutos a TA, se vuelve a secar y se satura con PBS, 0.5% de BSA, 5% de suero. Después de 30 minutos a TA se efectúa la tinción directa o indirecta, usando anticuerpos específicos para el antígeno. La tinción directa conduce a mejor especificidad, pero da una tinción menos intensa, mientras que una tinción indirecta conduce a una tinción más intensa, pero menos específica. 7.3.- ANÁLISIS DE RESPUESTAS INMUNOLÓGICAS CELULARES EN HUMANOS. PARA EL ANTÍGENO DE LA INVENCIÓN Se puede determinar la relevancia inmunológica del antígeno de la invención mediante sensibilización in vitro de células T humanas. Todas las líneas de linfocito de célula T y todas las células dendríticas se derivan de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, acrón imo por su designación en inglés : Peripheral Blood Monon uclear Cells) de donadores sanos (de preferencia del subtipo HLA-A2). También se usa un HLA-A2.1 /Kb en ratones transgénicos para seleccionar péptidos HLA-A2.1. Se cultiva líneas de células T CD8+ específicas para el antígeno , recién descubiertas, y se las mantiene semanalmente en estimulación in vitro. Se prueba la actividad lítica y la producción de - I F N de las l íneas CD8 en respuesta al antígeno o a los péptídos derivados del antígeno, utilizando procedimientos comunes y corrientes . Se usa dos estrategias para elevar las líneas de células T CD8 + : una prop uesta basada en péptido y una propuesta basada en gene. Ambas propuestas req uieren de ADNc de longitud completa , del antígeno recién descubierto, en el marco de lectura correcto que se va a clonar en un sistema de suministro apropiado o bien q ue se va a usar para predecir la secuencia de péptidos que se u nen a H LA.

LA PROPUESTA A BASE DE PÉ PTIDO Se predice las secuencias de péptldo que se unen a H LA-A2 media nte el algoritmo de Parker (Parker, K. C , M. A. Bednarek y J. E. Coligan , 1994, Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains, J. Immunol. , 152: 163, y http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/) o mediante el método Rammensee (Rammensee, Friede, Stevanovic, MHC ligands and peptide motifs:1st listing, Immunogenetics, 41, 178-228, 1995; Rammensee, Bachman, Stevanovic: MHC ligands and peptide motifs, Landes Bioscience 1997, y http://134.2.96.221/scripts/hlaserver.dlll/home.htm). Luego se discrimina los péptidos en el modelo de ratones transgénicos HLA- A2.1/Kb (Vitiello y coautores). a) Epítopes predichos que se unen al alelo HLA_a0201: a.1) Nonámeros de HLA-A*0201 Posi- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Marcación Marcación SEQ ID cíón.- Rammen- Parker" NO: 848 F L W E S A A A c 777.681 68 24 R L W R L L L W A 521.615 5 761 S L A D R L I G V 30 655.875 6 893 S L P E Q R V T I 26 7 886 K L C S G G I s L 25 8 853 A A A C P L C s V 25 9 674 S A L A N T V T L 24 10 99 F V F E T L c s V 24 976.762 11 129 E L P H G F A s L 23 12 973 L I F T S K K s L 22 13 936 K L E Y K Y S K L 22 14 903 K T I D F W L K V 22 15 860 S V A D Y H A I V 22 16 830 L L L P G T C s D 22 17 675 A L A N T V T L A 22 18 503 5 L C S V N c E L 22 19 169 N T D E C T A T L 22 20 81 s L P D P V K G T 22 21 980 S L F G K I K S F 21 22 918 C T A I L L T V L 21 23 867 I V S S C V A G I 21 24 710 K M S V C T D N V 21 25 259 V L V R N I A I T 21 26 234 E L N R G N N V L 21 27 175 A T L M Y A V N L 21 28 70 V A V P H T P G L 21 29 24 R L W R L L L W A 21 30 914 S A G T C T A I L 20 31 891 G I S L P E Q R V 20 32 824 K T V P G S L L L 20 33 765 R L I G V T T D M 20 34 681 T L A G G P S F T 20 35 539 Y I I E E N T T T 20 36 264 I A I T G V A Y T 20 37 38 V T Q G T G P E L 20 38 °Esti mado d el tie mpo medio de disocia ción de una molécu la q ue contie ne esta secuencia . a .2) decámeros de H LA A02_01 Posi1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MarcaMarca SEQ ID ción.- ción ción NO: Ramm Parker" ensee 980 S L F G K I K S F T 151.648 39 866 A I V S S C V A G I 25 40 852 S A A A C P L C S V 24 41 786 H L E S L G I P D V 24 42 571 K I Y S I N V T N V 24 246.353 43 761 S L A D R L I G V T 23 44 626 I L K A H Q P Y G V 23 5 485 V M A D T E N K E V 23 350.117 46 29 K K W Q G T A F Q V 23 5691.997 47 916 G T C T A I L L T V 22 48 778 I T s P A E L F H L 22 49 766 L I G V T T D M T L 22 50 428 T L P T N M E T T V 22 51 350 L M Y K W A K P K I 22 52 972 D L I F T S K K s L 21 53 692 G L K Y F H H F T L 21 54 644 G T K N N K I H s L 21 55 65 S D N D F M I L T L 21 56 60 L V R N I A I T G V 21 57 7 G L C T S L P D P V 21 58 949 T L K D C D L P A A 20 59 95 V I F F Y R S N D V 20 60 733 s I T A Y V C Q A V 20 61 712 S V C T D N V T D L 20 62 702 S L C G N 1 G R K M 20 63 432 N M E T T V L W G I 20 64 263 N I A I T G V A Y T 20 65 121 G I R F D E W D E L 20 66 "Estimado del tiempo medio de disociación de una molécula que contiene esta subsecuencia.

HLA_A0205 Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Marcación SEQ ID de Parker" NO: 499 V T V 216 11 HLA A0203 Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Marcación SEQ ID de Rammen NO: see 846 F H F L W E S A A A 27 67 Brevemente, se inmuniza ratones transgénicos con péptido HLA-A2 con adyuvante; los que no son capaces de inducir una respuesta a CD8 (como se define por una lisis eficiente de células de bazo autólogas, pulsadas con péptido) serán analizados ulteriormente en el sistema humano. Las células dendríticas humanas (cultivadas de acuerdo con Romani y coautores) serán pulsadas con péptidos y usadas para estimular células T clasificadas con CD8 (por Facs). Después de varios estímulos semanales, se probará primeramente las líneas CD8 en BLCL autólogo, pulsado con péptido (líneas de células EBV-B transformadas). Para verificar el procesamiento apropiado in vivo del péptido, se probará las líneas CD8 en células tumorales transfectadas con ADNc (células tumorales LnCaP, Skov3 o CAMA transfectadas con HLA-A2).

PROPUESTA BASADA EN GENE ENTERO Las líneas de célula T CD8+ serán sensibilizadas y estimuladas ya sea con células dendríticas transfectadas con cañón genético, fibroblastos transfectados con B7.1, transducidos retroviralmente, virus de viruela recombinante (Kim y coautores) o bien células dendríticas infectadas con adenovirus (Butterfield y coautores). Las células infectadas con virus son muy eficientes para los péptidos antigénicos de la presente, puesto que el antígeno es expresado a nivel elevado, pero únicamente puede ser usado una vez para evitar el exceso de desarrollo de las líneas de células T virales. Después de estimulaciones alternadas, se prueba las líneas CD8+ en células tumorales transfectadas con ADNc, tal como se indica más arriba. Se determinan la especificidad y la identidad del péptido para confirmar la validación inmunológica. REFERENCIAS Vitiello y coautores (L. Sherman), J. Exp. Med., J. Exp. Med., 1991, 173:1007-1015- Romani y coautores, J. Exp. med., 1994, 180: 83-93. Kim y coautores, J. Immunother., 1997, 20:276-286. Butterfield y coautores, J. Immunol., 1998, 161: 5607-5613.

Todas las publicaciones, incluyendo, pero sin limitación a ellas, las patentes y las solicitudes de patente, citadas en esta descripción, quedan incorporadas en ella mediante la referencia, como si cada publicación individual hubiese sido específica e individualmente indicada para ser incorporada por la referencia en la presente, como si se hubiera expuesto completamente.

LISTADO DE S EC U EN C IAS <110> SmithKline Beecham Biologicals S.A. <120> Compuestos novedosos <130> BC45226 <160> 68 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 3280 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 atggctgagc ctgggcacag ccaccatctc tccgccagag tcaggggaag aactgagagg 60 cgcatacccc ggctgtggcg gctgctgctc tgggctggga ccgccttcca ggtgacccag 120 ggaacgggac cggagcttca tgcctgcaaa gagtctgagt accactatga gtacacggcg 180 tgtgacagca cgggttccag gtggagggtc gccgtgccgc ataccccggg cctgtgcacc 240 agcctgcctg accccgtcaa gggcaccgag tgctccttct cctgcaacgc cggggagttt 300 ctggatatga aggaccagtc atgtaagcca tgcgctgagg gccgctactc cctcggcaca 360 ggcattcggt ttgatgagtg ggatgagctg ccccatggct ttgccagcct ctcagccaac 420 atggagctgg atgacagtgc tgctgagtcc accgggaact gtacttcgtc caagtgggtt 480 ccccggggcg actacatcgc ctccaacacg gacgaatgca cagccacact gatgtacgcc 540 gtcaacctga agcaatctgg caccgttaac ttcgaatact actatccaga ctccagcatc 600 atctttgagt ttttcgttca gaatgaccag tgccagccca atgcagatga ctccaggtgg 660 atgaagacca cagagaaagg atgggaattc cacagtgtgg agctaaatcg aggcaataat 720 gtcctctatt ggagaaccac agccttctca gtatggacca aagtacccaa gcctgtgctg 780 gtgagaaaca ttgccataac aggggtggcc tacacttcag aatgcttccc ctgcaaacct 840 ggcacgtatg cagacaagca gggctcctct ttctgcaaac tttgcccagc caactcttat 900 tcaaataaag gagaaacttc ttgccaccag tgtgaccctg acaaatactc agagaaagga 960 tcttcttcct gtaacgtgcg cccagcttgc acagacaaag attatttcta cacacacacg 1020 gcctgcgatg ccaacggaga gacacaactc atgtacaaat gggccaagcc gaaaatctgt 1080 agcgaggacc ttgagggggc agtgaagctg cctgcctctg gtgtgaagac ccactgccca 1140 ccctgcaacc caggcttctt caaaaccaac aacagcacct gccagccctg cccatatggt 1200 tcctactcca atggctcaga ctgtacccgc tgccctgcag ggactgaacc tgctgtggga 1260 tttgaataca aatggtggaa cacgctgccc acaaacatgg aaacgaccgt tctcagtggg 1320 atcaacttcg agtacaaggg catgacaggc tgggaggtgg ctggtgatca catttacaca 1380 gctgctggag cctcagacaa tgacttcatg attctcactc tggttgtgcc aggatttaga 1440 cctccgcagt cggtgatggc agacacagag aataaagagg tggccagaat cacatttgtc 1500 tttgagaccc tctgttctgt gaactgtgag ctctacttca tggtgggtgt gaattctagg 1560 accaacactc ctgtggagac gtggaaaggt tccaaaggca aacagtccta tacctacatc 1620 attgaggaga acactaccac gagcttcacc tgggccttcc agaggaccac ttttcatgag 1680 gcaagcagga agtacaccaa tgacgttgcc aagatctact ccatcaatgt caccaatgtt 1740 atgaatggcg tggcctccta ctgccgtccc tgtgccctag aagcctctga tgtgggctcc 1800 tcctgcacct cttgtcctgc tggttactat attgaccgag attcaggaac ctgccactcc 1860 tgccccccta acacaattct gaaagcccac cagccttatg gtgtccaggc ctgtgtgccc 1920 tgtggtccag ggaccaagaa caacaagatc cactctctgt gctacaatga ttgcaccttc 1980 tcacgcaaca ctccaaccag gactttcaac tacaacttct ccgctttggc aaacaccgtc 2040 actcttgctg gagggccaag cttcacttcc aaagggttga aatacttcca tcactttacc 2100 ctcagtctct gtggaaacca gggtaggaaa atgtctgtgt gcaccgacaa tgtcactgac 2160 ctccggattc ctgagggtga gtcagggttc tccaaatcta tcacagccta cgtctgccag 2220 gcagtcatca tccccccaga ggtgacaggc tacaaggccg gggtttcctc acagcctgtc 2280 agccttgctg atcgacttat tggggtgaca acagatatga ctctggatgg aatcacctcc 2340 ccagctgaac ttttccacct 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Ala Val Asn Leu Lys Gln Ser Gly Thr Val Asn Phe Glu 180 185 190 Tyr Tyr Tyr Pro Asp Ser Ser lie lie Phe Glu Phe Phe Val Gln Asn 195 200 205 Asp Gln Cys Gln Pro Asn Ala Asp Asp Ser Arg Trp Met Lys Thr Thr 210 215 220 Glu Lys Gly Trp Glu Phe His Ser Val Glu Leu Asn Arg Gly Asn Asn 225 230 235 240 Val Leu Tyr Trp Arg Thr Thr Ala Phe Ser Val Trp Thr Lys Val Pro 245 250 255 Lys Pro Val Leu Val Arg Asn lie Ala lie Thr Gly Val Ala Tyr Thr 260 265 270 Ser Glu Cys Phe Pro Cys Lys Pro Gly Thr Tyr Ala Asp Lys Gln Gly 275 280 285 Ser Ser Phe Cys Lys Leu Cys Pro Ala Asn Ser Tyr Ser Asn Lys Gly 290 295 300 Glu Thr Ser Cys His Gln Cys Asp Pro Asp Lys Tyr Ser Glu Lys Gly 305 310 315 320 Ser Ser Ser Cys Asn Val Arg Pro Ala Cys Thr Asp Lys Asp Tyr Phe 325 330 335 Tyr Thr His Thr Ala Cys Asp Ala Asn Gly Glu Thr Gln Leu Met Tyr 340 345 350 Lys Trp Ala Lys Pro Lys lie Cys Ser Glu Asp Leu Glu Gly Ala Val 355 360 365 Lys Leu Pro Ala Ser Gly Val Lys Thr His Cys Pro Pro Cys Asn Pro 370 375 380 Gly Phe Phe Lys Thr Asn Asn Ser Thr Cys Gln Pro Cys Pro Tyr Gly 385 390 395 400 Ser Tyr Ser Asn Gly Ser Asp Cys Thr Arg Cys Pro Ala Gly Thr Glu 405 410 415 Pro Ala Val Gly Phe Glu Tyr Lys Trp Trp Asn Thr Leu Pro Thr Asn 420 425 430 Met Glu Thr Thr Val Leu Ser Gly He Asn Phe Glu Tyr Lys Gly Met 435 440 445 Thr Gly Trp Glu Val Ala Gly Asp His He Tyr Thr Ala Ala Gly Ala 450 455 460 Ser Asp Asn Asp Phe Met He Leu Thr Leu Val Val Pro Gly Phe Arg 465 470 475 480 Pro Pro Gln Ser Val Met Ala Asp Thr Glu Asn Lys Glu Val Ala Arg 485 490 495 He Thr Phe Val Phe Glu Thr Leu Cys Ser Val Asn Cys Glu Leu Tyr 500 505 510 Phe Met Val Gly Val Asn Ser Arg Thr Asn Thr Pro Val Glu Thr Trp 515 520 525 Lys Gly Ser Lys Gly Lys Gln Ser Tyr Thr Tyr He He Glu Glu Asn 530 535 540 Thr Thr Thr Ser Phe Thr Trp Ala Phe Gln Arg Thr Thr Phe His Glu 545 550 555 560 Ala Ser Arg Lys Tyr Thr Asn Asp Val Ala Lys He Tyr Ser He Asn 565 570 575 Val Thr Asn Val Met Asn Gly Val Ala Ser Tyr Cys Arg Pro Cys Ala 580 585 590 Leu Glu Ala Ser Asp Val Gly Ser Ser Cys Thr Ser Cys Pro Ala Gly 595 600 605 Tyr Tyr He Asp Arg Asp Ser Gly Thr Cys His Ser Cys Pro Pro Asn 610 615 620 Thr He Leu Lys Ala His Gln Pro Tyr Gly Val Gln Ala Cys Val Pro 625 630 635 640 Cys Gly Pro Gly Thr Lys Asn Asn Lys He His Ser Leu Cys Tyr Asn 645 650 655 Asp Cys Thr Phe Ser Arg Asn Thr Pro Thr Arg Thr Phe Asn Tyr Asn 660 665 670 Phe Ser Ala Leu Ala Asn Thr Val Thr Leu Ala Gly Gly Pro Ser Phe 675 680 685 Thr Ser Lys Gly Leu Lys Tyr Phe His His Phe Thr Leu Ser Leu Cys 690 695 700 Gly Aen Gln Gly Arg Lys Met Ser Val Cys Thr Asp Asn Val Thr Asp 705 710 715 720 Leu Arg He Pro Glu Gly Glu Ser Gly Phe Ser Lys Ser He Thr Ala 725 730 735 Tyr Val Cys Gln Ala Val He He Pro Pro Glu Val Thr Gly Tyr Lys 740 745 750 Ala Gly Val Ser Ser Gln Pro Val Ser Leu Ala Asp Arg Leu He Gly 755 760 765 Val Thr Thr Asp Met Thr Leu Asp Gly He Thr Ser Pro Ala Glu Leu 770 775 780 Phe His Leu Glu Ser Leu Gly He Pro Asp Val He Phe Phe Tyr Arg 785 790 795 800 Ser Asn Asp Val Thr Gln Ser Cys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Thr He 805 810 815 Arg Val Arg Cys Ser Pro Gln Lys Thr Val Pro Gly Ser Leu Leu Leu 820 825 830 Pro Gly Thr Cys Ser Asp Gly Thr Cys Asp Gly Cys Asn Phe His Phe 835 840 845 Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val Ala Asp Tyr 850 855 860 His Ala He Val Ser Ser Cys Val Ala Gly He Gln Lys Thr Thr Tyr 865 870 875 880 Val Trp Arg Glu Pro Lys Leu Cys Ser Gly Gly He Ser Leu Pro Glu 885 890 895 Gln Arg Val Thr He Cys Lys Thr He Asp Phe Trp Leu Lys Val Gly 900 905 910 He Ser Ala Gly Thr Cys Thr Ala He Leu Leu Thr Val Leu Thr Cys 915 920 925 Tyr Phe Trp Lys Lys Asn Gln Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys Leu 930 935 940 Val Met Asn Ala Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala Asp Ser 945 950 955 960 Cys Ala He Met Glu Gly Glu Asp Val Glu Asp Asp Leu He Phe Thr 965 970 975 Ser Lys Lys Ser Leu Phe Gly Lys He Lys Ser Phe Thr Ser Lys Arg 980 985 990 Thr Pro Asp Gly Phe Asp Ser Val Pro Leu Lys Thr Ser Ser Gly Gly 995 1000 1005 Pro Asp Met Asp Leu 1010 <210> 3 <211> 677 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 3 ttttttaatt tacaaacaaa gtgtgggtat atttggcagg tttgaggcaa gcagaaagga 60 gggtttgggt actctataaa aaaagatctg aaattcaaac atctgataag gccacaatga 120 agagatttcc agcagtgggt gttgcaggat gctggcaccc aaatcgccgc acgttgcaaa 180 ggtgctatgc aaggtgagga ggcaggtgag gcaggcagtg cctctcacag gtccatgtct 240 gggcctcctg aggatgtctt cagcggcact gagtcaaatc catcaggagt cctcttggag 300 gtaaatgatt tgatcttccc aaagagtgac ttcttgctgg taaagatgag gtcgtcctct 360 acatcctcgc cttccatgat ggcgcagtgt cagctgctgg caggtcacag tccttgagag 420 tagcattcat caccagcttg gagtacttgt actctagttt ttgattcttt ttccaaaagt 480 agcaggtcaa gacggtgagc aggatggcag tacaggtgcc tgcagagatg cccactttca 540 gccagaaatc tatggttttg cagatggtga ctctctgctc aggcagagaa atgccaccag 600 agcatagctt gggttctcgc cacacgtaag tagtcttctg gatcccagcc acacagctgc 660 tgacgatagc atggtag 677 <210> 4 <211> 105 <212> PRT <213= - homo sapiens <4Q0> 4 Tyr His Ala He Val Ser Ser Cys Val Ala Gly He Gln Lys Thr Thr 1 5 10 15 Tyr Val Trp Arg Glu Pro Lys Leu Cys Ser Gly Gly He Ser Leu Pro 20 25 30 Glu Gln Arg Val Thr He Cys Lys Thr He Asp Phe Trp Leu Lys Val 35 40 45 Gly He Ser Ala Gly Thr Cys Thr Ala He Leu Leu Thr Val Leu Thr 50 55 60 Cys Tyr Phe Trp Lys Lys Asn Gln Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys 65 70 75 80 Leu Val Met Asn Ala Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala Asp 85 90 95 Thr Ala Pro Ser Trp Lys Ala Arg Met 100 105 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 5 Arg Leu Trp Arg Leu Leu Leu Trp Ala 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 6 Ser Leu Ala Asp Arg Leu He Gly Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 7 Ser Leu Pro Glu Gln Arg Val Thr He 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 8 Lys Leu Cys Ser Gly Gly He Ser Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 9 Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400 10 Ser Ala Leu Ala Asn Thr Val Thr Leu 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 11 Phe Val Phe Glu Thr Leu Cys Ser Val 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 12 Glu Leu Pro His Gly Phe Ala Ser Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 13 Leu He Phe Thr Ser Lys Lys Ser Leu 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 14 Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Ser Lys Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 15 Lys Thr He Asp Phe Trp Leu Lys Val <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 16 Ser Val Ala Asp Tyr His Ala He Val 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 17 Leu Leu Leu Pro Gly Thr Cys Ser Asp 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 18 Ala Leu Ala Asn Thr Val Thr Leu Ala 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 19 Thr Leu Cys Ser Val Asn Cys Glu Leu 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400 20 Asn Thr Asp Glu Cys Thr Ala Thr Leu 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 21 Ser Leu Pro Asp Pro Val Lys Gly Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 22 Ser Leu Phe Gly Lys He Lys Ser Phe 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 23 Cys Thr Ala He Leu Leu Thr Val Leu 1 5 <210> 24 <211> 9 < 12> PRT <213> Secuencia artificial <400> 24 He Val Ser Ser Cys Val Ala Gly He 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 25 Lys Met Ser Val Cys Thr Asp Asn Val 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 26 Val Leu Val Arg Asn He Ala He Thr i 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 27 Glu Leu Asn Arg Gly Asn Asn Val Leu 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 28 Ala Thr Leu Met Tyr Ala Val Asn Leu 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 29 Val Ala Val Pro His Thr Pro Gly Leu 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 30 Arg Leu Trp Arg Leu Leu Leu Trp Ala 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 31 Ser Ala Gly Thr Cys Thr Ala He Leu 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 32 Gly He Ser Leu Pro Glu Gln Arg Val 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 33 Lys Thr Val Pro Gly Ser Leu Leu Leu 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 34 Arg Leu He Gly Val Thr Thr Asp Met 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 35 Thr Leu Ala Gly Gly Pro Ser Phe Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 36 Tyr He He Glu Glu Asn Thr Thr Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 < 12> PRT <213> Secuencia artificial <400> 37 He Ala He Thr Gly Val Ala Tyr Thr 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 38 Val Thr Gln Gly Thr Gly Pro Glu Leu 1 5 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 39 Ser Leu Phe Gly Lys He Lys Ser Phe Thr 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 40 Ala He Val Ser Ser Cys Val Ala Gly He 1 5 10 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 41 Ser Ala Ala Ala Cys Pro Leu Cys Ser Val 1 5 10 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 42 His Leu Glu Ser Leu Gly He Pro Asp Val 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 43 Lys He Tyr Ser He Asn Val Thr Asn Val 1 5 10 <210> 44 <211> 10 < 12> PRT <213> Secuencia artificial <400> 44 Ser Leu Ala Asp Arg Leu He Gly Val Thr 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 45 He Leu Lys Ala His Gln Pro Tyr Gly Val 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 46 Val Met Ala Asp Thr Glu Asn Lys Glu Val 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 47 Leu Leu Trp Ala Gly Thr Ala Phe Gln Val 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 48 Gly Thr Cys Thr Ala He Leu Leu Thr Val 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 49 He Thr Ser Pro Ala Glu Leu Phe His Leu 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 50 Leu He Gly Val Thr Thr Asp Met Thr Leu 1 5 10 <210> 51 <211> 10 < 12> PRT <213> Secuencia artificial <400> 51 Thr Leu Pro Thr Asn Met Glu Thr Thr Val 1 5 10 <210> 52 :211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 52 Leu Met Tyr Lys Trp Ala Lys Pro Lys He 1 5 10 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 53 Asp Leu He Phe Thr Ser Lys Lys Ser Leu 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 54 Gly Leu Lys Tyr Phe His His Phe Thr Leu 1 5 10 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 55 Gly Thr Lys Asn Asn Lys He His Ser Leu 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 56 Ser Asp Aßn Asp Phe Met lie Leu Thr Leu 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 57 Leu Val Arg Asn He Ala He Thr Gly Val 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 58 Gly Leu Cys Thr Ser Leu Pro Asp Pro Val 1 5 10 <210> 59 <211> 10 < 12> PRT <213> Secuencia artificial <400> 59 Thr Leu Lys Asp Cys Asp Leu Pro Ala Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 60 Val He Phe Phe Tyr Arg Ser Asn Asp Val 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 61 Ser He Thr Ala Tyr Val Cys Gln Ala Val 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 62 Ser Val Cys Thr Asp Asn Val Thr Asp Leu 1 5 10 <210> 63 <211> 10 < 12> PRT <213> Secuencia artificial <400> 63 Ser Leu Cys Gly Asn Gln Gly Arg Lys Met 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 64 sn Met Glu Thr Thr Val Leu Ser Gly He 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 65 Asn He Ala He Thr Gly Val Ala Tyr Thr 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 66 Gly He Arg Phe Asp Glu Trp Asp Glu Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 67 Phe His Phe Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <400> 68 Phe Leu Trp Glu Ser Ala Ala Ala Cys 1 5 INFORMACIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO.l atggctgagcctgggcacagccaccatctctcegccagagtcaggggaagaactgagaggcgcatacsccggctgtggcg gctgctgctctgggctgggaccgccttccaggtgacccagggaacgggaccggagcttcatgcctgcaaagagtctgagt accactatgagtacacggcgtgtgacagcacgggttccaggtggagggtcgccgtgccgcataccccgggcctgtgcacc agcctgcctgaooccgtcaagggcacsgagtgctcottctcctgcaacgccggggagtctctggatatgaaggaccagtc atgtaagccatgcgctgagggccgctactccctcggcacaggcattcggtttgatgagtgggatgag?cgccccatggct ttgccagcctctcagccaacatggagctggatgacagtgctgctgagtecaccgggaactgtacttcgtccaagtgggtt ccccggggcgactacatcgcctccaacacggacgaatgcacagccacactgatgtacgccgtcaacctgaagcaatctgg caccgttaacttcgaatactactatccagactccagcatcatctttgagtttttcgttcagaatgaccagtgccagccca atgcagatgactccaggtggatgaagaccacagagaaaggatgggaattccacagtgtggagctaaatcgaggcaataat gtcctctattggagaaccacagccttctcagtatggaccaaageacccaagcccgtgctggtgagaaacattgccataac aggggtggcctacacttcagaatgcfctcccctgcaaacctggcacgtatgcagacaagcagggctcctctttctgcaaac tttgcccagccaactcttattcaaataaaggagaaacttcttgccaccagtgtgaccctgacaaatactcagagaaagga tcttcttcctgtaacgtgcgcccagcttgcacagacaaagattatttctacacacacacggcccgcgatgccaacggaga gacacaactcatgtacaaatgggccaagccgaaaatctgtagcgaggaccttgagggggcagtgaagctgcctgcctctg gtgtgaagacccactgcccaccctgcaaccoaggcttcttcaaaaccaacaacagcacctgccagccctgcccatatggt tcctactccaatggctcagactgtacccgctgccctgcagggactgaacctgctgtgggatttgaatacaaatggtggaa cacgctgcccacaaacatggaaacgaccgttctcagtgggatcaacttcgagtacaagggcatgacaggetgggaggtgg ctggtgatcacatttacacagctgctggagcctcagacaatgacttcatgattetcactctggttgtgccaggatttaga cctecgcagtcggtgatggcagacacagagaataaagaggtggccagaatcacdtttgtctttgagaccctctgttctgt gaactgtgagctctacttcatggtgggtgtgaattctaggaccaacactcctgtggagacgtggaaaggttccaaaggca aacagtcctatacctacatcattgaggagaacactaccacgagcttcaccegggecttccagaggaccaettttcatgag gcaagcaggaagtacaccaacgacgttgccaagatctactccatcaatgtcaccaatgttatgaatggcgtggcctccta ctgccgtccctgtgccctagaagcctctgatgtgggctcctcctgcacctcttgtcctgctggtcactacattgaccgag attcaggaacctgccactcctgcccccctaacacaattctgaaagcccaccagccttatggtgtccaggcctgtgtgccc tgtggtccagggaccaagaacaacaagatccactctctgtgctacaatgattgcaccttctcacgcaaoactccaaccag' gactttcaactacaacttctccgetttggcaaacaccgtsactc.ttgctggagggccaagctt.cacttccaaagggttga aatacttccatcactttaccctcagtctctgtggaaaccagggtaggaaaatgtctggtgcaccgacaatgtoactgac ctccggattcrtgagggtgagtcagggttctccaaatctatcacagcctacgctgccaggcagtcatcatqcccccaga ggtgacaggctacaaggccggggtttcctcacagcctgtcagccttgctgatcgacttattggggtgacaacagatat;ga ctctggatggaatcacctccccagctgaacttttccacctggagtccttgggaaeaccggacgtgatcttcttttatagg tCCSita&tataacccaatcatac?attetaaaaa?t aar.r?r?attrpratrmnprprapitraran ??ari-rrt-fr>r< tccaatgatgtgacccagtcctgcagttctgggagatcaaccaccatccgegtcaggtgcagfcccacagaaaactgtccc tggaagtttgctgctgccaggaacgtgctcagatgggacctgtgatggctgcaacttccacttcctgtgggagagcgcgg ctgcttgcccgctctgetcagtggctgactaccatgctatcgtcagcagctgtgtggctgggatccagaagaceacttac gtgtggcgagaaccsaagctatgctctggtggcatttictctgcctgagcagagagtcaccatctgcaaaaccaCagattt ctggctgaaagegggcatctctgcaggcacctgtactgccatcctgctcaccgtcctgaectgctactttfcggaaaaaga atcaaaaactagagtacaagtactccaagctggtgatgaatgctactstcaaggactgtgacetgccagcagctgacagc tgcgccatcatggaaggcgaggatgtagaggaegacetcatctttaccagcaagaagtcactctttgggaagaecaaatc atttacctccaagaggactcctgatggatttgactcagtgccgctgaagacatcctcaggaggcccagacatggacctgt g OU^CAC?KrCTGCCTC^CTGCCTCCTC^ CTGCAAC&CCCACTGCTGGAAATCTCTGCATT^ CAAACCCTCCTTTCTSCTTGCCTC-VUU CTGC?U?^ SEQ ID NO:2 MAEPGHSHHI^ARVI^RTERRIPRLWKLLLWAGTAFQVTC ?PEI^IACKESE SLPDPVKGTECSFSOíAGEFLDMKDQSCXPCAEGRYSLsTGIRFDEWDEIiPHGFAS SAinffi? PRGDYIASOTTlECrATIJÍYA ^KQSGTVNFEYYra VLyWRTTAFSV TKVPKPVLVRNIAITGVAYTSECFPCKPaTYADKQGSSFC^a.CPAireY sssan^PAc roroyFY ?p'A 3ANGETQi p wAKP??csEDi^GAv??^ SYSNGSDCTRCTAGTEPAVGFE?CWWNTLPTNMETtVLSGXNFEYKGS^ PPQSVMADTENKEVARlTFWETLCSVNCELyF rraVNSR NTPVETWKOSKGTO ASRKTTNDVAKI YS INVTNVMNC3VAS YCR^ 8PGTKmp IHSLC?OTC FSROTPTRT N? FSAIAimra^^ LRXPEGESsFSKSITAYVCQAVIIPPEVTGYKAOTSSQPVSIADRLtGVT ^ SNDVTQSCSSSRSTTIRWCSPQKTVPGSU?PGTCSIX?TClX?CNFHFLWESAftACPI?^ VWREPKLCSC?SISLPÉQRVTIOO'IPF I.IWGISAGTCTAIU.TVLTCYF K NQi^^ CAIMEGEDVEDDLIFTS SLFsKIKSFTS RTPIX?FDSWl^KtSSsGPDMDI.

SEQ ID NO:3 TT?RTTAATTTACAAACAAAGTGTGGGTATATTTGGCAGGTTTGAGGCAAGCAGA GGAGGGTTTGGGTAC TC?A?AAAAAAAGATCTGAAA??CAAACATCTGATAAGGCCACAATGAAGAGATTTCCAGCAGTGGGTGT?G CAGGATGCTGGCACCCAAATCGCCGCACGTTGCAAAGGTGCTATGCAAGGTGAGGAGGCAGGTGAGGCAGGC AGTGCCTCTCACAGGTCCATGTCTGGGCCTCCTGAGGATGTCTTCAGCGGCACTGAGTCAAATCCATCAGGA GTCCTCTTGGAGGTAAATGATTTGATCTTCCCAAAGAGTGAC?TCTTGCTGGTAAAGATGAGGTCG?CCTCT ACATCCTCGCC??CCATGATGGCGCAGTGTCAGCTGCTGGCAGGTCACAGTCCTTGAGAGTAGCATTCATCA CCAGCTTGGAGTACTTGTACTCTAGTTTTTGATTCTTTTTCCAAAAGTAGCAGGTCAAGACGGTGAGCAGGA TGGCAGTACAGGTGCCTGCAGAGATGCCCACTTTCAGCCAGAAATCTATGGTGTTGCAGATGGTGACTCTCT GCTCAGGCAGAGAAATGCCACCAGAGCATAGCTTGGGTTCTCGCCACACGTAAGTAGTCTTCTGGATCCCAG CCACACAGCTGCTGACGATAGCATGGTAG SEQIDNO:4 YHAlVSSCVAGIQ TTYVWREPKLCSGGISLPEQRVtiCKTIDFWLKVGISAGTCTAlLLTVLTCYF WKKNQKLEYKYSKLVM ATLKDCD PAADTAPS KARM

Claims (1)

1. REIVINDICACION ES 1 .- U n pol ipéptido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, en toda la longitud de SEQ ID NO: 2. 2.- Un polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la secuencia de aminoácido tiene por lo menos 95 por ciento de identidad con respecto a SEQ I D NO: 2. 3.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porq ue comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2. 4.- El polipéptido aislado de SEQ ID NO: 2.} 5.- Un polipéptido caracterizado porque comprende un fragmento inmunogénico de un polipéptido como se reivindicó en cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 4 (de ser necesario cuando está acoplado a un portador), q ue es capaz de elevar una respuesta inmunológica que reconoce al polipéptido de SEQ ID NO: 2. 6.- Un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque el polipéptido es parte de una proteína de fusión mayor. 1.- Un polipéptido de conformidad con cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 6 , caracterizado además porq ue está conjugado qu ímicamente a una proteína portadora. 8.- Un polinucleótido aislado, caracterizado porque codifica un polipéptido como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 9.- Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad con respecto a la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2, en toda la longitud de SEQ ID NO: 2; o una secuencia de nucleótido complementaria de dicho polinucleótido aislado. 10.- Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad con respecto a una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2, en toda la región codificadora; o una secuencia de nucleótido complementaria del polinucleótido aislado. 11.- Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad con respecto a SEQ ID NO: 1 en toda la longitud de SEQ ID NO: 1; o una secuencia de nucleótido complementaria de dicho polinucleótido aislado. 12.- El polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado además porque la identidad es por lo menos de 95 por ciento. 13.- Un polinucleótido aislado, caracterizado porque está seleccionado de: a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2; b) el polinucleótido de SEQ ID NO: 1; y c) el polinucleótido obtenible seleccionando un banco apropiado bajo condiciones de hibridación estrictas, con una sonda marcada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de ella; codificando dicho polinucleótido una proteína (de ser necesario cuando está acoplado a un portador) que es capaz de elevar una respuesta inmunológica que reconoce la proteína de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de nucleótido complementaria de dicho polinucleótido aislado. 14.- Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13. 15.- Un microorganismo vivo recombinante, caracterizado porque comprende el vector de expresión de la reivindicación 14. 16.- Una célula anfitriona, caracterizada porque comprende el vector de expresión de la reivindicación 15 o el polinucleótido aislado de las reivindicaciones 8 a 13. 17.- Un proceso para producir un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende: cultivar una célula anfitriona de acuerdo con la reivindicación 16, bajo condiciones suficientes para la producción del polipéptido, y recuperar el polipéptido del medio de cultivo. 18.- Una vacuna, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable. 19.- Una vacuna, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva del polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 y un portador farmacéuticamente aceptable. 20.- Una vacuna, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de un antígeno que presenta células modificadas cargándolas in vitro con un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o modificadas genéticamente in vitro para que expresen un polipéptido de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador farmacéuticamente efectivo. 21.- Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado además porque comprende adicionalmente un adyuvante inductor de TH-1. 22.- Una vacuna de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada además porque el adyuvante inductor de TH-1 está seleccionado del grupo de adyuvantes que comprende: 3D-MPL, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol y un oligonucleótido CpG. 23.- Un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido o el fragmento ¡nmunológico que fueron reivindicados en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. 24.- Un método de selección para identificar compuestos que estimulen o que inhiban la función del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende un método seleccionado del grupo que consiste de: a) medir la unión de un compuesto candidato al polipéptido (o a las células o las membranas que contienen el pol ipéptido) o una proteína de fusión del mismo, por medio de un marcador directa o indirectamente asociado con el compuesto candidato; b) medir la unión de un compuesto candidato al polipéptido (o a las células o a las membranas que contienen el polipéptido) o una proteína de fusión del mismo, en presencia de un competidor marcado; c) probar si el compuesto candidato da por resultado una señal generada por la activación o la inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados para las células o las membranas de célula que contienen el polipéptido; d) mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido de cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 7, para formar una mezcla; medir la actividad del polipéptido en la mezcla, y comparar la actividad de la mezcla con una norma; o e) detectar el efecto de un compuesto candidato sobre la producción de ARNm que codifica dicho polipéptido, y dicho polipéptido en las células, usando, por ejemplo, un aná lisis ELISA. 25.- Un método para el tratamiento de un sujeto mediante inmunoprofilaxis o terapia, caracterizado porque comprende la inducción in vitro de respuestas inmunológicas a una molécula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, utilizando la incubación in vitro del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, con células procedentes del sistema inmunológico de un mamífero, y reinfundir esas células ¡nmunológicas activadas al mamífero, para el tratamiento de la enfermedad. 26.- Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el tratamiento es para cáncer de los ovarios o cáncer de colon. 27.- Un agonista o antagonista para el polipéptido de las reivindicaciones 1 a 5. 28.- Un compuesto, caracterizado porque es: a) un agonista o antagonista para el polipéptido de las reivindicaciones 1 a 5; b) un polinucleótido aislado de las reivindicaciones 8 a 13; o c) una molécula de ácido nucleico que modula la expresión de la secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; para uso en terapia. 29.- Un proceso para diagnosticar una enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad en un sujeto, en relación con la expresión o la actividad de un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 en un sujeto, caracterizado porque comprende analizar la presencia o la cantidad del polinucleótido en una muestra derivada de dicho sujeto. 30.- Un proceso para diagnosticar una enfermedad o la susceptibilidad a la enfermedad en un sujeto, relacionada con la expresión o la actividad de un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 en un sujeto, caracterizado porque comprende analizar la presencia o la cantidad del pollnucleótido en una muestra derivada de dicho sujeto. 31.- Un proceso para diagnosticar la presencia de cáncer de colon o la susceptibilidad al cáncer de colon en un sujeto relacionada con la expresión o la actividad de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un sujeto, caracterizado porque comprende analizar la presencia o la cantidad del polipéptido en una muestra derivada de dicho sujeto. 32.- Un proceso para diagnosticar la presencia de cáncer de colon o la susceptibilidad al cáncer de colon en un sujeto relacionada con la expresión o la actividad de un polin ucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 en un sujeto, caracterizado porque comprende analizar la presencia o la cantidad del polinucleótido en una muestra derivada de dicho sujeto. 33.- Un polinucleótido aislado, caracterizado porque está seleccionado del grupo que consiste de: a) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótido que tiene por lo menos 70 por ciento de identidad con SEQ ID NO: 3 en toda la longitud de SEQ ID NO: 3; b) un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEQ ID NO: 3; c) el polinucleótido de SEQ ID NO: 3. 34.- Una composición de vacuna viva , caracterizada porque comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 14, o un microorganismo vivo recombinante de acuerdo con la reivindicación 15. 35.- El uso de un polin ucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de carcinoma . 36. El uso de un polin ucleótido como el reivind icado en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 , para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de carcinoma de colon . 37.- El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de carcinoma . 38.- El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de carcinoma de colon .