ES2557431T3 - Vacuna de combinación para Streptococcus - Google Patents

Abstract

Una composición inmunógena o composición de vacuna que comprende; proteína SP1298 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogénico(s) de la misma y/o proteína(s) que tiene(n) una identidad de más del 70% y proteína SP2205 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogénico(s) de la(s) misma(s) y/o una proteína(s) que tiene(n) una identidad de más del 70% para uso en medicina.

Description

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DESCRIPCION

Vacuna de combinacion para Streptococcus

La invencion se refiere al campo de la medicina, mas especialmente al campo de las vacunas contra infecciones bacterianas, mas en particular del genero Streptococcus, mas particularmente la especie Streptococcus pneumoniae.

Streptococcus pneumoniae (neumococo, S. pneumoniae) es un patogeno importante, que provoca una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. S. pneumoniae es una causa importante de enfermedades invasivas tales como la meningitis, bacteriemia y neumonla, as! como enfermedades no invasivas tales como la otitis media aguda y sinusitis (i). En los ninos pequenos, el neumococo es a menudo parte de la flora nasofarlngea normal. Especialmente durante los dos primeros anos de vida, los ninos son colonizados con nuevas cepas de neumococos. Los ninos colonizados con S. pneumoniae desarrollan con mas frecuencia otitis media aguda que los ninos que no estan colonizados (ii, iii, iv).

Los mecanismos moleculares precisos a traves de los cuales invade el neumococo y dana tejidos de acogida no se entienden completamente. Durante muchos anos, la capsula de polisacarido ha sido reconocida en la tecnica como el principal factor de virulencia y, en consecuencia, un candidato importante a vacuna (para una revision, vease v, vi). Las estrategias actuales de vacuna neumococica se centran en el uso de conjugados, en los que un numero limitado de diferentes polisacaridos capsulares estan ligados a una protelna portadora (vii, viii). Aunque los resultados de los primeros ensayos parecen prometedores, todavla surgen problemas ya que la vacunacion a gran escala con el tiempo generalmente conduce a un cambio en la distribucion de los serotipos hacia tipos capsulares que son poco inmunogenicas o no incluidos en la vacuna. Tal cambio se puede mejorar mediante el intercambio horizontal frecuente de genes capsulares, como lo describen varios investigadores (ix, x, xi).

En los ultimos anos, se ha puesto mucha atencion en el papel de las protelnas neumococicas en la patogenesis y la proteccion. Las protelnas que estan implicadas en la patogenesis de las infecciones por S. pneumoniae se consideran componentes interesantes para futuras vacunas conjugadas. Tales protelnas son capaces de cambiar la respuesta inmune contra los polisacaridos presentes en la vacuna de independiente de celulas T a dependiente de celulas T, a traves de lo cual la respuesta de anticuerpos hacia los polisacaridos se puede aumentar y se proporcionara una respuesta de memoria. Ademas, dichas protelnas deben proporcionar proteccion contra la colonizacion y la infeccion con cepas de S. pneumoniae cuyos polisacaridos capsulares no estan incluidos en la vacuna.

Las capacidades de proteccion de diferentes protelnas (virulencia) han sido investigadas previamente. La inmunizacion de neumolisina (xii), la protelna A de superficie neumococica (PspA) (xiii, xiv, xv), la adhesina A de superficie neumococica (PsaA) (xvi), y la neuraminidasa (xvii) confieren claramente proteccion en animales.

En la literatura han sido reportados diversos polinucleotidos de S. pneumoniae y los polipeptidos predichos que son codificados por dichos nucleotidos y se ha contemplado el uso de estos compuestos en vacunas y en preparaciones medicinales, por ejemplo en los documentos WO 97/37026, WO 00/06737 y WO 98/18930. Estas publicaciones, sin embargo, no identifican ninguna protelna funcional y mucho menos una vacuna basada en una protelna funcional. Estas publicaciones tampoco dicen nada con respecto a las protelnas que cuando se usan en vacunas son capaces de provocar una respuesta inmune y mucho menos que son capaces de provocar alguna actividad protectora

En el documento de Cron y colaboradores (Antonie van Leeuwenhoek 95: 43-43, 2009) se menciona que SP2205 es una protelna de superficie expuesta y un objetivo interesante para su inclusion en vacunas de protelna. Ademas, se ha divulgado que las protelnas SP1298 y Sp2205 son ejemplos de la familia DHH. Sin embargo, no se proporcionan datos de una preparacion inmunogenica de combinacion con cualquiera de estas protelnas.

Actualmente se encuentra disponible una vacuna polisacarida para 23 serotipos bacterianos (Pneumovax 23MR, Merck, EE.UU.) y una vacuna neumococica conjugada para 7 serotipos (PrevenarMR, Wyeth, EE.UU.) que proporciona una buena proteccion inmunologica. Sin embargo, existen limitaciones con estas vacunas. Tanto la vacuna polisacarida como la conjugada solo protegen contra los serotipos del tipo de la vacuna, permitiendo que ocurra el reemplazo de serotipos que no son de la vacuna. Este reemplazo de serotipos y la enfermedad posterior ha enfatizado la necesidad de estrategias alternativas de vacunas.

El mundo esta requiriendo una vacuna efectiva de bajo costo, que idealmente proporcionarla proteccion inmunologica contra todos los serotipos de neumococo, la colonizacion neumococica y la enfermedad invasiva. La vacuna serla inmunogenica en todos los grupos de edad y provocarla una respuesta que puede ser reforzada.

La presente invencion identifica una vacuna proteica de multiples componentes que abarca varias protelnas neumococicas conservadas que han mostrado algun grado de proteccion en modelos murinos como nuevos candidatos de vacunas.

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Ahora se ha encontrado que una combination de dos protelnas de S. pneumoniae puede ser utilizada en la preparation de una vacuna contra microorganismos y especialmente S. pneumoniae. Estas protelnas se encuentran entre un gran grupo de protelnas que se detectaron durante una criba de selection negativa en todo el genoma para factores bacterianos que contribuyen a la colonization, bacteriemia y meningitis in vivo (WO 2008/127094 y PCT/NL2009/050600).

En consecuencia, la invention se refiere a una composition inmunologica, o composition de vacuna de acuerdo con la revindication 1. La invencion tambien se refiere al uso de estas protelnas o fragmentos de las mismas para la preparacion de una vacuna para el tratamiento de una infection por S. pneumoniae y/o colonizacion, y al uso de estas protelnas o fragmentos de las mismas o protelnas recombinantes o sinteticas o fragmentos o protelnas funcionalmente homologas o fragmentos de las mismas como un portador para inducir protection profilactica contra otros microorganismos, incluidos los virus.

En esta description y las reivindicaciones adjuntas el tratamiento abarca y en general es la profilaxis de infecciones.

El termino "fragmento funcional" se refiere a una version acortada de la protelna, que es una variante funcional o un derivado funcional. Una "variante funcional" o un "derivado funcional" de una protelna es una protelna cuya secuencia de aminoacidos puede derivarse de la secuencia de aminoacidos de la protelna original por la sustitucion, supresion y/o adicion de uno o mas residuos de aminoacidos de una forma que, a pesar del cambio en la secuencia de aminoacidos, la variante funcional retiene al menos una parte de al menos una de las actividades biologicas de la protelna original que es detectable por una persona ordinariamente capacitada en la tecnica. Una variante funcional es generalmente al menos 70% homologa e incluso mas ventajosamente al menos 80 o 90% homologa a la protelna de la cual se puede derivar. "Funcional" como se usa en la presente memoria significa funcional en las bacterias Streptococcus pneumoniae y capaces de provocar anticuerpos que proporcionan proteccion contra la enfermedad causada por dicha bacteria.

La expresion "sustituciones conservadoras" tal como se utiliza con respecto a los aminoacidos se refiere a la sustitucion de un aminoacido dado por un aminoacido que tiene caracterlsticas fisicoqulmicas de la misma clase. Por lo tanto, cuando un aminoacido de las protelnas SP1298 y/o SP2205 tiene un grupo de caracterlstica hidrofoba, una sustitucion conservadora lo reemplaza por otro aminoacido que tiene tambien un grupo de caracterlstica hidrofoba; otras de tales clases son aquellos en las que el grupo que caracteriza es hidrofllico, cationico, anionico o contiene un tiol o un tioeter. Tales sustituciones son bien conocidas por aquellos ordinariamente capacitados en la tecnica, es decir, vease la patente de los Estados Unidos No. 5.380.712. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos se pueden hacer, por ejemplo, dentro del grupo de aminoacidos alifaticos no polares (Gly, Ala, Pro, Ile, Leu, Val), el grupo de aminoacidos polares no cargados (Cys, Ser, Thr, Met, Asn, Gln), el grupo de acidos aminoacidos polares cargados (Asp, Glu, Lys, Arg) o el grupo de aminoacidos aromaticos (His, Phe, Tyr, Trp).

El termino "parte inmunogenica" incluye la referencia a cualquier parte de una protelna SP1298 y/o SP2205, o un homologo funcional o fragmento funcional del mismo, que es capaz de provocar una respuesta inmune en un mamlfero. Dicha parte inmunogenica corresponde preferiblemente a un determinante antigenico de dicho patogeno.

Tal como se utiliza aqul, el termino "antlgeno" se refiere a una molecula capaz de ser enlazada por un anticuerpo o un receptor de celulas T (RCT) si es presentado por moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). El termino "antlgeno", como se usa aqul, tambien abarca los epltopos de celulas T. Un epltopo de celulas T es reconocido por un receptor de celulas T en el contexto de un CMH de clase I, presente en todas las celulas del cuerpo excepto los eritrocitos, o clase II, presente en las celulas inmunes y, en particular celulas presentadoras de antlgeno. Este evento de reconocimiento conduce a la activation de las celulas T y mecanismos efectores posteriores tales como proliferation de las celulas T, secretion de citoquinas, secretion de perforina, etc. Un antlgeno adicionalmente puede ser reconocido por el sistema inmune y/o puede inducir una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que conduce a la activacion de linfocitos T y/o B. Esto puede, sin embargo, requerir que, al menos en ciertos casos, el antlgeno contenga o este enlazado a un epltopo de celulas T cooperadoras y se presente en un adyuvante. Un antlgeno puede tener uno o mas epltopos (epltopos B y T). La reaction especlfica mencionada anteriormente pretende indicar que el antlgeno reaccionara preferiblemente, tlpicamente de una forma altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo o RCT y no con la multitud de otros anticuerpos o RCT que pueden ser evocados por otros antlgenos. Los antlgenos en la presente memoria tambien pueden ser mezclas de varios antlgenos individuales. Los antlgenos, como se usan en este documento, incluyen antlgenos de enfermedades infecciosas, mas especialmente antlgenos de Streptococcus pneumoniae, mas preferiblemente antlgenos derivados de las protelnas SP1298 y/o SP2205 y fragmentos y derivados de las mismas.

Tal como se utiliza aqul, el termino "determinante antigenico" se entiende que se refiere a aquella portion de un antlgeno que es especlficamente reconocida ya sea por linfocitos T o por linfocitos B. Los linfocitos B responden a determinantes antigenicos foraneos a traves de la production de anticuerpos, mientras que los linfocitos T son los mediadores de la inmunidad celular. Por lo tanto, los determinantes antigenicos o epltopos son aquellas partes de un antlgeno que son reconocidas por anticuerpos, o en el contexto de un CMH, por los receptores de celulas T. Un determinante antigenico puede contener uno o mas epltopos.

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El termino "tratamiento profilactico o terapeutico de una infeccion por Streptococcus pneumoniae" o "tratamiento profilactico o terapeutico de una infeccion neumococica" se refiere tanto a tratamientos profilacticos como terapeuticos en donde la virulencia del patogeno es bloqueada o disminuida, pero tambien a los tratamientos en donde los anticuerpos contra las protelnas SP1298 y/o SP2205 reconocen las bacteria y protegeran al huesped contra la infeccion, ya sea directamente a traves de agotamiento inmunitario, o indirectamente mediante el bloqueo de la actividad de la protelna, inhibiendo as! el crecimiento de las bacterias. Ademas, el termino se refiere al bloqueo de la funcion de las protelnas SP1298 y/o SP2205 in vivo reduciendo de este modo las capacidades de adhesion del patogeno con una reduccion concomitante en la capacidad de colonizacion y de invasion. Por lo tanto, el termino incluye la induccion de respuestas inmunes en los sujetos que utilizan formulaciones de vacunas de la invencion, as! como la inhibicion del crecimiento del patogeno in vivo mediante el uso de anticuerpos de la presente invencion como un compuesto activo en una composicion farmaceutica administrada al sujeto. Tambien se incluye la inhibicion de la virulencia y/o el crecimiento de las bacterias mediante tratamiento con antibioticos.

El termino "anticuerpo" se refiere a moleculas que son capaces de enlazarse a un epltopo o determinante antigenico e incluye referencia a formas de enlazamiento al antlgeno de los anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab)2). El termino "anticuerpo" con frecuencia se refiere a un polipeptido codificado sustancialmente por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos que se enlazan y reconocen especlficamente un analito (antlgeno). Sin embargo, aunque se pueden definir varios fragmentos de anticuerpos en terminos de la digestion de un anticuerpo intacto, una persona normalmente capacitada se dara cuenta que tales fragmentos pueden ser sintetizado nuevamente bien sea qulmicamente o mediante la utilizacion de metodologla de ADN recombinante. Por lo tanto, el termino anticuerpo, como se usa aqul, tambien incluye fragmentos de anticuerpo tales como Fv de cadena sencilla, anticuerpos quimericos (es decir, que comprenden regiones constantes y variables de diferentes especies), anticuerpos humanizados (es decir, que comprenden una region determinante de complementariedad (RDC) de una fuente no humana) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespeclficos). El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse por tecnicas que son bien conocidas en el arte tales como inmunizacion de un huesped y recoleccion de sueros (policlonal) (vease, por ejemplo, Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N.J., Ee.UU., 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7, 1-24 (1975); Broughton y Strong, Clin. Chem. 22, 726-732 (1976); y Playfair, y colaboradores, Br. Med. Bull. 30, 24-31 (1974)) o mediante la preparacion de llneas celulares hlbridas continuas y recolectando la protelna secretada (monoclonal) (vease, por ejemplo, Kohler y colaboradores en Nature 256, 495-497 (1975) y Eur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976); por Milstein y colaboradores, Nature 266, 550-552 (1977); y por Walsh, Nature 266, 495 (1977)) o clonando y expresando secuencias de nucleotidos o versiones sometidas a mutagenesis de los mismos que codifican al menos las secuencias de aminoacidos requeridas para el enlazamiento especlfico de anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o fragmento de la misma, en donde las inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, lgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Fragmentos de los mismos pueden incluir Fab, Fv y F(ab')2, Fab', y similares. Ademas, agregados, pollmeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos pueden ser utilizados cuando sea apropiado siempre y cuando se mantenga la afinidad de enlazamiento por una molecula particular.

Tal como se utiliza aqul, el termino "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composicion de anticuerpo que tiene una poblacion homogenea de anticuerpos. El termino no esta limitado en cuanto a la especie o fuente del anticuerpo, ni se pretende que este limitado por la forma en que se elabora. El termino abarca inmunoglobulinas enteras as! como fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv, y otros, tales como fragmentos de la RDC, que retienen la funcion de enlazamiento al antlgeno del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales de cualquier especie de mamlfero se pueden utilizar en esta invencion. En la practica, sin embargo, los anticuerpos seran tlpicamente de origen murino o de rata debido a la disponibilidad de llneas celulares de rata o de murino para uso en la elaboracion de las llneas celulares hlbridas requeridas o hibridomas para producir anticuerpos monoclonales.

Como se usa en este documento, el termino "anticuerpos monoclonales humanizados" significa que al menos una porcion de los aminoacidos expuestos en las regiones marco del anticuerpo (o fragmento), que no coinciden con los aminoacidos correspondientes en las contrapartes humanas mas homologas, se cambian, tal como mediante mutagenesis dirigida al sitio del ADN que codifica el anticuerpo. Debido a que estos aminoacidos expuestos estan en la superficie de la molecula, esta tecnica se llama remodelacion superficial. Por otra parte, debido a que los aminoacidos en la superficie de la molecula son aquellos que mas probablemente den lugar a una respuesta inmune, esta remodelacion superficial disminuye la inmunogenicidad del anticuerpo monoclonal cuando se administra a una especie cuya llnea celular no se utilizo para generar el anticuerpo, tal como la humana. El termino "anticuerpo monoclonal humanizado" tambien incluye un anticuerpo quimerico en donde las regiones variables ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal generado por un hibridoma de una llnea celular no humana son cada una unidas, a traves de tecnologla recombinante, a una region constante de cadena ligera humana y al menos una region constante de cadena pesada, respectivamente. La preparacion de tales anticuerpos quimericos (es decir, humanizados) es bien conocida en la tecnica.

El termino "que reconoce especlficamente", incluye la referencia a una reaccion de enlazamiento entre un anticuerpo y una protelna que tiene un epltopo reconocido por el sitio de enlazamiento del antlgeno del anticuerpo. Esta reaccion de enlazamiento es determinante de la presencia de una protelna que tiene el epltopo reconocido entre la presencia de una poblacion heterogenea de protelnas y otros compuestos biologicos. El enlazamiento especlfico a

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un anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad para una protelna particular. Por ejemplo, los anticuerpos producidos contra las protelnas SP1298 y/o SP2205 de la presente invention se pueden seleccionar para obtener anticuerpos que reconocen especlficamente dichas protelnas. Las protelnas utilizadas como inmunogenos pueden estar en conformation nativa o desnaturalizada a fin de proporcionar un epltopo lineal. Se pueden utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que reconocen especlficamente una protelna en particular (u otro analito). Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase solida se utilizan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales especlficamente inmunorreactivos con una protelna. Vease Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una description de los formatos de inmunoensayo y de las condiciones que se pueden utilizar para determinar la reactividad selectiva.

Un "sujeto" como se denomina en este documento se entiende que incluye mamlferos y otros animales, en donde los mamlferos incluyen, por ejemplo, seres humanos, simios, monos, caballos, ganado, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones y ovejas. El termino "animal no humano" significa que no incluye a los seres humanos. Preferiblemente, en la presente invencion, el sujeto es un ser humano, mas preferiblemente un nino o una persona mayor.

Las protelnas SP1298 y SP2205 tienen una secuencia de aminoacidos segun lo previsto en la Fig. 1. Las protelnas SP1298 y SP2205 de la presente invencion han sido identificadas mediante huella genetica de arreglo genomico (GAF), que es un metodo de alto rendimiento para identificar genes condicionalmente esenciales en Streptococcus pneumoniae mediante el uso de una combination de mutagenesis de transposones al azar y tecnologla de microarreglos (vease Bijlsma, JJE y colaboradores, 2007, Appl. Environm. Microbiol. 73 (5): 1514-1524, y el documento WO 2008/127094). GAF detecta los sitios de insertion del transposon en una biblioteca de mutantes mediante amplification y marcacion del ADN cromosomico adyacente al transposon y posterior hibridacion de estas sondas con un microarreglo. La identification de los sitios de insercion de transposones en mutantes que han desaparecido de la biblioteca debido a la selection, que representa genes condicionalmente esenciales, se logra mediante la hibridacion diferencial de las sondas generadas a partir de la biblioteca cultivada bajo dos condiciones para un arreglo. Para la detection de genes esenciales para colonization nasofarlngea y/o diseminacion hacia y/o supervivencia en la sangre, se usaron bibliotecas de mutantes de Streptococcus pneumoniae para infectar ratones en un modelo de infection por neumonla en murinos. Para la deteccion especlfica de genes esenciales para la colonizacion nasofarlngea, se utilizaron bibliotecas de mutantes de Streptococcus pneumoniae para infectar ratones en un modelo de infeccion de colonizacion en murinos. Para la deteccion especlfica de genes esenciales para supervivencia en la sangre, se usaron bibliotecas de mutantes de Streptococcus pneumoniae para infectar ratones en un modelo de infeccion por bacteriemia en murinos. Despues de la exposition, se identificaron los mutantes que habla desaparecido del lavado nasofarlngeo y/o de las muestras de sangre tomadas de los ratones, y se identificaron los genes alterados de estos mutantes. SP1298 y SP2205 se encontraban entre las protelnas que hablan sido identificadas como candidatas para el desarrollo de vacunas.

Se ha encontrado ahora sorprendentemente que una combinacion de ambas protelnas es mas efectiva en el desarrollo de una respuesta inmunologica que las protelnas individuales.

En una realization preferida de la invencion, las protelnas o un fragmento(s) de las mismas utilizadas en la preparation de la vacuna, son SP1298 o un fragmento homologo (funcional) de la misma de S. pneumoniae y SP2205 o un fragmento homologo (funcional) de la misma de S. pneumoniae. Ademas, dicha vacuna puede comprender otras protelnas inmunogenicas, tales como cualquiera de las protelnas enumeradas en los documentos WO 2008/127094 y PCT/NL2009/ 050600.

Igualmente es posible emplear un fragmento de SP1298 y/o SP2205 para la preparacion de una vacuna. Un fragmento es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que es funcionalmente similar a la correspondiente section de la protelna. Un fragmento preferido es un oligopeptido que contiene una de las partes caracterizadoras o dominios activos de la protelna. Las protelnas o los fragmentos funcionales de las mismas pueden obtenerse mediante tecnicas recombinantes o mediante slntesis qulmica. Los oligopeptidos sinteticos basados en o derivados de SP1298 y/o SP2205 puede por ejemplo ser obtenidos por tecnologla Pepscan convencional. Una persona capacitada en la materia puede preparar facilmente fragmentos o protelnas homologas de ambas SP1298 y/o SP2205. Ademas, la aplicabilidad de estos fragmentos o protelnas homologas para proporcionar una respuesta inmunologica a la infeccion por S. pneumoniae puede ser probada facilmente por la persona capacitada en la materia, por ejemplo, mediante la realizacion de experimentos tales como los descritos en la seccion experimental a continuation.

Las protelnas o fragmentos (funcionales) que se utilizan en la preparacion de la vacuna pueden ser protelnas parcialmente purificadas, protelnas purificadas o fragmentos de SP1298 y/o SP2205.

A fin de obtener una vacuna que se pueda administrar, la protelna o protelnas o fragmentos se ponen en una forma que sea adecuada para este proposito. Con este fin, la(s) protelna(s) puede(n) ser conjugada(s) con una protelna portadora. Las protelnas portadoras que se pueden utilizar en esta invencion son en general portadores convencionales y como tales son bien conocidas en la tecnica. La vacuna puede igualmente comprender tambien

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adyuvantes y otros componentes adicionales para garantizar aun mas el buen funcionamiento de la vacuna. Estos componentes adicionales son generalmente conocidos por la persona normalmente capacitada.

En una realization preferida de la invention, la composition que comprende la(s) protelna(s) o el(los) fragmento(s) estan por tanto, combinados con un adyuvante y/o un portador. A partir de esta composicion se prepara una vacuna que se utiliza en la vacunacion preventiva contra S. pneumoniae.

La invencion proporciona ademas un metodo para la preparation de una vacuna contra S. pneumoniae. El metodo comprende las etapas de preparar o aislar la protelna o el fragmento u homologo u homologo funcional de la protelna o fragmento, la determination de la respuesta inmunogenica mediante el aumento de anticuerpos contra la protelna o el fragmento u homologo u homologo funcional de la protelna o fragmento y analizar los anticuerpos por la actividad. El metodo de acuerdo con la invencion tambien abarca la production recombinante o sintetica de la protelna o el fragmento u homologo u homologo funcional de la protelna o fragmento y las etapas posteriores para la preparacion de la vacuna.

Los antlgenos de la vacuna de esta invencion se administran en una concentration que es terapeuticamente efectiva para prevenir o tratar infecciones por Streptococcus pneumoniae. Para lograr este objetivo, las vacunas pueden formularse usando una variedad de excipientes aceptables conocidos en la tecnica. Tlpicamente, las vacunas se administran mediante inyeccion, ya sea por via intravenosa o por via intraperitoneal. Los metodos para llevar a cabo esta administration son conocidos por aquellos normalmente capacitados en la tecnica.

Preferiblemente, la vacuna contiene al menos 5-150 pg de masa antigenica por dosis, mas preferiblemente 50-100 pg y lo mas preferible 80 pg por dosis. Siendo la masa antigenica la masa de la protelna antigenica. Podrlan ser incluso preparadas vacunas de acuerdo con la presente invencion con una masa antigenica de hasta 275 pg por dosis, y tales vacunas aun no pueden provocar reacciones locales en el sitio de la inyeccion. Por supuesto, se pueden colocar incluso mas microgramos de antlgeno en una dosis de vacuna de una vacuna de acuerdo con la invencion, pero si la protection obtenida con la vacuna no se mejora con una dosis mas alta, el aumento de la carga antigenica solo trae como resultado una vacuna mas costosa de lo necesario. Ademas, un aumento de la dosis de antlgeno puede eventualmente conducir a reacciones locales inaceptables en el sitio de inyeccion, que se deben evitar.

Una vacuna de acuerdo con la invencion puede contener una protelna SP1298 o SP2205 (parcialmente) purificada o recombinante o un fragmento funcional de las mismas, donde dicha protelna recombinante es producida preferiblemente por medio de la expresion de un vector de expresion en celulas huesped adecuadas, conteniendo dicho vector de expresion la secuencia del gen o una parte inmunogenica del mismo bajo el control de un promotor adecuado. Varios sistemas de expresion adecuados son conocidos en la tecnica y se pueden utilizar en un metodo para preparar una vacuna de acuerdo con la invencion.

Una vacuna de acuerdo con la invencion puede comprender ademas un adyuvante adecuado. Muchos sistemas adyuvantes son conocidos en la tecnica, por ejemplo se utilizan comunmente sistemas adyuvantes de aceite en agua. Cualquier aceite adecuado puede ser utilizado, por ejemplo un aceite mineral conocido en la tecnica para uso en adyuvantes. La fase oleosa tambien puede contener una mezcla adecuada de diferentes aceites, ya sea minerales o no minerales. Los adyuvantes adecuados pueden comprender tambien vitamina E, opcionalmente mezclada con uno o mas aceites. La fase acuosa de una vacuna con adyuvante de aceite en agua contendra el material antigenico. Las formulaciones adecuadas usualmente comprenden aproximadamente 25-60% de fase oleosa (40-75% de fase acuosa). Ejemplos de formulaciones adecuadas pueden comprender 30% de fase acuosa y 70% de fase oleosa o 50% de cada uno. Se prefiere especialmente una vacuna no recombinante a base de lactococos que presenta las protelnas antigenicas neumococicas mencionadas aqul o fragmentos de la mismas. Las partlculas con forma de bacterias derivadas de lactococos no estan vivas y se denominan partlculas de matriz reforzadora Gram positivas (GEM) (Van Roosmalen, ML y colaboradores, 2006, Methods 38: 144-149). Estas partlculas GEM no cuentan con protelnas de superficie y el contenido intracelular esta en gran medida degradado (Bosma, T. y colaboradores, 2006, Appl. Environ. Microbiol. 72: 880-889). Las partlculas GEM se pueden utilizar como vehlculo de anclaje y suministro para las protelnas neumococicas (vease Audouy, SAL y colaboradores, 2007, Vaccine 25 (13): 2497).

Las formulaciones de vacunas de la presente invencion pueden usarse en metodos profilacticos de la invencion para la inmunizacion de un sujeto mediante la introduction de dichas formulaciones en dicho sujeto por via subcutanea, intramuscular, intranasal, intradermica, intravenosa, transdermica, transmucosa, oral, o directamente en un ganglio linfatico. En otra realizacion, la composicion se puede aplicar localmente, cerca de un deposito local de patogeno contra el cual se desearla vacunar.

La presente invencion proporciona ademas un metodo para la fabrication de una vacuna destinada a la proteccion de un sujeto contra una infection neumococica, en donde dicha vacuna se combina con un diluyente farmaceuticamente aceptable, vehlculo, excipiente o adyuvante para la misma, de tal manera que se proporciona una formulation que puede proveer una dosis de al menos 20 pg de protelna en un solo evento de administracion.

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Una vacuna (preparada por un metodo) de acuerdo con la invencion puede ser utilizada en un metodo para proteger a un sujeto contra una infeccion neumococica.

Para garantizar una adecuada proteccion, se administra la vacuna preferiblemente en un regimen de vacunacion de 2 dosis, para lo cual se administran la primera dosis (vacunacion de cebado) y la segunda dosis (vacunacion de refuerzo) al sujeto con un intervalo de aproximadamente 3 semanas. De esta forma el sujeto habra obtenido una proteccion completa contra la infeccion neumococica. La vacunacion es muy favorable para los ninos pequenos.

Description de las figuras:

Figura 1: Secuencias de aminoacidos (AA) de SP1298 (311 AA; parte superior) y SP2205 (657 AA; parte inferior). La conservation del dominio consenso DHH (pfam01368) en ambas protelnas se indica con negrita, y la conservation del dominio de consenso asociado a DHH (DHHA1) (pfam02272) en cursiva. Los dominios transmembrana (primeros 50 AA) eliminados por la expresion de SP2205 se indican mediante caracteres pequenos (es decir, sin mayusculas). Figura 2: Contribution de las protelnas a la adhesion a las celulas epiteliales farlngeas humana Detroit 562. Barra de la izquierda: S. pneumoniae de tipo silvestre, barra del medio SP1298 mutante y barra de la derecha SP2205 mutante. La adhesion se expresa en relation con el de tipo silvestre, y los ambientes de las diferentes cepas utilizadas se indican debajo del eje x.

Figura 3: Carga bacteriana en el modelo de colonization de infeccion unica y experimentos de coinfection en ratones.

Figura 4: Carga bacteriana en el modelo de neumonla de infeccion unica y experimentos de coinfeccion en ratones. Concentration en el tejido pulmonar, en lavado del pulmon (BAL) y en sangre.

Figura 5: Carga bacteriana en el modelo de bacteriemia de infeccion unica y experimentos de coinfeccion en ratones.

Figura 6: Carga bacteriana tras la vacunacion con una o ambas protelnas recombinantes en comparacion con los controles positivos PrevenarMR y PspA y con un control negativo (alumbre) despues de la exposition a TIGR4 de tipo silvestre.

Ejemplos

Materiales y metodos

Construction de mutantes de supresion dirigidos. Se empleo un metodo de PCR con megacebador para reemplazar genes objetivo en el genoma de las cepas TIGR4, D39, y SME215 de S. pneumoniae con el casete de resistencia a espectinomicina del plasmido pR412T7 (Bijlsma, JJE y colaboradores, 2007, Appl. Environm. Microbiol. 73(5): 15141524). En la primera etapa, el casete de resistencia a espectinomicina y las dos regiones de flanqueo del gen objetivo se amplificaron por PCR utilizando el plasmido pR412T7 o ADN cromosomico aislado de una de las tres cepas de neumococo como plantilla, respectivamente. Las regiones de flanqueo eran de aproximadamente 500 pb de longitud y contenlan menos de 150 pb de la secuencia codificante del gen objetivo. Para cada region de flanqueo, el cebador mas cercano al gen objetivo contenla una secuencia adicional complementaria a un cebador del casete de espectinomicina. En la segunda etapa, los productos de la PCR de las dos regiones de flanqueo se fusionaron con el casete de resistencia a espectinomicina por medio de PCR de extension del solapamiento, lo que conduce a la incorporation del casete de resistencia a espectinomicina entre las dos regiones de flanqueo del gen objetivo. El producto resultante de la PCR se transformo en la cepa correspondiente de la siguiente forma.

En primer lugar, se prepararon poblaciones de celulas de S. pneumoniae precompetentes. En pocas palabras, se inocularon medio cCAT (10 g litro-1 de acidos Casamino (Difco), 5 g litro-1 de triptona (Difco), 10 g litro'1 de extracto de levadura (Difco), 5 g litro-1 de NaCl, K2P04 16 mM, glucosa al 0,2%, y 0,15 g litro-1 de glutamina) con varias colonias y se cultivaron hasta una densidad optica a 620 nm (DO62o) de 0,25-0,3. Despues de una dilution de 30 veces del cultivo en medio CTM (medio cCAT complementado con albumina de suero bovino al 0,2% y CaCl2 1 mM), las celulas se desarrollaron hasta una DO620 de 0,1, se sedimentaron, se resuspendieron en 0,1 volumenes de CTM- pH 7,8 (CTM ajustado a pH 7,8 con NaOH) que contenla glicerol al 15% y se almaceno a -80°C. Para la transformation, se cultivaron celulas TIGR4, D39 o SME215 precompetentes durante 15 minutos a 37°C en un volumen de 10 veces de CTM-pH 7,8 complementado con 100 ng/ml de CSP (CSP-1 para D39 y SME215, CSP- 2 para TIGR4). Despues de la adicion de ADN, se incubaron los cultivos durante 30 min a 32°C, seguido de una incubation de dos horas a 37°C. Despues del crecimiento durante la noche en placas selectivas que contenlan 150 pg/ml de espectinomicina, se recolectaron los transformantes individuales de las placas, se reunieron, crecieron en fase semilogarltmica en 20 ml de medio GM17 complementado con espectinomicina, y se almaceno a -80°C. Los transformantes se seleccionaron con base en la resistencia a la espectinomicina y se controlaron mediante PCR para la recombination en el lugar deseado en el cromosoma. Ademas, se genero un mutante doble ASP1298ASP2205 en cada una de las tres cepas de neumococo. Con este fin, se inactivo el gen para SP1298 mediante reemplazo alelico con un casete de trimetoprima como se describio anteriormente, y se introdujo en las cepas ASP2205 respectivas (espectinomicina) mediante transformacion.

Construccion del plasmido y production de SP1298 etiquetada con His. Se amplifico mediante PCR el gen para SP1298 de la cepa TIGR4 de S. pneumoniae con los pares cebadores oligonucleotidos LCSP1298XbaIH6F y

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LCSP1298BamR y se clonaron en el vector de clonacion pCR2.1 del kit de clonacion TA (Invitrogen) para obtener pLCl298. En la siguiente etapa, se corto el gen para SP1298 por digestion con XbaI y BamHI y luego se subclono en el vector plasmido de expresion pET11c (Novagen) para obtener pLCl298Xbal_#1. La secuencia de nucleotidos del gen clonado para SP1298 fue confirmada por secuenciacion.

Para la produccion de SP21298 etiquetada con His, se diluyeron 50 veces cultivos de una noche de E. coli BL21 (pLCl298Xbal_ #1) en 2x LB precalentado (37°C) complementado con glucosa al 0,5% y 100 pg/ml de ampicilina. A una DO600 entre 0,6 y 0,8, se anadio IPTG hasta una concentration final de 0,1 mM. Despues de 2 horas, se sedimentaron las celulas, se resuspendieron en regulador de lisis (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,4, e imidazol 10 mM) a una DO600 equivalente a 100, y se lisaron por sonicacion. El residuo insoluble en el lisado se separo mediante ultracentrifugacion a 40.000 rpm durante 60 min. El sobrenadante resultante se cargo en una columna de 1 ml HiTrap Chelating HP (Amersham Biosciences) con nlquel para la purification, se eluyo con imidazol 300 mM y las fracciones que contenlan SP1298 se dializaron contra Hepes 10 mM. Despues de la dialisis, se liofilizo rHisSP1298 y se almaceno a -20°C hasta su uso posterior. La identidad de la protelna purificada se confirmo por analisis mAlDI-TOF, y se determino la concentracion mediante el ensayo del acido bicinconlnico (BioRad).

Construccion del plasmido y produccion de SP2205 etiquetado con His. El gen para SP2205 de la cepa TIGR4 de S. pneumoniae se amplifico por PCR con LCSP2205AvrH6F y LCSP2205BamR y se clono en el vector de clonacion pCR2.1 del kit de clonacion TA (Invitrogen) para obtener pLC2205. En la siguiente etapa, se escindio el gen para SP2205 mediante digestion con BamHI y AvrII y posteriormente se subclono en el vector plasmido de expresion pET11c (Novagen) para obtener pLC2205_6. La secuencia de nucleotidos del gen clonado para SP2205 fue confirmada por secuenciacion.

Para la produccion de SP2205 etiquetado con His, se diluyeron 50 veces cultivos de una noche de E. coli BL21 (pLC2205_6) en 2x LB precalentado (37°C) complementado con glucosa al 0,5% y 100 pg/ml de ampicilina. A una Do60o entre 0,6 y 0,8, se anadio IPTG hasta una concentracion final de 0,1 mM. Despues de 2 horas, se sedimentaron las celulas, se resuspendieron en regulador de lisis (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, pH 7,4, Imidazol 10 mM, urea 6 M, PMSF 1 mM, y Triton X-100 al 1o%) a una DO600 equivalente a 100. Antes de la sonicacion, se anadieron PMSF 100 mM, BZA 100 mM, y lisozima al sedimento de SP2205 para mejorar la lisis. Se removio cualquier residuo insoluble adicional en el lisado mediante ultracentrifugacion a 40.000 rpm durante 60 min. Se cargo el sobrenadante resultante en una columna de 1 ml HiTrap Chelating HP (Amersham Biosciences) con nlquel para la purificacion y se eluyo con imidazol 300 mM. Se dializaron las fracciones que contenlan SP2205 contra Hepes 10 mM, urea 6 M, y Triton X-100 al 10%. Despues de la dialisis, se almaceno rHisSP2205 en solution a -20°C hasta su uso posterior. La identidad de la protelna purificada se confirmo por analisis MALDI-TOF y se determino la concentracion mediante el ensayo del acido bicinconlnico (Bio-Rad).

Llnea celular y cultivo celular. Se cultivo rutinariamente la llnea celular epitelial humana farlngea Detroit 562 (ATCC numero CCL-138) en medio RPMI 1640 sin rojo fenol (Invitrogen, Palses Bajos) complementado con piruvato de sodio 1 mM y suero de ternera fetal (FCS) al 10% (v/v). Todas las celulas se cultivaron a 37°C en un ambiente de CO2 al 5%.

Ensayo de adherencia. Para los ensayos de adherencia, se cultivaron las bacterias hasta una fase exponencial media en THY y se almacenan en allcuotas de 1 ml a -80°C en THY que contenla glicerol al 15%. Antes de cada ensayo, se resuspendieron las bacterias en medio RPMI 1640 sin rojo fenol complementado con FCS al 1%. La adhesion de los neumococos a las celulas epiteliales se realizo como se ha descrito previamente (Bootsma HJ y colaboradores, 2007, Infect. Immun. 75: 5489-5499; Hermans P.W.M. y colaboradores, 2006, J. Biol. Chem. 28l (2): 968- 976). En resumen, se sembraron celulas Detroit 562 en placas de 24 pozos y se incubaron durante 48 h. Se lavaron las monocapas confluentes dos veces con PBS y se infectaron con 1x107 UFC ml-1 (multiplicidad de infection (MOI) de 10 (bacterias/celulas)) y se permitio la adhesion neumococos a las celulas durante 2 h a 37°C en un ambiente de CO2 al 5%. Se removieron las bacterias no adherentes mediante tres lavados con 1 ml con PBS, despues de lo cual se anadieron 200 pl de tripsina al 25%, EDTA 1 mM para desprender las celulas, seguido por 800 pl de Triton X-100 al 0,025% enfriado con hielo en PBS para lisar las celulas. Se sembraron en placa las muestras para el recuento de las UFC, y se corrigieron para tener en cuenta las pequenas diferencias en el recuento inicial del inoculo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces. La adherencia de los mutantes se da como el porcentaje con relation al tipo silvestre. Las cepas mutantes y de tipo silvestre crecieron comparativamente en medio RPMI (sin rojo fenol complementado con FCS al 1%) unicamente.

Estudios de virulencia in vivo. Se usaron ratones CD-1 hembra no consangulneos de ocho semanas de edad (Charles River Laboratories) para todos los modelos de infeccion. Se descongelaron rapidamente las allcuotas de las bacterias almacenadas a -80°C, se recogieron por centrifugation, y se resuspendieron en PBS esteril para obtener la cantidad necesaria de UFC/ml. Antes de la infeccion, se pasaron las cepas en ratones para mantener la virulencia tal como se describio anteriormente (Hendriksen WT y colaboradores, 2007, J. Bacteriol. 189: 1382-1389). Para el modelo de neumonla, se anestesiaron ligeramente los ratones con isoflurano al 2,5% (vol / vol)/O2, y se infectaron por via intranasal pipeteando 50 pl de inoculo (5x106 de UFC totales) en las fosas nasales de los ratones mantenidos en position vertical. En momentos predeterminados despues de la infeccion, se sacrificaron grupos de

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ratones mediante inyeccion con anestesia, y se recogieron muestras de sangre mediante sangrado retro-orbital. Se recuperaron las bacterias de la nasofaringe mediante lavado de las fosas nasales con 2 ml de PBS esteril (lavado nasofarlngeo, NPL). Se realizo un lavado pulmonar broncoalveolar (BAL) mediante el lavado de los pulmones con 2 ml de PBS esteril, despues de lo cual se retiraron los pulmones del cuerpo y se homogeneizaron en 2 ml de PBS esteril usando un homogeneizador de mano. En el modelo de colonization, se infectaron los ratones por via intranasal con 10 pl de inoculo (5x106 de UFC totales), un volumen lo suficientemente pequeno solo para infectar la nariz (nasofaringe) de los ratones. En instantes de tiempo predeterminados despues de la infection, se recogieron NPL y de pulmon como se describio anteriormente. En el modelo de bacteriemia, se infectaron los ratones en una vena de la cola con un inoculo de 100 pl (106-107 de UFC totales). Se recuperaron las bacterias de la sangre mediante una puncion de la vena lateral de la cola del mismo raton a las 0, 12, 24 y 36 horas despues de la infeccion. El numero de bacterias viables en NPL, BAL, sangre y pulmones homogeneizados se determino mediante siembra en placas de diluciones seriadas 10 veces sobre placas de agar sangre (BA).

Para todos los experimentos de coinfection, se utilizo una relation 1:1 de tipo salvaje y mutante para infectar a los ratones como se describe en los modelos antes mencionados. Esta configuration reduce la variation entre los ratones individuales, la preparacion y distribucion de la inoculacion, y la recoleccion de muestras. Se cuantificaron las bacterias viables mediante siembra en placa de diluciones seriadas en placas BA y placas BA complementadas ya sea con espectinomicina o espectinomicina y trimetoprima. Posteriormente, se calcularon los puntajes del Indice de competition (IC) para cada animal individual tal como la relacion de salida del mutante con respecto al tipo silvestre dividido por la relacion de entrada del mutante con respecto a las bacterias de tipo silvestre. Para todos los experimentos en los que no se recuperaron bacterias mutantes de un raton particular, el numero 20 (llmite inferior de detection) fue sustituido como el numerador. Una puntuacion de los de IC de 0 indica un numero igual de bacterias mutantes y de tipo silvestre, una puntuacion de IC <0 indica que el mutante fue sobrepasado por la de tipo silvestre. Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobacion del Comite del Centro Medico de £tica Animal de la Universidad Radboud de Nijmegen.

Estudio de vacunacion. Los ratones hembra CD-1 (6 semanas de edad) se inmunizaron subcutaneamente con 150 pl de vacuna o de control (se utilizo alumbre como control negativo y Prevenar como control positivo). Gel de hidroxido de aluminio (Sigma) fue el adyuvante usado y se formulo con cada una de las vacunas a razon de 3 mg/ml. Las inmunizaciones completas consistieron en tres dosis a intervalos de 14 dlas. Cada grupo consistio en 10 ratones. Los ratones vacunados en forma individual recibieron 50 pg de antlgeno y los ratones que recibieron una combination de ambas protelnas DHH recibieron 25 pg de cada una. Los ratones fueron expuestos a la cepa TIGR4WT dos semanas y media despues de la ultima inmunizacion en nuestro modelo de neumonla y se tomaron muestras 48 horas despues de la infeccion.

Deteccion de IgG especlfica del antlgeno por ELISA. Para determinar el concentraciones de anticuerpos contra SP1298, SP2205, SP1298/SP2205, se utilizo un procedimiento de ELISA. Se recubrieron placas de microtitulacion con alta capacidad de enlazamiento (Greiner, Alphen aan de Rijn, Palses Bajos) con 1 pg/pl de rHisSP1298 o rHisSP2205 purificado en 100 pl/ pozo durante la noche a 4°C. Se lavaron las placas con PBS (pH 7,4) con Tween 20 al 0,05%, a continuation se incubaron 1 h con BSA al 2% en PBS/Tween. Se anadieron diluciones de tres veces de sueros a las placas y se incubaron durante 1 h a 37°C. Despues del lavado, se incubo el anticuerpo secundario de fosfatasa alcalina dirigido a IgG-Fc de raton (Sigma-Aldrich) durante 1 h a 37°C usando una dilution 1:25.000. Despues de lavar con Tween 20 al 0,05%, se anadieron 100 pl/ pozo de p-nitrofenil fosfato en regulador de sustrato (dietanolamina 10 mM y cloruro de magnesio 0,5 mM, pH 9,5) y se leyo a 405 nm.

Analisis estadlstico. Las comparaciones de las cargas bacterianas entre cepas bacterianas de tipo silvestre y mutantes se realizaron mediante la prueba t de Student (desapareada) para la adherencia in vitro y con los modelos individuales de infeccion de raton. Para la coinfeccion, se realizo la comparacion de las puntuaciones del log de IC utilizando la prueba t de una muestra (con una mediana arbitraria de 0) considerando P <0,05 como estadlsticamente significativo. Todos los analisis estadlsticos se realizaron utilizando GraphPad Prism version 4.0.

Resultados

A partir de la Fig. 2 parece que la adherencia a las celulas epiteliales de la faringe se vio afectada en los mutantes SP1298 y SP2205 en comparacion con sus respectivos tipos silvestres (ya sea TIGR4, D39 o SME215). La supresion de SP2205 mostro el efecto mas dramatico en los tres ambientes, siendo todos muy significativos. El mutante SP1298 mostro una disminucion significativa en la adhesion en el ambiente de SME215, y una tendencia a la disminucion en las otras dos cepas.

Con respecto a los estudios de infeccion, en el modelo de colonizacion, se observo una reduction significativa de la carga bacteriana tanto en la configuracion individual como de coinfeccion tanto para los mutantes individuales como los mutantes dobles (Fig. 3), especialmente en el ambiente de TIGR4. No se observo un efecto sinergico o aditivo cuando se comparan los mutantes individuales con el mutante doble, excepto para el ambiente de D39, donde el mutante doble era sobrepasado mas considerablemente que los dos mutantes individuales. En el modelo de neumonla (vease la Fig. 4) todos los mutantes fueron significativamente atenuados en los pulmones en las tres cepas, tanto individualmente como en competencia con sus respectivos tipos silvestres. En el modelo de infeccion

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de bacteriemia (Fig. 5) el mutante SP2205 en TIGR4 y D39 fue atenuado unicamente en sangre en una configuracion de coinfeccion, lo que sugiere que este mutante solo es capaz de sobrevivir eficientemente durante la bacteriemia cuando no esta en competencia con el tipo silvestre. El mutante SP1298 fue significativamente atenuado en sangre de TIGR4 y D39 tanto durante infeccion individual como durante coinfeccion.

En el estudio de vacunacion, los ratones fueron inyectados con una o ambas protelnas recombinantes. Como es evidente a partir de la Fig. 5, solamente una combinacion de ambas protelnas proporciono proteccion contra la exposicion subsiguiente con una cepa TIGR4 de S. pneumoniae, ya que las cargas bacterianas fueron significativamente menores en los pulmones y la sangre de estos ratones en comparacion con el grupo de control negativo que recibio adyuvante (alumbre) solamente. En comparacion con el control positivo (la vacuna comercialmente disponible PrevenarMR) la combinacion se comporta casi tan bien, mientras que los resultados individuales de las dos protelnas fueron menos pronunciados o estaban ausentes.

Se afirma por lo tanto que la combinacion de SP2205 y SP1298 es una composicion de vacuna prometedora, que confiere una proteccion significativa contra la neumonla neumococica, indicando tambien que tanto SP1298 como SP2205 podrlan ser considerados como potenciales candidatos para una vacuna de protelna de multiples componentes.

Referencias

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   Reivindicaciones

   1. Una composicion inmunogena o composicion de vacuna que comprende; protelna SP1298 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogenico(s) de la misma y/o protelna(s) que tiene(n) una identidad de mas del 70% y protelna SP2205 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogenico(s) de la(s) misma(s) y/o una protelna(s) que tiene(n) una identidad de mas del 70% para uso en medicina.
2. 2. Una composicion inmunogenica o composicion de vacuna para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 para el tratamiento de infecciones microbianas.
3. 3. Una composicion de vacuna para uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que comprende adicionalmente un portador farmaceuticamente aceptable.
4. 4. Una composicion de vacuna para uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3, que comprende adicionalmente un adyuvante.
5. 5. Una composicion de vacuna para uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha formulacion proporciona proteccion contra neumonla, meningitis, otitis media y/o sepsis causada por Streptococcus pneumoniae.
6. 6. Una composicion inmunogenica o composicion de vacuna para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una protelna que tiene una identidad de mas del 80% con la protelna SP1298 de S. pneumoniae, preferiblemente mas del 90%.
7. 7. Una composicion inmunogenica o composicion de vacuna para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una protelna que tiene una identidad de mas del 80% con la protelna SP2205 de S. pneumoniae, preferiblemente mas del 90%.
8. 8. Un metodo para la preparacion de una formulacion de vacuna neumococica, en donde dicho metodo comprende poner en asociacion, una cantidad efectiva de protelna SP1298 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogenico(s) de la misma y/o una protelna(s) que tiene(n) una identidad de mas del 70% y la protelna SP2205 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogenico(s) de la misma y/o una protelna(s) que tiene(n) una identidad de mas del 70% y al menos uno de un diluyente, vehlculo, excipiente o adyuvante farmaceuticamente aceptable para la(s) misma(s).
9. 9. Uso de una combinacion de protelna SP1298 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogenico(s) de la misma y/o una protelna(s) que tiene(n) una identidad de mas del 70% y protelna SP2205 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogenico(s) de la misma y/o una protelna(s) que tiene(n) una identidad de mas del 70% para la preparacion de una vacuna para el tratamiento o profilaxis de una infeccion por S. pneumoniae.
10. 10. Uso de una combinacion de protelna SP1298 de S. pneumoniae y/o un fragmento inmunogenico de la misma y/o una protelna(s) que tiene(n) una identidad de mas del 70% y protelna SP2205 de S. pneumoniae y/o un fragmento(s) inmunogenico(s) de la misma y/o una protelna(s) que tiene(n) una identidad de mas del 70% para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con infecciones por S. pneumoniae.
11. 11. Uso de acuerdo con la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, en donde la combinacion comprende una protelna que tiene una identidad de mas del 80% con la protelna SP1298 de S. pneumoniae, preferiblemente mas del 90%.
12. 12. Uso de acuerdo con la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, en donde la combinacion comprende una protelna que tiene una identidad de mas del 80% con la protelna SP2205 de S. pneumoniae, preferiblemente mas del 90%.