KR20070001274A

KR20070001274A - 치료학적 펩타이드

Info

Publication number: KR20070001274A
Application number: KR1020067023963A
Authority: KR
Inventors: 뭄타즈 비르이
Original assignee: 더 유니버시티 오브 브리스톨
Priority date: 2004-04-15
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2007-01-03
Also published as: NZ551204A; AU2005232437B2; EP1735446A2; BRPI0509936A; WO2005099337A3; AU2005232437A1; MXPA06011501A; NO20065201L; JP4960219B2; JP2007532618A; CA2563332A1; IL178517A0; WO2005099337A2; JP2012097099A; EP2468863A1

Abstract

본 발명은 CEACAM 수용체에 결합되는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 외막 단백질로부터 분리되는 리간드를 제공하며, 이때 리간드는 기술된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 또는, 이의 단편, 동족체, 기능성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 다른 2차 가공 생성물을 포함하는 수용체 결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 당해 리간드를 포함하는 약제 및 백신과, 감염의 치료 또는 예방에 있어서의 이들의 용도를 제공한다. 또한 당해 리간드 및 감염의 치료 또는 예방에 있어서의 이들의 용도를 제공한다. 또한, 신규 치료학적 화합물의 동정을 위한 스크리닝 방법을 제공한다.

CEACAM 수용체, 모락셀라 카타르할리스, 백신, 중이염, 신생물 질환

Description

치료학적 펩타이드{Therapeutic peptides}

본 발명은 치료학적 펩타이드 및 특히, 감염의 치료시 잠재적인 약제학적 활성에 대한 화합물의 스크리닝에서 뿐만 아니라, 감염에 대한 백신 또는 다른 치료제의 제조에서 유용한 치료학적 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명자는 암배아성 항원 관련 세포 접착 분자(CEACAM; Carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecules)가 점막의 병원체, 특히 호흡기 병원체[예: 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 및 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)]에 대한 수용체임을 이미 확인하였다. CEACAM은 면역글로블린 상과의 일원인 암배아성 항원(CEA)과에 속한다. CEA 유전자 과는 표면 발현되고(CEA), 분비된 [임신 특이성 당단백질(pregnancy-specific glycoprotein), PSG] 아과를 포함한다. CEACAM(CEA-관련 세포 접착 분자)²⁰로서 재정의된 막-결합 아과는 CEACAM1이 특정 사람의 조직¹²에서 가장 광범위하게 발현되는 몇몇 관련 당단백질을 포함한다. 본 발명자에 의해 보고된 연구는 주로 4개의 세포외 도메인, TM 영역 및 짧거나(S) 긴(L) 세포질 꼬리부(분자식: NA 1BA2-TM-S 또는 L)를 함유하는 CEACAM1에 의해 형질 감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO; Chinese Hamster Ovary) 세포(이전에 CD66a 및 BGPc로서 언급됨)를 사용한다. 또한, 하나 이상의 세포외 도메인을 함유하는 가용성의 절단된 작제물이 사용된다. 이전의 연구는 네이세리아 메닝기티디스 및 해모필루스 인플루엔자가 모두 주로 몇몇 CEACAM^7,9,10의 N-도메인을 표적으로 한다는 것을 입증하였다. 이러한 표적화는 세포 침입⁹ 뿐만 아니라, 세포 표면 접착을 유도할 수 있다. 또한, 세균은 식세포 및 T와 B 림프구 상의 CEACAM에 결합될 수 있다. 이러한 상호작용은 , 예를 들면, 엔. 고노르호애(N. gonorrhoeae)(엔. 메닝기티디스에 밀접하게 관련됨)가 이들 림프구²¹ ^,22의 CEACAM에 결합되는 경우에 T 및 B 림프구의 세균 세포 사멸⁸, 표적 세포 사멸 또는 T 및 B 림프구의 면역 기능의 억제를 유도할 수 있다.

모락셀라 카타르할리스 및 해모필루스 인플루엔자중 CEACAM-결합 리간드의 존재는 CEACAM가 네이세리아의 외막 불투명도-관련 Opa 단백질과 오랫동안 관련이 있어왔고, 해모필루스 인플루엔자나 모락셀라 카타르할리스는 Opa 단백질을 생성하지 않기 때문에 본 발명자에게는 놀라운 발견이었다. 이어지는 설명에서, 본 발명은 점막, 특히 호흡기 막의 감염 또는, 귀(특히, 중이염)의 감염을 특별히 언급하면서 기술할 것이지만, 본 발명은 CEACAM 수용체가 감염이나 다른 수용체-결합 과정에 관여되는 생식기 점막 또는 요도, 또는 세균이 점막 표면으로부터 전파될 수 있는 사람 감염의 그 밖의 다른 곳과 같은 다른 부위에서 동등한 유용성을 밝혔음을 이해해야 한다.

점막 병원체인 네이세리아 메닝기티디스(Nm), 해모필루스 인플루엔자(Hi) 및 모락셀라 카타르할리스(Mx)는 사람 특이적 유기체이고, 이들이 심각한 감염을 유발할 수 있는 상부 호흡기관에 잔류한다. 특정 혈청 그룹(serogroup)의 수막염 구균성 균주는 건강한 개인의 25% 이하에서 비인강내에 보유될 수 있다¹. 그러나, 수많은 개체중, 당해 유기체는 점막 장벽을 침입하여 가장 신속히 진행되고 상당히 심각한 질병중 하나를 유발한다. 수막염 구균 감염에 대한 숙주 감수성을 증가시키는 정확한 요인은 완전히 이해되고 있지 않다. 더욱이, 그룹-특이적 백신에 의해 제공되는 제한된 보호와 그룹 B 다당류의 비-면역원성은, 숙주 감수성을 이해하고 수막염 구균에 대항하기 위한 통상의 표적으로서 작용할 수 있는 두드러진 피막하 특성을 확인하기 위한 기본적인 연구에 대한 필요성을 강조하고 있다. 본 발명자에 의한 연구는 수막염 구균의 군집화에 대한 분자 수준의 이해 및 식세포 뿐만 아니라 사람의 장벽 세포(상피 및 내피)와의 상호작용 특성의 이해를 제공한다. 최근에, 공생의 네이세리아에 의한 점막 군집화에 대한 기본바탕이 상당히 무해한 군집체와 가끔, 그러나 심각한 병원체(예: Nm)간에 구분되는 특성을 이해하기 위하여 연구되었다. 또한, 연구는 공생의 네이세리아가 Nm의 잠재적인 백신 항원의 캐리어로서 사용될 수 있는 지를 결정하였다.

건강한 개인의 75% 이하는 에이치. 인플루엔자 종(H. influenzae)에 속하는 균주를 보유할 수 있다². Hib 백신의 결과로, 서구에서 b형 질환의 발병률에 있어서 상당한 감소를 이루었음에도 불구하고, 타입화 되지 않은 Hi(NTHi) 균주에 의해 유발되는 질병은 주요한 문제점으로 남아있다. NTHi는 후두개염, 중이염, 봉와염, 폐렴, 심내막염, 균혈증 및 수막염을 포함하는 국부 및 산재성 감염을 유발한다. 중이염은 소아 의학의 주요 문제점중 하나이고, NTHi는 생후 1년 동안에 영아에서의 20%를 초과하는 사례와 관련이 있다² ^,3. NTHi는 또한 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD) 및 낭포성 섬유증을 앓고 있는 환자에 있어서 급성 재발성 및 지속성 감염과 관련이 있다. 이들 환자중 NTHi에 의한 재발성 감염 또는 어린이들중 중이염의 다발성 사례를 결정하는 것은 확실치 않다^2,3,4.

사람 호흡기관의 다른 상주균인, 모락셀라 카타르할리스는 종종 Hi와 함께 국부 감염의 경우로부터 분리된다. 두 유기체는 모두 부비동염 및 천식 증상의 악화와 관련이 있다^5,6. Mx는 어린이 중이염의 세 번째로 가장 통상적인 원인이다(매년 3 내지 4백만건에 관련되어 있는 것으로 평가됨). 성인, 특히 COPD를 앓고 있는 환자에 있어서 하부 호흡기관 감염을 또한 유발한다⁵. 드문 경우로, 산재성 감염과 관련이 있다⁵. Hi 및 Mx는 모두 지속성 감염을 유발하며, 조직 침투에 의해 숙주 면역 메카니즘 및 항생제를 피할 것으로 사료된다⁴. Mx의 몇몇 외막 단백질이 이들의 접착 특성에 대해 연구되었다. 그러나, Mx에 대해 극히 적은 세포성 수용체가 확인되었고, 병원성 메카니즘에 대한 많은 세부적 사항이 연구되어야 한다^4,5,6.

호흡기 점막 병원체에 대한 주요 요건은 호흡성 상피 세포와의 확고한 접촉의 성립에 있다. 이들 사람 향성 병원체의 표적은 사람 특이적 분자이고, 연구는 시험관내 사람 조직 및 기관 배양에 의존해야 한다. 접착은 종종 세균성 단계- 및 항원성 변이적인 구조물에 의해 매개된다. 또한, 병원체의 접착은 다면적이고, 환경적 순응은 접착 방식에서 중요한 역할을 하는 것이 점차 확실해지고 있다. 많은 최근의 연구가 복잡한 세포 표적 메카니즘에서 다양한 단계를 규명하기 시작했음에도 불구하고, 환경적 순응 또는 숙주-미생물 크로스-토크의 세부 사항은 아직 조사되어야만 한다.

본 발명자에 의한 최근의 연구는 Nm^7-9 및 Hi^10,11가 특정한 사람 세포 표면 수용체 CEACAM¹²를 표적으로 삼는 독특하고 다른 통상적인 메카니즘을 공유한다고 밝혔다.

더욱이, 본 발명자는 최근에 모락셀라 카타르할리스의 임상적 분리체가 또한 사람의 CEACAM 분자를 표적으로 함을 확인하였다. 또한, 오늘날 고분자량의 모락셀라 외막 단백질이 수용체에 결합됨을 발견하였다. 호흡기 상피 세포를 포함하는 특정 조직¹²에서 CEACAM의 발현이 입증되었다²⁴. 이들 관찰은 CEACAM의 특이적 표적화가 호흡성 세균에 특히 유용하고, 수렴 진화의 결과로서 발생될 수 있음을 의미한다.

그중, 네이세리아 메닝기티디스에 의해 사용되는 접착 인자는 선모(pili, 섬 모(fimbriae))^13,14,16 및 외막 불투명도 단백질, Opa와 Opc^15,16이다. Nm 선모는 다중 필린 서브 유니트로 구성된 긴 필라멘트형의 단백질 구조물이다. 그들은 일반적으로 피막이 부분적으로 또는 전체적으로 외막 리간드를 차폐하여 이들의 기능적 효능을 감소시키는 반면에, 선모는 피막을 가로질러 완전히 피막된 세균에서 기능적으로 잔류한다는 사실로 인하여, 피막 세균^13,14,16에서 가장 중요한 어드헤신(adhesin)으로서 간주된다. Opa는 단백질의 항원성 변이적 과이며, 엔. 고노르호애(N. gonorrhoeae) 뿐만 아니라, 엔. 메닝기티디스에서 생성된다. 수막염 구균에서, 3 - 4 opa 유전자 좌위는 4개의 표면 노출 루프를 갖는 관련 막관통 단백질을 암호화하고, 이중 세 개는 서열이 변이된다^16,17. 다른 막관통 단백질인 Opc는 상당히 불변이다^15,16. 지난 12년 동안, 본 발명자는 Nm 선모의 구조/기능 관계, Opa 및 Opc 단백질의 독성 잠재력을 연구하였고, 네이세리아 불투명도 단백질에 대한 2개의 사람 수용체를 확인하였다. 또한, 세포 독성에서 LPS 및 다른 인자의 역할 뿐만 아니라, 사람 표적 세포와 세균의 상호작용에 있어서 표면 시알산의 역할이 본 발명자에 의해 연구되었다.

본 발명은 CEACAM 수용체에 결합되는 모락셀라 외막 단백질로부터 분리된 고분자량의 리간드를 본 발명자가 동정함으로써 완성되었다.

리간드는 이의 SDS-PAGE 이동 패턴에 의해 특성화될 수 있고, 이 패턴은 오랜 기간동안 비등시키는 경우에 분자량이 대략 60 내지 150 kD인 단량체로 분해되 는 단백질의 USP-과임을 지적한다.

리간드는 Mx 균주(ATCC 25238(MX2))에서 UspA1으로서 특성화되었고 이의 아미노산 서열이 결정되었다. 리간드는 또한 수용체 결합 영역 또는 도메인, 즉 수용체에 결합되는 펩타이드 또는 펩타이드-결합 특성을 결정하기 위해 특성화되었다.

따라서, 본 발명은 CEACAM 수용체에 결합되는 모락셀라 카타르할리스 외막 단백질로부터 분리된 리간드를 제공하며, 이때 리간드는 도 6에 제시된 서열의 잔기 463 내지 863, 527 내지 623, 527 내지 668, 527 내지 863, 427 내지 623, 427 내지 668 및 427 내지 863을 포함하거나 이들로 이루어진 수용체 결합 도메인을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 동족체, 기능성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 이의 다른 2차 가공 생성물이다.

바람직한 양태에서, 당해 리간드는 도 6에 제시된 서열의 잔기 527 내지 623, 527 내지 668 및 427 내지 623을 포함하거나 이들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 동족체, 기능성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 이의 다른 2차 가공 생성물이다.

용어 리간드는 본 명세서에서, 수용체 결합 도메인을 포함하여, 이것이 수용체 결합 특성을 보유하도록 하는 수용체에 결합되는 전체 분자 및 이의 일부를 모두 나타내기 위하여 사용된다. 따라서, "리간드"는 수용체 결합 도메인만으로 이 루어진 분자, 즉 수용체 결합을 위해 필요한 펩타이드 영역 또는 영역들을 포함한다.

또 다른 바람직한 양태에서, 당해 폴리펩타이드는 도 27에 나타낸 정렬에서 확인된 도 6에 나타낸 서열 잔기 427 내지 623 영역내에서 하나 이상의 보존성 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 이러한 양태에서, 당해 폴리펩타이드는:

QHSSDIKTLK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA,

DIAQNQT,

DIQDLAAYNELQD,

QTEAIDALNKASS,

TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK,

NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK,

NQADIANNIKNIYELA,

NQADIANNI 및

NIYELA중 하나 이상을 포함하거나 이들로 이루어진다.

본 발명의 폴리펩타이드 리간드는 N 또는 C 말단 또는 이들 둘다에서 본원에 제시된 서열로부터 결실 또는 당해 서열로의 첨가에 의해 변형된, 본원에 제시된 서열의 수용체 결합 도메인을 포함하고, 당해 변형된 펩타이드는 CEACAM 수용체에 결합하는 능력을 보유한다. 따라서, 본 발명은 추가로 50개, 40개, 30개, 20개, 10개, 5개, 3개 또는 1개의 아미노산이 N 또는 C 말단 또는 이들 둘다에서 본원에 제시된 아미노산 서열로부터 결실되거나 이들로 첨가된 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어진 리간드를 제공하고, 이때, 당해 변형된 폴리펩타이드는 CEACAM 수용체에 결합하고/하거나 비변형된 펩타이드에 대한 면역 반응을 유발하는 능력을 보유하고 있다. 바람직하게, 560번 위치의 아미노산은 변형된 펩타이드에 보유된다.

본 발명의 폴리펩타이드 단편에 대해, 임의의 크기의 단편이 본 발명에 사용될 수 있고 단, 당해 단편은 CEACAM 수용체와 결합하는 능력을 보유해야만 한다. 단지 수용체 결합에 요구되는 영역을 포함하는 소형 펩타이드를 분리하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드 리간드는 N- 및 C-말단중 어느 하나 또는 이들 둘다에서 절단시켜 공지된 모락셀라 카타르할리스 UspA1 단백질로부터 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로, N 말단으로부터 적어도(또는 정확하게) 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 100개, 120개, 140개, 160개등 내지 520개 아미노산이 결핍되고/되거나 C말단으로부터 적어도(또는 정확하게) 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 100개, 120개, 140개, 160개, 180개 또는 200개 아미노산이 결핍된 야생형 UspA1 서열을 제공한다. 바람직하게, 절단물은 CEACAM 결합 기능을 보유한다. 가능한 절단물은 하기의 표에 나타낸 것들로부터 선택될 수 있고 이 모두는 본 발명의 범위에 속한다.

상기 방식으로 절단될 수 있는 공지된 야생형 UspA1 서열은 균주 ATCC25238(MX2; 진뱅크 승인 번호 AAD43465), P44(AAN84895), O35E(AAB96359), TTA37(AAF40122), O12E(AAF40118), Q46E(AAF36416), V1171(AAD43469), TTA24(AAD43467)의 서열들(실시예 10, 표 II 참조)이다.

이상적으로는, 당해 양태의 UspA1 절단물은 도 6에 제시된 서열중 잔기 463 내지 863, 527 내지 623, 527 내지 668, 527 내지 863, 427 내지 623, 427 내지 668 및 427 내지 863으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 이의 단편, 동족체, 기능성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물 또는 이의 다른 2차 가공 생성물을 포함하거나 이들로 이루어지거나 예를 들어, 도 27에 나타낸 정렬에서 확인된 도 6에 제시된 서열중 잔기 427 내지 623 영역내에서 하나 이상의 보존성 서열;

QHSSDIKTLK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA,

DIAQNQT,

DIQDLAAYNELQD,

QTEAIDALNKASS,

TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK,

NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK,

NQADIANNIKNIYELA,

NQADIANNI 및

NIYELA을 포함하거나 이들로 이루어진다.

본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 리간드 함유 융합 단백질의 제조는 간편할 수 있다. 따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 리간드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게, 당해 양태에 따른 융합 단백질은 이의 전체 길이에 걸쳐 임의의 공지된 전장 서열과 50% 미만으로 동일하다.

상동성 펩타이드는 서열 비교에 의해 동정될 수 있다. 상동성 펩타이드는 본원에 제시된 펩타이드 서열 또는 이의 단편을 우선 상향 순위로 하여 이들의 전체 길이에 걸쳐 바람직하게 60% 이상, 보다 바람직하게, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 동일하다. 바람직하게, 상동성 펩타이드는 CEACAM 수용체에 결합하고/하거나 본원에 제시된 펩타이드 서열 또는 이의 단편에 대한 면역 반응을 유발하는 능력을 보유한다. 바람직하게, 560번 위치 또는 상동성 위치에서의 아미노산은 라이신이다.

도 20은 상이한 기원의 펩타이드 서열 정렬을 보여주고 기능(즉, CEACAM 결합 능력)을 보유하면서 변형될 수 있는 서열 영역을 지적한다.

본 발명자는 펩타이드 리간드의 CEACAM 결합 능력이 편광 이색성(CD) 분광기에 의해 결정된 바와 같이, 무작위 코일 구조와는 반대인 α나선형와 연관되어 있는 것으로 판단하였다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 펩타이드 리간드 또는 수용체 결합 도메인 또는 이의 단편 또는 동족체 또는 이의 기타 유도체는 α-나선형 구조를 갖고 있다. 임의로, 당해 구조는 고리형 코일 구조이다. 바람직하게, CD 분광기는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 수행한다.

추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 제시된 펩타이드 또는 이의 단편과 구조적으로 상동성인 펩타이드를 제공한다. 구조적으로 상동성인 펩타이드는 상기된 바와 같은 상동성 펩타이드이고 도 18에 나타낸 바와 같이 α나선형임을 지적하는 편광 이색성 분광기 흔적을 나타낸다. 본원에 기재된 펩타이드 또는 이의 단편의 미모토프(mimotope)가 또한 고려된다. 미모토프는 D-아미노산 또는 비천연 아미노산 치환을 포함할 수 있지만 여전히 본원에 기재된 펩타이드의 기능적 특성을 보유하고 α-나선형 형태임을 지적하는 CD 흔적을 포함한다.

본 발명자에 의해 밝혀진 α-나선형 형태는 본원에 제시된 펩타이드가 구형 서브유니트 구조를 소유하여 CEACAM 결합에 적당한 형태를 성취하기 위해 막과 연합되지 않음을 지적한다. 따라서, 여전히 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 리간드 또는 수용체 결합 도메인을 포함하는 구형 서브유니트 분자를 제공하고 이는 전장의 UspA1 단백질이 아니고 외막의 존재와는 무관하게 CEACAM 수용체와 결합할 수 있다. 바람직하게, 구형 서브유니트 분자는 200개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 100개 미만의 아미노산을 포함한다.

구조적 및/또는 기능적으로 동등한 수용체 결합 도메인은 다른 UspA 형 단백질에서 또한 생성될 수 있는데, 이는 UspA1 및 UspA2 단백질 모두로부터 유도된 모자이크 에피토프를 함유할 수 있는 Mx에서 하이브리드 단백질이 생성되기 때문이다²³. 이러한 동등한 수용체 결합 도메인을 포함하는 리간드도 또한 본 발명의 범위에 속한다.

펩타이드 리간드의 CEACAM 결합 성질은 이것이 항원(즉, 백신으로) 및 항생제 둘다로서의 용도를 갖고 있음을 의미하고 투여됨에 의해 CEACAM 결합을 차단하여 병원체의 결합 및 진입을 차단한다.

따라서, 리간드 또는 수용체 결합 도메인은 감염의 예방 또는 치료시 사용하기에 적합하다.

본 발명은 또한 이의 동족체, 단편, 다형성체, 축퇴물 및 스플라이스 변이체와 함께, 본 발명의 리간드 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.

본 발명의 리간드 또는 이의 배합물이 백신 또는 감염의 다른 예방적 치료에 사용될 수 있다.

백신 또는 다른 예방적 치료법은 환자의 치료시 사용하기 위한 리간드의 약제학적으로 허용되는 제제를 제공하기 위하여 공지된 보조제, 비히클, 부형제, 결합제, 담체 및 방부제 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 약제에 사용하기 위한 리간드의 약제학적으로 허용되는 제제를 제공한다.

리간드의 약제학적으로 허용되는 제제는 CEACAM 수용체가 연루되는 질환의 치료 또는 예방시, 예를 들면, 감염, 호흡기 질환, 신생물 질환 및 신생물 질환 관련 증상과, 혈관형성의 치료 또는 예방시 사용될 수 있다.

바람직하게는, 감염을 치료하는 경우에, 감염은 점막의 것이거나, 점막을 통해 발생되고, 특히 호흡기 감염이다.

가장 바람직하게는, 리간드는 네이세리아 메닝기티디스, 해모필루스 인플루엔자 및 모락셀라 카타르할리스를 위한 백신으로서 또는 이들의 다른 예방 또는 치료시 사용된다. 이상적으로, 리간드는 중이염을 위한 백신으로서 또는 이의 다른 예방 또는 치료시 사용된다.

다른 측면으로, 본 발명의 리간드는 또한 일반적으로 몇몇 점막 병원체에 대해 공격받기 쉬운 그룹 및 공중을 보호하기 위하여 치료학적 제제로서 사용하기 위한 신규 차단 시약을 동정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 리간드는 이를 위해 유용한 수용체 동족체를 확인하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 치료학적 제제로서 사용하기 위한 신규 차단 시약의 동정을 위한 스크리닝 검정법을 제공하며, 이 검정법은 본 발명의 리간드에 대한 이들의 모의 능력 또는 이들의 상동성에 대해 잠재적인 치료학적 제제를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 언급한 스크리닝 검정법에 의해 동정되는 치료학적 제제를 제공한다.

효과적인 백신 성분은 생물학적으로 활성인 펩타이드 모사체와 같은 본 발명에 의해 동정되는 수용체 표적화 메카니즘의 정보를 사용하여 제조할 수 있다. 이들은 차단, 옵소닌 작용 및 살균 작용을 하는 항체를 유도할 뿐만 아니라, 점막의 세균성 군집화/침입을 방지할 수 있다.

본 발명의 리간드에 의해 동정되는 세균 유도된 생물학적 활성 펩타이드 서열은 암에서 CEACAM의 역할을 연구하는데 사용될 수 있고, 분자로서의 개발은 이들 과정과 관련이 있다. 이들은 또한 항암제로서 및 혈관형성을 억제하거나 달리 이의 치료 잠재력을 갖는다.

본 발명의 펩타이드 리간드의 형태에 관하여 본 발명자에 의해 만들어진 정보는 예를 들어, 플라스틱으로부터 합성 나노 구조를 디자인하기 위해 사용될 수 있다. 당해 구조는 생물학적 분해에 내성이고 비면역원성이라는 장점을 갖는다. 이와 같이, 이것은 특히, CEACAM 수용체를 차단함에 의해 병원체의 결합 및 진입을 차단하는 작용을 하는 '항생제'로서 유용하다.

다른 양태에 있어서, 본 발명은 CEACAM 수용체가 질환을 유발하는 병원체의 세포성 표적화에 관여하는 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조시 CEACAM 수용체-결합 리간드의 용도를 제공하며, 이때 리간드는 도 6에 제시된 서열의 잔기 463 내지 863, 527 내지 623, 527 내지 668, 527 내지 863, 427 내지 623, 427 내지 668 및 427 내지 863으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 동족체, 기능성 등가물, 유도체, 축퇴물 또는 하이드록실화, 설폰화 또는 글리코실화 생성물이나, 다른 2차 가공 생성물을 포함한다.

본 발명의 당해 측면에서의 용도에 적합한 기타 리간드는 예를 들어, 도 27에 나타낸 정렬에서 확인된 도 6에 나타낸 서열의 잔기 427 내지 623 영역내에서 하나 이상의 보존성 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 폴리펩타이드이다:

QHSSDIKTLK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA,

DIAQNQT,

DIQDLAAYNELQD,

QTEAIDALNKASS,

TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK,

NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK,

NQADIANNIKNIYELA,

NQADIANNI 및

NIYELA.

바람직하게는, 질환은 감염, 호흡기 질환, 신생물 질환 및 신생물 질환과 관련된 증상과, 혈관형성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

상기 기술한 바와 같은 약제는 특히, 병원체가 점막을 감염시키거나, 이를 통해 도입되는 경우에 유용성이 있다.

본 명세서에 기술된 바와 같은 약제는 특히, 모락셀라 카타르할리스에 의해 유발되는 감염(질환)의 치료 또는 예방에 유용하다. 그러나, 본 명세서에 기술된 바와 같은 리간드는 CEACAM 수용체가 관여되는 질환, 예를 들면, 네이세리아 메닝기티디스 및 해모필루스 인플루엔자에 의해 유발되는 질환 치료용 약제의 제조시 유용하다.

특히 바람직한 양태로, 질환은 중이염이다.

본 발명의 리간드는 또한 다른 구강 세균에 의해 유발되는 질환, 예를 들면, 충치의 치료시 사용될 수 있다.

구강 세균 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)은 잇몸 질환과 연관되어 있지만 또한 중이염, 여전히 출산과 관련이 있고 드문 경우에는 균혈증과 관련이 있다. 발명자에 의한 최근 연구는 푸코박테리움 뉴클레아툼의 여러 분리주가 CEACAM과 결합하고 CEACAM1의 에프. 뉴클레아툼으로의 결합이 본원에 제시된 폴리펩타이드 리간드에 의해 억제될 수 있음을 보여주었고 이는 본 발명의 리간드 또는 수용체 결합 도메인이 당해 병원체에 의해 발병되는 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음을 시사한다.

본 발명에 따라 바람직한 폴리펩타이드 리간드인 D-7이, 비캡슐화(나타내지 않음)되거나 캡슐화된 세균과 HeLa-CC1H(실시예 7)의 상호작용을 차단하고 다중 CEACAM으로의 결합을 차단하는 능력 및 다수의 점막 감염 종에 대한 이의 효능때문에 상당한 잠재력을 갖는 항미생물 제제이다. 추가로, Mx 접착을 차단하는 항체 반응을 유발하는 이의 능력(실시예 8)은 Mx가 흔히 연루된 중이염 또는 폐 감염을 예방하기 위한 백신 후보물 또는 이의 단독 또는 다중성분 백신(이하의 Mx 항원과 함께: UspA2, Hag/MID, OMPCD, Mcap)의 일부로서의 이의 잠재력을 시사한다[문헌 5번 참조]. 어드헤신(Adhesin) 계열의 백신은 예를 들어, 전신성 백신 접종에 의한 마우스 방광염 모델에서 방광 병원체성 에스케리치아 콜리에 대해 성공적으로 사용되었다[문헌 29번 참조].

본 발명에 따른 리간드의 예방 약물로서의 혼입은 특히 치명적이거나 항생제 내성인 균주를 획득할 위험성이 높은 다양한 상황에서 고려될 수 있고 직접 국소 적용에 의해 또는 프로바이오틱을 통해 전달될 수 있다. 탄수화물-렉틴 상호작용을 통한 표적 조직으로 부착하는 세균의 경우에, 가용성 탄수화물은 시험관내 및 동물 모델에서 감염을 성공적으로 예방하였다[문헌 30번, 31번, 32번 참조]. 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 단백질 SAI/II의 영역에 상응하는 합성 펩타이드의 국소 적용은 사람 대상체에서 에스. 뮤탄스에 의한 결합을 억제하는 것으로 나타났다. 당해 연구는 2주동안 하루에 1mg.ml^-1로 구강 세척하는데 펩타이드를 사용하였고 이것은 군집 형성을 예방하기에 충분하였다[문헌 33번 참조]. 락토바실리 형태의 프로바이오틱스는 많은 감염을 예방하기 위해 사용되었다[문헌 34번, 35번 참조]. 추가로, 재조합 이. 콜리 균주는 LPS 유전자가 쉬가(Shiga) 독소 수용체의 구조적 모사체를 암호화도록 변형된 프로바이오틱으로서 사용되었다. 당해 균주의 경구 투여는 쉬가 독소 생성 이. 콜리를 사용한 치사 투여량으로부터 마우스의 사망을 차단하는 것으로 나타났다[문헌 36번 참조]. 국소적으로 적용된 차단 펩타이드는 전이 프로바이오틱스의 사용 또는 발현 시기 또는 수준을 위해 조절될 수 있는 발현 벡터를 사용하는 경우 전달될 수 있다. 따라서, 항미생물 제제에 대한 노출 시간은 조절될 수 있다[문헌 37번, 38번 참조].

수용체의 결합 도메인을 표적화함에 의한 차단은 세균 접착과 유사하고 고유 공생 세균 리간드의 결합의 유해 효과 이상의 유해 효과를 나타내지 않는다. 또한, 당해 특이적 전략은 기타 공생 미생물군에 대해 내성을 갖도록 하여 당해 미생물군은 CEACAM과 거의 결합하지 못한다[문헌 7번, 10번, 38번 참조]. 더욱이, 펩타이드 주요 형태의 단량체성 및 1가 특성은 CEACAM에 대해 수용체 클러스터링시 유도되는 것으로 나타나는 바람직하지 못한 시그날 전달을 유발할 가능성이 적다[문헌 11번, 39번 참조].

생체내 수명 뿐만 아니라 결합을 보장하면서 이의 크기를 감소시키기 위한 CEACAM 상호작용 및 변형에 관여하는데 중요한 아미노산을 추가로 동정함에 의한 D-7의 개선책은 본 발명의 범위내에 속할 수 있다. 당해 변형은 비천연 또는 D-아미노산의 혼입을 포함할 수 있다[문헌 33번 참조]. 당해 항-접착/항-침투 치료에 대한 내성은 세균 리간드내 임의의 변화가 이들 자체의 기능(이 경우, 군집 형성/감염) 상실을 유발하기 때문에 일어날 가능성이 없다. 펩타이드 경쟁으로 인해 수용체 특이성이 완전히 변형된 돌연변이의 출현은 수용체에 대한 경쟁이 천연에서 병원체간에 발생할 가능성이 있기때문에 통상적인 것 보다 흔하게 발생할 것으로 예상되지 않는다. 따라서, D-7은 몇몇 병원체에 대한 항-접착 제제로서 및 백신 후보물로서 작용할 잠재력을 갖는다.

본 발명의 양태는 이제 하기의 도면을 참조로 비제한적 예에 의해 전적으로 기술할 것이다.

도 1은 니트로셀룰로스 상에 고정화된 3개의 균주에 대한 CEACAM1-Fc(1 ㎍·㎖^-1) 가용성 수용체 작제물 단독(백색, 좌측 바아) 또는 CEACAM1 N-도메인 특이적 항체 YTH71.3(회색, 중심 바아)의 존재하에 상대적인 결합 수준을 도시한 그래프이다. 각 경우에 CD33-Fc 결합은 무시할 만 하다(흑색, 우측 바아). 균주 1, 2, 3은 각각 MX2(ATCC 25238), MX3, MX4(임상적 분리물)이다. 결합은 도트 블롯 오버레이(dot blot overlay) 법으로 측정하고, 반응의 세기는 NIH Scion 이미지 프로그램을 사용하는 밀도측정 분석법에 의해 정량화한다.

도 2는 비해리하에(비가열, 레인 1) 또는 10분 동안 가열한 후에(레인 2) 분리된 균주 MX2 단백질의 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. 블롯은 CEACAM1-Fc(㎍·㎖^-1) 및 고추냉이 퍼옥시다제 및 이의 기질에 접합된 항-사람 Fc 항체에 의해 검출되는 수용체 결합과 겹친다.

도 3은 균주 MX2, MX3, MX4(각각 레인 1 내지 3)의 변성 전세포 용해물의 웨스턴 블롯이 CEACAM1-Fc(㎍·㎖^-1; a), 항-UspA1 펩타이드 항체(10 ㎍·㎖^-1; b) 및 항-UspA2 펩타이드 항체(10 ㎍·㎖^-1; c)와 겹침을 나타내고 있다. 세 균주에서 CEACAM1-Fc 결합 단백질 및 항-UspA1 결합 단백질의 유사한 이동 프로필을 주시한다. 약 250 kDa에서 해리되지 않은 단백질의 잔여물(이 경우에, 알칼리성 포스파타제 검정시 보다 높은 검출 감수성으로 인하여 감지됨)은 CEACAM1-Fc에 결합된다. 이들은 항-펩타이드 항체에 의해 단지 약하게 인식되는데, 이는 아마도 합성 펩타이드내에 함유된 에피토프가 천연 단백질에 완전히 노출되지 않고, 점진적으로 복합 축퇴물로서 노출되기 때문이다. 항-UspA2 항체는 겉보기 질량이 200 kDa 보다 큰 단백질에 결합되고, 이는 가열후에 해리되지 않고 잔류하며, 이는 UspA2 단백질임을 지적한다.

도 4는 MX2의 CEACAM1 결합 단백질의 트립신 분해 펩타이드의 질량 스펙트럼에 이은, 전기-용출(4a)을 나타낸 것이다. 완전한 단백질 동정 데이타베이스로 데이타 입력한 요약이 (4b)에 제시되어 있다. 상위 10개의 동정된 단백질의 테이블 및 확률값이 (4c)에 제시되어 있다. 제1 등급의 후보물인, 이 경우에 Z-스코어가 2.34인 UspA1의 상세한 설명이 매치되는 펩타이드 번호, 단백질내에 이들의 위치, 커버된 단백질의 % 및 이 경우에 매치되지 않은 펩타이드 리스트를 제시하면서 (4d)에 제시되어 있다.

도 5는 MX2의 UspA1의 트립신 분해 단편의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다. A: 2차 항체(B 및 C에 사용되는 염소 항-사람 Fc 및 염소 항-래빗 Ig의 혼합물)를 사용하는 대조군 블롯. B: CEACAM1-Fc 및 염소 항-사람 Fc와 겹쳐진 블롯. C: UspA1 펩타이드(ETNNHQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR(서열번호 1))(참조 도 6) 및 항-래빗 Ig에 대해 상승된 친화성 정제된 래빗 항체와 겹쳐지는 블롯. * = 분자량 마커가 있는 레인 - 좌측에 제시됨. 이중 화살표로 제시된 펩타이드는 항-UspA1 펩타이드 항체(C) 뿐만 아니라, CEACAM1-Fc(B)와 강하게 반응한다. 최저 MW 펩타이드(화살표)에 대한 항-UspA1 펩타이드 항체의 결합은 이러한 CEACAM-결합 단편을 MX2의 UspA1의 N-199 내지 K-863내에 함유된 C-말단 단편으로서 동정한다(참조: 도 6).

도 6은 MX2 UspA1 단백질의 아미노산 서열(서열번호 2)을 나타낸 것이다. 래빗에서 항혈청을 상승시키는데 사용되는 UspA1-특이적 펩타이드는 굵게 나타내었다. CEACAM-결합 영역은 MX2의 UspA1의 밑줄친 C-말단 단편에 함유된다.

도 7은 CEACAM과 반응하는 트립신 분해 펩타이드의 분리를 나타낸 것이다. 엠. 카타르할리스 균주 MX2는 37 ℃에서 10분 동안 1 ㎎/㎖의 트립신으로 처리한다. 트립신 분해된 샘플은 SDS-PAGE에 적용시킨다. 염색후, 50 kDa 영역은 밤새 전기용출시킨다. 전기용출된 단백질은 동결건조시키고, 완충액에 재현탁시켜, 2차 겔에 적용시킨다. 겔 부분은 니트로셀룰로스 상에 블롯팅시키고, CEACAM과 반응하는 펩타이드 밴드는 CEACAM1-Fc(블롯)를 사용하여 웨스턴 블롯 오버레이로 동정한다.

[*]: N-말단 서열분석을 위해 보내진 펩타이드 밴드를 나타낸다.

도 8은 MX2 UspA1 단백질의 트립신 분해 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 3)을 나타낸 것이다. 제시된 50 kDa 트립신 분해 펩타이드(아미노산 463 내지 863번)는 CEACAM 및 UspA1 펩타이드(밑줄친 아미노산 753 내지 780번)에 대한 항혈청에 결합된다. 약 50 kDa CEACAM 결합 펩타이드의 N-말단 서열은 아미노산 462번의 트립신 절단 부위 이후에 생성되는 "ALESNVEEGL(서열번호 4)"이다.

도 9는 재조합 펩타이드의 발현을 위한 uspA1 유전자 단편을 생성하는데 사용되는 프라이머의 위치를 도식적으로 나타낸 것이다. CEACAM1 결합 부위는 프라이머 P4 및 P7에 의한 DNA 증폭에 의해 암호화되고, 이 영역(문자 A-l)을 통한 부가의 프라이머를 고안하여 사용한다.

도 10은 재조합 단편 4-7의 서열(서열번호 5)을 나타낸 것이다. 밑줄친 영역은 CEACAM1-반응성 트립신 분해 펩타이드의 N-말단 영역이다. 단편 4-7의 예상되는 분자량은 약 26 kDa이다. His-태그된 단편의 예상 MW: 약 28 kDa. 절단된 펩타이드의 위치는 'T'로 나타낸다(참조: 도 13).

도 11은 pQE30 시스템으로 예시되는 바와 같이, 재조합 UspA1 펩타이드에 대한 일반적인 클로닝, 발현 및 정제 계획을 나타내는 다이아그램이다.

도 12는 벡터 pQE30의 지도이다.

도 13은 재조합 4-8(레인 3), 4-T(레인 4) 및 4-7(레인 5) 폴리펩타이드에 대한 블롯 오버레이인 CEACAM1-Fc의 결합을 나타낸 것이다. 레인 1은 트레포네마 대조군 재조합 펩타이드를 함유하고, 레인 2는 4-8 작제물을 함유하는 비-유도된 M15의 용해물을 함유한다.

도 14는 항-His 태그 항체(상부) 및 CEACAM1-Fc(기저)와의 재조합 펩타이드 반응성을 나타내는 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 레인 2-4는 6 내지 8개의 펩타이드를 함유하고, 레인 1은 대조군으로서 4-8을 함유한다. 펩타이드의 예상되는 이동 위치가 우측에 제시되어 있다. 두 펩타이드는 모두 항-His 항체에 결합된다. 그러나, 4-8이 CEACAM1-Fc에 결합되는 반면에, 6-8은 결합되지 않는다.

도 15는 D-8 폴리펩타이드가 CEACAM1-Fc에 결합되지만(레인 1), 대조군으로서 사용되는 CD33-Fc에는 결합되지 않음(레인 2)을 나타내고 있다. 펩타이드의 기원은 항-His 태그 항체(레인 3)와의 반응성에 의해 확인한다.

도 16은 rUspA1 단편의 상대적 크기 및 위치를 나타내는 도식적 다이아그램이다. 재조합체 4-7은 세균성 차단을 위해 사용되었다 - 참조 도 17.

도 17은 CHO-CEACAM1 형질 감염체를 펩타이드의 부재하에(A), 또는 제시된 농도의 재조합 대조군 펩타이드(트레포네마 펩타이드, B)나 UspA1 r4-7 펩타이드(균주 MX2에 상응하는 서열, C 및 D) 및 부가된 세균의 존재하에 2시간 동안 배양함을 제시하고 있다. 이 배양이 끝날 무렵, 결합되지 않은 세균은 세척하고, 결합된 세균은 항-엠. 카타르할리스 폴리클로날 항혈청 및 TRITC 접합된 2차 항체에 의해 검출한다. 1 ㎍/㎖에서 이종성 엠. 카타르할리스 균주(MX1)의 상당한 억제가 수득되며, 10 ㎍/㎖에서는, 에이치. 인플루엔자 결합이 엠. 카타르할리스 UspA1 재조합 펩타이드에 의해 상당히 억제된다.

도 18은 K 560 I 의 돌연변이를 갖는 재조합 D-7 펩타이드의 편광 이색성 스펙트럼을 보여주는 그래프이다. 당해 스펙트럼은 D-7이 α나선형 구조를 갖는 반면 D-7(K 560 I)은 무작위 코일 형태를 나타냄을 지적한다.

도 19는 CEACAM1과 결합하지 않는 D-T 영역에 걸쳐있는 일련의 선형 펩타이드를 보여준다. D-7의 K560에 상응하는 K 잔기는 밑줄로 나타낸다.

도 20은 10개의 Mx 균주인 TTA24, TTA37, p44, O12E, O35E, O46E, MX2, V1171, MX3 및 MX4의 UspA1 단백질의 아미노산 서열의 D-7 영역을 정렬한 것이다. 상부 라인은 주요 서열을 나타낸다.

도 21은 O35E D-7 대 MX2 D-7의 수동 정렬이다. 상부 라인은 주요 서열을 나타낸다.

도 22는 MegAlign^TM(DNASTAR Inc.)에 의해 결정된 바와 같이 Mx 분리주의 D-7 영역의 서열 동일성을 나타내는 표이다.

도 23은 재조합 펩타이드 D-7(재조합 6-8이 아닌, 즉, MX2의 UspA1의 E659-K863 잔기)이 동종성 및 이종성 균주 둘다가 CEACAM1 을 발현하는 형질감염된 CHO 세포에 결합하는 것을 억제함을 보여준다. 펩타이드 부재(칼럼 1), 대조군 펩타이드(2ug.ml^-1; 칼럼 2) 또는 D-7(2ug.ml^-1; 칼럼 3) 세균을 사용한 세포의 예비 항온처리 후, 세균을 첨가하고 1시간 후 비접착 세균을 세척함에 의해 제거하였다. 이어서 명백한 특성을 갖는 균주에 대해 생성된 항혈청 및 로다민 접합 2차 항체를 사용하여 세포와 연합된 세균을 검출하였다. Mx: 모락셀라 카타르할리스, Nm. 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis); Hi: 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae).

도 24는 D-7에 의한 세균성-CC1-Fc 상호작용의 억제를 나타내는 일련의 챠트이다. (a) 동종성 Mx 균주 MX2(회색 칼럼)에 결합하고 이종성 균주 MX1(검정 칼럼)에 결합하는 수용체의 용량 의존적 억제를 펩타이드 농도 범위 0.001 내지 0.1ug.ml^-1에 대해 나타내었다. C는 대조군 펩타이드 D-8△을 나타낸다. 단독의 CC-1-Fc와 비교되는 평균값(n =3, ^*P<0.015)을 나타낸다. (b) D-8△(회색 칼럼)가 아닌 재조합 D-7(검정 칼럼)이 동종성 및 이종성 종(각각의 그래프에 나타낸 바와 같음) 둘다의 다수의 균주의 CC1-Fc로의 결합을 억제한다. 상이한 속으로부터의 명백한 분리주의 전체 세포 용해물은 니트로셀룰로스상으로 점재(dot)시키고 단독의 CC1-Fc의 존재 또는 펩타이드의 존재(각각 2ug.ml^-1)하에 오버레이하였다. 부재시와 비교하여 펩타이드 존재하의 억제 % 값은 NIH 시온(Scion) 이미지 소프트웨어를 사용한 밀도측정 분석으로 수득하였다. 데이타는 2개 내지 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.

도 25는 D-7이 특정 범주의 CEACAM 발현 세포주에 세균이 결합하는 것을 억제함을 보여준다. (a) 지적된 바와 같은 펩타이드의 존재(2ug.ml^-1) 또는 부재하에 세포의 예비 항온처리 후 CEACAM1을 발현하는 형질감염된 CHO 세포와의 세균 상호작용에 대한 면역형광 분석. 로다민 표지에 의해 가시화된 세균의 접착 억제는 D-7의 존재하에 관찰된다. (b) 생존 계수 분석을 사용한 CHO-CEACAM1 세포로의 세균 결합 억제에 대한 정량적 분석. 표적 단층을, 나타낸 바와 같은 대조군 펩타이드(2ug.ml^-1;c) 또는 특정 범위의 D-7과 예비 항온처리하였다. 대조군 펩타이드와 비교하여 D-7의 % 억제의 평균값을 나타낸다(n=3-6, ^*P < 0.05). a 및 b에 사용된 균주는 다음과 같다: Mx(Mx1), Nm(C751D), Hi(THi, Rd) 및 Hi-aeg(A3). (c) D-7에 의한 명백한 CEACAM에 대한 Nm(C751D) 결합 억제. CEACAM1(CC1), CEA 또는 CEACAM6(CC6)을 발현하는 HeLa 세포는 펩타이드 부재, 대조군 펩타이드(2ug.ml^-1, 회색 칼럼) 또는 D-7(2ug.ml^-1; 검정 칼럼)와 예비 항온처리하였다. 세포당 접착된 Nm의 평균 수는 면역형광 분석을 사용하고 각각의 경우 직접 20개의 세포를 계수하여 수득하였다. (d) 선모 및 Opa 단백질을 통해 접착을 지지하는 CEACAM1-발현 수준이 높은 HeLa 세포주(HeLa-CC1H)를 Opa 및 Opc 어드헤신(adhesin)을 발현하는 균주 MC58의 캡슐화되고 선모화된 변이체 h18.18로 감염시켰다. 세포 접착은 지적된 바와 같이 d-8△이 아닌 D-7의 첨가 전(pre) 또는 첨가와 동시(sim)에 감소하였다. (e) 펩타이드 부재, 대조군 펩타이드(2ug.ml^-1) 또는 D-7(2ug.ml^-1)과의 세포의 예비 항온처리 후 CEACAM을 발현하는 것으로 공지된 A549 폐 상피 세포와 세균 작용의 억제. 사용된 균주는 Mx(Mx1), Nm(C751D) 및 Hi(Hi-aeg, A3)이었다.

도 26은 D-7에 대해 생성된 친화성 정제된 래빗 항체가 동종성 및 이종성 Mx가 CEACaM1-Fc(CC1-Fc)에 결합하는 것을 억제함을 보여주는 챠트이다. 도트-블롯 오버레이 실험에서, 항체 부재 대조군과 비교되는 결합은 NIH 시온 이미지 소프트웨어를 사용한 밀도측정 분석에 의해 측정하였다. 시험된 Mx 균주에 대해 양호한 억제한 관찰되지만 Hi(THi Rd & Hi-aeg A3), Nm(C751A & C751D) 및 Ng(P9-13)을 포함하는 시험된 기타 세균 종에 대해서는 관찰되지 않는다. 데이타는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.

도 27은 엔. 메닝기티디스(N. meningitidis)가 단독으로, 또는 대조군 펩타이드(B) 또는 차단 펩타이드 D-7(C)의 존재하에 HMEC1 세포로 접착됨을 보여준다. D-7의 존재하에 실질적으로 억제가 완전함을 주지한다.

도 28은 MX2 서열의 단편 4-T에 상응하는 공지된 UspA1 단백질 서열의 단편의 다중 정렬이다. 분석된 모든 서열에 보존된 잔기는 암색으로 나타낸다. 잔기들이 존재하는 경우 모든 서열에서 보존되지만 하나 이상의 서열에서 상응하는 위치가 결실된 잔기들은 암갈색으로 나타낸다. 당해 위치에 존재하는 잔기가 변형된 경우, 보존성 잔기는 담갈색으로 나타낸다.

실시예 1. 모락셀라 카타르할리스( Moraxella catarrhalis ) 균주는 UspA1 단백질을 통해 사람의 CEACAM1-Fc에 결합한다

이 연구에 사용되는 모락셀라 카타르할리스(Mx) 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에서 입수한 표준 균주(ATCC 25238, 이것의 클론 배양은 MX2로 표시함) 뿐만 아니라, 임상적 분리물(MX3 및 MX4)을 포함한다.

수용체 오버레이 검정법은 Mx가 CEACAM1-Fc 수용체 작제물에 결합되는 것을 나타낸다

엠. 카타르할리스 균주와 CEACAM1과의 상호작용을 평가하기 위하여, 세균(약 4-8 x 10⁶)을 니트로셀룰로스에 적용시키고, 공기 건조시켜, 비특이적 결합 부위를 3% BSA-PBST로 차단한다. 니트로셀룰로스 스트립은 CEACAM1-Fc(1 내지 2 ㎍·㎖^-1) 단독 또는 CEACAM1 N-도메인 항체 YTH71.3의 존재하에 겹쳐진다. CD33-Fc(1 내지 2 ㎍·㎖^-1)는 네가티브 대조군으로서 사용된다. 키메라 단백질 작제물은 앞서 기술한 바와 같이 제조한다¹¹. 키메라성 수용체 결합은 고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소 항-사람 Fc 항체에 의해 검출한다. 블롯은 디아미노 벤지덴 및 과산화수소나 니트로블루 테트라졸륨 및 5-브로모-4-클로로-3-인도일포스페이트 기질에 의해 각각 전개시킨다. 모든 Mx 균주는 CEACAM1-Fc에 결합되지만, CD33-Fc에는 결합되지 않는다(도 1). 수용체 결합은 모노클로날 항체 YTH71.3의 존재하에 억제됨으로써, 수용체의 N-말단 도메인에 균주가 결합됨을 제시하고 있다. 따라서, 모든 균주는 단지 N 도메인만을 함유하는(도시되지 않음) CEACAM1의 절단된 N-Fc 작제물에 동일하게 잘 결합된다.

엠. 카타르할리스의 CEACAM1-Fc 결합 단백질의 동정

Mx의 전세포 용해물(약 3 x 10⁷)은 미리 가열 처리없이, 또는 100 ℃에서 10 분 동안 가열한 후에 10% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔(인비트로겐)의 개개 레인에 적용시키고, 180 V에서 45분 동안 전기영동시킨다. 겔로부터의 단백질을 표준 블롯팅 조건을 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨다. 니트로셀룰로스 막은 상기 기술한 바와 같이 가용성의 키메라성 작제물과 겹쳐진다. 각 경우에, CEACAM1-Fc에 특이적으로 결합되는 단일 단백질이 관찰된다. 겔 상의 단백질의 이동은 Mx의 UspA1 단백질임을 지적하고, 이는 세균 용해물을 열변성없이 적용하는 경우에, CEACAM1 결합 단백질은 겉보기 질량이 200 kDa 보다 크게 이동되는 반면, 용해물을 먼저 가열하면, CEACAM1-결합 단백질은 대략 92 kDa의 감소된 질량으로 이동되기 때문이다(도 2).

UspA1에 대해 유도되고, 유사 단백질인 UspA2에 대해서는 유도되지 않은 항체는 Mx 균주의 CEACAM1-Fc 결합 단백질에 결합된다.

펩타이드는 엠. 카타르할리스 균주의 UspA 단백질에 대해 공개된 서열에 따라 고안한다. 즉, ETNNRQKDKIDQLGYALKEQGQHFNNR(서열번호 1; UspA1-펩타이드) 및 KDEHDKLITANKTAIDANKAS(서열번호 6; UspA2-펩타이드). 펩타이드는 혼입된 N-말단 시스테인 잔기를 통해 KLH에 결합되고, 14일 간격으로, 먼저 완전한 프로인트 보조제와 함께, 그 이후에는 불완전 프로인트 보조제와 함께 래빗을 면역화하기 위하여 사용한다(래빗당 200 ㎍의 펩타이드). 래빗은 0일째 및 면역화후 14일 간격으로 채혈한다. 폴리클로날 항체는 아미노링크 플러스 칼럼(AminoLink Plus columns)(Pierce)에 결합된 적절한 펩타이드를 사용하여 정제한다. UspA-특이적 항체는 웨스턴 블롯 오버레이 법에서 1 내지 10 ㎍·㎖^-1의 농도로 사용되며, 알칼리성 포스파타제에 결합된 염소 항-래빗 2차 항체에 의해 검출된다. 블롯은 앞서 기술한 바와 같이 전개시킨다. 세 개의 Mx 균주의 SDS-PAGE 상의 CEACAM1-Fc 결합 단백질의 이동은 UspA1-항체 결합 단백질의 것과 동일하지만, UspA2-항체 결합 단백질의 것과는 동일하지 않다(도 3).

CEACAM1-Fc와 함께 공침전되는 엠. 카타르할리스 리간드는 UspA1로서 동정된다

세균의 밤새 배양물은 프로테아제 억제제 칵테일(pic: PMSF 1 mM, E-64 1 μM, 펩스타틴 A 1 μM, 베스타틴 6 nM 및 EDTA 100 μM)을 함유하는 PBSB중 100 mM 옥틸 βD 글루코피라노시드에 현탁시킨다. 샘플을 철저히 혼합하고, 4 ℃에서 밤새 방치시킨다. 한편, 세파로즈 CL-4B(Sigma)에 결합된 100 ㎕ 단백질 A는 20 ㎍의 CEACAM1-Fc 또는 CD33-Fc(대조군으로 사용됨)에서 4 ℃에서 밤새 배양하고, 이어서 PBSB로 3회 세척하여 결합되지 않은 수용체를 제거한다. 불용성의 세균성 물질은 15,000 g로 30분 동안 원심분리하여 제거한다. 가용성 추출물은 수용체-단백질 A 세파로즈 복합체와 함께 4 ℃에서 2시간 동안 배양한다(수용체 작제물 ㎍ 당 세균 5 x 10⁸의 비율로). 50 mM 옥틸 βD 글루코피라노시드로 광범위하게 세척한 다음, PBSB 샘플은 SDS-PAGE 전기영동법 및 변성 조건하에 웨스턴 블롯팅 법으로 분석한다.

CEACAM1-Fc와의 공침전 실험에서, MX4는 약 97 kDa의 강하게 염색된 단백질을 수득하고, MX3은 약 92 kD의 비교적 약하게 염색된 단백질을 수득한다. 공침전 단백질의 질량은 수용체 오버레이 실험에서 관찰된 것에 상응한다(도 3에 제시됨). 어떠한 단백질도 CD33-Fc와는 공침전하지 않는다. 공침전 단백질은 또한 UspA1 단백질로서 동정되는데, 이는 이들이 항-UspA1 펩타이드 항체에 결합되기 때문이다. 또한, 겔로부터 절제한 다음, MX4 단백질은 MALDI-TOF 질량 분석법에 적용시킨다(하기 참조).

MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 CEACAM1 리간드 동정

(a) 웨스턴 오버레이 샘플. MX2 및 MX3의 전세포 용해물은 트렌치 겔중 SDS-PAGE에 적용시키고, CEACAM1-Fc 결합 리간드에 상응하는 단백질 밴드는 겔로부터 전기 용출시킨다. 샘플을 농축시키고, 2차 겔의 단일 레인에 다시 적용시켜, 적절한 단백질의 겔 내 트립신 분해 전에 전기영동시킨다. 생성된 펩타이드는 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-이동 시보(Matrix-assisted Laser desorption/ionisation-time-of-flight; MALDI-TOF) 질량 분석법에 의해 분석한다. 생성된 질량 스펙트럼의 예가 MX2의 CEACAM 결합 단백질에 대해 제시되어 있다(도 4a). 수득된 펩타이드 매스는 완전한 단백질 동정 부위로 도입시키고, 이 단백질에 대해 제시된 바와 같은 결과를 수득한다(도 4b, c). 이 경우에, 10개의 펩타이드 매스가 단백질의 대략 18%를 차지하는 엠. 카타르할리스의 UspA1의 트립신 분해 펩타이드에 대해 예상되는 질량과 일치한다(도 4d). 예상치가 2.34인 Z 스코어는 단백질이 UspA1이라는 것을 강하게 예시한다(Z 스코어 > 1.65는 95번째 백분위수 이상이다; http:/129.85.19.192/profound_bin/webProFound.exe.). 또한, 다른 결합되지 않은 MX2의 고분자량 밴드는 유사한 분석에 따라 UspA2로서 동정된다. 균주 MX3에 대해서도 유사하게, CEACAM1 결합 및 비결합 단백질은 UspA1 및 UspA2로서 각각 동정된다.

(b) 공침전 샘플: MX4의 경우, CEACAM1-Fc 공침전 단백질(상기 기술한 바와 같음)은 또한 모든 분류 연구에서 MALDI-TOF MS에 의해 Z 스코어가 2.27인 UspA1로서 동정된다. 단백질의 21%를 차지하는 12개의 펩타이드가 일치한다.

따라서, 이 연구는 모락셀라 카타르할리스가 제시된 표준 및 임상적 균주에서 고분자량 단백질 UspA1을 통해 사람의 CEACAM1을 표적으로 함을 확인하였다.

UspA1 및 재조합 펩타이드의 효소적 분해

(a) UspA1의 트립신 분해 펩타이드는 CEACAM1-Fc에 결합한다

MX2 세균성 현탁액(10¹⁰ ㎖^-1)은 0.1 내지 1 ㎎/㎖의 농도인 트립신(Sigma)으로 처리하고, 37 ℃에서 1 내지 4시간 동안 배양한다. 분해된 용해물은 SDS-PAGE 완충액에서 해리시키고, 비등하여, 전기영동시킨다. 니트로셀룰로스로 옮긴 후에, 블롯은 수용체 작제물 CEACAM1-Fc 또는 친화성 정제된 항-UspA1 펩타이드 항체와 겹쳐진다. 수용체와 반응하는 작은 단편은 또한 항-UspA1-특이적 항체에 결합된다(도 5).

(b) 엠. 카타르할리스 균주 MX2의 UspA2의 CEACAM 결합 도메인의 위치 결정

MX2 세균성 현탁액은 37 ℃에서 10분 동안 1 ㎎/㎖의 트립신으로 처리한다.

트립신 분해 샘플은 SDS-PAGE 겔에서 수행한다. 염색후, 50 kDa 영역은 밤새 전기용출시킨다. 전기용출된 단백질은 동결건조시키고, 완충액에 재현탁시켜, 2차 겔에 적용시킨다. 겔 부분은 니트로셀룰로스 상에 블롯팅시키고, CEACAM과 반응하는 펩타이드 밴드는 CEACAM1-Fc를 사용하여 웨스턴 블롯팅 오버레이 법으로 동정한다(도 7).

펩타이드 밴드는 약 50 kDa에 상응하고, 약 150 kDa 펩타이드는 N-말단 서열분석한다. N-말단 서열은 ALESNVEEGL(서열번호 4)(약 50 kDa 펩타이드) 및 ALESNV(서열번호 7)(약 150 kDa 펩타이드)이다. 150 kDa 단백질은 이들이 동일한 N-말단 서열을 가지므로 확실히 50 kDa 단백질의 삼량체이다. 이러한 MX2 UspA1의 펩타이드의 N-말단 서열은 도 8에 제시되어 있다.

(c) 재조합 펩타이드

도 6에 제시된 서열중 아미노산 1 내지 449번으로 이루어진 작제된 N-말단 재조합 MX2 펩타이드는 CEACAM에 결합되지 않는다. 이는 또한 도 8에 제시된 서열의 아미노산 463 내지 863번으로 이루어지고, N-말단 서열 ALESNVEEGL(서열번호 4)을 갖는 약 50 kDa의 트립신 분해 펩타이드가 CEACAM-결합 도메인을 함유한다고 제시한다.

실시예 2. 점막성 병원체의 다중 독성 결정 인자에 대한 수용체 결합 도메인의 동정

엔. 메닝기티디스 및 에이치. 인플루엔자는 CEACAM 상의 중복 부위에 결합하는 리간드를 통해 사람의 CEACAM 분자를 표적으로 한다. 본 발명의 Mx 리간드는 또한 N 도메인을 표적으로 한다. 이들 관찰은 몇몇 점막성 병원체의 리간드에 대한 유사한 특성이 수용체 표적화에 관여될 수 있다는 흥미로운 가능성을 지적하였다.

CEACAM과 Nm 및 Hi의 상호작용은 표면 발현된 변이적 도메인의 구조적 특징에 의해 영향을 받으므로, 이는 이들이 수용체에 결합될 수 있는 공간 형태로 유사한 결정적인 아미노산을 함유할 수 있고, 이들은 다른 변이 단백질로 보존될 수 있음을 제안한다. 실제로, 우리의 연구 및 다른 연구들은 Opa의 두 개의 과변이 루프(HV1 및 HV2)가 CEACAM 표적화에 관여될 수 있다고 제안하고 있다^9,18. 리간드와 수용체와의 상호작용의 가능한 결정 인자를 동정할 수 있는 한 강력한 기술은 파아지 디스플레이(phage display)로, 이는 압타머(aptamer)(리간드 결합을 억제하는 본래 구조에 보다 밀접하게 관련되는 서열)²⁰ 뿐만 아니라, 미모토프(결합 도메인을 모방하는 랜덤 서열)¹⁹를 동정하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 CEACAM에 결합하는 Mx 리간드 도메인이 다른 CEACAM-결합 점막성 병원체에 대한 모사체로서 작용하고, 이러한 리간드의 구조적 특징은 CEACAM N-도메인 표적화를 위해 Nm 및 Hi 리간드에 필요한 두드러진 특징을 동정하는 것을 도움으로써 상당히 융통성있게 만든다. Mx 도메인에 대한 항체는 동일하거나, 유사하거나, 근접하게 위치하는 수용체 영역을 표적화하는 능력을 갖는 다른 리간드를 동정하는 잠재력을 가질 수 있다.

MX2 UspA1의 최소한의 CEACAM1 결합 도메인의 동정은 단백질 공학 및 재조합 DNA 기술의 공지된 방법을 사용하여 수행한다. 재조합 펩타이드는 수용체에 결합되는 MX2 도메인을 검출하기 위하여 상기 기술한 수용체 오버레이 검정법에 의해 시험관내에서 스크리닝할 수 있다. His-태그 펩타이드는 닉켈 칼럼에서 분리할 수 있고, His-태그는 필요에 따라 절단하고, 다른 연구를 위한 항체를 수득하기 위하여 래빗 및 마우스를 면역화시키는데 사용된다.

생물학적 적용을 위한 적절한 길이의 펩타이드는 수용체 결합의 차단과 같은, 다른 작용 뿐만 아니라, 면역학적 자극 특성을 조사하여 결정할 수 있다.

실시예 3. 리간드 상호작용에 필요한 수용체의 두드러진 특징

CEACAM의 N-도메인은 Opa 단백질의 상호작용에 충분하므로, 본 발명자는 또한 CEACAM N-도메인의 접착성 에피토프를 연구하기 위하여 파지 디스플레이 기술을 사용한다. 수용체의 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발⁹에 의해 본 발명자가 연구하여 온 수용체에 대한 리간드-결합 영역(들)의 지식들이 이 연구를 용이하게 한다. 이 경우에 또한, 리간드 오버레이 검정법이 수용체 서열을 함유하는 키메라 파지의 바이오패닝(biopanning)(친화성 농축)에 유용하다.

수용체 동족체는 생성된 Opa 형태와 무관하게 다중 균주를 차단하는 잠재력을 갖는데, 이는 본 연구가 항원성 변화에도 불구하고, 특정 Opa 단백질이 1차 접착을 위해 수용체에 대한 통상의 특성을 필요로 한다고 이미 제시하고 있기 때문이다⁹. CEA 항원은 장 점막으로부터 생성되고, CEACAM을 표적으로 하는 것으로 또한 공지된 이. 콜라이(E. coli) 균주의 접착을 차단할 수 있음을 특히 주지한다. 이는 선천적 면역성 대 장 병원체의 메카니즘으로서 제안되었다. ¹²따라서, 이들 수용체 동족체는 치료학적 제제로서 작용한다.

실시예 4. 재조합 CEACAM-결합 모락셀라 카타르할리스 UspA1 펩타이드의 생성

요약:

UspA1 길이에 따른 몇몇 단편의 PCR 증폭은 도 9에 제시된 프라이머를 사용하여 수행한다. 재조합 펩타이드는 하기에 기술되는 바와 같이 수득한다. 첫 라운드에서, CEACAM1에 결합되는 재조합 펩타이드는 프라이머 P4 및 P8에 의해 증폭된 DNA에 의해 암호화되지만, P1 내지 P5 사이의 영역에 의해서 암호화되는 것은 아님이 밝혀졌다. 또한, 재조합 P4 내지 P7은 CEACAM1에 결합되지만, P6 내지 P8은 아니다. 부가의 프라이머가 P4 및 P7 영역내에서 사용된다. 영역 D-7은 CEACAM-결합을 보유한다. 단편 4-7의 서열이 도 10에 제시되어 있다.

재조합 UspA1 펩타이드에 대한 일반적인 클로닝, 발현 및 정제 계획

UspA1 단편 1 내지 5는 pBAD 시스템을 사용하여 생성한다. 필요한 PCR 생성물은 pBAD 벡터로 클론화된 TA이고, TOP10 이. 콜라이 균주가 증폭을 위해 사용된다. 과정의 나머지는 도 11에 제시되어 있으나, 단 pBAD는 아라비노즈를 사용하여 유도한다. 단편 4 내지 7은 pBAD 및 pQE30을 모두 사용하여 생성한다(도 11). 유사한 CEACAM-결합을 갖는 시스템이 생성된다. 단편의 나머지는 도 11의 계획을 사용하여 생성한다.

벡터 및 pQE30 발현 시스템

벡터 pQE30(도 12)은 이. 콜라이 균주 M15와 함께 사용된다. M15는 pQE30으로 클로닝된 DNA의 전사를 제한하는 리프레서를 암호화하는 플라스미드 pREP4를 함유한다. 1 mM의 농도로 IPTG의 부가는 이 리프레서의 암호화 및, 이에 따른 pQE30중 클로닝된 단편의 전사를 방지한다.

클로닝 계획

PCR 증폭 인자를 먼저 pCR2.1에 결합시킨다. 이는 증폭 인자가 제한 분해(BamHI/PstI)로 회수할 수 있는 안정한 숙주를 제공하여, 유전자 단편의 각 말단이 절단되도록 보장한다. pQE30은 유사하게 분해하고, 두 제한 부위를 절단하는 것이 또한 보장되는, 겔 정제에 의해 회수한다. 분해된 pQE30 및 UspA1 증폭 인자는 밤새 16 ℃에서 T4 DNA 리가제로 결합시켜, CaCl₂ 컴피턴트 이. 콜라이 M15로 형질전환시킨다. 형질전환체는 암피실린(100 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)으로 보충된 LB 한천 위에서 선택한다. 4 내지 8개 콜로니를 채취하고, 항생제를 함유하는 LB 브로스에서 성장시킨다. 3 내지 4 ㎖의 배양액으로부터 세균은 원심분리에 의해 수거하고, 알칼리 분해 미니프렙 법에 적용시킨다. 정제된 벡터는 상기와 같이 분해 하여 uspA1 삽입물을 체크한다. 정확한 크기의 삽입물을 갖는 pQE30을 함유하는 세균은 50 ㎖ 배양액에서 성장시키고, IPTG에 의해 유도한다(하기 참조). 그 다음에, 웨스턴 블롯을 재조합 단백질 제조에 대해 스크리닝하기 위하여 사용한다. 또한, 벡터는 삽입물이 DNA의 정확한 부위에 존재하는 지를 결정하고, 서열 오차를 조사하기 위하여 서열분석한다.

발현 및 정제

pQE30/uspA1 작제물을 함유하는 M15는 1 mM 농도의 IPTG를 부가하기 전에 OD600 = 0.5로 교반하면서, LB(100 ㎍/㎖의 암피실린 및 25 ㎍/㎖의 카나마이신으로 보충됨) 브로스에서 성장시킨다. 배지는 다시 3 내지 4시간 동안 배양시키고, 세균은 원심분리에 의해 회수한다. 세균 펠릿은 완충액 B(8M 우레아, 50 mM 트리스, 10% 에탄올, 2% 트윈, 5 mM 이미다졸, pH 7)에서 1 내지 3시간 동안 용해시키고, 막 물질은 20,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 제거한다. 상등액은 회전식 혼합기에서 1 내지 2시간 동안 닉켈 수지와 함께 배양하고, 폴리프로필렌 칼럼을 통해 통과시킨다. 보유된 수지는 5 내지 10 ㎖의 완충액 B로 세척하고, 결합된 단백질은 100 mM 이미다졸이 보충된 완충액 B의 0.5 ㎖ 용출로 용출시킨다. 용출된 단백질은 투석 전에 SDS-PAGE로 조사하여 우레아 및 다른 염을 제거한다.

재조합 단편

A: 단편 1 내지 5 및 4 내지 8

pBAD 시스템에 의해 생성된 이들 단편은 1-5가 CEACAM1에 결합되지 않지만, 4-8은 결합된다고 밝히고 있다.

B: pQE30 시스템을 사용하여 제조한 단편 4-8, 4-8T, 4-7 및 6-8

단편 4 내지 8은 제조된 첫 번째 rUspA1 단편으로, 블롯-오버레이 검정에서 높은 친화성으로 CEACAM1과 결합하는 것으로 밝혀졌다. 전체 길이의 4-8 rUspA1 펩타이드 이외에, 보다 작은 절단된 단백질이 관찰된다. 이 펩타이드(4-T로 표시됨)는 또한 CEACAM1에 결합되고, 4-8보다 낮은 수준으로 발현되는 것으로 나타났다(도 13). pQE30/4-T의 서열 분석으로 불일치(CAA to TAA)는 잔기 Q624에서 종결 코돈을 유도하는 것으로 밝혀졌다(참조: 도 10).

펩타이드 4-7 및 6-8은 2차 CEACAM 결합 부위가 6-8에 생성되는 가능성을 배제하기 위하여 제조한다. 4-T 펩타이드로부터 예상되는 바와 같이, 4-7은 CEACAM 결합(도 13)을 나타내지만, 6-8은 이를 나타내지 않는다(도 14).

C: pQE30 시스템에 의해 제조된 단편 D-8 및 D-7

rUspA1 단편 D-8(도 15) 및 D-7(도시되지 않음)은 모두 CEACAM1과 결합하는 것으로 밝혀졌다.

재조합 펩타이드 4-7의 생물학적 활성

엠. 카타르할리스 균주 MX1 및 에이치. 인플루엔자 균주 Rd는 CEACAM1로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 결합된다. 이들의 결합은 엠. 카타르할리스 UspA1 재조합 펩타이드 4-7에 의해 차단될 수 있지만, 대조군 펩타이드에 의해서는 차단될 수 없다(도 17).

추가의 실험에서, 재조합 펩타이드 D-7(재조합체 6-8이 아닌, 즉, MX2의 잔기 E659 내지 K863)은 동종성 및 이종성 균주 둘다가 CEACAM1을 발현하는 형질감염된 CHO 세포로 결합하는 것을 억제하는 것으로 나타났다(도 23). 펩타이드 부재(칼럼 1), 대조군 펩타이드(2ug.ml^-1;칼럼 2) 또는 D-7(2ug.ml^-1; 칼럼 3)의 존재하에 세포의 예비 항온처리한 후, 세균을 첨가하고 1시간 항온처리 후 비접착 세균을 세척하여 제거하였다. 이어서 명백한 균주에 대해 생성된 항혈청 및 로다민 접합된 2차 항체를 사용하여 세포와 연합된 세균을 검출하였다. Mx: 모락셀라 카타르할리스, Nm: 나이제리아 메닝기티디스; Hi: 해모필루스 인플루엔자.

실시예 5. CEACAM1-결합 펩타이드의 특징 분석

펩타이드 D-7은 가장 강한 결합 재조합 펩타이드인 것으로 밝혀졌다. 따라서, MX2의 영역 D-7(142개 아미노산; 도 16 참조)은 CEACAM1 결합 정보를 포함한다.

절단된 펩타이드 4-T(197개 아미노산)은 약한 결합을 보유한다(도 13). 따라서 영역 D-T는 CEACAM1 결합 능력을 갖는 영역을 포함할 수 있다.

D-7에서 단일 아미노산 치환 K560I는 CEACAM1 결합을 완전히 차단하는 것으로 밝혀졌다.

펩타이드 D-8(D-8△)에서 영역 571 내지 632의 결실은 CEACAM1 결합을 소실시켰다.

D-T 영역을 관통하는 선형 중첩 펩타이드(도 19)를 제조하고 CEACAM1과 결합하는 이의 능력을 시험하였다. CEACAM1과의 어떠한 결합도 관찰되지 않았다.

편광 이색성 분광기

편광 이색성(CD) 분광기로 펩타이드 D-7 및 돌연변이 D-7(K 560 I)을 분석하였다. 편광 이색성 스펙트럼은 Jobin-Yvon CD6 분광편광기를 사용하여 실온에서 수득하였다. 0.1mg/ml의 농도에서 재조합체 D-7 및 D-7(K 560 I)의 스펙트럼은 석영 큐벳에서 측정하였다. 모든 스펙트럼은 관련 단백질 부재 완충액 스펙트럼을 공제하여 평균 8개의 스캔이고 엑셀(Microsoft Inc)을 사용하여 플롯팅하였다.

수득된 스펙트럼은 D-7이 α 나선형 구조를 갖는 반면, D-7(K 560 I)는 무작위 코일을 형성함을 보여준다(도 18). 특정 이론에 얽매이지 않고, Mx UspA1의 CEACAM1 결합에는 α 나선형 아마도 고리형 코일 구조를 필요로 함을 시사한다.

요약

상기된 결과로부터 본 발명자들은 Mx UspA1의 CEACAM1 결합에는 α-나선형, 아마도, 고리형 코일 구조 뿐만 아니라 D-7내에 특정 영역이 필요한 것으로 결론지었다.

Mx UspA1의 CEACAM1 결합 도메인이 수용체 결합에 필요한 α-나선형을 취한다는 발견은 특히 흥미롭다. Opa 단백질은 표면 노출된 루프상에 존재하는 CEACAM-결합 도메인을 제공하기 위해서는 주의깊게 재구성되어야만 한다. 본 발견은 D-7이 자발적으로 재폴딩하여 CEACAM 결합 성질을 제공함을 시사한다. D-7에서, 고리형 구조는 CEACAM1 결합을 위해 적당한 형태를 갖는 구형 서브유니트 구조를 제공한다. D-7 펩타이드의 당해 이로운 성질은 펩타이드 및 유도체, 동족체 또는 이의 단편이 서브유니트 백신 또는 치료제로서 특정 용도를 가질 수 있음을 의미한다. 요구되는 α나선형을 갖는 D-7 펩타이드의 유도체는 고유의 "핑거프린트" 편광 이색성 스펙트럼에 의해 동정될 수 있다.

실시예 6. 서열 분석

Mx의 10개 균주의 UspA1 단백질의 아미노산 서열의 D-7 영역의 정렬은 도 20에 나타낸다.

10개의 균주 중 6개는 서열 분석된 영역에서 동일하다. 균주 MX3 및 MX4는 D-7 영역의 유용한 서열에 대해서 100% 동일하고 결정되지 않은 MX3 및 MX4 각각에 대한 N-말단의 13개 및 17개의 아미노산 잔기를 고려하여 각각 전체 90.85% 및 88.03%의 동일성을 갖는다.

잔여 2개의 균주 TTA37 및 O35E는 D-T 영역내에서 발생한 것으로 보여지는 바와 같은 결실을 갖는다. D-7내의 갭을 포함하는 전체 동일성은 각각 70.4% 및 50%이다. TTA37은 100개의 아미노산 잔여 영역에서 동일한 반면 O35E는 수동으로 정렬될때 72개의 아미노산중 71개가 동일하다(도 21). O35E는 CEACAM1과 결합하지 않는 것으로 공지되어 있다. TTA37은 시험에 유용하지 못하다.

실시예 7. D-7의 접착 차단 성질

결과

Mx, Nm, Ng 및 Hi의 동종성 및 이종성 균주에 대해 효과적인 항-접착 제제로서의 D-7의 잠재력은 먼저 가용성 수용체를 사용하여 조사되었다. CEACAM1-Fc(CC1-Fc)는 니트로셀룰로스상으로 점재된 2개의 Mx 균주의 전체 세포 용해물의 오버레이 전에 D-7과 예비 항온처리하였다. 재조합체 D-7은 용량 의존적 방식으로 CC1-Fc의 이종성 균주 MX1 및 동종성 균주 MX2에 대한 결합을 상당히 억제하는 것으로 밝혀졌다(도 24a). 억제는 상당하였고 0.01ug.ml^-1 이상에서 정체기에 도달하는 것으로 나타났다. 이전에 CEACAM1에 결합하지 않는 것으로 나타난 대조군 펩타이드(D-8△)는 그러한 억제를 나타내지 않았다(실시예 5). 추가로, 다중 세균 균주의 억제가 측정되었다. 사용된 대다수의 균주는 전세계 기원의 임상적 분리주를 대표하였다(방법 참조). 상당하고 특이적인 억제는 D-8△이 아닌 D-7에서 나타났다(도 24b). 이어서, D-7의 차단 효과는 CEACAM1(CHO-CEACAM1)으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용하여 조사하였다. 가용성 수용체에 관하여, Mx, Nm 및 Hi의 CHO-CEACAM1 세포로의 결합 억제는 D-7과의 예비 항온처리 후 관찰되었지만 대조군 펩타이드에서는 관찰되지 않았다(도 25a 및 b). CHO-CEACAM1 세포로 결합하는 세균의 억제는 용량 의존성이고 Mx 및 Hi에 대해서 0.1ug.ml^-1에서 또는 그 이상에서 및 Nm에 대해 0.2ug.ml^-1에서 또는 그 이상에서 상당하였다. CHO-CEACAM1으로의 세균 결합의 거의 완전한 차단은 2ug.ml^-1의 농도에서 수득되었다(도 25a 및 b). 잠정적으로 억제에 대해 수득된 값은 본 연구에 사용된 세균의 CEACAM과의 상호작용에 대한 친화성 정도가 Nm>Mx>Hi임을 시사한다. CEACAM1 뿐만 아니라, 엔. 메닝기티디스는 상피 CEA 및 CEACAM6(NCA)를 포함하는 사람 CEACAM 계열의 기타 막을 표적으로 하는 것으로 나타났다[문헌 9번 참조]. 이것은 또한 몇몇 Mx 균주에 대한 경우이고 Hi 균주는 바람직한 수용체(데이타는 나타내지 않음)로서 CEACAM1을 표적으로 하는 경향이 있다. D-7(2ug.ml^-1)과 예비 항온처리한 후, Nm의 CEACAM1, 6 및 CEA를 발현하는 형질감염된 HeLa 세포로의 결합이 억제되는 것으로 관찰되었다(도 25c).

D-7의 효능은 추가로 부분적으로 상피 세포의 가능한 생체내 염증 증상을 모방하기 위해 고수준의 CEACAM1을 발현하도록 제조된 세포주인 HeLa-CC1H를 사용하여 시험하였다. 고밀도 수용체는 Opa 발현 세균이 캡슐의 존재에도 불구하고 표적 세포에 부착하도록 한다[문헌 7번 참조]. 따라서, 당해 모델을 통해 본 발명자는 또한 생체내에서 발견될 수 있는 Nm(h18.18)의 표현형, 즉, 캡슐화된, 선모화된 및 Opc 뿐만 아니라 외막 단백질 Opa의 발현을 사용할 수 있도록 하였다[문헌 15번, 25번 참조]. 먼저, h18.18의 Opa 결핍 변이체의 HeLa-CC1H로의 결합은 상대적으로 낮은 것으로 밝혀졌고(세포당 10개 내지 20개 세균) 이는 선모의 발현때문이다. 예상된 바와 같이, h18.18의 HeLa-CC1H로의 접착은 많이 증진되었고(세포당 10개 내지 20개 세균) 선모의 기여에도 불구하고 h18.18에 의한 세포 접착은 D-7을 사용하여 사전에 또는 동시에 처리함에 의해 상당히 감소하였다(도 25d). 상기된 것 외에도 D-7은 CEACAM을 발현하는 것으로 공지된 사람 폐 상피 세포주 A549에 대해 시험하였다[문헌 26번 참조]. 당해 세포주는 또한 기타 Mx 리간드에 대한 수용체를 발현하는 것 때문에 선택되었다[문헌 27번 참조]. 따라서, 세균 로드를 감소시키는데 있어서 D-7의 효능이 시험될 수 있었다. D-8△이 아닌 D-7(2ug.ml^-1)의 존재하에 Nm 및 Hi와 A549 세포와의 상호작용의 급격한 감소가 관찰되었다(도 25e). 결합 감소는 또한 Mx 균주에 대해 관찰되었고 비교적 낮음에도 불구하고도 상당하였다(도 25e).

방법

세균 분리주 및 배양

Mx 및 Nm은 10%의 가열된 말 혈액이 보충된 BHI 한천상에서 증식시키고 Hi는 레빈탈 염기가 보충된 뇌 심장 주입물(BHI) 한천상에서 증식시켰다. Ng 균주는 GC 한천상에서 배양하였다. 모든 세균은 5% CO₂ 배양기에서 16시간동안 37℃에서 배양하였다. Mx 균주는 중이염 및 COPD의 경우로부터 수득된 임상적 분리주이고 여러 국가로부터의 분리주를 대표한다. Eagan, c1 및 f1은 각각 b, c 및 f형의 캡슐을 갖는 분류가능한 Hi이다. Rd는 a형 d 균주의 비캡슐 변이체이다. 균주 A930065 및 NT1은 NTHi이다. 균주 A3, F2087, F3035 및 F1947은 Hi 바이오 그룹 아에기프티우스 분리주이다. Nm 분리주 C751A, C751B 및 C751D는 3개의 명백한 Opa를 발현하는 혈청 그룹 A 균주 C751의 분리주이다. 기타 분리주는 하기의 혈청그룹에 속한다: PMC17(A), C311 및 MC58(B) 및 C114(C) PMC2(29E), PMC4(W135) 및 PMC(Y). Ng 분리주 P9-13, 16 및 35는 균주 P9의 내부균주 Opa 변이체이고 기타 임상적 분리주는 전세계적으로 부터 기원하는 것이다. 본 연구에 사용되는 대다수의 균주는 이전에 추가로 기재되었다[문헌 10번, 26번 및 28번 참조].

항체

항-폴리 히스티딘 마우스 모노클로날 항체는 제조원(Qiagen)으로부터 구입하였고 0.2ug.ml^-1로 사용하였다. Mx, Nm 및 Hi 균주에 대한 폴리클로날 항혈청은 표준 프로토콜 및 항원으로서 다중 균주의 전체 세포 용해물을 사용하여 래빗에서 생성하였다. 본 연구에 사용된 항-UspA1 항체(R38)는 실시예 1에서 기재되었고 D-7에 대한 폴리클로날 항혈청(문헌 26번 참조)은 Ni-NTA 수지(Qiagen; 면역화당 펩타이드 100-200ug)의 에 결합된 펩타이드로 면역화시킴에 의해 래빗에서 생성시켰다. 56℃에서 30분동안 항혈청을 가열하여 보체를 불활성화시켰다. 항 D-7 항체는 제조업자의 프로토콜(Pierce)에 따른 아미노링크 플러스 칼럼에 커플링된 펩타이드 D-7을 사용하여 친화성으로 정제하였다.

가용성 수용체 작제물 및 세포주

가용성 CEACAM1-Fc 및 본 연구에 사용된 CEACAM1으로 형질감염된 CHO 세포는 선행 기술 분야에서 기재되었다[문헌 11번 및 9번 참조]. 특정 범위의 CEACAM 분자를 발현하는 HeLa 세포는 짐머맨 볼프강 교수 (University of Munich, Germany)및 그레이 오웬 스코트 박사(University of Toronto, Canada)로부터 기부받았고 10% 태아 소 혈청(FCS)를 함유하는 RPMI 1640에서 증식시켰다. A549 사람 폐 암종 세포(유동 연구소)는 10% (FCS)를 함유하는 F12 햄 매질에서 배양하였다. 고수준의 CEACAM을 발현하는 HeLa 세포는 Tet-On^TM(Clontech) 유전자 발현 시스템을 사용하여 제조하였다. ceacam1 유전자는 pTRE-2hyg 반응 플라스미드(Clontech)에 클로닝시키고 Fugene-6(Roche)를 사용하여 조절 유전자(Clontech)을 함유한 HeLa 세포에 형질전환시켰다. 형질감염체는 400ug.ml^-1 하이그로마이신을 사용하여 선택하였다. CEACAM 발현에 양성인 이들 형질감염체는 FACS 및 제한 희석을 사용하여 선택하였다. 0.25ug. ml^-1 독시사이클린의 존재하에 HeLa-CC1H 클론은 최고 수준의 수용체를 생성하였다.

수용체 오버레이 분석

이들 실험은 하기에 기재된 것을 제외하고는 선행 기술에 기재된 방법을 근거로한다[문헌 9번 참조]. 억제 연구를 위해, CEACAM-Fc(0.1ug.ml^-1)를 실온에서 1시간동안 D-7 또는 대조군 펩타이드(0.001-2ug.ml^-1)로 예비 항온처리하였다. 이어서 블롯을 단독으로 CEACAM1-Fc(0.1ug.ml^-1)와 오버레이하거나 기재된 바와 같은 펩타이드와 예비 항온처리하였다. 또한, 블롯을 수용체(0.1ug.ml^-1)와 오버레이하기 전에 1시간동안 정제된 래빗 항 D-7 항체(10ug.ml^-1)와 오버레이하였다. 어느 경우에도, 수용체 결합 수준은 NIH 시온 이미지 프로그램을 사용한 밀도 측정 분석으로 측정하였다.

펩타이드 D-7에 의한 CEACAM 발현 세포로의 세균 접착의 억제

컨플루언트 단층 세포를 2% 태아 소 혈청이 첨가된 199 배지에서 37℃에서 30 내지 60분동안 펩타이드 D-7 또는 대조군 펩타이드(0.1-2ug.ml^-1)로 예비 항온처리하였다. 펩타이드와의 예비 항온처리 후 단층을 조사하여 세포에 대해 해로운 효과가 나타나지 않음을 확인하였다. 이어서, 단층을 2% 태아 소 혈청이 첨가된 199 배지에서 37℃에서 1시간동안 세포당 100 내지 200개의 세균 비율로 항온처리하였다. 비 접착 세균은 199 배지로 4회 세척하여 제거하고 이어서 단층을 면역형광 검출을 위해 처리하고 1% 사포닌으로 용해시키고 선행 기술에 기재된 바와 같은 콜로니 형성 단위(cfu)의 측정을 위해 세균 희석액을 도말하였다[문헌 25번 참조]. 면역형광 검출을 위해, 세포를 10분동안 무수 메탄올에 고정하고 0.05% Tween을 함유하는 PBS중에서 1% 소 혈청 알부민으로 세척하고 블록킹하였다. 부착된 세균은 항 세균 항혈청 및 로다민 접합된 2차 항체를 사용하여 검출하였다. HeLa-CEACAM 발현 세포에 부착하는 세균의 수는 X400 배율로 올림푸스 IX70 현미경을 사용하여 직접 계수하여 수득하였다. 결합된 세균의 평균값은 2회 실험으로부터 무작위로 선택된 20개 세포에 부착된 세균의 수를 계수한 후에 수득하였다. HeLa-CC1H로의 세균 접착은 상기된 바와 같이 cfu 분석으로 측정하였다.

실시예 8. 항 D-7 항체는 Mx-CEACAM1 상호작용을 억제한다

결과

D-7에 대해 생성된 래빗 항혈청은 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯 오버레이에서 여러 Mx 균주 기원의 UspA1과 교차 반응성인 항체를 함유하였다(데이타는 나타내지 않음). 친화성 정제된 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의한 항-D-7의 Nm Opa 또는 Hi P5로의 결합이 관찰되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). CC1-Fc 오버레이 전에 항-D-7(10ug.ml^-1)을 사용한 특정 범주의 Mx 균주의 전체 세포 용해물의 항온처리는 수용체를 상당히 억제하였고 대다수의 균주가 80% 초과 억제를 나타낸다(도 26). 그러나, 유사한 실험에서 저수준의 억제는 Hi, Nm 및 Ng 균주에 대해 관찰되었다. 따라서, D-7에 대한 항체는 Mx 감염으로부터 보호를 제공할 수 있는 반면 D-7은 다양한 범주의 CEACAM 표적 세균에 대한 보다 일반적인 항-미생물 펩타이드로서 작용할 수 있다.

실시예 9. 펩타이드 D-7에 의한 CEACAM 발현 사람 내피 세포로 세균 접착의 억제

내피 세포에 대한 D-7의 효과를 평가하기 위해, 컨플루언트 단층의 HMEC-1 세포를 사용하였다. 사람의 미세혈관 내피 세포는 D-7 또는 재조합체 대조군 분자(모두 1ug.ml^-1에서)을 사용하여 60분동안 예비 항온처리하였다. 이어서 세균(엔. 메닝기티디스 균주 C751의 OpaD-발현 분리주)은 세포당 100개의 세균 감염 비율로 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이 시간 이후, 비접착 세균은 세척하여 제거하고 단층은 실온에서 10분동안 메탄올중에 고정시켰다. 접착 세균은 엔. 메닝기티디스에 대한 래빗 폴리클로날 항혈청과의 오버레이에 이어서 항 래빗 TRITC 접합된 2차 항체로 검출하였다.

다수의 내피 세포는 펩타이드의 부재하에 세포당 30개 이하의 세균이 연합되어 있다. 대조군 펩타이드의 존재하에서 세균 결합에 대한 어떠한 명백한 억제가 관찰되지 않았다. 그러나, D-7의 존재하에 당해 결합은 세포에 1개 또는 2개의 세균이 때때로 나타남으로써 실질적으로 억제되었다(도 27).

따라서, D-7은 상피 세포 뿐만 아니라 내피 세포로의 엔. 메닝기티디스의 Opa-CEACAM 매개된 접착을 억제할 수 있다.

실시예 10. 공지된 UspA1 단백질 서열중에서 단편 "4-T"(Mx2 UspA1의 아미노산 427 내지 623)의 서열 보존

모든 전장 단백질 서열에 대한 다중 정렬을 수행하여 기타 균주의 서열에서 상응하는 단편을 확인하였다.

이들 단편에 대한 다중 정렬은 도 28에 나타낸다. 연합된 동일성 %는 하기에 나타낸다.

D-7 영역에 대해 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 상기 결과는 4-T 영역이 상이한 균주간에 고도로 보존되어 있음을 지적하고 O35E(85% 동일성)를 제외하고는 시험된 모든 균주에 대한 서열이 95% 이상의 동일성을 나타낸다. 이전에 주지한 바와 같이, O35E는 CEACAM에 결합하지 않는다. 따라서, 도 28에 나타낸 바와 같이 보존된 서열 영역 4-T(427 내지 623)를 포함하거나 이들로 이루어진 펩타이드는 본 발명에 따른 바람직한 펩타이드이고 이는 질환, 특히 CEACAM 수용체가 연루된 질환의 치료 및 예방에 사용된다.

문헌참조:

<110> The University of Bristol <120> THERAPEUTIC PEPTIDES <130> APM/7168 WO <150> GB 0419594.7 <151> 2004-09-03 <150> GB 0408390.3 <151> 2004-04-15 <160> 60 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> His or Arg <400> 1 Glu Thr Asn Asn Xaa Gln Asp Gln Lys Ile Asp Gln Leu Gly Tyr Ala 1 5 10 15 Leu Lys Glu Gln Gly Gln His Phe Asn Asn Arg 20 25 <210> 2 <211> 863 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 2 Met Asn Lys Ile Tyr Lys Val Lys Lys Asn Ala Ala Gly His Leu Val 1 5 10 15 Ala Cys Ser Glu Phe Ala Lys Gly His Thr Lys Lys Ala Val Leu Gly 20 25 30 Ser Leu Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Met Ala Thr Thr Ala Ser Ala 35 40 45 Gln Lys Val Gly Lys Ala Thr Asn Lys Ile Ser Gly Gly Asp Asn Asn 50 55 60 Thr Ala Asn Gly Thr Tyr Leu Thr Ile Gly Gly Gly Asp Tyr Asn Lys 65 70 75 80 Thr Lys Gly Arg Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Leu Phe Asn Glu Ala 85 90 95 Thr Asn Glu Tyr Ser Thr Ile Gly Ser Gly Gly Tyr Asn Lys Ala Lys 100 105 110 Gly Arg Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Gly Tyr Asn Glu Ala Thr Asn 115 120 125 Gln Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Asp Asn Asn Thr Ala Lys Gly Arg 130 135 140 Tyr Ser Thr Ile Gly Gly Gly Gly Tyr Asn Glu Ala Thr Ile Glu Asn 145 150 155 160 Ser Thr Val Gly Gly Gly Gly Tyr Asn Gln Ala Lys Gly Arg Asn Ser 165 170 175 Thr Val Ala Gly Gly Tyr Asn Asn Glu Ala Thr Gly Thr Asp Ser Thr 180 185 190 Ile Ala Gly Gly Arg Lys Asn Gln Ala Thr Gly Lys Gly Ser Phe Ala 195 200 205 Ala Gly Ile Asp Asn Lys Ala Asn Ala Asp Asn Ala Val Ala Leu Gly 210 215 220 Asn Lys Asn Thr Ile Glu Gly Glu Asn Ser Val Ala Ile Gly Ser Asn 225 230 235 240 Asn Thr Val Lys Lys Gly Gln Gln Asn Val Phe Ile Leu Gly Ser Asn 245 250 255 Thr Asp Thr Thr Asn Ala Gln Asn Gly Ser Val Leu Leu Gly His Asn 260 265 270 Thr Ala Gly Lys Ala Ala Thr Ile Val Asn Ser Ala Glu Val Gly Gly 275 280 285 Leu Ser Leu Thr Gly Phe Ala Gly Ala Ser Lys Thr Gly Asn Gly Thr 290 295 300 Val Ser Val Gly Lys Lys Gly Lys Glu Arg Gln Ile Val His Val Gly 305 310 315 320 Ala Gly Glu Ile Ser Asp Thr Ser Thr Asp Ala Val Asn Gly Ser Gln 325 330 335 Leu His Ala Leu Ala Thr Val Val Ala Gln Asn Lys Ala Asp Ile Lys 340 345 350 Asp Leu Asp Asp Glu Val Gly Leu Leu Gly Glu Glu Ile Asn Ser Leu 355 360 365 Glu Gly Glu Ile Phe Asn Asn Gln Asp Ala Ile Ala Lys Asn Gln Ala 370 375 380 Asp Ile Lys Thr Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu 385 390 395 400 Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Asp Asn Asn Ile Asn 405 410 415 Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile 420 425 430 Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly 435 440 445 Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr Lys Asp Ile Lys Ala Leu 450 455 460 Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile 465 470 475 480 Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Gln Asn 485 490 495 Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Ala 500 505 510 Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser 515 520 525 Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile Ala Glu 530 535 540 Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys 545 550 555 560 Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp Lys Lys 565 570 575 Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala Val Gly 580 585 590 Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn 595 600 605 Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln 610 615 620 Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys Val Ser 625 630 635 640 Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala Asp Ala 645 650 655 Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu Gln Gly 660 665 670 Glu Ala Leu Val Glu Gln Asn Lys Ala Ile Asn Gln Glu Leu Glu Gly 675 680 685 Phe Ala Ala His Ala Asp Val Gln Asp Lys Gln Ile Leu Gln Asn Gln 690 695 700 Ala Asp Ile Thr Thr Asn Lys Thr Ala Ile Glu Gln Asn Ile Asn Arg 705 710 715 720 Thr Val Ala Asn Gly Phe Glu Ile Glu Lys Asn Lys Ala Gly Ile Ala 725 730 735 Thr Asn Lys Gln Glu Leu Ile Leu Gln Asn Asp Arg Leu Asn Arg Ile 740 745 750 Asn Glu Thr Asn Asn His Gln Asp Gln Lys Ile Asp Gln Leu Gly Tyr 755 760 765 Ala Leu Lys Glu Gln Gly Gln His Phe Asn Asn Arg Ile Ser Ala Val 770 775 780 Glu Arg Gln Thr Ala Gly Gly Ile Ala Asn Ala Ile Ala Ile Ala Thr 785 790 795 800 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Ala Gly Glu His His Val Leu Phe Gly Ser 805 810 815 Gly Tyr His Asn Gly Gln Ala Ala Val Ser Leu Gly Ala Ala Gly Leu 820 825 830 Ser Asp Thr Gly Lys Ser Thr Tyr Lys Ile Gly Leu Ser Trp Ser Asp 835 840 845 Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Val Gly Gly Ser Tyr Arg Trp Lys 850 855 860 <210> 3 <211> 401 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 3 Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg 1 5 10 15 Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala 20 25 30 Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln 35 40 45 Asp Ala Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys 50 55 60 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 65 70 75 80 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 85 90 95 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 100 105 110 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 115 120 125 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 130 135 140 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 145 150 155 160 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 165 170 175 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 180 185 190 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu 195 200 205 Gln Gly Glu Ala Leu Val Glu Gln Asn Lys Ala Ile Asn Gln Glu Leu 210 215 220 Glu Gly Phe Ala Ala His Ala Asp Val Gln Asp Lys Gln Ile Leu Gln 225 230 235 240 Asn Gln Ala Asp Ile Thr Thr Asn Lys Thr Ala Ile Glu Gln Asn Ile 245 250 255 Asn Arg Thr Val Ala Asn Gly Phe Glu Ile Glu Lys Asn Lys Ala Gly 260 265 270 Ile Ala Thr Asn Lys Gln Glu Leu Ile Leu Gln Asn Asp Arg Leu Asn 275 280 285 Arg Ile Asn Glu Thr Asn Asn His Gln Asp Gln Lys Ile Asp Gln Leu 290 295 300 Gly Tyr Ala Leu Lys Glu Gln Gly Gln His Phe Asn Asn Arg Ile Ser 305 310 315 320 Ala Val Glu Arg Gln Thr Ala Gly Gly Ile Ala Asn Ala Ile Ala Ile 325 330 335 Ala Thr Leu Pro Ser Pro Ser Arg Ala Gly Glu His His Val Leu Phe 340 345 350 Gly Ser Gly Tyr His Asn Gly Gln Ala Ala Val Ser Leu Gly Ala Ala 355 360 365 Gly Leu Ser Asp Thr Gly Lys Ser Thr Tyr Lys Ile Gly Leu Ser Trp 370 375 380 Ser Asp Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Val Gly Gly Ser Tyr Arg Trp 385 390 395 400 Lys <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 4 Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 242 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 5 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp 35 40 45 Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln 50 55 60 Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Leu Gln Asp Ala Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp 85 90 95 Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala 100 105 110 Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala 115 120 125 Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile 130 135 140 Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met 145 150 155 160 Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn 180 185 190 Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys 195 200 205 Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn 210 215 220 Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn 225 230 235 240 Thr Leu <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 6 Lys Asp Glu His Asp Lys Leu Ile Thr Ala Asn Lys Thr Ala Ile Asp 1 5 10 15 Ala Asn Lys Ala Ser 20 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 7 Ala Leu Glu Ser Asn Val 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 8 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 9 Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln 1 5 10 15 Lys Ala Asp Leu Thr Lys Asp Ile Lys 20 25 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 10 Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln 1 5 10 15 Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala 20 25 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 11 Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr 1 5 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 12 Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 13 Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 14 Thr Ala Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala 1 5 10 15 Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys 20 25 <210> 15 <211> 42 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 15 Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly 1 5 10 15 Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly 20 25 30 Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys 35 40 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 16 Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala 1 5 10 15 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 17 Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 18 Asn Ile Tyr Glu Leu Ala 1 5 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 19 Ala Asn Ala Asp Asn Ala Val Ala Leu Gly Asn Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 20 Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 21 Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 22 Thr Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg 1 5 10 15 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 23 Ile Gly Leu Ser Trp Ser Asp Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Val Gly 1 5 10 15 Gly Ser Tyr Arg 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 24 Gln Thr Ala Gly Gly Ile Ala Asn Ala Ile Ala Ile Ala Thr Leu Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ser Arg 20 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 25 Asn Gln Asn Thr Leu Ile Glu Gln Gly Glu Ala Leu Val Glu Gln Asn 1 5 10 15 Lys <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 26 Ala Ile Asn Gln Glu Leu Glu Gly Phe Ala Ala His Ala Asp Val Gln 1 5 10 15 Asp Lys <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 27 Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile 1 5 10 15 Lys <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 28 Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg 1 5 10 15 Leu Ile Asp Gln Lys 20 <210> 29 <211> 33 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 29 Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn 1 5 10 15 Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp 20 25 30 Gly <210> 30 <211> 47 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 30 Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His 1 5 10 15 Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg 20 25 30 Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp 35 40 45 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 31 Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly 1 5 10 15 Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp Lys Lys 20 25 30 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 32 Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys 1 5 10 15 Asn Gln Ala Asp 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 33 Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp Lys 1 5 10 15 Lys Ile Thr Asn 20 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 34 Ile Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser 1 5 10 15 Met Val Ala Arg 20 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 35 Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr 1 5 10 15 Gln Gly Val Ala 20 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 36 Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile 1 5 10 15 Ala Lys Asn Gln 20 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 37 Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn 1 5 10 15 Ile Lys Asn Ile 20 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 38 Asn Lys Asp Gly Ile 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 39 Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 40 His His His His His His 1 5 <210> 41 <211> 142 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 41 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 35 40 45 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 50 55 60 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 100 105 110 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 115 120 125 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 130 135 140 <210> 42 <211> 142 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 42 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 35 40 45 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 50 55 60 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 100 105 110 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 115 120 125 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 130 135 140 <210> 43 <211> 100 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 43 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile 35 40 45 Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp 50 55 60 Ile Lys Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn 85 90 95 Gln Asn Thr Leu 100 <210> 44 <211> 142 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 44 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 35 40 45 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 50 55 60 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 100 105 110 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 115 120 125 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 130 135 140 <210> 45 <211> 142 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 45 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 35 40 45 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 50 55 60 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 100 105 110 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 115 120 125 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 130 135 140 <210> 46 <211> 72 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 46 Ala Ser Ser Glu Asn Thr Gln Asn Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile 1 5 10 15 Ala Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln 20 25 30 His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys Val Ser Ala Ala Asn Thr 35 40 45 Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ser Phe Glu Thr 50 55 60 Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 65 70 <210> 47 <211> 142 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 47 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 35 40 45 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 50 55 60 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 100 105 110 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 115 120 125 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 130 135 140 <210> 48 <211> 142 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 48 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 35 40 45 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 50 55 60 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 100 105 110 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 115 120 125 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 130 135 140 <210> 49 <211> 142 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 49 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 35 40 45 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 50 55 60 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 100 105 110 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 115 120 125 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 130 135 140 <210> 50 <211> 129 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 50 Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln 1 5 10 15 Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln 20 25 30 Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val 35 40 45 Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala 50 55 60 Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Leu Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr 85 90 95 Leu Ala Lys Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys 100 105 110 Ala Glu Ala Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr 115 120 125 Leu <210> 51 <211> 125 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 51 Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn 1 5 10 15 Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp Lys 20 25 30 Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala Val 35 40 45 Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys 50 55 60 Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala 65 70 75 80 Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys Val 85 90 95 Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala Asp 100 105 110 Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 115 120 125 <210> 52 <211> 197 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 52 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Ala Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp 35 40 45 Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln 50 55 60 Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Leu Gln Asp Ala Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp 85 90 95 Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala 100 105 110 Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala 115 120 125 Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile 130 135 140 Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met 145 150 155 160 Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn 180 185 190 Ile Tyr Glu Leu Ala 195 <210> 53 <211> 197 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 53 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Ala Leu Glu Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp 35 40 45 Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln 50 55 60 Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Leu Gln Asp Ala Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu Ala Ile Asp 85 90 95 Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala 100 105 110 Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala 115 120 125 Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile 130 135 140 Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met 145 150 155 160 Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn 180 185 190 Ile Tyr Glu Leu Ala 195 <210> 54 <211> 148 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 54 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Ala Leu Glu Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp 35 40 45 Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln 50 55 60 Ala Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Gln Tyr 65 70 75 80 Ala Gln Lys Gln Thr Glu Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser 85 90 95 Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn 100 105 110 Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp 115 120 125 Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn Ile 130 135 140 Tyr Glu Leu Ala 145 <210> 55 <211> 197 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 55 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Thr Leu Glu Ser Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp 35 40 45 Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln 50 55 60 Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Ala Gln Lys Gln Thr Glu Ala Ile Asp 85 90 95 Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala 100 105 110 Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala 115 120 125 Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile 130 135 140 Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met 145 150 155 160 Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn 180 185 190 Ile Tyr Glu Leu Ala 195 <210> 56 <211> 197 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 56 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Lys Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Thr Leu Glu Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp 35 40 45 Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln 50 55 60 Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Ala Gln Lys Gln Thr Glu Ala Ile Asp 85 90 95 Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala 100 105 110 Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala 115 120 125 Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile 130 135 140 Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met 145 150 155 160 Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn 180 185 190 Ile Tyr Glu Leu Ala 195 <210> 57 <211> 197 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 57 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Leu Thr 20 25 30 Lys Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly Leu Leu Asp 35 40 45 Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln 50 55 60 Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu Ala Ala Tyr 65 70 75 80 Asn Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Ala Gln Lys Gln Thr Glu Ala Ile Asp 85 90 95 Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala 100 105 110 Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala 115 120 125 Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile 130 135 140 Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met 145 150 155 160 Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Lys Asn 180 185 190 Ile Tyr Glu Leu Ala 195 <210> 58 <211> 168 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 58 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala 20 25 30 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu 35 40 45 Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Ala Tyr Ala Lys Gln Gln Thr Glu 50 55 60 Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile 65 70 75 80 Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile 85 90 95 Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Leu His Asp Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu 115 120 125 His Ser Met Val Ala Arg Ala Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala 130 135 140 Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn 145 150 155 160 Ile Lys Asn Ile Tyr Glu Leu Ala 165 <210> 59 <211> 98 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 59 Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Lys Asn Asn Val Glu Glu Gly 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Ser Gly Arg Leu Ile Asp Gln Lys Ala Asp Ile Ala 20 25 30 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Gln Asn Gln Thr Asp Ile Gln Asp Leu 35 40 45 Ala Ala Tyr Asn Glu Leu Gln Asp Gln Tyr Ala Gln Lys Gln Thr Glu 50 55 60 Ala Ile Asp Ala Leu Asn Lys Ala Ser Ser Glu Asn Thr Gln Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu 85 90 95 Leu Ala <210> 60 <211> 142 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <400> 60 Ala Ser Ser Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Thr Ala Glu Leu Gly Ile 1 5 10 15 Ala Glu Asn Lys Lys Asp Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Ala Asn Glu 20 25 30 Asn Lys Asp Gly Ile Ala Lys Asn Gln Ala Asp Ile Gln Leu His Asp 35 40 45 Lys Lys Ile Thr Asn Leu Gly Ile Leu His Ser Met Val Ala Arg Ala 50 55 60 Val Gly Asn Asn Thr Gln Gly Val Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala 65 70 75 80 Lys Asn Gln Ala Asp Ile Ala Asn Asn Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu 85 90 95 Ala Gln Gln Gln Asp Gln His Ser Ser Asp Ile Lys Thr Leu Ala Lys 100 105 110 Val Ser Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ile Ala Lys Asn Lys Ala Glu Ala 115 120 125 Asp Ala Ser Phe Glu Thr Leu Thr Lys Asn Gln Asn Thr Leu 130 135 140

Claims

도 6에 나타낸 서열 잔기 527 내지 623으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열 및 도 28에 나타낸 서열 정렬에서 확인된 보존성 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 분리된 폴리펩타이드.
제1항에 있어서, 보존성 서열이,

QHSSDIKTLK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA,

DIAQNQT,

DIQDLAAYNELQD,

QTEAIDALNKASS,

TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK,

NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK,

NQADIANNIKNIYELA,

NQADIANNI 및

NIYELA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분리된 폴리펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 절단된 UspA1 단백질인 분리된 폴리펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 암배아성 항원 관련 세포 접착 분자(CEACAM) 수용체와 결합하는 분리된 폴리펩타이드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 비히클, 부형제, 결합제, 담체 또는 방부제를 포함하는 약제.
감염 치료 또는 예방을 위한 제5항에 따른 약제의 용도.
질환을 일으키는 병원체의 세포 표적에 CEACAM 수용체가 관여하는 질환의 치료 또는 예방을 위한 제5항에 따른 약제의 용도.
제7항에 있어서, 감염, 호흡기 질환, 신생물 질환, 신생물 질환과 관련된 증상, 혈관형성, 충치 및 잇몸 질환의 치료 또는 예방을 위한 용도.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 감염이 점막에 존재하거나, 이를 통해 발생되는 용도.
제9항에 있어서, 감염이 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 또는 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis)에 의해 유발되는 용도.
제9항에 있어서, 감염이 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)에 의해 유발되는 용도.
중이염의 예방 또는 치료를 위한, 제5항에 따르는 약제의 용도.
모방 능력 또는 하기 폴리펩타이드와의 상동성에 대해 잠재적인 치료학적 제제를 스크리닝함을 포함하는, 치료제로서 사용하기 위한 신규 차단 시약을 동정하는 스크리닝 분석에서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 비히클, 부형제, 결합제, 담체 또는 방부제를 포함하는 백신.
제5항에 따른 유효량의 약제를 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 개인의 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
첨부된 도면의 도 6을 참조로 실질적으로 본원중에 기재되고 설명된 바와 같은 폴리펩타이드.
제16항의 폴리펩타이드를 포함하는, 실질적으로 본원중에 기재된 바와 같은 약제.
질환을 유발하는 병원체의 세포성 표적화에 CEACAM 수용체가 관여되는 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서, 도 6에 나타낸 서열의 잔기 527 내지 623으로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 아미노산 서열 및 도 28에 나타낸 서열 정렬에서 확인된 보존성 서열 또는 CEACAM 결합 능력을 보유하고 있는 이의 단편 또는 기능성 등가물을 포함하거나 이들로 이루어진 CEACAM 수용체 결합 리간드의 용도.
제18항에 있어서, 보존성 서열이,

QHSSDIKTLK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADLTKDIK,

NVEEGLLDLSGRLIDQKADIAKNQA,

DIAQNQT,

DIQDLAAYNELQD,

QTEAIDALNKASS,

TAELGIAENKKDAQIAKAQANENKDGIAK,

NQADIQLHDKKITNLGILHSMVARAVGNNTQGVATNKADIAK,

NQADIANNIKNIYELA,

NQADIANNI 및

NIYELA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
제18항 또는 제19항에 있어서, 질환이 감염, 호흡기 질환, 신생물 질환, 신생물 질환과 관련된 증상, 혈관형성, 충치 및 잇몸 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 병원체가 점막을 감염시키거나 이를 통해 침입하는 용도.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 질환을 유발하는 병원체가 네이세리아 메닝기티디스, 해모필루스 인플루엔자 또는 모락셀라 카타르할리스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 감염을 유발하는 병원체가 푸소박테리움 뉴클레아툼인 용도.
제22항 또는 제23항에 있어서, 질환이 중이염인 용도.