JP5292303B2 - 新規アジュバント - Google Patents
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Description
βヘマチンを以下の方法で作製した。
b Derf2 1μg+βヘマチン 1mM+アラムアジュバント100μg
c Derf2 2μg+アラムアジュバント100μg
d Derf2 1μg+アラムアジュバント100μg
ワクチン接種動物として約5ヶ月齢のビーグル犬を用いた。
b Derf2 100μg+βヘマチン7.5μM+アラムアジュバント 0.5mg
c Derf2 100μg+アラムアジュバント 0.5mg
d Derf2 100μg+βヘマチン15μM
e Derf2 100μg+βヘマチン7.5μM
f Derf2 100μg
ワクチン接種動物として約5ヶ月齢のビーグル犬を用いた。
b Derf2 100μg+βヘマチン1mM+アラムアジュバント1mg
c Derf2 100μg+アラムアジュバント1mg
2 Derf2 100μg+βへマチン1mM+アラムアジュバント1mg 投与3週間後採血
3 Derf2 100μg+アラムアジュバント1mg 投与3週間後採血
4 Derf2 100μg+βへマチン2mM+アラムアジュバント1mg 投与4週間後採血
5 Derf2 100μg+βへマチン1mM+アラムアジュバント1mg 投与4週間後採血
6 Derf2 100μg+アラムアジュバント1mg 投与4週間後採血
図5に示すように、βヘマチンを添加した場合にIgG2抗体価は著しく上昇した。また、投与4週間後に採血した血清においては、βヘマチン投与量が多い方がIgG2抗体価が上昇した。いずれのイヌ個体においてもIgG1抗体価の上昇は認められなかった。
牛乳房炎ワクチンのアジュバントにβヘマチンを用いた場合の抗体誘導能をマウスを用いて評価した。
Escherichia coli J5株をワクチン抗原として用いた。
保存菌液をTryptic Soy Broth(BD Difco製)1Lに加え、37℃で6時間振盪培養した。遠心分離(10,000rpm ,10min)後、菌体を0.4%ホルマリン加PBS 100mLに懸濁し、25℃で一昼夜攪拌して不活化した。不活化菌液を遠心分離し、菌体をPBS 100mLに再懸濁後、同じく遠心分離した。この菌体洗浄操作を計3回行い、得られた菌体をPBS 50mLに懸濁したものを抗原液原液とした。尚、培養後の菌液についてはTryptic Soy Brothを用いて10倍階段希釈後、各希釈液をTryptic Soy Agar(BD Difco製)へ塗抹し、菌数を求めた。
マウス35頭を7頭ずつ以下の試験群(5群)に区分した。
βヘマチン40μM投与群 7頭
βヘマチン20μM投与群 7頭
βヘマチン無投与群 7頭
非接種群 7頭
4 供試動物
5週齢のマウス(ddy、 ♀)35頭を用いた。
5 ワクチン調製
PBSで109 CFU/mLに調製した不活化菌液に、ワクチン接種量0.5mL中に100、40又は20μMとなるようにヘマチンを調整し、水酸化アルミニウムゲル(アラム)40μgを加えた。βヘマチン添加ワクチンを作製し、PBSで109 CFU/mLに調製した不活化菌液に水酸化アルミニウムゲルのみ40μgを加え、βヘマチン無添加ワクチンを作製した。
マウスは導入後1週間予備飼育後、調製したワクチンを2週間間隔で0.5mLずつ皮下投与した。導入後1週間毎に、尾静脈より採血し、また2回目ワクチン投与後2週間目に全採血し、得られた血清を用いてELISA法により抗体価を測定した。
Escherichia coli J5株の抗血清をイムノプレートに固相化し、0.1%ゼラチン加PBS(希釈液)でブロッキング後、E.coli J5株不活化抗原液をさせたものを抗原吸着プレートとした。被検血清を希釈液で100倍に希釈したものを原液として、さらに2倍階段希釈した。これら希釈血清0.05mLを抗原吸着プレートに加え、4℃で一晩反応させた。0.05%Tween20加PBS(洗浄液)で5回洗浄後、各ウエルに標識抗体(ペルオキシターゼ標識抗マウスIgG1及びIgG2a抗体をブロッキング液で希釈したもの)を0.1mLずつ加え、37℃で1時間反応させた。洗浄液で5回洗浄後基質液(2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)二アンモニウム塩45mgを1mLの水に溶解し、この0.15mLと5%過酸化水素水0.05mLを基質緩衝液(A液(クエン酸一水和物21.0gを水に溶解し、全量を1,000mLとしたもの)とB液(クエン酸三ナトリウム二水和物29.4gを水に溶解し、全量を1,000mLとしたもの)を混合し、pH4.0に調整)10mLに加えたものを各ウエルあたり0.1mLずつ加え、37℃で20分間反応させた。その後、0.32%フッ化ナトリウム溶液を各ウエルに0.05mLずつ加えて反応を停止させ、波長415nmの吸光度を測定した。血清対照の平均吸光度値の2倍をカットオフ値とし、これ以上の吸光度値を示した血清の最高希釈倍数の逆数を抗体価とした。
豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus/PRRSV)の野外株(不活化)を用い、βヘマチンの感染症に対するアジュバント効果についてマウスを用いた検討した。
日本全薬工業株式会社で分離・保存したPRRSV JFS04-07株、05-01株、05-02株及び05-03株をそれぞれMARC145細胞(PRRSV感受性アカゲサル腎臓由来細胞)に接種し、CPEの出現を観察した。約1週間後にCPEが認められたPRRSV JFS04-07株を本実施例に使用した。それぞれの株について、PCR法でPRRSV遺伝子の検出を行ったところ、PRRSV JFS04-07株以外の3株については遺伝子の増幅が見られなかった。
175Tフラスコ16本に播種したMARC145細胞にPRRSV JFS04-07株を接種し、CPE確認後凍結・融解を3回行い、5,000rpm,30分間遠心分離して約800mLの培養上清を回収した。30%スクロースをクッションとして、この培養上清を35,000rpm,4時間遠心した。遠心後、得られたペレットを6mLのPBSで懸濁した。
βヘマチン(10μM)添加群、βヘマチン(5μM)添加群、βヘマチン無添加群及び対照群の計4群を以下のように設定した。対照群は1頭とし、それ以外の群は各7頭とした。βヘマチンは接種量200μL中に10μM又は5μMとなるように調製し、水酸化アルミニウムゲル(Alum)80μgを加えた。
(ii) 不活化PRRSV+βヘマチン(5μM)+Alum投与群(βヘマチン添加群)
(iii) 不活化PRRSV+Alum投与群(βヘマチン無添加群)
(iv) 対照群(無投与)
試験には、生後5週齢のBALB/c(♀)マウスを使用した(生後4週齢で導入し、1週間馴致)。免疫は2週間隔で2回、マウス1匹あたり200μLずつ腹腔内に投与した。2回目の免疫からさらに2週間後、心臓から全採血し、血清を採取した。採取した血清はエッペンドルフチューブに入れ、-20℃で保管した。
175Tフラスコ24本に播種したMARC145細胞にPRRSV JFS04-07株を接種し、CPE確認後凍結・融解を3回行い、5,000rpm,30分間遠心分離して約1,200mLの培養上清を回収した。30%スクロースをクッションとして、この培養上清を35,000rpm,4時間の条件下で遠心した。遠心後、ペレットを7mLのPBSで懸濁した。
採取したマウス血清と作製したELISA用抗原を用い、Box TitrationによるELISA系の構築を行った。これにより、固相化には1.2μg/mLのELISA用抗原を用いることとした。マウス血清は8,000倍から2倍階段希釈し、2次抗体にはHRP標識抗マウスtotal IgG抗体、抗マウスIgG1抗体及び抗マウスIgG2a抗体を用いた。2次抗体反応後TMB試薬で発色し、発色反応停止後、450nm/570nmのOD値を測定した。
(対照群のOD値の平均)×2
をカットオフ値とし、これ以上の値を抗体価とした。
リンパ球混合反応によるβヘマチンの樹状細胞に対する活性化作用についての検討
同種異系マウスC3H由来T細胞は活性化したRAW-Blue cells(単球系セルラインであるBalb/c由来細胞)上に発現するMHC分子を非自己の抗原と認識して増殖性を示す。そこで、各条件下でRAW-Blue cellsを培養後、(C3H)由来T細胞と混合培養し、T細胞の増殖活性を測定することでβヘマチンによるRAW-Blue cellsに対する活性化能を評価した。
i)24 wellプレートに5×105 cells / well (0.5 mL/ well)でRAW-Blue cellsを播き,以下に示す各条件で48時間刺激・培養した。
βヘマチン添加群;0, 6.25, 12.5, 25, 50μL(/ well)
CpG添加群;0, 6.25, 12.5, 25, 50μg /mL(/well)
未添加群
ii)刺激培養後,RAW-Blue cellsを回収しマイトマイシンC処理した。
図14にβヘマチンの投与量に対するT細胞の増殖を示す。また、図15にβヘマチンとCpGのT細胞増殖に対する効果を示す。図14及び図15の結果は、リンパ球混合反応により、単球由来の細胞株であるRAW-Blue cellsがβヘマチンによって活性化されたことを示唆する。
ICRマウスにsarcorma180(S180)を皮下接種した胆癌マウスモデルを使用し、βヘマチンを接種した。免疫終了後、脾細胞のS180(抗原)に対する細胞障害活性及び脾細胞の抗原特異的な増殖性について測定した。
以下の各群(3匹/群)のワクチンを週1回、計3回腹腔内投与した。
群2:S180のlysate+Alum(βヘマチン-)
群3:S180のlysate+βヘマチン(0.1mMを0.5mL)+Alum(βヘマチン+)
この際、Alumは40mg/mLの濃度で使用した。
いずれのワクチン群についても皮下接種したS180に対する縮小効果、細胞障害活性の有意な上昇は認められなかったがβヘマチン含有ワクチン投与群のリンパ球(脾細胞)では、抗原に対する高い増殖性を示す傾向が認められた(図16)。
マウスを用いたβヘマチンの粘膜アジュバントとしての効果の確認(血清中IgG1及びIgG2a並びに気管支及び腸管洗浄液中IgAの測定)
方法
自社分離Staphylococcus aureus No.39株をホルマリンで不活化した全菌体を抗原とし、生後5週齢のbalb/cマウス(♀)に投与した。抗原量は1×109 CFUとした。ワクチン投与量は10μLとした。βヘマチンは、ワクチン投与量10μLに対して20μM、100μM及び500μMに調整したものを用いた。
(b)SA+Alum+βヘマチン(20μM)
(c)SA+Alum+βヘマチン(100μM)
(d)SA+Alum+βヘマチン(500μM)
この際、Alumは40mg/mLの濃度で使用した。
Claims (7)
- ヘモゾイン若しくはβヘマチン並びにアラムアジュバントを含む、アレルゲンワクチンと併用する、IgG2抗体又はIgG2a抗体の産生を上昇させる、ワクチンアジュバント組成物。
- Th1免疫反応を誘導する、請求項1記載のワクチンアジュバント組成物。
- 5μM〜2mMのヘモゾイン又はβヘマチンを含む、請求項1又は2に記載のワクチンアジュバント組成物。
- 粘膜ワクチンアジュバントである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のワクチンアジュバント組成物。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のワクチンアジュバント組成物及びアレルゲンワクチンを含むワクチン組成物。
- 粘膜ワクチンである、請求項5記載のワクチン組成物。
- アレルゲンが、花粉アレルゲン又はダニアレルゲンである、請求項5又は6に記載のワクチン組成物。
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