WO2017170592A1 - Ｍｄｃｋ細胞の培養方法 - Google Patents

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cell
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多恵 魚谷
宗一郎 桑原
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一般財団法人阪大微生物病研究会
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Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing MDCK cells using microcarriers and MDCK cells suitable for microcarrier culture.
  • the present invention also relates to a virus propagation method by culturing MDCK cells using a microcarrier.
  • a microcarrier culture method is known as a mass culture technique for cells having adhesiveness.
  • the microcarrier culture method introduces cells, culture solution, and microcarriers that serve as cell adhesion scaffolds into a culture container, and intermittently agitates the culture solution to bring the suspended cells and microcarriers into contact with each other. Is adhered to the surface of the microcarrier. By this method, the cells grow on the surface of the microcarrier.
  • Microcarriers can provide a very large surface area for cell attachment and growth relative to the volume ratio, and are suitable for mass culture of cells.
  • vaccine production One of the fields that utilize cell mass culture technology is vaccine production.
  • vaccine production after selecting host cells that are sensitive to the virus of interest, a large number of cells obtained by culture are infected with the virus, and the virus is propagated to produce a vaccine. Since a large amount of virus is required for practical use of a vaccine, it is necessary to prepare a large number of cells to be infected with the virus.
  • Influenza is an infectious disease that is prevalent all over the world every year, and there is a risk of pandemic, so it is necessary to secure a large amount of influenza vaccine.
  • a method for propagating an influenza virus using a growing chicken egg has been used. Since manufacturing methods using embryonated eggs have high hurdles for raw material procurement and quality control, methods for producing influenza viruses by growing them in cultured cells are being put into practical use. However, it has been regarded as a problem that the proliferation of viruses is poor in cultured cells, and the supply of a rapid and sufficient amount of vaccine is restricted. Therefore, there is an urgent need to build a system that can produce vaccines in large quantities and quickly.
  • Influenza vaccine production includes the steps of isolating or producing seed virus of influenza virus, the step of preparing the required amount of embryonated chicken eggs and cultured cells for growing seed virus, and the seed virus obtained by developing the eggs and cultured cells. It is comprised at the stage which is propagated using. Cultured cells can be used at each stage. Examples of traditional cultured cells used for the production of influenza vaccines include Madin-Derby canine kidney-derived cells (hereinafter MDCK cells), African green monkey kidney-derived cells (hereinafter Vero cells), and the like.
  • MDCK cells Madin-Derby canine kidney-derived cells
  • Vero cells African green monkey kidney-derived cells
  • Vero cells were isolated and established from kidney epithelial cells of African green monkeys (Cercopeticus aethiops) in 1962, and have been used for more than 20 years in the production of human vaccines against infections such as poliovirus and Japanese encephalitis virus. Vero cells are sensitive to a wide range of viruses and are also used to propagate influenza viruses. MDCK cells were established in 1958 from normal male cocker spaniel kidneys, and in 1968 Gauss et al. Revealed susceptibility to influenza virus. Increased sensitivity to influenza viruses by adding trypsin, glucose, vitamins, etc. to the culture medium of MDCK cells has been utilized for the separation of various influenza viruses.
  • Patent Document 1 discloses that an MDCK cell line (ATCC CCL-34) is acclimated to a serum-free medium, and an MDCK-33016 line capable of suspension (floating) culture has been established.
  • Patent Documents 2 and 3 disclose that the PTA-7909 and PTA-7910 strains capable of replicating cold-adapted influenza virus were cloned from the MDCK cell line (ATCC CCL-34). Has been.
  • MDCK cells infected with virus produce interferon that suppresses virus growth, they also have the property that the virus is less prone to grow than Vero cells that do not produce interferon.
  • microcarriers are used for mass culture of cells, it is difficult to say that a method for mass culture of MDCK cells using microcarriers has been established.
  • strong adhesion between the cells and the microcarriers is required.
  • the problem is that the adhesion between the cells and the microcarriers is weakened by repeating cell passage when the culture tank is scaled up.
  • stirring is accompanied. Therefore, it is considered that the cells are subjected to physical stress due to frequent contact of the cells with a stirring blade, a culture tank wall, or the like. As a result, there is a problem of a decrease in cell growth efficiency during mass culture of MDCK cells using microcarriers.
  • a medium supplemented with serum derived from animals such as cows and horses is generally used.
  • Serum serves as a source of hormones, growth factors, etc., and is useful for reducing physical stress due to culture operations.
  • supply of a large amount of hormones, growth factors, and the like is required due to the large-scale proliferation of cells accompanying an increase in culture efficiency.
  • the use of serum is a concern for safety and adaptability to production on a factory scale. For this reason, in cell culture using microcarriers, cells capable of growing in a serum-free medium are required.
  • An object of the present invention is to provide an MDCK cell suitable for culture using a microcarrier and a method for culturing the MDCK cell.
  • the present inventors have developed not only a high cell growth ability in a serum-free medium but also MDCK cells having a strong adhesion to microcarriers and a culture method using the cells. It was found to be suitable for culture using a microcarrier. Furthermore, the present inventors have found that the cells have a high expansion ratio on microcarriers when cultured in a serum-free medium, thereby completing the present invention.
  • the present invention comprises the following. 1. A method for culturing cloned MDCK cells, wherein the expansion ratio when culturing with a microcarrier is 4.5 or more. 2. 2. The method for culturing cloned MDCK cells according to item 1 above, wherein the cloned MDCK cells exhibit a cell floating rate of 20% or less. 3. 2. The cloned MDCK cell according to item 1 above, wherein the expansion rate of the cloned MDCK cell is that obtained by seeding and culturing the cloned MDCK cell at a cell seeding density of 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. Culture method. 4). 4.
  • a method for propagating a virus according to item 7 above comprising incubating MDCK cells after the virus infection. 9. 9. The method for propagating a virus according to item 7 or 8, wherein the virus is an influenza virus. 10.
  • a cloned MDCK cell having an expansion ratio of 4.5 or more when cultured using a microcarrier. 11. 11. The cloned MDCK cell according to item 10 above, wherein the expansion rate of the cloned MDCK cell is that obtained by seeding and culturing the cloned MDCK cell at a cell seeding density of 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less. . 12 12.
  • MDCK cells can be efficiently propagated from a low seeding density even in culture in a serum-free medium.
  • Example 1 It is a figure which shows the result of having confirmed the cell growth ability at the time of culturing cell lines A and B and Pre Cloning Cell using a microcarrier.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having confirmed the amount of medium components and the amount of metabolites in the culture solution at the time of culturing cell lines A and B and Pre Cloning Cell using a microcarrier.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having confirmed the floating whole cell density and the cell floating rate in the culture solution at the time of culturing cell lines A and B and Pre Cloning Cell using a microcarrier.
  • Example 2 It is a figure which shows the result of having confirmed the expansion magnification at the time of culture
  • Example 3 It is a figure which shows the result of having confirmed the expansion magnification at the time of culture
  • MDCK cells are animal cells established from the kidneys of normal male cocker spaniels in 1958 and are used for various purposes. Sensitivity to influenza virus was clarified by Gaush et al. In 1968, and it is also used for propagation and replication of influenza virus.
  • the cloned MDCK cells of the present invention are cells that have been subjected to single cell cloning after the MDCK cell population has been acclimated to a serum-free medium.
  • the cloned MDCK cells of the present invention include cells obtained by proliferating and / or passaging the cloned cells.
  • cells that are not single-cell cloned exist as a cell population containing a plurality of cells having various properties.
  • the MDCK cell population means cells that have not been single-cell cloned. Any MDCK cell population may be used, and an MDCK cell population obtained from a cell bank may be used. For example, cells specified by ATCC CCL-34 can be used.
  • the MDCK cell population can be stably cultured in the medium by being acclimated to the specific medium.
  • a medium supplemented with serum derived from animals such as cows and horses is generally used.
  • Serum serves as a source of hormones and growth factors, and also helps to reduce physical stress due to culture operations.
  • many problems arise with the use of serum One is safety concerns. There is a risk that virus, bacteria, mycoplasma, abnormal prion, which has become a problem with bovine spongiform encephalopathy (BSE), and the like are mixed through animal-derived serum. Another concern is adaptability to production on an industrial scale. Serum varies in quality and composition between lots. Such lot differences affect cell growth.
  • the cell population was conditioned to a serum-free medium before single cell cloning.
  • the serum-free medium for single cell cloning may contain growth factors and trace elements.
  • Growth factors contained in the medium release cell proliferation signals.
  • the type of growth factor in the medium during the acclimation process is thought to affect the character of the cell.
  • cells contained in the MDCK cell population are modified into cells capable of growing in a serum-free medium while affecting each other.
  • each MDCK cell is separated.
  • a limiting dilution method can be used as a method for separation.
  • the isolated cloned MDCK cell line is further cultured in a serum-free medium until confluent, and passage is performed to obtain a sufficient amount of cells. Thereafter, the properties of the cloned MDCK cell line can be evaluated, and a cloned MDCK cell line having suitable properties can be obtained.
  • the cloned MDCK cell line is evaluated for cell growth ability, seeding density, expansion ratio, virus sensitivity, etc., has high cell growth ability, is sensitive to multiple types of influenza viruses, and is also strong against microcarriers
  • a cloned MDCK cell line characterized by having adhesive strength can be selected. Although it has been difficult to select cells having both cell growth ability, virus sensitivity and strong adhesion to microcarriers, the inventors have intensively studied and found that the cells can be selected by the above-described cloning method. It was.
  • a specific evaluation means such as cell proliferation ability, the method described in Examples described later can be used.
  • the culture method of the present invention is characterized by using cells having strong adhesion (adhesion) to microcarriers.
  • the adhesion strength of cells to microcarriers can be expressed by the cell floating rate when cells are cultured in a culture solution containing microcarriers.
  • the culture method of the present invention is characterized by using cloned MDCK cells having a cell floating rate of 20% or less, preferably 15% or less, more preferably 10% or less, and particularly preferably 5% or less.
  • the cell floating rate is a value obtained by dividing the floating cell density after culturing MDCK cells for a certain time in the presence of the microcarrier by the seeded cell density. The lower the cell floating rate, the higher the adhesion to the microcarrier. Indicates.
  • the cell floating rate of the cloned MDCK cells of the present invention is such that the culture time is 48 hours or less, preferably 24 hours or less, preferably 6 hours or less, more preferably 1.5 hours or less, particularly preferably 0.5 hours or less. It is the one at the time. More specifically, it is preferable to use a cloned MDCK cell having a cell suspension rate of 20% or less after 0.5 hours or a cell suspension rate of 5% or less after 1.5 hours. In addition, it is estimated that a cell floating rate does not change a lot with the seeding density of a cell.
  • the culture method of the present invention is characterized by using cloned MDCK cells exhibiting an expansion ratio of 4.5 or more, preferably 6.5 or more, more preferably 8.5 or more.
  • the expansion magnification is a value obtained by dividing the cell density after culturing the cells for a certain period by the seeded cell density, and serves as an index indicating the ease of proliferation.
  • the expansion ratio of the cloned MDCK cell of the present invention is that when cultured with a microcarrier, and the culture time is 48 hours or more, preferably 60 hours or more, more preferably 72 hours or more, and 144 hours or less, Preferably, 120 hours or less, more preferably 96 hours or less has elapsed.
  • the expansion ratio in the present invention is 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, preferably 1.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, preferably 1.3 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or less, and more preferably.
  • seeding at a seeding density of 10 4 cells / cm 2 or more particularly preferably 0.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 or more.
  • cells can be cultured using the method described in Example 3 described later, and the expansion magnification can be confirmed.
  • the culture method of the present invention has an advantage that cells can be rapidly grown even at a low seeding density, and the time and cost for scale-up can be saved.
  • the cloned MDCK cell in the present invention is not particularly limited as long as it has the above cell floating rate and / or expansion ratio.
  • Cells obtained by proliferating and / or subcultured cells selected by the above cloning method are also included in the cloned MDCK cells of the present invention.
  • Cell passage can be performed by known methods. After cell culture with microcarriers, the cells have grown and as a result are densely adhered onto the microcarrier surface. In passaging, the densely adherent cells are moved onto the new microcarrier surface. For example, the cells can be removed from the microcarrier using a protease such as trypsin or collagenase, then these cells are washed and diluted in a medium containing the microcarrier.
  • a protease such as trypsin or collagenase
  • the cloned MDCK cell in the present invention is an MDCK cell specified by the international deposit number NITE BP-022014.
  • Such cells were commissioned on March 4, 2015, to the Patent Microorganism Deposit Center (Postal Code 292-0818, 2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu, Chiba, Japan) After being deposited in Japan as number NITE P-0214, it was requested to be transferred to the international deposit based on the Budapest Treaty at the Patent Microbiology Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, and received under the deposit number NITE BP-0214 is there.
  • the MDCK cell identified by the accession number NITE BP-0214 is, as shown in Example 1 described later, based on MDCK cells (derived from ATCC CCL-34), and after single cell cloning by the limiting dilution method, It has been elected.
  • the culture method of the present invention includes culturing cloned MDCK cells using a microcarrier.
  • a microcarrier is a fine particle that can be cultured with cells attached to the surface.
  • the surface of the microcarrier is not particularly limited as long as it is a material to which cells can adhere, and the microcarrier used in the present invention is not particularly limited.
  • the material for the microcarrier include dextran, gelatin, collagen, polystyrene, polyethylene, polyacrylamide, glass, and cellulose.
  • dextran is preferable.
  • the shape of the microcarrier include a spherical shape (bead) and a disk shape. The shape of the microcarrier is preferably spherical.
  • the size (diameter) of the spherical microcarrier is, for example, about 0.01 to 1 mm, preferably about 0.05 to 0.5 mm, and more preferably about 0.1 to 0.3 mm.
  • the microcarrier may be porous.
  • Examples of the spherical microcarrier used in the present invention include Cytodex 1 (trade name), Cytodex 3 (trade name), Cytopore (trade name) (hereinafter, GE Healthcare Life Science) and the like.
  • Examples of the disk-shaped microcarrier include Cytoline 1 (product name), Cytoline 2 (product name) (hereinafter, GE Healthcare Life Science) and the like.
  • porous microcarrier examples include Cytopore (trade name), Cytoline 1 (trade name), Cytoline 2 (trade name) (hereinafter, GE Healthcare Life Science) and the like.
  • Other commercially available microcarriers include Biosilon (trade name) (NUNC), Hillex (trade name) (Solo Hill), Corning (registered trademark) microcarrier (Corning), and the like.
  • the microcarrier used in the present invention is particularly preferably a spherical dextran microcarrier.
  • Cytodex 1 (trade name), Cytodex 3 (trade name) and Cytopore (trade name) are preferable, and Cytodex 1 (trade name) and Cytodex 3 (trade name) are particularly preferable. 1 (trade name) is preferred.
  • the seeding density of the cloned MDCK cells in the culture method of the present invention is not particularly limited and can be adjusted as appropriate.
  • the seeding density (cells / cm 2 ) in this specification means the cell density per culture surface area when seeding cells.
  • the density of the cell in a culture medium can be confirmed with a well-known method, it can confirm with the measuring method using a hemocytometer or an automatic cell counter etc., for example.
  • the seeding density in this specification is the cell density per microcarrier surface area when seeding cells.
  • the medium for culturing the cloned MDCK cells of the present invention is not particularly limited, but a serum-free medium to which no animal-derived serum is added is preferred. Any serum-free medium may be used, such as Eagle MEM medium (Nissui Pharmaceutical), OptiPRO SFM (Thermo Fisher Scientific), VP-SFM (Thermo Fisher Scientific), EX-CELL MDCK (SAFC MDCK, SAFC MDCK (c) (Lonza), ProVero 1 (Lonza), BalanCD MDCK (Irvine Scientific), etc. can be used.
  • the culture conditions such as the density of microcarriers, the number of stirring revolutions, the dissolved oxygen concentration, and the culture temperature may be any as long as the cells can grow and can be adjusted as appropriate. In the culture method of the present invention, even when the stirring rotation speed is about 30 to 60 rpm, the cells adhere well to the microcarriers and can efficiently proliferate.
  • the cloned MDCK cell of the present invention can be used in a method for growing a virus capable of infecting MDCK cells, a method for producing substances such as metabolites produced by MDCK cells, and the like.
  • the MDCK cell of the present invention can be used in a method for propagating a virus capable of infecting MDCK cells.
  • a virus capable of infecting MDCK cells any virus can be used as long as MDCK cells are sensitive, and examples thereof include orthomyxovirus, paramyxovirus, rhabdovirus and flavivirus.
  • influenza virus will be described as an example.
  • influenza virus to which the cloned MDCK cell of the present invention is sensitive is not particularly limited. For example, all currently known subtypes and future isolated and identified subtypes are also included.
  • influenza A virus it is classified into subtypes (ie, 16 HA (H1-H16) subtypes and 9 NA (N1-N9) subtypes) based on the antigenicity of their HA and NA molecules
  • Influenza viruses containing a combination of HA subtypes and NA subtypes are contemplated.
  • influenza B virus an influenza virus including a combination of Victoria strain and Yamagata strain is considered.
  • influenza A virus Since each subtype of influenza A virus has high variability in RNA genome, new strains are frequently generated. In April 2009, after the epidemic in Mexico was recognized, the flu that has been spread worldwide is called new influenza, swine flu, pandemic influenza A (H1N1), sine flu, A / H1N1 pdm, etc. ing. Viruses that were prevalent among pigs were directly transmitted from pigs to humans at farms, etc., and then spread among humans. The seasonal influenza A influenza virus (flu A type A virus H1N1 subtype) and A Hong Kong type influenza (influenza A virus H3N2 subtype) are distinguished. In addition, due to the high variability of the RNA genome, virus strains are distinguished by the time and place of isolation among the same subtypes of influenza A virus.
  • Influenza B virus continues to undergo irreversible antigenic mutations, but is relatively later than mutations in influenza A virus, and the epidemic cycle is about two years. Since influenza B virus was first isolated in 1940 during a medium-scale influenza epidemic in New York, frequent epidemics have been recorded, resulting in increased mortality. Infection has been confirmed only among humans, but there is no subtype, and there are only two lines, the Yamagata line and the Victoria lineage.
  • influenza virus used in the present invention is not only the influenza virus isolated from the living body as described above, but also attenuated, chicken egg growth adaptation, cell culture growth adaptation, temperature sensitive phenotype so that it can be applied to influenza vaccines. It may be a recombinant virus produced by modification such as adaptation to mucosal administration.
  • RNA segments such as influenza virus antigenic sites and polymerase sites, and reverse genetics
  • the RNA segments of strains with high growth potential and the target antigenicity Various methods such as a method of recombining the RNA segment shown, a method of producing an attenuated virus by low-temperature passage, and a method of adding a mutagen to a virus culture system can be mentioned.
  • the culture time of the cloned MDCK cell in the culture method of the present invention is not particularly limited as long as it is suitable for scale-up.
  • the culture time is 48 hours or longer, preferably 60 hours or longer, more preferably 72 hours or longer, 144 hours or shorter, preferably 120 hours or shorter, more preferably 96 hours or shorter.
  • the scale-up procedure is the same as the passage.
  • the time at which the influenza virus is infected with the cloned MDCK cells is not particularly limited, and may be any time suitable for practical use. For example, after scale-up, when cells become confluent, it is preferable to infect influenza virus and then incubate the cells for a certain period of time.
  • the incubation time is not particularly limited. Incubation means that the cells are maintained under a certain condition for a certain period of time, and it does not matter whether or not the cells grow by incubation. Incubation can also be performed under the same conditions as in culturing cells, but is preferably performed under optimal conditions for the infected virus.
  • Influenza viruses that infect MDCK cells are called seed viruses.
  • Influenza virus is isolated from a living body or produced by some modification, and then passaged and propagated using chicken eggs and various cells to become a seed virus.
  • the seed virus used in the present invention may be one that has been passaged in any of chicken eggs and various cells, and is not particularly limited. More preferably, the influenza virus is propagated by infecting the cloned MDCK cells with the seed virus that has been passaged and propagated by MDCK cells in the culture method of the present invention.
  • influenza virus propagated by the culture method of the present invention is used for the production of influenza vaccines.
  • any known method or any method developed in the future may be used.
  • Example 1 Production and selection of cloned MDCK cells Single-cell cloning (1) Culture in serum-containing medium MDCK cells (ATCC No. CCL-34, Lot 1166395, passage number 53) obtained from ATCC are thawed and eagle containing 10% fetal calf serum (hereinafter FCS) MEM medium (Nissui Pharmaceutical) was added and washed by centrifugation. An eagle MEM medium containing 10% FCS was added to the pellet and suspended, and cultured in a T75 flask. The cells cultured for 5 days at 37 ° C. ⁇ 1 ° C.
  • FCS fetal calf serum
  • Pre Cloning Cell Single cell cloning of serum-free conditioned MDCK cells
  • Pre Cloning Cell Single cell cloning of the ATCC-derived serum-free conditioned MDCK cell population (hereinafter referred to as Pre Cloning Cell) obtained in (2) is performed by limiting dilution, and cell proliferation is improved. A cell line with excellent and uniform morphology was selected.
  • the specific procedure for cloning is as follows. Pre Cloning Cell was thawed and cultured in a T25 flask using serum-free medium OptiPRO SFM. The cells cultured at 37 ° C. ⁇ 1 ° C. for 3 days were washed with a PBS solution containing 1 mM EDTA-4Na, and then TrypLE Select was added to separate the cells from the incubator.
  • OptiPRO SFM was added to the cells, centrifuged and washed, and OptiPRO SFM was added to the resulting pellet to resuspend the cells. The number of cells in this cell suspension was counted, and a cell suspension of 5 cells / mL was prepared. In each well of a 96-well plate, 100 ⁇ L of 5 cell / mL cell suspension was seeded, and the wells in which only one cell was seeded were marked and cultured. After the cells in the marked wells reached confluence, they were detached with TrypLE Select and subcultured to 24-well plates. In order to remove TrypLE Select in the medium, the culture medium in the well was completely removed on the next day after passage and replaced with fresh medium. Similarly, the passage was repeated with a 6-well plate and a T75 flask, and when a sufficient cell amount was obtained, the cloned MDCK cell line was stored frozen (passage number 63).
  • an infectious titer of the virus culture supernatant As a result of measuring the infectious titer of the virus culture supernatant, an infectious titer of 7.0 log 10 TCID 50 / mL or more was obtained for any of the cloned MDCK cell lines for all virus strains.
  • cloned MDCK cell line Based on the above evaluation results, it can be cultured in serum-free medium, is sensitive to multiple subtypes of influenza virus, and has strong adhesion to microcarriers ATCC-derived serum-free conditioned cloned MDCK cell line A (hereinafter cell line A) was selected. Cytodex 1 (GE Healthcare Life Science) was used as the microcarrier. On the other hand, a cloned MDCK cell line B (hereinafter referred to as cell line B), which has a weaker adhesion to microcarriers than cell line A but has similar properties to cell line A, was selected for comparison.
  • cell line B a cloned MDCK cell line B (hereinafter referred to as cell line B), which has a weaker adhesion to microcarriers than cell line A but has similar properties to cell line A, was selected for comparison.
  • Cell line A is registered with the Patent Microorganisms Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (Postal Code 292-0818, 2-5-8 Kazusa Kamashichi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) under the accession number NITE P-0214. (Receipt date: March 4, 2015), requested to be transferred to the International Deposit under the Budapest Treaty at the Patent Microbiology Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation, and received with the deposit number NITE BP-0214 It was done.
  • a / Ibaraki / N12073 / 2011 H1N1) pdm09 (hereinafter TA-73) ), A / Ibaraki / N12232 / 2012 (H3N2) (hereinafter referred to as TA-232), B / Ibaraki / N12322 / 2012 (hereinafter referred to as TA-322), and B / Ibaraki / N12336 / 2012 (hereinafter referred to as TA-336).
  • an Eagle's MEM medium supplemented with 4 mM glutamine, 4.7 g / L glucose, 20 mM sodium bicarbonate and 0.1 ⁇ TrypLE Select was used, and cultured under conditions of 34 ° C. and 5% CO 2. Went. After virus infection, the culture supernatant from the first day to the third day of culture was sampled, and the HA value and the infectious value were measured. For HA-73, TA-322 and TA-336, 0.5% chicken erythrocytes were used for 1 hour reaction at room temperature, and for TA-232, 1.0% guinea pig erythrocytes were used at 4 ° C. For 1.5 hours.
  • the unit of the infectious titer is log 10 TCID 50 / mL.
  • the results of HA titers on the first to third days (1 to 3 dpi) after influenza virus infection are shown in Table 2 below, and the results of infection titers are shown in Table 3 below.
  • a graph summarizing these results is shown in FIG. In FIG. 1, the solid line is the infection value, and the broken line is the HA value.
  • Example 2 Culture of Cloned MDCK Cell Line Using Microcarrier Cell line A was cultured in serum-free medium OptiPRO SFM (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 4 mM glutamine. As control cells, cell line B and Pre Cloning Cell were used. Cells were seeded at a seeding density of 2.3 ⁇ 10 4 cells / cm 2 . Cytodex 1 (GE Healthcare Life Science) was used as a microcarrier at a density of 3.5 g / L. The culture conditions were 15 rpm until 48 hours of culture, 30 rpm after 48 hours, pH 7.0, temperature 37.0 ° C., and dissolved oxygen concentration (DO) 3.00 ppm. Aeration was performed with a perforated tube. As a culture vessel, a bioreactor having a capacity of 3 L was used.
  • the number of cells in the culture solution was confirmed by a technique in which a part of the culture solution was collected and the cells adhered to the microcarriers were dispersed using trypsin.
  • a cell autoanalyzer (Beckman Coulter) was used to measure the number of cells.
  • the concentration of the metabolite was confirmed using a bioprocess analyzer Cedex Bio (Roche Diagnostics).
  • the results of confirming the cell growth ability of each cell line are shown in FIG.
  • the solid line in FIG. 2 indicates the number of cells adhering to the microcarrier, and the broken line indicates the number of cells floating in the culture supernatant. Each cell line cannot grow in a floating state and die. Compared with Pre Cloning Cell and Cell Line B, the number of cells floating in the supernatant was smaller than that of Pre Cloning Cell and Cell Line B, so that it was confirmed that cell line A had strong adhesion to microcarriers. Cell line A grew to 6.9 ⁇ 10 4 cells / cm 2 on the third day of culture. On the other hand, cell line B and Pre Cloning Cell required 4 days to grow to the same extent.
  • concentration of the culture-medium component and the metabolite of a cell which exist in a culture medium is shown in FIG.
  • Example 3 Confirmation of Expansion Magnification of Cloned MDCK Cell Line
  • the cell line A was seeded at the following cell seeding densities a to d and cultured. Pre Cloning Cell was used as a control.
  • a 2.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 (17.6 ⁇ 10 4 cells / mL)
  • b 1.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 (8.8 ⁇ 10 4 cells / mL)
  • c 0.6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 (5.3 ⁇ 10 4 cells / mL)
  • d 0.3 ⁇ 10 4 cells / cm 2 (2.6 ⁇ 10 4 cells / mL)
  • the culture volume was 400 mL, and agitation culture was performed at 60 rpm in the presence of 37.0 ° C. and 5% CO 2 . Cytodex 1 was used as the microcarrier.
  • the density of the microcarrier is 2.0 g / L.
  • Example 4 Transfer of cloned MDCK cell line between microcarriers Cell line A was transferred from microcarriers to microcarriers under the following conditions. Further, after the transfer, influenza virus was infected, and the HA titer and infectious titer of the virus were measured by the same method as in Example 1.
  • influenza virus was inoculated into cells when MDCK cells became confluent.
  • the working volume at the time of influenza virus inoculation was 20 L, and the viable cell density was 12.8 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 16.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • Eagle MEM medium supplemented with 4 mM glutamine, 3.6 g / L glucose, 20 mM sodium hydrogen carbonate and 0.1 ⁇ TrypLE Select was used.
  • the cells were cultured under the culture conditions of 20 to 60 rpm with stirring, pH 7.0, temperature 34.0 ° C., and dissolved oxygen concentration (DO) 3.00 ppm.
  • DO dissolved oxygen concentration
  • the culture supernatant was sampled every day until the fourth day of culture, and the infectivity titer was measured.
  • the highest infectious titer value was defined as the peak infectious titer (log 10 TCID 50 / mL).
  • the infectivity titer was measured in the same manner as in Example 1.
  • the cell line A exhibits a high cell growth ability in microcarrier culture, so that a large amount of cells can be prepared at the start of virus culture, and that it exhibits high virus growth ability even after transfer to microcarriers.
  • MDCK cells can be efficiently proliferated using microcarriers. Furthermore, since the virus can be efficiently propagated by using the culture method of the present invention, it is possible to produce an efficient vaccine, which is industrially superior. For practical use in vaccine production, culturing in a large volume is indispensable. However, according to the method for culturing such cells using the MDCK cells and microcarriers of the present invention, a high expansion ratio on the microcarriers and / or microcarriers. There is an advantage that the cost and time of scale-up can be saved due to the high adhesive strength to.

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Abstract

本発明は、マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が４．５以上を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞及び当該ＭＤＣＫ細胞の培養方法、当該ＭＤＣＫ細胞の培養方法を用いてウイルスを増殖する方法、及びマイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が４．５以上を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞に関する。

Description

ＭＤＣＫ細胞の培養方法
　本発明は、マイクロキャリアを用いたＭＤＣＫ細胞の培養方法及びマイクロキャリア培養に適したＭＤＣＫ細胞に関する。また本発明は、マイクロキャリアを用いてＭＤＣＫ細胞を培養することによる、ウイルスの増殖方法にも関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２０１６－６５２５１号優先権を請求する。
　近年、医薬品生産や再生医療等の様々な分野において、細胞、組織、微生物等を効率良く大量に培養することが求められている。特に、バイオ医薬品や再生医療の実用化のためには、細胞の大量培養技術の確立が重要である。細胞の大量培養は、モノクローナル抗体、組換え蛋白質、膜蛋白質、ウイルス等の生産スケールへの移行を可能とし、バイオ医薬品等の実用化を大きく推進させるものと期待される。
　接着性を有する細胞の大量培養技術としては、マイクロキャリア培養法が知られている。マイクロキャリア培養法は、培養容器内に細胞、培養液及び細胞の接着足場となるマイクロキャリアを導入し、培養液を間欠的に撹拌して、浮遊した細胞及びマイクロキャリアを接触させることにより、細胞をマイクロキャリアの表面に接着させる方法である。この方法により、細胞はマイクロキャリアの表面上で増殖する。マイクロキャリアは、体積比に対し、細胞が接着及び増殖するための非常に大きな表面積を提供することが可能であり、細胞の大量培養に適している。
　細胞の大量培養技術を利用する分野のひとつとして、ワクチン製造が挙げられる。ワクチン製造では対象となるウイルスに対して感受性を示す宿主細胞を選択した後、培養して得られた大量の細胞にウイルスを感染させ、ウイルスを増殖させてワクチンを製造する。ワクチンの実用化のためには大量のウイルスが必要となるため、ウイルスを感染させる細胞を大量に用意する必要がある。
　インフルエンザは毎年世界中で流行する感染症であり、パンデミックの恐れもあるため、大量にインフルエンザワクチンを確保することが必要とされている。インフルエンザワクチンの製造には、発育鶏卵を利用してインフルエンザウイルスを増殖させる方法が用いられてきた。発育鶏卵を利用した製造方法は原料調達や品質管理のハードルが高いことから、培養細胞でインフルエンザウイルスを増殖させて製造する方法が実用化されつつある。しかしながら、培養細胞ではウイルスの増殖性が悪く、迅速かつ十分な量のワクチン供給に制約が生じることについて問題視されている。そこで大量かつ迅速にワクチン生産を行うことができるシステムの構築が急務となっている。
　インフルエンザワクチンの製造は、インフルエンザウイルスのシードウイルスを分離又は作出する段階、シードウイルスを増殖させるための発育鶏卵や培養細胞を必要量用意する段階、及び得られたシードウイルスを発育鶏卵や培養細胞等を用いて増殖させる段階で構成される。培養細胞は、各々の段階において用いることができる。インフルエンザワクチンの製造に用いられる伝統的な培養細胞として、マディン－ダービーイヌ腎臓由来細胞（以下、ＭＤＣＫ細胞）やアフリカミドリザル腎臓由来細胞（以下、Ｖｅｒｏ細胞）等が挙げられる。Ｖｅｒｏ細胞は、１９６２年にアフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ　ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎臓上皮細胞から分離及び樹立され、ポリオウイルスや日本脳炎ウイルス等の感染症に対するヒト用ワクチンの製造に２０年以上前から使用されてきた。Ｖｅｒｏ細胞は、広範囲のウイルスに対する感受性を持ち、インフルエンザウイルスの増殖にも用いられている。ＭＤＣＫ細胞は１９５８年に正常な雄のコッカースパニエルの腎臓から樹立された細胞であり、１９６８年にＧａｕｓｈらによってインフルエンザウイルスに対する感受性が明らかにされてきた。ＭＤＣＫ細胞の培養液にトリプシン、グルコース、ビタミン等を添加することにより、インフルエンザウイルスに対する感受性が高まることが、各種インフルエンザウイルスの分離に利用されてきた。
　インフルエンザウイルスを増殖させる段階に用いるＭＤＣＫ細胞について、開発が試みられている。例えば、特許文献１には、ＭＤＣＫ細胞株（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－３４）を無血清培地に馴化させ、懸濁（浮遊）培養が可能なＭＤＣＫ－３３０１６株を樹立したことが開示されている。また、特許文献２及び特許文献３には、低温適合性インフルエンザウイルスを複製することが可能なＰＴＡ－７９０９株及びＰＴＡ－７９１０株を、ＭＤＣＫ細胞株（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－３４）からクローニングしたことが開示されている。一方で、ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞はウイルス増殖を抑制するインターフェロンを産生するため、インターフェロンを産生しないＶｅｒｏ細胞と比べ、ウイルスが増殖しにくいという性質も有する。
　マイクロキャリアは細胞の大量培養に利用されているが、マイクロキャリアを用いたＭＤＣＫ細胞の大量培養方法が確立されているとはいい難い。ＭＤＣＫ細胞がマイクロキャリア上において高い増殖効率を示すためには、細胞とマイクロキャリアの強い接着力が要求される。しかしながら、培養槽をスケールアップする際に細胞継代を繰り返すことにより、細胞とマイクロキャリアの接着力が弱まることが課題となっている。さらに、マイクロキャリアを用いてＭＤＣＫ細胞を培養する際は撹拌を伴うため、細胞が撹拌翼や培養槽壁等と頻繁に接触することで、細胞が物理的ストレスを受けると考えられる。これにより、マイクロキャリアを用いたＭＤＣＫ細胞の大量培養時に、細胞の増殖効率の低下が問題となっている。
　細胞を大量培養する際、一般的にウシやウマ等の動物由来血清を添加した培地が用いられる。血清はホルモンや成長因子等の供給源となり、また培養操作による物理的ストレスの軽減に役立つ。マイクロキャリアを用いて細胞を培養する場合、培養の効率化に伴う細胞の大量増殖により、多量のホルモンや成長因子等の供給が要求される。しかし、血清の使用は安全性や工場規模での生産への適応性に対する懸念がある。そのため、マイクロキャリアを用いた細胞培養において、無血清培地で増殖可能な細胞が求められている。
国際公開ＷＯ１９９７／０３７０００ 国際公開ＷＯ２００８／１０５９３１ 国際公開ＷＯ２０１０／０３６７６０
　本発明は、マイクロキャリアを用いた培養に適するＭＤＣＫ細胞及び当該ＭＤＣＫ細胞の培養方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、無血清培地における高い細胞増殖能のみではなく、マイクロキャリアへ強い接着力を有するＭＤＣＫ細胞及び当該細胞を用いた培養方法がマイクロキャリアを用いた培養に適することを見出した。更に当該細胞は無血清培地での培養において、マイクロキャリア上で高い拡張倍率を有することを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、すなわち以下よりなる。
１．マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が４．５以上を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
２．クローン化ＭＤＣＫ細胞が、２０％以下の細胞浮遊率を示す、前項１に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
３．クローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率が、クローン化ＭＤＣＫ細胞を２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞播種密度で播種して培養した場合のものである、前項１に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
４．クローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率が、クローン化ＭＤＣＫ細胞を４８時間以上培養した場合のものである、前項１又は３に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
５．クローン化ＭＤＣＫ細胞が、ＭＤＣＫ細胞集団を無血清培地に馴化させた後にクローン化された細胞である、前項１～４のいずれか１に記載のＭＤＣＫ細胞の培養方法。
６．受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０１４にて特定されるＭＤＣＫ細胞を、マイクロキャリアを用いて培養することを含む、ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
７．前項１～５のいずれか１に記載のＭＤＣＫ細胞の培養方法を用いて、ウイルスを増殖する方法。
８．ＭＤＣＫ細胞に、ウイルスを感染させた後、インキュベートを行うことを含む、前項７に記載のウイルスを増殖する方法。
９．ウイルスが、インフルエンザウイルスである、前項７又は８に記載のウイルスを増殖する方法。
１０．マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が４．５以上を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞。
１１．クローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率が、クローン化ＭＤＣＫ細胞を２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞播種密度で播種して培養した場合のものである、前項１０に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞。
１２．クローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率が、クローン化ＭＤＣＫ細胞を４８時間以上培養した場合のものである、前項１０又は１１に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞。
１３．クローン化ＭＤＣＫ細胞が、ＭＤＣＫ細胞集団を無血清培地に馴化させた後にクローン化された細胞である、前項１０～１２のいずれか１に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞。
　本発明のＭＤＣＫ細胞及びマイクロキャリアによる当該細胞の培養方法によれば、無血清培地での培養においても低い播種密度からＭＤＣＫ細胞を効率よく増殖させることが可能となる。
細胞株Ａ、Ｂ及びＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌによるインフルエンザウイルス増殖性を確認した結果を示す図である。（実施例１） マイクロキャリアを用いて細胞株Ａ、Ｂ及びＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌを培養した際の細胞増殖能を確認した結果を示す図である。（実施例２） マイクロキャリアを用いて細胞株Ａ、Ｂ及びＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌを培養した際の培養液中の培地成分量及び代謝産物量を確認した結果を示す図である。（実施例２） マイクロキャリアを用いて細胞株Ａ、Ｂ及びＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌを培養した際の培養液中の浮遊全細胞密度及び細胞浮遊率を確認した結果を示す図である。（実施例２） マイクロキャリアを用いて細胞株Ａ及びＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌを培養した際の拡張倍率を確認した結果を示す図である。（実施例３）
　ＭＤＣＫ細胞は、１９５８年に正常な雄のコッカースパニエルの腎臓から樹立された動物細胞であり、種々の用途に用いられている。１９６８年にＧａｕｓｈらによってインフルエンザウイルスに対する感受性が明らかにされており、インフルエンザウイルスの増殖や複製にも用いられている。
　本発明のクローン化ＭＤＣＫ細胞は、ＭＤＣＫ細胞集団を無血清培地に馴化させた後にシングルセルクローン化を行った細胞である。本発明のクローン化ＭＤＣＫ細胞には、クローン化された細胞を増殖及び／又は継代することにより得られた細胞も含む。通常、シングルセルクローン化されていない細胞は、様々な性質を持つ複数の細胞を含む細胞集団として存在している。本明細書において、ＭＤＣＫ細胞集団とはシングルセルクローン化されていない細胞を意味する。ＭＤＣＫ細胞集団としては、いかなるものを用いてもよく、細胞バンクから入手したＭＤＣＫ細胞集団を用いてもよい。例えば、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－３４にて特定される細胞を用いることができる。
　ＭＤＣＫ細胞集団は特定の培地に馴化させることにより、当該培地にて安定的に培養することが可能となる。動物細胞の培養には一般的にウシやウマ等の動物由来血清を添加した培地が用いられる。血清はホルモンや成長因子の供給源となり、また培養操作による物理的ストレスの軽減にも役立つ。しかし、血清の使用には多くの問題も生じる。ひとつは、安全性に対する懸念である。動物由来の血清を介して、ウイルスや細菌、マイコプラズマ、牛海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ　：　ＢＳＥ）で問題となった異常プリオン等が混入する危険性がある。もうひとつは、工業規模での生産への適応性に対する懸念である。血清はロット間で質や組成が異なる。このようなロット差は細胞増殖に影響を及ぼす。また、工業規模での生産では大量の血清が必要となるが、血清は非常に高価で、供給も安定していない。以上のことから、動物細胞を工業規模で培養するためには血清を含まない培地を用いることが望まれる。本発明では、無血清培地にて安定的に培養可能なＭＤＣＫ細胞のクローン化ＭＤＣＫ細胞株を効率的に選出するために、シングルセルクローニングの前に細胞集団を無血清培地に馴化させた。無血清培地での増殖に適応した細胞集団のみからシングルセルクローニングを行うことにより、無血清培地で増殖可能なクローン化ＭＤＣＫ細胞株だけを選択的に取得することが可能となった。シングルセルクローニングの際の無血清培地には、成長因子や微量元素が含まれていてもよい。培地に含まれる成長因子は細胞増殖シグナルを放出させる。馴化工程における培地中の成長因子の種類は、細胞の形質に影響を与えるものと考えられる。馴化工程では、ＭＤＣＫ細胞集団に含まれる細胞同士が互いに影響を与え合いながら、無血清培地にて増殖可能な細胞へと改変される。本発明では、シングルセルクローン化の前にＭＤＣＫ細胞集団を無血清培地に馴化させることにより、無血清培地中で効率よく増殖可能な細胞を選出することができたものと考えられる。
　無血清培地に馴化させたＭＤＣＫ細胞集団を得た後、シングルセルクローン化を行う。シングルセルクローン化では、まず、ＭＤＣＫ細胞１個毎に分離する。分離する手法としては、限界希釈法を用いることができる。分離されたクローン化ＭＤＣＫ細胞株をさらにコンフルエントになるまで無血清培地で培養し、継代を行い、十分な細胞量を得る。その後、クローン化ＭＤＣＫ細胞株について性質を評価し、好適な性質を持つクローン化ＭＤＣＫ細胞株を得ることができる。クローン化ＭＤＣＫ細胞株は、細胞増殖能、播種密度、拡張倍率、ウイルスへの感受性等について評価を行い、高い細胞増殖能を持ち、複数の型のインフルエンザウイルスに感受性を持ち、更にマイクロキャリアへ強い接着力を有することを特徴とするクローン化ＭＤＣＫ細胞株を選出することができる。細胞増殖能、ウイルス感受性及びマイクロキャリアへの強い接着力を共に併せ持つ細胞を選出することは困難であったが、本発明者らの鋭意検討により、上述のクローニング方法によって当該細胞を選出できることを見出した。なお、細胞増殖能等の具体的な評価手段としては後述する実施例に記載の手法を用いることができる。
　本発明の培養方法は、マイクロキャリアへの接着力（付着力）が強い細胞を用いることを特徴とする。細胞のマイクロキャリアへの接着力は、マイクロキャリアを含む培養液中で細胞を培養した場合の細胞浮遊率で表すことができる。本発明の培養方法では、細胞浮遊率が２０％以下、好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞を用いることを特徴とする。細胞浮遊率とは、マイクロキャリア存在下でＭＤＣＫ細胞を一定時間培養した後の浮遊細胞密度を播種細胞密度で割った値であり、細胞浮遊率が低いほど、マイクロキャリアへの接着力が高いことを示す。本発明のクローン化ＭＤＣＫ細胞の細胞浮遊率は、培養時間が４８時間以下、好ましくは２４時間以下、好ましくは６時間以下、更に好ましくは１．５時間以下、特に好ましくは０．５時間以下経過した時点のものである。より具体的には、０．５時間経過した時点で細胞浮遊率が２０％以下、又は１．５時間経過した時点で細胞浮遊率が５％以下を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞を用いることが好ましい。なお細胞浮遊率は、細胞の播種密度によって大きく変わることはないと推測される。
　本発明の培養方法は、拡張倍率が４．５以上、好ましくは６．５以上、更に好ましくは８．５以上を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞を用いることを特徴とする。拡張倍率とは、細胞を一定時間培養した後の細胞密度を、播種した細胞密度で割った値であり、増殖のしやすさを表す指標となるものである。本発明のクローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率は、マイクロキャリアにより培養された際のものであり、培養時間が４８時間以上、好ましくは６０時間以上、更に好ましくは７２時間以上、また、１４４時間以下、好ましくは１２０時間以下、更に好ましくは９６時間以下経過した時点のものである。また本発明における拡張倍率は、２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下、好ましくは１．６×１０４細胞／ｃｍ２以下、好ましくは１．３×１０４細胞／ｃｍ２以下、更に好ましくは１．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の播種密度、また０．１×１０４細胞／ｃｍ２以上、好ましくは０．２×１０４細胞／ｃｍ２以上、更に好ましくは０．３×１０４細胞／ｃｍ２以上、特に好ましくは０．６×１０４細胞／ｃｍ２以上の播種密度で播種された場合のものである。例えば、後述する実施例３に記載の方法を用いて細胞を培養し、拡張倍率を確認することができる。本発明の培養方法においては、低い播種密度であっても、速やかに細胞を増殖させることができ、スケールアップの時間とコストが節約できるという利点がある。また本発明の培養方法によれば、細胞が対数増殖期に移るまでに時間の節約が可能となる。より具体的には、０．６×１０４細胞／ｃｍ２以上、かつ２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の播種密度で播種された場合に、細胞を播種した後、７２～９６時間培養を行った時点で、細胞拡張率が４．５以上を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞を用いることが好ましい。
　本発明におけるクローン化ＭＤＣＫ細胞は、上記細胞浮遊率及び／又は拡張倍率を有するものであればよく、特に限定されない。上記クローニング方法により選出した細胞を増殖及び／又は継代して得られた細胞も、本発明のクローン化ＭＤＣＫ細胞に含まれる。細胞の継代は公知の手法により行うことができる。マイクロキャリアによる細胞培養後は、細胞が増殖した結果、マイクロキャリア表面上に密集して接着していることとなる。継代では、密集して接着している細胞を、新しいマイクロキャリア表面上へ移動させる。例えば、トリプシンやコラゲナーゼといったプロテアーゼを用いて細胞をマイクロキャリアから取り出し、次にこれらの細胞を洗浄等行い、マイクロキャリアを含む培地中へ希釈することにより行うことができる。
　本発明におけるクローン化ＭＤＣＫ細胞は、さらに具体的には、国際寄託の受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０１４で特定されるＭＤＣＫ細胞である。かかる細胞は、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、平成２７年３月４日に受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０１４として国内寄託された後、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターにて、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管請求され、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０１４により受領されたものである。受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０１４で特定されるＭＤＣＫ細胞は、後述する実施例１に示すとおり、ＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－３４由来）を基にして、限界希釈法によりシングルセルクローン化を行なった後、選出されたものである。
　本発明の培養方法は、クローン化ＭＤＣＫ細胞を、マイクロキャリアを用いて培養することを含む。マイクロキャリアとは、表面に細胞が接着することで細胞培養することができる微粒子である。マイクロキャリアの表面は、細胞が接着可能な材質であれば特に限定されるものではなく、本発明に用いるマイクロキャリアは特に限定されるものではない。マイクロキャリアの材質としては、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ガラス、セルロース等が挙げられる。マイクロキャリアの材質としては、デキストランが好ましい。マイクロキャリアの形状としては、球状（ビーズ）、円盤状等が挙げられる。マイクロキャリアの形状としては、球状が好ましい。
　球状のマイクロキャリアの大きさ（直径）は、例えば約０．０１～１ｍｍ、好ましくは約０．０５～０．５ｍｍ、より好ましくは約０．１～０．３ｍｍである。マイクロキャリアは多孔性であってもよい。本発明で用いられる球状のマイクロキャリアとしては、例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ　１（商品名）、Ｃｙｔｏｄｅｘ　３（商品名）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）（以上、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）等が挙げられる。円盤状のマイクロキャリアとしては、例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ　１（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ　２（商品名）（以上、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）等が挙げられる。多孔性のマイクロキャリアとしては、例えば、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ　１（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ　２（商品名）（以上、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）等が挙げられる。その他市販のマイクロキャリアとして、Ｂｉｏｓｉｌｏｎ（商品名）（ＮＵＮＣ）、Ｈｉｌｌｅｘ（商品名）（ソロヒル）、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）マイクロキャリア（コーニング）等が挙げられる。本発明で用いられるマイクロキャリアとしては、特に球状のデキストラン製マイクロキャリアが好ましい。球状のデキストラン製マイクロキャリアとしては、Ｃｙｔｏｄｅｘ　１（商品名）、Ｃｙｔｏｄｅｘ　３（商品名）及びＣｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）が好ましく、さらにＣｙｔｏｄｅｘ　１（商品名）及びＣｙｔｏｄｅｘ　３（商品名）が好ましく、特にＣｙｔｏｄｅｘ　１（商品名）が好ましい。
　本発明の培養方法におけるクローン化ＭＤＣＫ細胞の播種密度は、特に限定されるものではなく、適宜調節が可能である。例えば、２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下、好ましくは１．６×１０４細胞／ｃｍ２以下、好ましくは１．３×１０４細胞／ｃｍ２以下、更に好ましくは１．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の播種密度でＭＤＣＫ細胞を播種した場合であっても、細胞を増殖させることが可能である。また０．１×１０４細胞／ｃｍ２以上、好ましくは０．２×１０４細胞／ｃｍ２以上、更に好ましくは０．３×１０４細胞／ｃｍ２以上の播種密度で播種することが望ましい。本明細書における播種密度（細胞／ｃｍ２）とは、細胞を播種する際の、培養表面積当たりの細胞密度を意味する。なお培地中の細胞の密度は、公知の手法により確認できるが、例えば、血球計算盤又は自動セルカウンター等を用いた測定方法により確認することができる。本発明はマイクロキャリアを用いて培養を行うことから、ＭＤＣＫ細胞はマイクロキャリアの表面に接着して増殖する。本明細書における播種密度は、細胞を播種する際のマイクロキャリアの表面積当たりの細胞密度である。２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下という低い播種密度で培養を行うことにより、培養のために準備する細胞量を少量に抑えることができるため、コストが節約できるという利点がある。
　また、本発明のクローン化ＭＤＣＫ細胞を培養するための培地は特に限定されないが、動物由来の血清の添加されていない無血清培地が好ましい。無血清培地はいかなるものを用いてもよいが、例えばイーグルＭＥＭ培地（日水製薬）、ＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＶＰ－ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥＸ－ＣＥＬＬ　ＭＤＣＫ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＵｌｔｒａＭＤＣＫ（Ｌｏｎｚａ）、ＰｒｏＶｅｒｏ　１（Ｌｏｎｚａ）、ＢａｌａｎＣＤ　ＭＤＣＫ（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等を用いることができる。またマイクロキャリアの密度、撹拌回転数や溶存酸素濃度、培養温度等の培養条件は細胞が増殖可能なものであればよく、適宜調節可能である。本発明の培養方法においては、撹拌回転数が３０～６０　ｒｐｍ程度でも、細胞がマイクロキャリアに良好に接着し、効率よく増殖することが可能である。
　本発明のクローン化ＭＤＣＫ細胞は、ＭＤＣＫ細胞に感染可能なウイルスを増殖させる方法や、ＭＤＣＫ細胞により産生される代謝産物等の物質を生産する方法等に用いることができる。好ましくは本発明のＭＤＣＫ細胞は、ＭＤＣＫ細胞に感染可能なウイルスを増殖させる方法に用いることができる。ＭＤＣＫ細胞に感染可能なウイルスとしては、ＭＤＣＫ細胞が感受性を示すものであればよく、たとえばオルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス及びフラビウイルスが挙げられる。その一例としてインフルエンザウイルスの場合を例示して説明を行う。
　本発明のクローン化ＭＤＣＫ細胞が感受性を示すインフルエンザウイルスは、特に限定されるものではない。例えば、現在知られているすべての亜型及び将来単離及び同定される亜型も含む。Ａ型インフルエンザウイルスの場合、それらのＨＡ分子及びＮＡ分子の抗原性に基づいて亜型（すなわち１６種のＨＡ（Ｈ１～Ｈ１６）亜型及び９種のＮＡ（Ｎ１～Ｎ９）亜型）に分類され、ＨＡの亜型とＮＡの亜型との組み合わせを含むインフルエンザウイルスが考えられる。Ｂ型インフルエンザウイルスの場合、ビクトリア系統と山形系統との組み合わせを含むインフルエンザウイルスが考えられる。
　Ａ型インフルエンザウイルスの各亜型は、ＲＮＡゲノムの変異性が高いため、新しい株が頻繁に生じている。２００９年４月にメキシコでの流行が認知された後、世界的に流行したとされるインフルエンザは、新型インフルエンザ、ブタインフルエンザ、パンデミックインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、ｓｗｉｎｅ　ｆｌｕ、Ａ／Ｈ１Ｎ１　ｐｄｍ等と呼ばれている。ブタの間で流行していたウイルスが、農場等でブタからヒトに直接感染し、その後ヒトの間で広まったとされる新型インフルエンザは、従前より存在していた季節性のＡソ連型インフルエンザ（インフルエンザＡ型ウイルスＨ１Ｎ１亜型）や、Ａ香港型インフルエンザ（インフルエンザＡ型ウイルスＨ３Ｎ２亜型）とは、区別される。またＲＮＡゲノムの変異性が高いことから、インフルエンザＡ型ウイルスの同じ亜型の中でも、単離された時期や場所によって、ウイルス株が区別されている。
　Ｂ型インフルエンザウイルスは、非可逆的な抗原変異が続いているが、Ａ型インフルエンザウイルスにおける変異よりも比較的遅く、流行の周期は２年程度である。Ｂ型インフルエンザウイルスは１９４０年ニューヨークにおける中程度の規模のインフルエンザ流行中初めて分離されて以来、たびたび流行を繰り返し、それによる死亡率の上昇も記録されている。ヒトの間でのみ感染が確認されているが、亜型は存在せず、山形系統とビクトリア系統という２つの系統のみが存在する。
　本発明において用いられるインフルエンザウイルスは、上述のような生体から分離されたインフルエンザウイルスの他、インフルエンザワクチンに適用可能なように、弱毒化、鶏卵増殖適合化、細胞培養増殖適合化、温度感受性表現形質化、粘膜投与適合化等の改変を加えて作出した組換えウイルスであっても良い。また、改変を加えるための手段として、インフルエンザウイルスの抗原部位やポリメラーゼ部位等の８本のＲＮＡ分節に変異を導入する方法、リバースジェネティクスにより増殖力の高い株のＲＮＡ分節と目的の抗原性を示すＲＮＡ分節を組み換える方法、低温継代によって弱毒ウイルスを作成する方法、ウイルス培養系への変異誘発剤を添加することによる方法等の様々な方法が挙げられる。
　クローン化ＭＤＣＫ細胞を、マイクロキャリアを含む培養液中に上述した播種密度で播種した後、コンフルエントになるまで培養を行い、その後、新たなマイクロキャリアへと移行することにより、スケールアップを行うことができる。本発明の培養方法におけるクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養時間は、スケールアップに適したものであればよく、特に限定されるものではない。例えば、培養時間は４８時間以上、好ましくは６０時間以上、更に好ましくは７２時間以上、また、１４４時間以下、好ましくは１２０時間以下、更に好ましくは９６時間以下である。スケールアップの手順は、継代と同様である。
　本発明の培養方法において、インフルエンザウイルスをクローン化ＭＤＣＫ細胞に感染させる時期は、特に限定されず、実用上適した時期であればよい。例えば、スケールアップ後、細胞がコンフルエントになった時点で、インフルエンザウイルスを感染させ、その後細胞を一定時間インキュベートすることが好ましい。インキュベートする時間は特に限定されない。インキュベートとは、細胞を一定期間ある条件下に維持することを意味し、インキュベートにより細胞が増殖するかしないかは問わない。インキュベートは細胞を培養するのと同様の条件下で行うこともできるが、好ましくは感染させたウイルスの至適条件下で行う。ＭＤＣＫ細胞に感染させるインフルエンザウイルスは、シードウイルスと呼ばれる。インフルエンザウイルスは、生体から分離された後、又は、何らかの改変を加えられて作出された後、鶏卵や各種細胞を用いて継代されて増殖し、シードウイルスとなる。本発明において用いられるシードウイルスは、鶏卵や各種細胞のいずれで継代されたものであってもよく、特に限定されない。より好ましくは、ＭＤＣＫ細胞によって継代して増殖したシードウイルスを、本発明の培養方法においてクローン化ＭＤＣＫ細胞に感染させて、インフルエンザウイルスを増殖させることが好ましい。
　また、本発明の培養方法により増殖されたインフルエンザウイルスは、インフルエンザワクチンの製造に用いられる。インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞から精製する工程については、公知の手法又は今後開発されるいずれの手法を用いてもよい。
　本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
（実施例１）クローン化ＭＤＣＫ細胞の作出及び選出
１．シングルセルクローニング
（１）血清含有培地での培養
　ＡＴＣＣより入手したＭＤＣＫ細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．　ＣＣＬ－３４、Ｌｏｔ　１１６６３９５、継代数５３）を解凍し、１０％　牛胎仔血清（以下、ＦＣＳ）を含むイーグルＭＥＭ培地（日水製薬）を加えて遠心洗浄した。このペレットに１０％　ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地を加えて浮遊させたものをＴ７５フラスコ内で培養した。３７℃±１℃で５日間培養した細胞を１　ｍＭ　ＥＤＴＡ－４Ｎａを含むＰＢＳ溶液で洗浄した後、トリプシンを添加して細胞を培養器から剥離させた。１０％　ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地を添加してトリプシンを中和し、Ｔ２２５フラスコに継代した。この細胞を３７℃±１℃で４日間培養した後、同様にしてＴ２２５フラスコに継代した。３７℃±１℃で６日間培養した細胞をトリプシン処理により回収した後、１０％　ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地を添加してトリプシンを中和した。遠心により細胞を分離し、得られたペレットをセルバンカー２（日本全薬工業）に浮遊させ、液体窒素中で凍結保存した（継代数５６）。
（２）ＡＴＣＣ由来ＭＤＣＫ細胞集団の無血清培地への馴化
　次いで、（１）にて得た細胞を解凍し、無血清培地ＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＴ７５フラスコ内で培養した。３７℃±１℃で４日間培養した細胞を１　ｍＭ　ＥＤＴＡ－４Ｎａを含むＰＢＳ溶液で洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加して培養器から剥離させた。この細胞にＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭを加えて遠心洗浄し、得られたペレットにＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭを加えて浮遊させたものをＴ７５フラスコに移し、３７℃±１℃で４日間培養した。この細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを用いて回収し、遠心洗浄して得られたペレットをセルバンカー２に浮遊させ、－８０℃のフリーザーで凍結保存した（継代数５８）。
（３）無血清馴化ＭＤＣＫ細胞のシングルセルクローニング
　（２）にて得たＡＴＣＣ由来無血清馴化ＭＤＣＫ細胞集団（以下、Ｐｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌ）を、限界希釈法によりシングルセルクローニングを行い、細胞増殖性が優れ、形態が均一な細胞株を選出した。クローニングの具体的な手順は以下のとおりである。Ｐｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌを解凍し、無血清培地ＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭを用いてＴ２５フラスコ内で培養した。３７℃±１℃で３日間培養した細胞を１　ｍＭ　ＥＤＴＡ－４Ｎａを含むＰＢＳ溶液で洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加して培養器から剥離させた。この細胞にＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭを加えて遠心洗浄し、得られたペレットにＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭを加えて細胞を再浮遊させた。この細胞懸濁液の細胞数を計数し、５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調整した。９６穴プレートの各ウェルに５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を１００　μＬずつ播種し、１個の細胞のみが播種されたウェルに目印を付けて培養を行った。目印を付けたウェルの細胞がコンフルエントに達した後ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔで剥離し、２４穴プレートへ継代した。培地中のＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを除去するため、継代翌日にウェル中の培養液を完全に除き、新鮮培地に交換した。同様にして６穴プレート、Ｔ７５フラスコと継代を重ね、十分な細胞量が得られた時点でクローン化ＭＤＣＫ細胞株を凍結保存した（継代数６３）。
２．スクリーニング
（１）インフルエンザウイルスの増殖性の評価
　得られたクローン化ＭＤＣＫ細胞株について、インフルエンザウイルス増殖性を指標としたスクリーニングを実施した。また本実施例では、インフルエンザウイルスのＨＡ価及び感染価の確認は、国立感染症研究所著「インフルエンザ診断マニュアル（第３版、平成２６年９月）」の「Ｐａｒｔ　ＩＶ」に開示される方法に従って行った。
（１－１）１次スクリーニング
　まず、全てのクローン化ＭＤＣＫ細胞株と、Ｐｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌを解凍し、無血清培地ＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭを用いてＴ７５フラスコ内で培養した（継代数６４）。解凍後、増殖したクローン化ＭＤＣＫ細胞株を６穴プレートに播種し、３７℃±１℃で培養した後インフルエンザウイルス株をｍ．ｏ．ｉ＝０．０００１で感染させた（継代数６５）。クローン化ＭＤＣＫ細胞株のウイルス増殖性を評価するため、ウイルス培養上清のＨＡ価を測定した。
（１－２）２次スクリーニング
　Ｐｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌ以上のＨＡ価を示したクローン化ＭＤＣＫ細胞株（全体の３０．２％）について、他のインフルエンザウイルス株の増殖性を評価した。先の試験と同様にして６穴プレートで培養したクローン化ＭＤＣＫ細胞株（継代数６５）にウイルスを感染させた後、ウイルス培養上清を用いたＨＡ価測定試験を行い、全てのウイルス株についてＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌ以上のＨＡ価を示したクローン化ＭＤＣＫ細胞株を選定した（全体の２．８％）。
（１－３）３次スクリーニング
　６穴プレートを用いたスクリーニングにより選定されたクローン化ＭＤＣＫ細胞株について、さらにＴ７５フラスコスケールでのインフルエンザウイルス増殖性を確認した。Ｔ７５フラスコ内で培養したクローン化ＭＤＣＫ細胞株（継代数６５）にＡ／Ｎｅｗ　Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ（Ｈ３Ｎ２）等のウイルス株をそれぞれｍ．ｏ．ｉ＝０．０００１で感染させた。ウイルス培養上清のＨＡ価を確認し、すべてのウイルス株でＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌと同等以上のＨＡ価を示したクローン化ＭＤＣＫ細胞株を選定した（全体の０．６％）。
（１－４）４次スクリーニング
　Ｔ７５フラスコを用いたスクリーニングにより選定されたクローン化ＭＤＣＫ細胞株について、１０代以上継代した細胞のインフルエンザウイルス増殖性を確認した。クローン化ＭＤＣＫ細胞株を解凍し、無血清培地ＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭを用いてＴ７５フラスコ内で継代培養した。継代数７７代～８０代となった細胞にＡ／Ｎｅｗ　Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）等のウイルス株をそれぞれｍ．ｏ．ｉ＝０．０００１で感染させた。ウイルス培養上清の感染価を測定した結果、いずれのクローン化ＭＤＣＫ細胞株もすべてのウイルス株について７．０　ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ以上の感染価が得られた。
（２）マイクロキャリア上での細胞増殖能の評価
　ウイルス増殖性を指標として選定されたクローン化ＭＤＣＫ細胞株について、マイクロキャリア培養への適性を評価した。
（３）クローン化ＭＤＣＫ細胞株の選出
　上記の評価結果をもとに、無血清培地で培養可能であり、かつ複数の亜型のインフルエンザウイルスに感受性を持ち、更にマイクロキャリアへ強い接着力を有するＡＴＣＣ由来無血清馴化クローン化ＭＤＣＫ細胞株Ａ（以下、細胞株Ａ）を選出した。マイクロキャリアはＣｙｔｏｄｅｘ　１（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。一方、マイクロキャリアへの接着力が細胞株Ａよりも弱いが、残りの性質は細胞株Ａと類似するクローン化ＭＤＣＫ細胞株Ｂ（以下、細胞株Ｂ）も選出し、比較対象とした。
　なお、細胞株Ａは、受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０１４により、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に寄託され（受領日：平成２７年３月４日）、独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターにて、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管請求され、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０１４により受領された。
[規則26に基づく補充 17.04.2017]　
（４）選出したクローン化ＭＤＣＫ細胞株のインフルエンザウイルス増殖性
　Ｔ７５フラスコにて細胞株Ａを増殖させた。細胞株Ａがコンフルエントになった時点で、インフルエンザウイルスを細胞に接種した。細胞の培養条件に関する各パラメーター及びインフルエンザウイルス株の感染時の細胞数に関する各パラメーターは以下の通りである。
Figure WO-DOC-TABLE-1
　接種したウイルス株は、いずれも国立感染症研究所より分与され、ＭＤＣＫ細胞にて５代継代したものであり、それぞれ、Ａ／Ｉｂａｒａｋｉ／Ｎ１２０７３／２０１１（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９（以下、ＴＡ－７３）、Ａ／Ｉｂａｒａｋｉ／Ｎ１２２３２／２０１２（Ｈ３Ｎ２）（以下、ＴＡ－２３２）、Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／Ｎ１２３２２／２０１２（以下、ＴＡ－３２２）、Ｂ／Ｉｂａｒａｋｉ／Ｎ１２３３６／２０１２（以下、ＴＡ－３３６）という。接種量はｍ．ｏ．ｉ＝０．００１である。培養培地としては、４　ｍＭグルタミン、４．７　ｇ／Ｌグルコース、２０　ｍＭ炭酸水素ナトリウム及び０．１×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加したイーグルＭＥＭ培地を用い、３４℃、５％　ＣＯ２の条件下で培養を行った。ウイルス感染後、培養１日目から３日目までの培養上清をサンプリングし、ＨＡ価及び感染価を測定した。ＨＡ価は、ＴＡ－７３、ＴＡ－３２２及びＴＡ－３３６については０．５％ニワトリ赤血球を用いて室温にて１時間反応、ＴＡ－２３２については１．０％モルモット赤血球を用いて４℃にて１．５時間反応させて測定した。また感染価の単位はｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬである。
　インフルエンザウイルス感染後１～３日目（１～３ｄｐｉ）における、ＨＡ価の結果を以下の表２、感染価の結果を以下の表３に示す。またこれらの結果をまとめたグラフを図１に示す。図１中、実線が感染価、破線がＨＡ価である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＨＡ価及び感染価の推移から、いずれのウイルス株についても、細胞株Ａにて増殖させた場合は、他の細胞株にて増殖させた場合よりも高いインフルエンザウイルス増殖性を示す傾向が確認された。
（実施例２）マイクロキャリアを用いたクローン化ＭＤＣＫ細胞株の培養
　細胞株Ａを、４　ｍＭ　グルタミンを添加した無血清培地ＯｐｔｉＰＲＯ　ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。対照細胞としては、細胞株Ｂ及びＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌを用いた。細胞は２．３×１０４　細胞／ｃｍ２の播種密度で播種した。マイクロキャリアは、Ｃｙｔｏｄｅｘ　１（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を、３．５　ｇ／Ｌの密度で用いた。培養条件は、培養４８時間目までは１５ｒｐｍ、４８時間以降は３０ｒｐｍの撹拌回転数で、ｐＨ７．０、温度３７．０℃、溶存酸素濃度（ＤＯ）３．００ｐｐｍであった。通気は多孔チューブにより行った。また培養容器としては、３Ｌ容量のバイオリアクターを用いた。
　培養液中の細胞数は、培養液を一部採取し、マイクロキャリアに接着した細胞をトリプシンを用いて分散させる手法により確認した。細胞数の測定には生死細胞オートアナライザー（ベックマン・コールター）を用いた。また、代謝物の濃度は、バイオプロセス分析機器　Ｃｅｄｅｘ　Ｂｉｏ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて確認した。
　各細胞株の細胞増殖能を確認した結果を、図２に示す。図２中の実線はマイクロキャリアに接着している細胞の数を示し、破線は培養上清中に浮遊している細胞の数を示す。各細胞株は浮遊した状態では増殖できず、死滅する。細胞株ＡはＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌや細胞株Ｂと比較して上清中に浮遊している細胞の数が少ないことから、マイクロキャリアへの接着力が強いことが確認された。
　細胞株Ａは培養３日目で６．９×１０４　細胞／ｃｍ２まで増殖した。一方細胞株Ｂ及びＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌは同程度まで増殖するために４日間要した。
　なお培地中に存在する培地成分及び細胞の代謝産物の濃度を図３に示す。
　本実施例の培養条件の培養液において、上清に浮遊する細胞数を測定した。播種した細胞のうち、上清に浮遊している細胞の割合を次の計算式にて算出し、細胞浮遊率とした。
（各培養時間における浮遊全細胞密度）÷（播種細胞密度）×１００＝細胞浮遊率（％）
　各細胞株の浮遊全細胞密度を確認した結果を図４、各細胞株の細胞浮遊率を以下の表４に示す。細胞株ＡはＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌや細胞株Ｂと比較して細胞浮遊率が低いことから、マイクロキャリアへの接着力が強いことが確認された。また、細胞株Ａは培養開始から１．５時間経過した時点で、播種した細胞のほぼすべてがマイクロキャリアに付着していると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例３）　クローン化ＭＤＣＫ細胞株の拡張倍率の確認
　実施例２と同様にして、以下のａ～ｄの細胞播種密度により細胞株Ａを播種し、培養を行った。Ｐｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌを対照として用いた。
　ａ：２．０×１０４　細胞／ｃｍ２　（１７．６×１０４　細胞／ｍＬ）
　ｂ：１．０×１０４　細胞／ｃｍ２　（８．８×１０４　細胞／ｍＬ）
　ｃ：０．６×１０４　細胞／ｃｍ２　（５．３×１０４　細胞／ｍＬ）
　ｄ：０．３×１０４　細胞／ｃｍ２　（２．６×１０４　細胞／ｍＬ）
　なお、培養容量は４００　ｍＬであり、３７．０℃、５％ＣＯ２存在下、６０　ｒｐｍにて撹拌培養を行った。マイクロキャリアはＣｙｔｏｄｅｘ　１を用いた。マイクロキャリアの密度は２．０　ｇ／Ｌである。
　結果を図５に示す。グラフの各点付近の値は、各々の時点の拡張倍率の値を示す。細胞株Ａでは、培養開始から約３０～１４４時間経過した時点の拡張倍率がＰｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌと比較して高く、効率よく増殖可能であることがわかった。また、細胞株Ａでは、細胞播種密度によらず培養開始から約７２～９６時間経過した時点の拡張倍率は約４．５以上を示し、Ｐｒｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｃｅｌｌと比較して高い値を示すことがわかった。
（実施例４）　クローン化ＭＤＣＫ細胞株のマイクロキャリア間の移行
　細胞株Ａを以下の条件により、マイクロキャリアからマイクロキャリアに移行させた。また移行後、インフルエンザウイルスを感染させて、ウイルスのＨＡ価及び感染価を実施例１と同様の方法により測定した。
（１）マイクロキャリア間の移行方法
　細胞株Ａを、無血清培地で、マイクロキャリアとしてＣｙｔｏｄｅｘ　１を用いて２Ｌスケールで培養し、増殖させた。その後、培養条件の各制御を停止し、マイクロキャリアを沈降させた。その後培養上清を抜き取り、１ｍＭ　ＥＤＴＡ－４Ｎａを含むＰＢＳ溶液を添加して３７℃で３０分間洗浄した。マイクロキャリアを再び沈降させた後、細胞洗浄液を抜き取った。トリプシンを添加し、３７℃で３０分程度処理を行った。トリプシンインヒビターを添加した後、２０Ｌの培養器に細胞及びマイクロキャリアを全量移注した。表５に細胞播種時の播種パラメーターを、表６に細胞培養中の増殖パラメーターを示す。
[規則26に基づく補充 17.04.2017]　
Figure WO-DOC-TABLE-5
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）マイクロキャリア間の移行後のクローン化ＭＤＣＫ細胞株のウイルス感受性
　マイクロキャリア間の移行後、ＭＤＣＫ細胞がコンフルエントになった時点で、インフルエンザウイルスを細胞に接種した。接種したウイルス株は、ＴＡ－７３であり、接種量はｍ．ｏ．ｉ＝０．００１である。インフルエンザウイルス接種時のワーキングボリュームは２０Ｌ、生細胞密度は１２．８×１０４細胞／ｃｍ２～１６．０×１０４細胞／ｃｍ２であった。培地は、４　ｍＭグルタミン、３．６　ｇ／Ｌグルコース、２０　ｍＭ炭酸水素ナトリウム及び０．１×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加したイーグルＭＥＭ培地を使用した。ウイルス接種後、撹拌回転数２０～６０ｒｐｍ、ｐＨ７．０、温度３４．０℃、溶存酸素濃度（ＤＯ）３．００ｐｐｍの培養条件により培養を行った。ウイルス感染後、培養４日目まで毎日培養上清をサンプリングし、感染価を測定した。このうち、最も高い感染価の値をピーク感染価（ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）とした。感染価の測定は、実施例１と同様にして行った。
　ピーク感染価は、以下の表７に示す通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　細胞株Ａは、マイクロキャリア培養にて高い細胞増殖能を示すことからウイルス培養開始時点に大量の細胞を準備できること、マイクロキャリア移行後も高いウイルス増殖性を示すことがわかった。
　以上詳述したように、本発明の培養方法によれば、マイクロキャリアを用いて効率よくＭＤＣＫ細胞を増殖させることができる。さらに本発明の培養方法を用いることで、ウイルスを効率的に増殖させることができるため、効率的なワクチン製造を可能とすることができ、産業上優れている。ワクチン製造での実用化においては大容量での培養が必須であるが、本発明のＭＤＣＫ細胞及びマイクロキャリアによる当該細胞の培養方法によれば、マイクロキャリア上での高い拡張倍率及び／又はマイクロキャリアへの高い接着力によりスケールアップのコスト及び時間が節約できるという利点がある。

Claims (13)

  1. マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が４．５以上を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
  2. クローン化ＭＤＣＫ細胞が、２０％以下の細胞浮遊率を示す、請求項１に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
  3. クローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率が、クローン化ＭＤＣＫ細胞を２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞播種密度で播種して培養した場合のものである、請求項１に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
  4. クローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率が、クローン化ＭＤＣＫ細胞を４８時間以上培養した場合のものである、請求項１又は３に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
  5. クローン化ＭＤＣＫ細胞が、ＭＤＣＫ細胞集団を無血清培地に馴化させた後にクローン化された細胞である、請求項１～４のいずれか１に記載のＭＤＣＫ細胞の培養方法。
  6. 受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２０１４にて特定されるＭＤＣＫ細胞を、マイクロキャリアを用いて培養することを含む、ＭＤＣＫ細胞の培養方法。
  7. 請求項１～５のいずれか１に記載のＭＤＣＫ細胞の培養方法を用いて、ウイルスを増殖する方法。
  8. ＭＤＣＫ細胞に、ウイルスを感染させた後、インキュベートを行うことを含む、請求項７に記載のウイルスを増殖する方法。
  9. ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項７又は８に記載のウイルスを増殖する方法。
  10. マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が４．５以上を示すクローン化ＭＤＣＫ細胞。
  11. クローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率が、クローン化ＭＤＣＫ細胞を２．０×１０４細胞／ｃｍ２以下の細胞播種密度で播種して培養した場合のものである、請求項１０に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞。
  12. クローン化ＭＤＣＫ細胞の拡張倍率が、クローン化ＭＤＣＫ細胞を４８時間以上培養した場合のものである、請求項１０又は１１に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞。
  13. クローン化ＭＤＣＫ細胞が、ＭＤＣＫ細胞集団を無血清培地に馴化させた後にクローン化された細胞である、請求項１０～１２のいずれか１に記載のクローン化ＭＤＣＫ細胞。
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