JPWO2017170592A1 - Mdck細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が4.5以上を示すクローン化MDCK細胞の培養方法。
2.クローン化MDCK細胞が、20%以下の細胞浮遊率を示す、前項1に記載のクローン化MDCK細胞の培養方法。
3.クローン化MDCK細胞の拡張倍率が、クローン化MDCK細胞を2.0×104細胞/cm2以下の細胞播種密度で播種して培養した場合のものである、前項1に記載のクローン化MDCK細胞の培養方法。
4.クローン化MDCK細胞の拡張倍率が、クローン化MDCK細胞を48時間以上培養した場合のものである、前項1又は3に記載のクローン化MDCK細胞の培養方法。
5.クローン化MDCK細胞が、MDCK細胞集団を無血清培地に馴化させた後にクローン化された細胞である、前項1〜4のいずれか1に記載のMDCK細胞の培養方法。
6.受託番号NITE BP−02014にて特定されるMDCK細胞を、マイクロキャリアを用いて培養することを含む、MDCK細胞の培養方法。
7.前項1〜5のいずれか1に記載のMDCK細胞の培養方法を用いて、ウイルスを増殖する方法。
8.MDCK細胞に、ウイルスを感染させた後、インキュベートを行うことを含む、前項7に記載のウイルスを増殖する方法。
9.ウイルスが、インフルエンザウイルスである、前項7又は8に記載のウイルスを増殖する方法。
10.マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が4.5以上を示すクローン化MDCK細胞。
11.クローン化MDCK細胞の拡張倍率が、クローン化MDCK細胞を2.0×104細胞/cm2以下の細胞播種密度で播種して培養した場合のものである、前項10に記載のクローン化MDCK細胞。
12.クローン化MDCK細胞の拡張倍率が、クローン化MDCK細胞を48時間以上培養した場合のものである、前項10又は11に記載のクローン化MDCK細胞。
13.クローン化MDCK細胞が、MDCK細胞集団を無血清培地に馴化させた後にクローン化された細胞である、前項10〜12のいずれか1に記載のクローン化MDCK細胞。
1.シングルセルクローニング
(1)血清含有培地での培養
ATCCより入手したMDCK細胞(ATCC No. CCL−34、Lot 1166395、継代数53)を解凍し、10% 牛胎仔血清(以下、FCS)を含むイーグルMEM培地(日水製薬)を加えて遠心洗浄した。このペレットに10% FCSを含むイーグルMEM培地を加えて浮遊させたものをT75フラスコ内で培養した。37℃±1℃で5日間培養した細胞を1 mM EDTA−4Naを含むPBS溶液で洗浄した後、トリプシンを添加して細胞を培養器から剥離させた。10% FCSを含むイーグルMEM培地を添加してトリプシンを中和し、T225フラスコに継代した。この細胞を37℃±1℃で4日間培養した後、同様にしてT225フラスコに継代した。37℃±1℃で6日間培養した細胞をトリプシン処理により回収した後、10% FCSを含むイーグルMEM培地を添加してトリプシンを中和した。遠心により細胞を分離し、得られたペレットをセルバンカー2(日本全薬工業)に浮遊させ、液体窒素中で凍結保存した(継代数56)。
次いで、(1)にて得た細胞を解凍し、無血清培地OptiPRO SFM(Thermo Fisher Scientific)を用いてT75フラスコ内で培養した。37℃±1℃で4日間培養した細胞を1 mM EDTA−4Naを含むPBS溶液で洗浄した後、TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)を添加して培養器から剥離させた。この細胞にOptiPRO SFMを加えて遠心洗浄し、得られたペレットにOptiPRO SFMを加えて浮遊させたものをT75フラスコに移し、37℃±1℃で4日間培養した。この細胞をTrypLE Selectを用いて回収し、遠心洗浄して得られたペレットをセルバンカー2に浮遊させ、−80℃のフリーザーで凍結保存した(継代数58)。
(2)にて得たATCC由来無血清馴化MDCK細胞集団(以下、Pre Cloning Cell)を、限界希釈法によりシングルセルクローニングを行い、細胞増殖性が優れ、形態が均一な細胞株を選出した。クローニングの具体的な手順は以下のとおりである。Pre Cloning Cellを解凍し、無血清培地OptiPRO SFMを用いてT25フラスコ内で培養した。37℃±1℃で3日間培養した細胞を1 mM EDTA−4Naを含むPBS溶液で洗浄した後、TrypLE Selectを添加して培養器から剥離させた。この細胞にOptiPRO SFMを加えて遠心洗浄し、得られたペレットにOptiPRO SFMを加えて細胞を再浮遊させた。この細胞懸濁液の細胞数を計数し、5 cells/mLの細胞懸濁液を調整した。96穴プレートの各ウェルに5 cells/mLの細胞懸濁液を100 μLずつ播種し、1個の細胞のみが播種されたウェルに目印を付けて培養を行った。目印を付けたウェルの細胞がコンフルエントに達した後TrypLE Selectで剥離し、24穴プレートへ継代した。培地中のTrypLE Selectを除去するため、継代翌日にウェル中の培養液を完全に除き、新鮮培地に交換した。同様にして6穴プレート、T75フラスコと継代を重ね、十分な細胞量が得られた時点でクローン化MDCK細胞株を凍結保存した(継代数63)。
(1)インフルエンザウイルスの増殖性の評価
得られたクローン化MDCK細胞株について、インフルエンザウイルス増殖性を指標としたスクリーニングを実施した。また本実施例では、インフルエンザウイルスのHA価及び感染価の確認は、国立感染症研究所著「インフルエンザ診断マニュアル(第3版、平成26年9月)」の「Part IV」に開示される方法に従って行った。
まず、全てのクローン化MDCK細胞株と、Pre Cloning Cellを解凍し、無血清培地OptiPRO SFMを用いてT75フラスコ内で培養した(継代数64)。解凍後、増殖したクローン化MDCK細胞株を6穴プレートに播種し、37℃±1℃で培養した後インフルエンザウイルス株をm.o.i=0.0001で感染させた(継代数65)。クローン化MDCK細胞株のウイルス増殖性を評価するため、ウイルス培養上清のHA価を測定した。
Pre Cloning Cell以上のHA価を示したクローン化MDCK細胞株(全体の30.2%)について、他のインフルエンザウイルス株の増殖性を評価した。先の試験と同様にして6穴プレートで培養したクローン化MDCK細胞株(継代数65)にウイルスを感染させた後、ウイルス培養上清を用いたHA価測定試験を行い、全てのウイルス株についてPre Cloning Cell以上のHA価を示したクローン化MDCK細胞株を選定した(全体の2.8%)。
6穴プレートを用いたスクリーニングにより選定されたクローン化MDCK細胞株について、さらにT75フラスコスケールでのインフルエンザウイルス増殖性を確認した。T75フラスコ内で培養したクローン化MDCK細胞株(継代数65)にA/New Caledonia(H1N1)、A/Hiroshima(H3N2)等のウイルス株をそれぞれm.o.i=0.0001で感染させた。ウイルス培養上清のHA価を確認し、すべてのウイルス株でPre Cloning Cellと同等以上のHA価を示したクローン化MDCK細胞株を選定した(全体の0.6%)。
T75フラスコを用いたスクリーニングにより選定されたクローン化MDCK細胞株について、10代以上継代した細胞のインフルエンザウイルス増殖性を確認した。クローン化MDCK細胞株を解凍し、無血清培地OptiPRO SFMを用いてT75フラスコ内で継代培養した。継代数77代〜80代となった細胞にA/New Caledonia(H1N1)等のウイルス株をそれぞれm.o.i=0.0001で感染させた。ウイルス培養上清の感染価を測定した結果、いずれのクローン化MDCK細胞株もすべてのウイルス株について7.0 log10TCID50/mL以上の感染価が得られた。
ウイルス増殖性を指標として選定されたクローン化MDCK細胞株について、マイクロキャリア培養への適性を評価した。
上記の評価結果をもとに、無血清培地で培養可能であり、かつ複数の亜型のインフルエンザウイルスに感受性を持ち、更にマイクロキャリアへ強い接着力を有するATCC由来無血清馴化クローン化MDCK細胞株A(以下、細胞株A)を選出した。マイクロキャリアはCytodex 1(GE Healthcare Life Science)を使用した。一方、マイクロキャリアへの接着力が細胞株Aよりも弱いが、残りの性質は細胞株Aと類似するクローン化MDCK細胞株B(以下、細胞株B)も選出し、比較対象とした。
なお、細胞株Aは、受託番号NITE P−02014により、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(郵便番号292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室)に寄託され(受領日:平成27年3月4日)、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターにて、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管請求され、受託番号NITE BP−02014により受領された。
T75フラスコにて細胞株Aを増殖させた。細胞株Aがコンフルエントになった時点で、インフルエンザウイルスを細胞に接種した。細胞の培養条件に関する各パラメーター及びインフルエンザウイルス株の感染時の細胞数に関する各パラメーターは以下の通りである。
細胞株Aを、4 mM グルタミンを添加した無血清培地OptiPRO SFM(Thermo Fisher Scientific)で培養した。対照細胞としては、細胞株B及びPre Cloning Cellを用いた。細胞は2.3×104 細胞/cm2の播種密度で播種した。マイクロキャリアは、Cytodex 1(GE Healthcare Life Science)を、3.5 g/Lの密度で用いた。培養条件は、培養48時間目までは15rpm、48時間以降は30rpmの撹拌回転数で、pH7.0、温度37.0℃、溶存酸素濃度(DO)3.00ppmであった。通気は多孔チューブにより行った。また培養容器としては、3L容量のバイオリアクターを用いた。
細胞株Aは培養3日目で6.9×104 細胞/cm2まで増殖した。一方細胞株B及びPre Cloning Cellは同程度まで増殖するために4日間要した。
なお培地中に存在する培地成分及び細胞の代謝産物の濃度を図3に示す。
(各培養時間における浮遊全細胞密度)÷(播種細胞密度)×100=細胞浮遊率(%)
実施例2と同様にして、以下のa〜dの細胞播種密度により細胞株Aを播種し、培養を行った。Pre Cloning Cellを対照として用いた。
a:2.0×104 細胞/cm2 (17.6×104 細胞/mL)
b:1.0×104 細胞/cm2 (8.8×104 細胞/mL)
c:0.6×104 細胞/cm2 (5.3×104 細胞/mL)
d:0.3×104 細胞/cm2 (2.6×104 細胞/mL)
なお、培養容量は400 mLであり、37.0℃、5%CO2存在下、60 rpmにて撹拌培養を行った。マイクロキャリアはCytodex 1を用いた。マイクロキャリアの密度は2.0 g/Lである。
細胞株Aを以下の条件により、マイクロキャリアからマイクロキャリアに移行させた。また移行後、インフルエンザウイルスを感染させて、ウイルスのHA価及び感染価を実施例1と同様の方法により測定した。
細胞株Aを、無血清培地で、マイクロキャリアとしてCytodex 1を用いて2Lスケールで培養し、増殖させた。その後、培養条件の各制御を停止し、マイクロキャリアを沈降させた。その後培養上清を抜き取り、1mM EDTA−4Naを含むPBS溶液を添加して37℃で30分間洗浄した。マイクロキャリアを再び沈降させた後、細胞洗浄液を抜き取った。トリプシンを添加し、37℃で30分程度処理を行った。トリプシンインヒビターを添加した後、20Lの培養器に細胞及びマイクロキャリアを全量移注した。表5に細胞播種時の播種パラメーターを、表6に細胞培養中の増殖パラメーターを示す。
マイクロキャリア間の移行後、MDCK細胞がコンフルエントになった時点で、インフルエンザウイルスを細胞に接種した。接種したウイルス株は、TA−73であり、接種量はm.o.i=0.001である。インフルエンザウイルス接種時のワーキングボリュームは20L、生細胞密度は12.8×104細胞/cm2〜16.0×104細胞/cm2であった。培地は、4 mMグルタミン、3.6 g/Lグルコース、20 mM炭酸水素ナトリウム及び0.1×TrypLE Selectを添加したイーグルMEM培地を使用した。ウイルス接種後、撹拌回転数20〜60rpm、pH7.0、温度34.0℃、溶存酸素濃度(DO)3.00ppmの培養条件により培養を行った。ウイルス感染後、培養4日目まで毎日培養上清をサンプリングし、感染価を測定した。このうち、最も高い感染価の値をピーク感染価(log10TCID50/mL)とした。感染価の測定は、実施例1と同様にして行った。
Claims (13)
- マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が4.5以上を示すクローン化MDCK細胞の培養方法。
- クローン化MDCK細胞が、20%以下の細胞浮遊率を示す、請求項1に記載のクローン化MDCK細胞の培養方法。
- クローン化MDCK細胞の拡張倍率が、クローン化MDCK細胞を2.0×104細胞/cm2以下の細胞播種密度で播種して培養した場合のものである、請求項1に記載のクローン化MDCK細胞の培養方法。
- クローン化MDCK細胞の拡張倍率が、クローン化MDCK細胞を48時間以上培養した場合のものである、請求項1又は3に記載のクローン化MDCK細胞の培養方法。
- クローン化MDCK細胞が、MDCK細胞集団を無血清培地に馴化させた後にクローン化された細胞である、請求項1〜4のいずれか1に記載のMDCK細胞の培養方法。
- 受託番号NITE BP−02014にて特定されるMDCK細胞を、マイクロキャリアを用いて培養することを含む、MDCK細胞の培養方法。
- 請求項1〜5のいずれか1に記載のMDCK細胞の培養方法を用いて、ウイルスを増殖する方法。
- MDCK細胞に、ウイルスを感染させた後、インキュベートを行うことを含む、請求項7に記載のウイルスを増殖する方法。
- ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項7又は8に記載のウイルスを増殖する方法。
- マイクロキャリアを用いて培養する際の拡張倍率が4.5以上を示すクローン化MDCK細胞。
- クローン化MDCK細胞の拡張倍率が、クローン化MDCK細胞を2.0×104細胞/cm2以下の細胞播種密度で播種して培養した場合のものである、請求項10に記載のクローン化MDCK細胞。
- クローン化MDCK細胞の拡張倍率が、クローン化MDCK細胞を48時間以上培養した場合のものである、請求項10又は11に記載のクローン化MDCK細胞。
- クローン化MDCK細胞が、MDCK細胞集団を無血清培地に馴化させた後にクローン化された細胞である、請求項10〜12のいずれか1に記載のクローン化MDCK細胞。
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