CN104404002B - 用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用，属于生物技术领域。用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基‑β‑环糊精和吐温‑80。本发明还提供制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，宿主细胞在接种猪圆环病毒2型之前，采用所述组合物处理1‑6h。本发明用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高猪圆环病毒2型对PK‑15细胞的感染效率。本发明制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养，每毫升病毒液的滴度就达到了10^7.5TCID₅₀。

Description

用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)是迄今发现的最小的病毒，无囊膜、基因组为单股环状DNA。猪圆环病毒分PCV1和PCV2(猪圆环病毒2型)两个血清型，其中，PCV1对猪没有致病性。上世纪90年代初，从断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)中分离PCV2，PCV2自出现起即被认为是危害世界养猪业重要的病原。现已证明PCV2还可以造成育肥猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy sdrome,PDNS)、PCV2相关性繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)和先天性震颤(congenitaltremors,CT)等疾病。现将PCV2所引起的各种疾病统称为猪圆环相关性疾病(PCVAD)。

随着商品化PCV2疫苗的成功使用，PCVAD得到有效控制。无论在商业化的养殖场，还是在实验条件下，商品化的PCV2疫苗均能有效保护PCV2的感染。由于PCV2在PK-15细胞系复制效率较低，因此市售疫苗抗原采用在PK-15细胞接毒后多次传代的方法不断提高病毒滴度，并伴随使用刺激剂。即便如此，大部分PCV2疫苗灭活前疫苗抗原含量也仅仅能达到10^6.0TCID₅₀/mL左右。这严重制约了疫苗的产量，并使疫苗的价格显著上升，为研制高效、经济的PCV2疫苗带来了障碍。

发明内容

本发明的目的是提供用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高猪圆环病毒2型对PK-15细胞的感染效率。

本发明的另一目的是提供制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养，每毫升病毒液的滴度就达到了10^7.5TCID₅₀。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基-β-环糊精和吐温-80。

优选的技术方案中，所述组合物中甲基-β-环糊精的浓度为1.0-4g/L，吐温-80的体积浓度为0.5-5ml/L。

优选的技术方案中，所述组合物还含有MEM培养基。

一种制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，宿主细胞在接种猪圆环病毒2型之前，采用权利要求1-3之一所述组合物处理1-6h。

优选的技术方案中，所述宿主细胞为PK-15细胞。

优选的技术方案中，所述宿主细胞采用所述组合物处理后，弃去所述组合物，接种猪圆环病毒2型，进行病毒的细胞培养。

优选的技术方案中，所述猪圆环病毒2型的传代次数为4-6次，每代培养时间为40-80小时。

优选的技术方案中，所述传代比例为1:2-4。

本发明用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高猪圆环病毒2型对PK-15细胞的感染效率，价格低廉。

本发明制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养，每毫升病毒液的滴度就达到了10^7.5TCID₅₀。该方法显著降低了人力和疫苗成本。

附图说明

图1.不同刺激物刺激PK-15细胞后PCV2DBN-SX07株感染效率间接免疫荧光图片.其中A：阴性对照孔的间接免疫荧光图片；B：阳性对照孔的间接免疫荧光图片；C：刺激物B1处理孔的间接免疫荧光图片；D：刺激物B2处理孔的间接免疫荧光图片；E：刺激物B3处理孔的间接免疫荧光图片；F：刺激物A1处理孔的间接免疫荧光图片；G：刺激物A2处理孔的间接免疫荧光图片；H：刺激物A3处理孔的间接免疫荧光图片；I：刺激物C1处理孔的间接免疫荧光图片；J：刺激物C2处理孔的间接免疫荧光图片；K：刺激物C3处理孔的间接免疫荧光图片。

图2.实施例3中各方法获得的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片。Control为未刺激PK-15细胞后接毒第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片；A1、A2或A3分别为刺激物A1、A2或A3刺激PK-15细胞后制备的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片；B1、B2或B3分别为刺激物B1、B2或B3刺激PK-15细胞后制备的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片；C1、C2和C3分别为刺激物C1、C2、C3刺激PK-15细胞后制备的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片。

具体实施方式：

本发明组合物能够提高PCV2感染效率，本发明中以PCV2DBN-SX07株为例。PCV2DBN-SX07株(Genbank NO.：FJ660968)公开于猪圆环病毒2型毒株分离鉴定和体外增殖特性研究[J]，王贵华等，中国畜牧兽医2012年第39卷第一期，17～22。

D-氨基葡萄糖、吐温-80(Tween-80)和甲基-β-环糊精(Methyl-beta-cyclodextrin，缩写MβCD)购自CRODA和Sigma。

MEM培养基购自Gibco。

PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)：是含有137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸二氢钠和2mM磷酸二氢钾的水溶液。

PBST缓冲液：含0.5‰(体积浓度)Tween-20的PBS缓冲液。

PK-15细胞系(ATCC,American Type Culture Collection)，接毒前在含血清MEM培养基中逐步传代克隆以去除PCV1污染。

MOI(multiplicity ofinfection):感染复数。

实施例1本发明组合物提高PCV2对PK-15细胞的感染效率

1.刺激物的筛选

在MEM培养基中添加不同浓度Tween-80、MβCD配制刺激物，考察这两种物质单独或者共同刺激PK-15细胞，对PCV2病毒感染效率的影响，刺激物中Tween-80、MβCD的含量如表1所示。

表1 刺激物中Tween-80、MβCD的含量

在96孔板的每孔中平铺1×10⁴PK-15细胞，铺板24h后采用表1中各刺激物分别进行刺激作用。每种刺激物作三个重复孔，每孔中加入刺激物100μL。各刺激物作用6h后，弃去刺激物，并用MEM培养基清洗各孔。按照感染复数MOI＝0.05，在各孔中接种PCV2DBN-SX07株，然后加入维持培养基，培养48h。维持培养基：在MEM培养基中添加终浓度为3mmol/L D-氨基葡萄糖和2％(体积百份浓度)血清。阳性对照孔中不加入任何刺激物，其他步骤同加入刺激物的孔。阴性对照孔中不加入刺激物、不接种病毒，其他步骤同加入刺激物的孔。病毒培养结束后，采用间接免疫荧光(IFA)方法检测PCV2DBN-SX07株的感染效率。IFA方法具体如下：在4℃条件下，用冰预冷的无水乙醇固定96孔板中的细胞1h，用PBST缓冲液洗涤，加入按1∶200倍稀释的PCV2阳性猪血清(购于VMRD公司),37℃孵育1h，PBST缓冲液洗涤5次，每次5min。然后，加入FITC-SPA荧光二抗(荧光标记葡萄球菌A蛋白，武汉博士德)，37℃孵育lh，PBST缓冲液洗涤5次，每次5min，于荧光显微镜下观察(Zeiss)。计算刺激物作用孔与阳性对照孔中阳性细胞数量，计算感染效率。

结果如图1，与阳性对照孔相比，刺激物B1、B2和B3分别刺激PK-15细胞后，PCV2DBN-SX07株的感染效率提高了400％；刺激物A1、A2和A3分别刺激PK-15细胞后，PCV2DBN-SX07株的感染效率提高了400％；刺激物C1、C2和C3分别刺激PK-15细胞后，PCV2DBN-SX07株的感染效率提高了1000％(如图1中I、J和K)。上述结果说明了，与阳性对照孔相比，含有Tween-80和MβCD的组合物提高PCV2DBN-SX07株的感染效率高于Tween-80或MβCD单一作用的效果之和。

2.MTT比色法测细胞活力

在96孔板加入PK-15细胞100μL/孔(每孔约l×l0⁴细胞)，采用MEM培养基培养24h，弃去培养液。采用表1中各刺激物分别刺激PK-15细胞，具体方法如下：在每个孔中加入一种刺激物，100μL/孔。为了考察刺激物刺激时间对PK-15细胞毒害情况，在刺激时间分别达到1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h，弃去刺激物，用无血清的MEM培养基清洗一遍。按照感染复数MOI＝0.05，在各孔中接种PCV2DBN-SX07株，然后加入维持培养基(组成同上)，在细胞培养箱中培养。对照中不加入任何刺激物。培养36h后，每孔加50μL MTT(四唑盐)溶液，37℃孵育4h；小心吸取上清液,每孔加150μL DMSO溶解水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)；酶标仪在550nm波长处检测每孔的光密度。结果分析：细胞活力％＝(加药细胞或病毒OD/对照细胞OD)×l00％。

结果如表1显示，刺激物C1对PK-15细胞刺激时间为1、2、3、4、5和6h，对PK-15细胞毒害作用最低，细胞活力是对照细胞的90％以上。刺激物C2对PK-15细胞刺激时间为1、2、3、4、5和6h，细胞活力是对照细胞的90％以上。刺激物C3对PK-15细胞刺激时间为1、2和3h，细胞活力是原细胞的90％以上。同时含有Tween-80和MβCD的刺激物对细胞的毒性在6h后，显著高于单一成分刺激物。

表2 各种刺激物作用不同时间对PK-15细胞活力的影响

3.刺激物作用PK-15细胞后对PCV2DBN-SX07株基因组复制的影响

对表1中各种刺激物，均考察不同刺激时间对PCV2DBN-SX07株基因组复制的影响。24孔板每孔中加入5×10⁴个PK-15细胞，培养24h，弃去培养液。在各孔中加入刺激物500μL，当刺激时间达到1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h，弃去刺激物，用无血清的MEM培养基清洗一遍。按照MOI＝0.05，每孔接种PCV2DBN-SX07株，加入维持培养基(成分同上)，在细胞培养箱中培养72h。对照中不加入任何刺激物。培养结束后，将24孔板在-20℃的冰箱反复冻融3次，提取PK-15细胞内的总DNA，采用定量PCR(Real-time PCR)检测PCV2DBN-SX07株基因组的量。

Real-time PCR反应体系：总DNA2μL，2×SYBR GREEN Real-time PCRMix10μL(购于TAKARA公司)，上、下游引物F/R各1μL(终浓度400nM)，水补足至20μL。置Roche Real timePCR仪上进行反应，程序：95℃预变性2min，95℃15S，60℃1min，进行40个循环。其中上游引物F的序列(SEQ ID NO:1)为5’-CCAGGAGGGCGTTCTGACT-3’；下游引物R(SEQ ID NO:2)为5’-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3’。

结果如表2所示，含有Tween-80和MβCD的刺激物C1、C2和C3能显著提高PCV2DBN-SX07株在PK-15细胞中的复制，刺激物C1对PK-15细胞作用1、2、3、4、5和6h，接种病毒、培养后，病毒基因组拷贝数是对照组的8.9、8.8、8.3、8.9、9.8和9.5倍。刺激物C2对PK-15细胞作用1、2、3、4、5和6h，接种病毒、培养后，病毒基因组拷贝数是对照组的9.3、9.3、9.7、10.3、10.1和10.1倍。刺激物C3对PK-15细胞作用1、2、3、4、5和6h，接种病毒、培养后，病毒基因组拷贝数是MEM作用对照组的9.7、9.3、9.4、9.4、9.7和9.4倍。刺激物C1、C2和C3刺激1～6h，PCV2DBN-SX07株基因组拷贝数显著高于Tween-80和MβCD单独刺激情况下病毒基因组拷贝数。

表2.各刺激物对PCV2DBN-SX07株基因组复制的影响

实施例2本发明组合物在制备第1代PCV2DBN-SX07株病毒液中的应用

PK-15细胞铺24孔板(每孔5×10⁴个)，采用MEM培养基培养24h，弃去培养液。采用表1中各刺激物分别刺激PK-15细胞，每孔刺激物加入量为500μL。每种刺激物刺激时间达到1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h，弃去刺激剂，用无血清的MEM培养基清洗一遍。按照接毒剂量为MOI＝0.05，在每孔中接种PCV2DBN-SX07株，加入维持培养基(成分同上)，在细胞培养箱中培养72h。培养结束后，24孔板在-20℃的冰箱反复冻融3次，将冻融物离心取上清液，该上清液即为第1代病毒液。检测各制备方法获得的病毒液滴度。

病毒液TCID₅₀测定方法如下：滴定病毒前一天将PK-15细胞铺于96孔板中，待细胞长成单层，用PBS洗3次。将病毒液(本实施例第一段中制备)用MEM培养基稀释，从10^-1稀释至10^-7，每孔加入100μL，每个样品4个重复孔，接毒后1h，弃去液体，每孔加入维持培养基(成分同上)。感染后96h进行IFA检测，Karber法计算病毒TCID₅₀。

结果如表3显示，采用刺激物C1刺激4h和5h后的PK-15细胞制备的第1代病毒液，滴度达到10^4.5TCID₅₀/mL。采用刺激物C2刺激3h和4h后的PK-15细胞制备的第1代病毒液，滴度达到10^4.5TCID₅₀/mL。采用刺激物C3刺激3h和4h后的PK-15细胞制备的第1代病毒液，滴度同样达到10^4.5TCID₅₀/mL，但PK-15细胞的细胞形态较差。采用本发明组合物刺激1～8h后的PK-15细胞制备的第1代病毒液，其滴度显著高于单一组成刺激物处理后方法或者无刺激培养方法。

表3.各种刺激物处理PK-15细胞对第1代病毒液滴度的影响

实施例3采用本发明组合物制备高滴度PCV2DBN-SX07株病毒液

1.病毒传代后阳性细胞含量比较

(1)采用本发明组合物刺激方法制备PCV2DBN-SX07株病毒液

具体步骤如下：10mL细胞瓶中PK-15细胞长成单层时，加入10mL刺激物C1、C2或C3(组成同实施例1)，作用6h之后弃去刺激物，并用MEM培养基清洗一次。接种PCV2DBN-SX07株，接毒剂量为MOI＝0.05，接毒后1h加入维持培养基(成分同上)培养48h，获得第1代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物。将第1代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物在-20℃的条件下反复冻融3次，离心取上清液，该上清液即为第1代PCV2DBN-SX07株病毒液。

第一次传代：第1代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物采用PBS缓冲液清洗3遍，用0.25％胰酶消化后，按照1∶3比例(1瓶传3瓶)进行传代，采用维持培养基(成分同上)培养72h，获得第2代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物。

按照相同方法将病毒继续传代，直至获得第5代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物。将第5代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物，在-20℃的条件下反复冻融3次，离心取上清液，该上清液即为第5代PCV2DBN-SX07株病毒液。

采用间接免疫荧光(IFA)方法(参照实施例1)检测各代病毒液的阳性细胞数。

(2)Tween-80对照方法制备PCV2DBN-SX07株病毒液

参照本发明组合物刺激方法，仅将刺激物改为A1、A2或A3，制备第1-第5代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物和病毒液。采用间接免疫荧光(IFA)方法(参照实施例1)检测各代病毒液的阳性细胞数。

(3)MβCD对照方法制备PCV2DBN-SX07株病毒液

参照本发明组合物刺激方法，仅将刺激物改为B1、B2或B3，制备第1-第5代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物和病毒液。采用间接免疫荧光(IFA)方法(参照实施例1)检测各代病毒液的阳性细胞数。

(4)未刺激对照方法

参照本发明组合物刺激方法，仅将刺激物改为MEM培养基，制备第1-第5代PCV2DBN-SX07株的细胞培养物和病毒液。采用间接免疫荧光(IFA)方法(参照实施例1)检测各代病毒液的阳性细胞数。

结果如图2显示，本发明组合物C1、C2或C3刺激方法获得的PCV2DBN-SX07株病毒的细胞培养物中阳性细胞数在第3代至少高于未刺激对照方法25倍以上，高于Tween-80对照方法和MβCD对照方法5倍以上。比较各方法获得的第5代PCV2DBN-SX07株病毒的细胞培养物中阳性细胞数，发现本发明组合物刺激方法显著大于未刺激对照方法、Tween-80对照方法和MβCD对照方法。

2.复合刺激后病毒滴度与未刺激比较

取各方法获得的各代PCV2DBN-SX07株病毒液测定TCID₅₀，Karber法计算病毒TCID₅₀。

表4.各方法制备的各代次病毒液的滴度(TCID₅₀/ml)

结果如表4所示，本发明组合物刺激方法(刺激物C1、C2或C3)获得的第1代病毒液滴度显著高于未刺激对照方法、Tween-80对照方法(A1、A2或A3)和MβCD对照方法(B1、B2或B3)。比较各方法获得的第3代病毒液滴度，发现未刺激对照方法病毒液滴度为10^4.5TCID₅₀/mL，Tween-80对照方法A3和MβCD对照方法B3病毒液滴度都达到了10^5.5TCID₅₀/mL，而本发明组合物刺激方法C1、C2或C3病毒滴度达到10^6.25TCID₅₀/mL。比较各方法获得的第5代病毒液滴度，发现未刺激对照方法病毒液滴度仅达到10^6.0TCID₅₀/mL；Tween-80对照方法(A1、A2或A3)病毒液滴度都在10^6.5TCID₅₀/mL以上，A3刺激方法最高达到10^6.75TCID₅₀/mL；MβCD对照方法(B1、B2或B3)病毒液滴度都在10^6.25TCID₅₀/mL，B3刺激方法最高达到10^6.75TCID₅₀/mL。而本发明组合物刺激方法C1、C2或C3获得的第3代病毒液滴度都已经达到10^6.25TCID₅₀/mL以上，C2达到了10^6.5TCID₅₀/mL；第4代病毒液滴度C1、C2或C3方法超过了10^7.0TCID₅₀/mL；在第5代时C1和C2刺激方法病毒滴度达到10^7.5TCID₅₀/mL。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用

<130> 20141211

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

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<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> 上游引物F

<400> 1

ccaggagggc gttctgact 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL

<220>

<223> 下游引物R

<400> 2

cgttaccgct ggagaaggaa 20

Claims (7)

1.用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基-β-环糊精和吐温-80；所述组合物中甲基-β-环糊精的浓度为1.0-4g/L，吐温-80的体积浓度为0.5-5ml/L。

2.根据权利要求1所述用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，其特征在于所述组合物还含有MEM培养基。

3.一种制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于宿主细胞在接种猪圆环病毒2型之前，采用权利要求1-2之一所述组合物处理1-6h。

4.根据权利要求3所述制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述宿主细胞为PK-15细胞。

5.根据权利要求4所述制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述宿主细胞采用权利要求1-2之一所述组合物处理后，弃去所述组合物，接种猪圆环病毒2型，进行病毒的细胞培养。

6.根据权利要求5所述制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述猪圆环病毒2型的传代次数为4-6次，每代培养时间为40-80小时。

7.根据权利要求6所述制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于所述传代比例为1:2-4。