CN103333971B - 鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。实验证明，本发明具有检测时间短、检测敏感性高且特异性强的优点，可实现同时检测和鉴别鸭黄病毒和鸭瘟病毒两种病原体，并对其相应病原含量进行定量，因而可用于鸭黄病毒和/或鸭瘟病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸭黄病毒和鸭瘟病毒的防治有重要意义。

Description

鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于RT-PCR检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

鸭黄病毒(Bai yang dian virus，BYD)又名鸭坦布苏病毒，主要引起种鸭和蛋鸭食欲急剧减退、产蛋急剧下降，卵泡变性，卵泡膜出血为主要特征。2010年以来，我国福建、浙江、江苏、山东、安徽、河南、河北、广东等地相继报道暴发了一种引起鸭产蛋大幅下降的疾病，给蛋鸭养殖业造成了很大的经济损失。鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)是引起鸭、鹅等水禽的急性败血性传染病的一种疱疹病毒，该病为一种广泛嗜全身性感染的传染病，不同日龄、性别的鸭均可感染，但以番鸭、麻鸭、绵鸭易感性最高，在自然流行中，成年鸭和产蛋母鸭发病较为严重，自然感染则多见于大鸭，尤其是产蛋的母鸭，1月龄以下的雏鸭发病较少。各养鸭国家和地区均有该病的发生和流行，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。

两种鸭病均是严重危害养鸭业的传染病，特别是有混合感染时，更增加了临床诊断工作的难度。因此迫切需要建立一种快速敏感的鸭黄病毒和鸭瘟病毒检测方法，在感染早期就能检测出这些病毒，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。目前，这两种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面存在一定劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是，建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。目前，还未见应用多重荧光定量PCR技术对鸭黄病毒和鸭瘟病毒进行检测和诊断的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便的鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，以实现同时检测并定量鸭黄病毒和鸭瘟病毒两种病原体。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.5至SEQ.ID.No.6的碱基序列。

探针A的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse1；探针B的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse2。

引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为3：3：3：2：2：2。

上述鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：A液：含有Premix ExTaq、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B、ddH₂O；B液：BYD+DPV模板，作为阳性对照；C液：ddH₂O，作为阴性对照。

A液中Premix ExTaq10μL，引物1、引物2、探针A终浓度均为0.3μmol/L，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L，ddH₂O8.5μL；B液含BYD+DPV模板各1μL，C液为2μL ddH₂O。

针对目前缺乏对鸭黄病毒和鸭瘟病毒同时进行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研究筛选了两套特异性的探针和引物，并通过进行不同浓度的配比，获得最佳引物和探针的浓度组合，据此建立了鸭黄病毒和鸭瘟病毒的二重荧光定量RT-PCR的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，本发明具有如下优点：

1）检测时间短

应用本发明可实现一管二检的目的，仅需要约30分钟的时间，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规PCR起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后还需花2小时进行凝胶电泳来观察结果。

2）检测敏感性高且特异性强

当鸭黄病毒和鸭瘟病毒同时存在时，本发明对其检测的CT值与单个原虫检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对鸭黄病毒或鸭瘟病毒的检出及检出的敏感性。另外，利用本发明还可对样品中相应病原含量进行定量，并且检测敏感性非常高，均能检测到100个拷贝的鸭黄病毒和/或鸭瘟病毒，鸭黄病毒比常规PCR方法敏感性高10倍，鸭瘟病毒比常规PCR敏感性高100倍，因而可用于鸭黄病毒和/或鸭瘟病毒疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此本发明对鸭黄病毒和鸭瘟病毒的防治有重要意义。

附图说明

图1是普通PCR检测鸭黄病毒的敏感性电泳图，图中：M为100bp DNA ladder，1～9为1×10¹⁰拷贝～1×10²拷贝为模板，10为阴性对照（水）。

图2是普通PCR检测鸭瘟病毒的敏感性电泳图，图中：M为100bp DNA ladder，1～9为1×10¹⁰～1×10²拷贝为模板，10为阴性对照（水）。

图3是荧光定量RT-PCR检测鸭黄病毒的敏感性（ROX通道）结果图，图中：1～9分别为1×10¹⁰～1×10²拷贝/μl（BYD257质粒拷贝数），10空白对照（为DEPC水）。

图4是荧光定量RT-PCR检测鸭黄病毒的敏感性（ROX通道）的标准曲线。

图5是荧光定量RT-PCR检测鸭瘟病毒的敏感性（FAM通道）结果图，图中：1～9分别为1×10¹⁰～1×10²拷贝/μl（DPV454质粒拷贝数），10空白对照（为DEPC水）。

图6是荧光定量RT-PCR检测鸭瘟病毒的敏感性（FAM通道）的标准曲线。

图7是荧光定量RT-PCR检测鸭黄病毒的特异性（ROX通道）结果图，图中：1鸭黄病毒、2鸭黄病毒+鸭瘟病毒、3鸭瘟病毒、4新城疫病毒、5鸭肝炎病毒、6番鸭细小病毒、7H9亚型禽流感病毒、8减蛋综合症病毒、9ddH₂O。

图8是荧光定量RT-PCR检测鸭瘟病毒的特异性（FAM通道）结果图，图中：其中1鸭黄病毒、2鸭黄病毒+鸭瘟病毒、3鸭瘟病毒、4新城疫病毒、5鸭肝炎病毒、6番鸭细小病毒、7H9亚型禽流感病毒、8减蛋综合症病毒、9ddH₂O。

图9是荧光定量RT-PCR检测鸭黄病毒的批内重复性（ROX通道）结果图，图中：1-3分别为第一天、第四天和第七天，4空白对照。

图10是荧光定量RT-PCR检测鸭瘟病毒的批内重复性（FAM通道）结果图，图中：1-3分别为第一天、第四天和第七天，4空白对照。

具体实施方式

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：

Lightcycler2.0荧光定量PCR仪(Roche)；DNA胶回收试剂盒购自广州东盛生物公司；pMD-18T试剂盒和Premix ExTaq^TM购自大连宝生物公司；DNA/RNA提取试剂盒、PCR试剂和质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

鸭黄病毒记载在“4株广西鸭源坦布苏病毒分离及初步鉴定”，中国动物检疫，已收录，待发表。

鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所；

新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭肝炎病毒AV2111株（以下简称为DHV I）购自中国兽医药品监察所；

番鸭细小病毒记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18(6):5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010，37（11):156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

减蛋综合症病毒记载在“减蛋综合症植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04):23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成

根据GenBank中鸭黄病毒和鸭瘟病毒的保守序列，采用Primer Express3.0软件，设计两对特异性引物和两条Taqman探针（表1）。

表1引物和TaqMan探针序列（5’-3’）

实施例2、荧光定量RT-PCR检测方法的建立

一、荧光定量RT-PCR检测方法的确定

1、样本的制备

参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取鸭瘟病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒和减蛋综合症病毒的DNA；同时抽提鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭源新城疫病毒的RNA，按反转录说明书将RNA反转录成cDNA，-30°保存备用。

2、标准品制备

以上述得到的鸭黄病毒的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(含25μL PCRMix、1μmol/L引物（BYD(257)-1和BYD(257)-2，见表2）、19μLddH₂O、4μL DNA模板)，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，55℃60s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，得到257bp PCR产物，将该PCR产物克隆至pMD-18T载体，得到BYD257质粒；测序BYD257质粒，该质粒中含有的PCR产物大小为257bp，测序结果经序列比对分析，扩增的目的片段均与相应序列同源性高达97%，说明为阳性质粒，含有鸭黄病毒保守序列。

以上述得到的鸭瘟病毒的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(含25μL PCR Mix、1μmol/L引物（DPV(454)-1和DPV(454)-2，见表2）、19μL ddH₂O、4μL DNA模板)，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，55℃60s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min，得到454bp PCR产物，将该PCR产物克隆至pMD-18T载体，得到DPV454质粒；测序DPV454质粒，该质粒中含有的PCR产物大小为454bp，测序结果经序列比对分析，扩增的目的片段均与相应序列同源性高达99%，说明为阳性质粒，含有鸭瘟病毒保守序列。

表2标准品制备所用引物序列

将BYD257质粒和DPV454质粒作为阳性标准品，按照文献（Vaitomaa，J.，RantalaA.，Halinen K.，Rouhiainen L.，Tallberg P.，Mokelke L.&Sivonen K.(2003)Quantitative Real-Time PCR for Determination of Microcystin Synthetase E CopyNumbers for Microcystis and Anabaena in Lakes.Applied and EnvironmentalMicrobiology.69:7289-7297.）计算拷贝数，结果为拷贝数分别为5.1×10¹⁰拷贝/μl和3.9×10¹⁰拷贝/μl。

3、荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立

用BYD257质粒和DPV454质粒（二者的拷贝比为1:1）作为模板，将表1中的引物和探针在终浓度为0.2-0.8μmol/L之间，进行不同浓度的配比进行荧光定量RT-PCR，选择引物和探针的最佳浓度。

扩增反应总体积为20μl，其中Premix ExTaq10μl（大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR390S）；2μl模板，终浓度均为0.2-0.8μmol/L的BYD（257-62）F、BYD（257-62）R和BYD（257-62）P；终浓度均为0.2-0.8μmol/L的DPV（454-65）F、DPV（454-65）R和DPV（454-65）P；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸30s进行40个循环；最后于40℃结束反应。

结果显示，不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，鸭黄病毒上、下游引物及探针终浓度分别为0.3μmol/L，鸭瘟病毒上、下游引物及探针终浓度分别为0.2μmol/L，对标准品的检测可获得较小的Ct值。

因此，优化的荧光定量RT-PCR的反应体系如下：扩增反应总体积为20μl，其中PremixExTaq10μl（大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR390S）；2μl模板，终浓度均为0.3μmol/L的BYD（257-62）F、BYD（257-62）R和BYD（257-62）P；终浓度均为0.2μmol/L的DPV（454-65）F、DPV（454-65）R和DPV（454-65）P；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合。

将上述的反应体系置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应，温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸30s进行40个循环；最后于40℃结束反应。

FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测鸭瘟病毒；ROX在610nm激发光下发荧光，用来检测鸭黄病毒.

二、普通PCR灵敏度检测

将鸭黄病毒和鸭瘟病毒的cDNA按10倍倍比稀释，1×10¹⁰拷贝～1×10²拷贝为模板，按照上述一、2、标准品制备中PCR扩增反应体系和反应条件进行PCR反应。结果如图1和2所示，PCR电泳检测鸭黄病毒得到PCR预期扩增片段大小约为257bp，最小检测限为1×10³拷贝；PCR电泳检测鸭瘟病毒得到PCR预期扩增片段大小约为454bp，最小检测限为1×10⁴拷贝。

三、荧光定量RT-PCR的敏感性试验

分别以10倍系列稀释的BYD257质粒（鸭黄病毒）和DPV454质粒(鸭瘟病毒)，得到拷贝数均为1×10¹⁰～1×10²拷贝/μl的BYD257和DPV454质粒，再将各种拷贝数的BYD257和DPV454质粒混合（二者的拷贝比为1:1）作为模板进行二重荧光定量PCR扩增，扩增体系和条件如上述一、3、中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序。

在610nm激发光下的结果（ROX）如图3和4所示；在530nm激发光下的结果（FAM）如图5和6所示。从荧光曲线可见，对鸭黄病毒和鸭瘟病毒的检测100拷贝仍有荧光曲线，表明该检测方法对鸭黄病毒和鸭瘟病毒的灵敏度均为100拷贝，比常规PCR方法敏感性高10～100倍，重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性，说明所建立的方法具有很好的扩增效率。

四、荧光定量RT-PCR的特异性试验及干扰性试验

1、荧光定量RT-PCR的特异性试验

按照上述一、3、中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板分别为鸭黄病毒cDNA、鸭黄病毒cDNA+鸭瘟病毒DNA、鸭瘟病毒DNA、鸭源新城疫病毒cDNA、鸭肝炎病毒cDNA、番鸭细小病毒DNA、H9亚型禽流感病毒cDNA和减蛋综合症病毒DNA，以ddH2O作为阴性对照。

在610nm激发光下检测鸭黄病毒的特异性，结果如图7所示，可见，样品1和2有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而样品3-9均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。

在530nm激发光下检测鸭瘟病毒的特异性，结果如图8所示，可见，样品2和3有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而样品1和4-9均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。

应用建立的二重荧光定量PCR，进行检测以确定两种模板存在时是否对检测的Ct值产生影响，图7中鸭黄病毒、鸭黄病毒+鸭瘟病毒混合样本检测的CT值分别为8.72和9.51；图8中，鸭瘟病毒、鸭黄病毒+鸭瘟病毒混合样本检测的CT值分别为8.66和9.58。结果说明，样品中存在两种病原与存在单种病原，检测的CT值变异非常小，并未影响对鸭黄病毒和鸭瘟病毒的检出及检出的敏感性。因此，本发明的引物、探针及其建立的二重荧光定量RT-PCR检测方法可应用于鉴定未知样本是否感染鸭黄病毒和鸭瘟病毒，二重荧光PCR反应结果的判断如下：

反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；

若在610nm激发光下（ROX）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有鸭黄病毒；反之，则样品中不含有鸭黄病毒；若在530nm激发光下（FAM）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有鸭瘟病毒；反之，则样品中不含有鸭瘟病毒；

若在610nm激发光下（ROX）和530nm激发光下（FAM）的反应结果均为S型曲线，则样品中含有鸭黄病毒和鸭瘟病毒；若在610nm激发光下（ROX）和530nm激发光下（FAM）的反应结果均不为S型曲线，则样品中均不含有鸭黄病毒和鸭瘟病毒。

四、重复性试验

按照上述一、3、中优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板为拷贝数均为1×10¹⁰拷贝/μl的鸭黄病毒和鸭瘟病毒混合的阳性样品。分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差（S）和变异系数（CV）来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。三天后重复检测保存于-20℃的模板，来验证模板的稳定性及荧光定量RT-PCR的批间重复性。

检测结果见图9和图10及表3所示，图9为在610nm激发光（ROX）下检测鸭黄病毒通道，图10为在530nm激发光（FAM）下检测鸭瘟病毒通道，可见，变异系数均小于3%（表3）。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。

表3批间重复性结果

实施例3、检测试剂盒的组装

根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。

A液：Premix ExTaq10μL（大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR390S）；终浓度均为0.3μmol/L的BYD（257-62）F、BYD（257-62）R和BYD（257-62）P；终浓度均为0.2μmol/L的DPV（454-65）F、DPV（454-65）R和DPV（454-65）P；加ddH₂O8.5μL

B液：BYD+DPV模板各1μL，作为阳性对照。

C液：含ddH₂O2μL，作为阴性对照。

Claims (4)

1.鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测引物组，其特征在于包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别是序列表SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2、SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5的碱基序列。

2.一种鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括引物组和探针组；引物组有引物1至4，它们分别是序列表SEQ.ID.No.1、SEQ.ID.No.2、SEQ.ID.No.4、SEQ.ID.No.5的碱基序列；探针组有探针A和探针B，它们分别是序列表SEQ.ID.No.3至SEQ.ID.No.6的碱基序列；

该试剂盒含有以下试剂：

A液：含有Premix ExTaq、引物1、引物2、探针A、引物3、引物4、探针B、ddH₂O；

B液：BYD+DPV模板，作为阳性对照；

C液：ddH₂O，作为阴性对照；

所述A液中Premix ExTaq 10μL，引物1、引物2、探针A终浓度均为0.3μmol/L，引物3、引物4、探针B终浓度均为0.2μmol/L，ddH₂O 8.5μL；所述B液含BYD+DPV模板各1μL，所述C液为2μL ddH₂O。

3.根据权利要求2所述的鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述探针A的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse1；所述探针B的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料Eclipse2。

4.根据权利要求3所述的鸭黄病毒和鸭瘟病毒二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述引物1、引物2、探针A、引物3、引物4和探针B的摩尔比为3：3：3：2：2：2。