CN104147598A - 血清i型鸭肝炎病毒冻干方法及其冻干制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，由含有血清I型鸭肝炎病毒的材料直接冷冻干燥制得；所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病毒24小时后死亡的8-10日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液；该方法操作简单、成本低廉，不需要添加冻干保护剂和冻干稀释液，制得的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂可以在10℃～-80℃保存，病毒效价无明显变化，保存条件要求低，保存时间长。

Description

血清I型鸭肝炎病毒冻干方法及其冻干制剂

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒冻干方法及其冻干制剂。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)引起的一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。鸭病毒性肝炎分为3个各自独立的没有血清学关系的血清型：I型、II型和III型。其中，血清I型鸭肝炎病毒(DHV-I)又称鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)，是目前我国流行的主要鸭肝炎病毒，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。

鸭甲型肝炎病毒目前发现有三种基因型，即DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，根据报道，我国目前流行的主要是DHAV-1，三种基因型均属于小RNA病毒科禽肝病毒属，病毒粒子呈球形或类球形，核衣壳呈20面体对称，直径为20-40nm，无囊膜，胞浆内繁殖，核酸为不分节段的单股正链RNA。该病毒对乙醚、氯仿、甲醇、胰酶、硫酸铵、常用消毒剂等有一定程度的抵抗力；能耐受pH3.0的酸性环境；对热也有较强抵抗力，56℃加热1小时仍有部分病毒存活。鸭甲型肝炎病毒不能凝集任何动物的红细胞，可在鸭胚和鸡胚的绒毛尿囊腔及鸡胚组织、鸭胚肝细胞、鸭胚肾细胞、鹅胚肾细胞等中增殖。

病毒的保存在病毒研究中是一个十分重要的环节。例如，在对某病毒株生物学特性进行长期、深入研究时，或对不同年代、不同地域的流行分离病毒株进行异同比较时，都需要保持病毒的遗传稳定性。而病毒弱毒疫苗种毒的保存、灭活疫苗种毒的保存等同样与病毒保存有着紧密的联系。病毒保存的方法有：冰箱保存法(普通冰箱保存：4～8℃；低温冰箱保存：-20℃～-40℃；超低温冰箱保存：-85℃)、液氮保存法(-196℃)和冷冻真空干燥保存法(冻干法)。其中，冷冻真空干燥保存法因不易发生液体泄漏导致污染、保存时间长、保存条件简单及保存成本低(不需消耗液氮)等优点而成为病毒保存的一种较好方法。在冷冻真空干燥保存法中，在冻干前通常需要加入冻干保护剂，冻干保护剂的作用是使保存对象在冻干过程中免受损伤并减少在保存过程中的死亡。冻干保护剂的种类有很多，如牛/马血清、无菌牛奶等，但不同保存对象适用的冻干保护剂不一定相同，需要研究者根据保存对象的特点采用适宜的冻干保护剂才能获得所需要的保存效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，该方法简单，成本经济，获得的冻干制剂保存条件要求低，保存时间长。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，是将含有血清I型鸭肝炎病毒的材料直接冷冻干燥，即得；所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病毒24小时后死亡的8-10日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液。

进一步，所述血清I型鸭肝炎病毒为1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)。

进一步，所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病毒24小时后死亡的9日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液。

进一步，所述冷冻干燥是先在4℃预冻0.5小时、-20℃预冻1小时，再-70℃冷冻过夜，次日真空干燥24-48小时。

2.采用上述方法制备的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种简单、经济的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂的制备方法，不需要添加冻干保护剂和冻干稀释液，只需将含血清I型鸭肝炎病毒的材料(鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液)直接冻干即可，制得的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂可以在10℃～-80℃保存，病毒效价无明显变化，保存条件要求低，保存时间长。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。

实施例1、血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂的制备

1、病毒株

血清I型鸭肝炎病毒CH60株，该病毒株为本实验室分离致弱的病毒株，已申请专利(申请号为201310011872.3)并进行生物材料保藏(保藏编号为CCTCC NO.V201248)。

2、实验用胚

9日龄SPF鸡胚。

3、病毒的增殖

将血清I型鸭肝炎病毒CH60株种毒用生理盐水稀释5倍后，按常规加入青霉素、链霉素至终浓度分别为100IU/mL和100μg/mL，经尿囊腔接种20枚9日龄鸡胚，0.2ml/胚，同时设立生理盐水阴性对照胚5枚。接种后的鸡胚用石蜡封闭进针孔，37℃孵化6天，每天照胚2次，在生理盐水阴性对照胚不死亡的前提下，弃去24小时内死亡的血清I型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚，收集24小时后死亡的血清I型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚，4℃冷藏过夜。

4、病毒冻干材料的制备

取前述收集的血清I型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚10枚，分别在无菌条件下按常规方法吸取尿囊液，混匀，作为病毒冻干材料(尿囊液毒)；另取前述收集的血清I型鸭肝炎病毒CH60株接种鸡胚10枚，分别在无菌条件下按常规方法收取尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体，无菌匀浆，作为病毒冻干材料(混合毒)。

5、病毒冻干制剂的制备

取前述两种病毒冻干材料，分别注入5ml或10ml西林瓶中，每瓶1-2ml，半加塞；分别在4℃预冻0.5小时、-20℃预冻1小时，然后-70℃冷冻过夜，次日真空干燥24小时，即得两种血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂。

实施例2、血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化

1、血清I型鸭肝炎病毒CH60株对鸡胚半数致死量(ELD₅₀)的测定

将血清I型鸭肝炎病毒CH60株种毒用生理盐水连续进行10倍的梯度稀释，即10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8和10^-9，共9个不同稀释度。将各个稀释度的病毒悬液分别接种于9日龄鸡胚尿囊腔，每个稀释度接种5枚鸡胚，0.2ml/胚，同时设立未稀释的血清I型鸭肝炎病毒CH60株种毒阳性对照组和生理盐水阴性对照组。接种后的鸡胚用石蜡封闭进针孔，37℃孵化6天，每天照胚2次，观察记录各组鸡胚死亡情况，弃去24小时内死亡鸡胚，记录24小时后死亡鸡胚数，按Reed-Muench法计算血清I型鸭肝炎病毒CH60株对鸡胚的半数致死量。

2、血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化

观察记录实施例1所得血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性变化，并按前述方法测定实施例1所得血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后对鸡胚的半数致死量。结果见表1，实施例1所得血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂的效价不低于冻干前效价的90％，且效价下降在0.5个滴度以内。

表1 血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在冻干前后的特性及效价变化

注：7.17表示ELD₅₀＝10^-7.17/0.2ml，即将病毒稀释10^7.17倍，每胚接种0.2ml可使50％的鸡胚致死；其余效价数据同此含义。

实施例3、血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在不同保存条件下的效价变化

取实施例1中所述病毒冻干制剂，分别置4～10℃、0℃、-20℃～-15℃、-80～-70℃保存不同时间，然后按前述方法测定其对鸡胚的半数致死量。结果见表2，实施例1所得血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂在-80至-70℃、-20至-15℃和0℃条件下均有良好的保存效果，病毒效价无明显降低，保存时间长；4至10℃条件下也至少可保存1年。

表2 血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂在不同保存条件下的效价变化

注：6.75表示ELD₅₀＝10^-6.75/0.2ml，即将病毒稀释10^6.75倍，每胚接种0.2ml可使50％的鸡胚致死；其余效价数据同此含义。

实施例4、血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂对雏鸭的免疫效果

为了测定血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂对雏鸭免疫鸭血清中和抗体滴度、免疫雏鸭对1万倍ELD₅₀的DHV-I强毒攻毒的抵抗，从而确定冻干制剂的效果。取按实施例1制备的于4-10℃保存半年的血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂，对1日龄天府肉鸭、樱桃谷鸭、四川麻鸭、建昌鸭、奥白星鸭各20只(经ELISA检测均为不含抗DHV-I抗体)，均随机分成2组，每组10只，1组每只肌肉注射1个免疫剂量的血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂作为试验组，2组每只肌肉注射0.2ml的灭菌生理盐水作空白对照，隔离饲养，于免疫后的第7天采血测定抗DHV-1的中和抗体滴度，结果如表3所示。

表3 血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂对不同雏鸭抗DHV-1的中和抗体滴度

鸭品种	天府肉鸭	樱桃谷鸭	四川麻鸭	建昌鸭	奥白星鸭
						中和抗体滴度	6.2	6.0	6.3	6.4	6.1

然后选择樱桃谷鸭进行强毒攻毒实验，具体为：每只肌肉注射1万倍ELD₅₀的DHV-1强毒(接种1日龄易感雏鸭10天内至少有8/10只死于鸭病毒性肝炎)，隔离饲养，详细观察记录临床表现，同时剖杀观察记录肉眼病理变化并制作肝脏组织学切片观察记录显微病理变化，结果如表4所示。

表4 血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂免疫1日龄樱桃谷鸭雏鸭7天后抗1万倍ELD₅₀的DHV-1强毒攻击结果

﹡注:分析是指与正常对照鸭进行x²检验的显著分析(体重是指存活鸭的平均体重，单位为克)

由表3和表4可以看出，1日龄雏鸭免疫鸭病毒性肝炎弱毒活疫苗(CH60株)冻干制剂后7天鸭血清中抗DHV的中和抗体滴度均≧2^6.0，接种1万倍ELD₅₀的DHV强毒后均获得有效保护，没有出现有害的临床症状和肝脏组织学正常，而非免疫对照组7日龄接种强毒后7天死亡5只，其余精神稍差，而未死亡鸭生长发育受到明显影响，其体重极显著低于免疫鸭(表4)。可见，于4-10℃保存半年的血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂效果良好。

实施例5、血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂对种鸭的免疫效果

为了测定血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂对种鸭免疫后不同时间血清中抗DHV-I的中和抗体滴度，从而确定冻干制剂的效果。取按实施例1制备的于0℃保存1年的血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂，于22周龄时对天府肉鸭、樱桃谷鸭、四川麻鸭、建昌鸭和奥白星鸭各20只种鸭(ELISA检测不含抗DHV-I抗体)进行首次免疫，24周龄进行加强免疫，每次免疫剂量均为1羽份/只，腿部肌肉注射。加强免疫后于第15、45、75、105、135、165、195和270天时每组随机采10只鸭采血测定抗DHV-I的中和抗体滴度，期间详细观察并作临床记录，结果如表5所示。

表5 免疫后不同时间种鸭血清中抗DHV-1中和抗体的滴度

由表5可知，血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂22周龄种鸭首免和24周龄加强免疫，270天血清中抗DHV中和抗体的滴度为2^6.3～2^6.6，表明0℃保存1年的I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂开产前免疫两次的免疫期可达到9个月。可见，于0℃保存1年的I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂效果良好。

因此可以利用本发明制得的血清I型鸭肝炎病毒CH60株冻干制剂对鸭病毒性肝炎的免疫防制，而免疫防治最为经济的办法是对种鸭进行免疫，使下一代雏鸭获得被动免疫保护。根据鸭病毒性肝炎的免疫保护特点，血清中抗DHV-I中和抗体的滴度≥2⁶即可获得保护。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，其特征在于，将含有血清I型鸭肝炎病毒的材料直接冷冻干燥，即得；所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病毒24小时后死亡的8-10日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液。

2.如权利要求1所述的血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，其特征在于，所述血清I型鸭肝炎病毒为I型鸭甲型肝炎病毒。

3.如权利要求1或2所述的血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，其特征在于，所述含有血清I型鸭肝炎病毒的材料为经尿囊腔接种血清I型鸭肝炎病毒24小时后死亡的9日龄鸡胚的尿囊液，或尿囊液、尿囊膜、羊水和胚体的无菌匀浆混合液。

4.如权利要求1所述的血清I型鸭肝炎病毒冻干方法，其特征在于，所述冷冻干燥是先在4℃预冻0.5小时、-20℃预冻1小时，再-70℃冷冻过夜，次日真空干燥24-48小时。

5.采用权利要求1至4任一项所述方法制备的血清I型鸭肝炎病毒冻干制剂。