KR20110010287A - 오리의 급만성 전염질병을 유발하는 병원체에 대한 항체를 지닌 난황을 함유하는 오리 사료 첨가용 조성물 - Google Patents

오리의 급만성 전염질병을 유발하는 병원체에 대한 항체를 지닌 난황을 함유하는 오리 사료 첨가용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리엄(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황을 포함하는 오리 사료 첨가용 조성물에 관한 것으로, 95% 이상의 폐사율을 야기하는 급만성 전염질병을 효과적으로 예방함으로써 오리농가의 막대한 경제적 손실을 예방할 수 있다.
급만성, 난황, 오리간염바이러스, 대장균, 리메렐라 아나티페스티퍼, 사료첨가제, 살모넬라 타이피뮤리움, 오리, 전염, 항체

Description

오리의 급만성 전염질병을 유발하는 병원체에 대한 항체를 지닌 난황을 함유하는 오리 사료 첨가용 조성물{Composition of feed additives for ducks comprising egg yolk containing IgY against pathogen to induce acute and chronic infection disease}
본 발명은 오리 사료 첨가용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 오리의 급만성 전염질병을 유발하는 병원체에 대한 특이적인 항체를 함유하는 난황을 포함하는 것을 특징으로 하는 오리 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.
국내 오리 사육농가나 사육두수는 오리고기 소비량 증가에 맞추어 점차 증가하고 있으며 사육형태도 소규모에서 대규모 형태로 빠르게 전환됨에 따라 급만성 전염질병으로 인한 오리의 집단 폐사로 사육농가에 가장 큰 경제적 피해를 주고 있다. 이렇게 선진화되고 있는 국내 오리 산업에서 가장 큰 문제점은 오리의 급만성 전염질병이다. 급만성 전염질병의 원인은 바이러스성 오리간염, 오리패혈증, 살모넬라와 대장균에 의한 설사증 등을 들 수 있으며 이 중 바이러스성 오리간염은 세 균성 원인체에 비해 강력한 전파력을 갖고 있다.
오리 간염바이러스 1형의 발병과 전파는 매우 빨라서 3-4일 이내에 모두 폐사를 일으킨다. 감염된 오리는 그들의 무리에서 뒤쳐지고 짧은 시간 이내에 움직이지 않고 눈을 감고 웅크린다. 폐사직전의 오리는 옆으로 누워서 발작적으로 두발을 차고 머리를 뒤로 젖힌 채 죽는다. 폐사는 임상증상이 나타난 이후 한 시간 이내에 일어난다. 이병율은 100%이고 폐사율은 감염된 어린 오리의 주령에 따라 다양하다. 1주령 이하의 어린오리에서는 폐사율은 95%에 이르고 1~3주령의 어린오리에서는 폐사율은 50%정도 그리고 4~5주령의 어린오리에서는 이병율과 폐사율은 매우 낮거나 무시할 수 있는 정도다.
따라서 오리 사육의 효과적인 백신 개발이 시급한 실정이지만 어린일령(5주이내)에는 백신 접종 후 전염성 질병의 면역력이 발생하기 이전에 상기 질병들이 발생하는 문제로 인해 완전하게 예방할 수 없는 실정이다.
양계와 달리 오리의 급만성 전염질병에 대한 정보나 뚜렷한 예방 및 대책은 특별히 수립된 방법이 없고 다양한 예방백신이 많지 않아 질병발생시 항생제나 항균제 등에 대한 의존도가 높다. 이런 이유로 안전한 축산물생산에 문제가 될 수 있고 공중보건학적으로도 항생물질 잔류에 의한 문제를 발생시킬 수 있기 때문에 사육단계에서 오리의 급만성 질병으로 인한 경제적 피해를 야기하는 국내질병 감염실태 조사결과에 따라 오리의 주요 질병을 유발하는 병원체를 저감 및 관리할 수 있고 잔류 등의 안전성 문제를 야기하지 않는 항생제 대체 물질의 개발이 필요하다.
항생물질을 대체할 수 있는 보조물질로는 프로바이오틱스(Probiotics)인 생균 제, 효소제 등을 사용하는 경우가 많으나 전염성 질병에 특이적이지 않기 때문에 그리 효과적이지 못하며 그 외에는 오리 질병에 사용할 수 있는 항생제 대체물질은 거의 없는 실정이다.
이에 본 발명은 농가에서 사용하기 편하면서 천연성분으로 구성되어 사람들에게 거부감이 없고, 항생제 내성 및 부작용이 발생하지 않으면서 오리의 급만성 전염질병을 예방할 수 있는 오리 사료 첨가용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황을 포함하는 오리 사료 첨가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황 1.0~50.0 중량%; 석류(Punica granatum), 벵갈퀸스(Aegle marmelos), 구두치(Tinospora cordifolia), 향부자(Cyperus rotundus), 호라레나 안티다이센트리카(Holarrhena antidysentrica), 판야나무(Salmalia malabarica), 아요완(Trachyspermum ammi), 소돔사과(Calotropis procera), 생강(Zingiber officinalis), 매자나무(Berberis aristata) 및 카오린을 포함하는 허브혼합분말 50.0~99.0 중량%로 조성되는 것을 특징으로 하는 오리 사료 첨가용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.
급만성 전염질병의 원인은 바이러스성 오리간염, 오리패혈증, 살모넬라와 대장균에 의한 설사증 등을 들 수 있으며 이 중 바이러스성 오리간염은 세균성 원인체에 비해 강력한 전파력을 갖고 있다.
본 발명은 상기에서 설명한 오리의 급만성 전염질병을 예방하기 위해 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황을 포함한다.
면역난황항체(IgY)의 경우 이미 여러 연구에 의하여 질병에 대한 예방 및 치료효과가 증명되어 왔으며 고농도로 사용하는 경우 항생제와 거의 같은 수준의 치료효과를 기대할 수 있고 완전식품인 계란에서 유래하므로 잔류, 안전성에 대한 염려가 전혀 없는 매우 유용한 물질이다.
난황항체는 조류의 면역체계를 이용한 수동면역의 한 형태로, 조류 이하의 난생동물의 경우는 어미 닭이 능동면역으로 획득한 면역항체는 난황 중으로 이행되어 자손에게 면역능이 전해진다. 난황 중의 항체 중 가장 많은 비율을 차지하는 것은 혈중의 IgG와 유사한 IgY이다. 이는 분자량이 약 160~180kDa으로 포유류의 IgG 보다 크며 포유류의 항체보다 장점이 있기 때문에 이용범위가 넓다.
한편, 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium), 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer) 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 항체 IgY를 함유하는 난황을 생산하기 위해 본 발명은 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium), 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer) 및 대장균(Escherichia coli)을 배양하여 백신을 제조한 후, 백신을 일정기간 간격으로 산란계에 3차 접종까지 실시하였다. 접종 후, 항체역가를 측정한 결과, 3차 접종 후인 7주부터 가장 높은 역가를 나타내었고, 항체역가가 감소하기 시작한 13주에 추가 접종을 실시한 후, 5~14주까지의 항체역가가 높은 계란의 난황만을 수거하여 수득하였다.
한편, 본 발명의 실험예에서는 본 발명에 포함되는 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황의 급만성 전염질병에 대한 예방효과를 측정하기 위해 우선 마우스에 적용시험을 실시하였는데, 그 결과, 특이항체난황분말을 투여한 군에서 염증인자인 호중구(neutrophil, NE), 단핵구(monocyte, MO), 림프구(lymphocyte, LY), 호산구(eosinophil, EO), 호염구(basophil, BA)가 감소하였고, 간 손상 지표인 ALB, ALT, ALP, TBIL를 분석한 결과, 병원체를 투여한 양성 대조군에 비해 특이항체난황을 투여한 군의 ALB(albumin)는 증가하고, ALT(alanine aminotransferase) 및 ALP(alkaline phosphate)는 감소한 것을 확인함으로써 간손상 억제 효과를 확인할 수 있다.
한편, 장내 미생물 수를 측정한 결과, 병원체만을 투여한 군보다 특이항체난황을 투여한 군이 대장균 및 살모넬라균이 감소하였고, 유익한 세균인 유산균은 증가하였다.
한편, 본 발명의 오리 사료 첨가용 조성물을 오리에 적용시 그 효과를 측정하기 위해 오리에 투여시 오리의 성장률, 혈액학적 및 조직병리학적 분석을 하였다.
그 결과, 특이항체난황을 투여한 군은 특이항체난황을 투여하지 않은 군(대조군)에 비해 사료요구율 및 폐사율이 감소하여 오리농가의 생산비 단가를 낮추었으며, 염증인자인 림프구 및 이염색성 백혈구가 대조군에 비해 감소하였고, 간 손상 지표인 ALT(alanine aminotransferase) 및 ALP(alkaline phosphate)가 감소한 것을 확인함으로써 간손상 억제 효과를 확인할 수 있다.
한편, 육안병변 및 병리조직학적 분석을 한 결과, 특이항체난황을 투여한 군은 대조군에서 발생한 출혈 및 간괴사가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 오리 사료 첨가용 조성물은 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황 1.0~50.0 중량%; 석류(Punica granatum), 벵갈퀸스(Aegle marmelos), 구두치(Tinospora cordifolia), 향부 자(Cyperus rotundus), 호라레나 안티다이센트리카(Holarrhena antidysentrica), 판야나무(Salmalia malabarica), 아요완(Trachyspermum ammi), 소돔사과(Calotropis procera), 생강(Zingiber officinalis), 매자나무(Berberis aristata) 및 카오린을 포함하는 허브혼합분말 50.0~99.0 중량%로 조성되는데, 급만성 전염질병을 효과적으로 예방할 수 있으면서 오리의 생산단가를 낮출 수 있어 경제적 효율성이 좋기 때문이다.
한편, 본 발명은 석류(Punica granatum), 벵갈퀸스(Aegle marmelos), 구두치(Tinospora cordifolia), 향부자(Cyperus rotundus), 호라레나 안티다이센트리카(Holarrhena antidysentrica), 판야나무(Salmalia malabarica), 아요완(Trachyspermum ammi), 소돔사과(Calotropis procera), 생강(Zingiber officinalis), 매자나무(Berberis aristata) 및 카오린을 포함하는 허브혼합분말을 포함하는데, 항균효과가 탁월하여 바이러스로 인한 오리의 급만성 전염질병을 예방할 수 있을 뿐만 아니라, 천연제제로 소비자들의 거부감을 감소시킬 수 있다.
한편, 본 발명에 포함되는 허브혼합분말은 바람직하게 석류(Punica granatum) 9.9~17.9 중량%, 벵갈퀸스(Aegle marmelos) 8.91~16.91 중량%, 구두치(Tinospora cordifolia) 3.95~9.95 중량%, 향부자(Cyperus rotundus) 1.85~5.85 중량%, 호라레나 안티다이센트리카(Holarrhena antidysentrica) 2.27~6.27 중량%, 판야나무(Salmalia malabarica) 0.92~2.92 중량%, 아요완(Trachyspermum ammi) 0.8~2.8 중량%, 소돔사과(Calotropis procera) 8.41~14.41 중량%, 생강(Zingiber officinalis) 0.26~1.26 중량%, 매자나무(Berberis aristata) 4.48~10.48 중량% 및 카오린 24.75~44.75 중량%로 이루어진 것이 좋다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 오리 사료 첨가용 조성물은 95% 이상의 폐사율을 야기하는 급만성 전염질병을 효과적으로 예방함으로써 오리농가의 막대한 경제적 손실을 예방할 수 있다.
또한, 천연재료로 구성된 오리 사료 첨가용 조성물을 사용하여 급만성 전염질병을 예방함으로써 화학적 항생물질에 대한 소비자들의 거부감 문제를 해결할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움( Salmonella Thyphimurium )에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼( Rimeriella anatipestifer )에 대한 IgY 및 대장균( Escherichia coli )에 대한 IgY 를 함유하는 난황 제조
실시예 1은 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황을 제조하였다.
단계 1: 항원생산
동결보관된 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)를 접종하기 전에 10일령 발육란을 준비하여 발육란에 접종할부위(요막강)을 표시한 후 요오드로 접종부위를 소독하고 기실부위와 접종부위를 뚫어주었다. 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis) 희석액(PBS)에 103.5∼105.5 ELD50/0.2ml의 농도가 되도록 바이러스를 희석하여 준비하였다. 발육란 1개당 0.2ml의 희석된 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)를 접종한 후 양초로 접종부위와 기술부위에 뚫은 구멍을 막은 후 37℃에서 48시간 호기배양하였다. 48시간 배양 후 검란을 시행하여 감염되어 죽거나 죽을 무렵의 계태아(embryo)를 선별하였다. 계태아의 몸통을 채취하여 유제(embryo 1 : PBS 20ml)와 함께 혼합한 후 포르말린 0.5%를 첨가하여 실온에서 48시간 동안 방치하면서 불활화 처리하였다. 불활화 처리 후 동망을 이용하여 조직을 제거하였다. 원심분리(7000rpm, 40min)를 통해서 불활화된 바이러스(virus)를 수거하였다. 동결보관된 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium), 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer) 및 대장균(Escherichia coli)은 혈액배지에 도말한 후, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 1일 호기배양하였다. 콜로니(colony)를 확인한 후, 준비된 10ml BHI broth에 접종하여 1일 동안 배양한 후, 1000ml BHI broth 접종하여 37℃ 쉐이킹 인큐베이터(Shaking incubator)에서 24~48시간 진탕배양하였다. 수득된 배양액을 0.3% 포르말린(formalin)으로 48시간 실온에서 불활화시킨 후, 10000Xg으로 원심분리한 다음 PBS(pH 7.2)로 풀어준 뒤, 0.1% 포르말린(formalin)으로 다시 불활화를 시켰다. 불활화한 후, 1일간 실온에서 방치한 후, 4℃ 냉장고에서 보관하였다. 그리고 스펙트로포토메터(Spectrophotometer)를 이용하여 1012 cell/ml로 농도를 맞췄다.
단계 2: 백신 제조
상기 단계 1에서 제조된 배양액을 스펙트로포토메터(Spectrophotometer)를 이용하여 410nm에서 OD값이 1.0이 되도록 산정한 후, 배양된 균주와 미네랄오일(ISA 70)을 3:7 비율로 혼합한 후, 균질기(Hmogenizer)를 이용하여 유화시킨 후, 무균검사와 불활화 확인시험을 거쳤다.
단계 3: 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY , 살모넬라 타이피뮤리움( Salmonella Thyphimurium )에 대한 IgY , 리메렐라 아나티페스티퍼( Rimeriella anatipestifer )에 대한 IgY 및 대장균( Escherichia coli )에 대한 IgY 를 함유하는 난황 생산( 특이항체난황 생산)
상기 단계 2에서 제조된 백신을 22주령된 Hy-Line Brown 산란계에 1ml씩 3주 간격으로 가슴에 접종하였으며, 항체 역가의 감소시기인 3차 접종 후, 8주 후에 'Boosting'을 실시하였다.
난황 중의 특이난황항체의 역가는 'Indirect ELISA Method'를 이용하였으며, 측정 샘플은 1차 접종 후부터 추가접종 후 2주까지의 난황을 모아 주별로 측정하였다. 난황항체의 활성은 Mine(1997)가 사용한 ELISA 방법을 응용하여 측정하였다.
특이난황항체의 역가를 측정한 결과(도 1), 산란계에 면역 3주 후에 계란의 IgY 항체역가가 증가하기 시작하였고 3차 접종 후인 7주부터 가장 높은 역가를 나타내 보였다. IgY 항체역가가 떨어지기 시작한 13주에 추가접종을 하였으며 이후에 다시 IgY의 역가가 증가하기 시작하였고 16주부터는 IgY의 역가가 점점 하락하는 경향을 나타내었다.
항원을 200ng/ml의 농도로 100㎕씩 96 웰 폴리스틸렌 프레이트(well poly styrene plate)에 코팅하여 4℃에서 하룻밤 방치하였다. PBS-T(phosphate buffer saline, 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 세척 후, 2% BSA가 함유된 PBS 버퍼로 1h/37℃ 블라킹(Blocking)하며 상기와 같은 방법으로 세척하였다. 음성대조군, 양성대조군 및 샘플을 2X씩 희석하여 웰(well)당 100㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 적절히 희석된 이차항체를 샘플처리와 같은 방법으로 반응시키고, 10분간 발색시킨 후, 492mm에서 ELISA Reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
단계 4: 난황분말 제조
IgY의 항체 역가가 음성대조군의 160X 이상이 되는 5주부터 14주까지의 계란을 집중적으로 집란하여 할란 후 난황만을 수거하였으며 이를 분무건조(spray dryer)하여 난황분말(이하, '특이항체난황분말'이라고 칭함)을 생산하였다.
하기 실험예의 모든 분석 결과의 통계분석은 SAS(Ver. 9.1, Statistical analysis system, 2004)를 이용하여 분산분석을 실시하였으며, 유의성은 5% 수준, ANOVA test 및 T-test를 실시하였다.
실험예 1: 마우스에서 특이항체난황으로부터 수득된 IgY 의 오리간염바이러스 ( Duck virus hepatitis ), 살모넬라 타이피뮤리움( Salmonella Thyphimurium ), 리메렐라 아나티페스티퍼 ( Rimeriella anatipestifer ) 및 대장균( Escherichia coli )에 대한 방어효과 측정
특이항체난황의 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium), 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer) 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 효과를 평가하기 위하여 8주령(29.38±2.18g)의 수컷 ICR 마우스(Orient Co., Korea) 40마리를 실험동물로 사용하였다. 실험동물은 실험처리구별로 케이지(cage)에서 사육하였으며 음수와 사료는 자유급식 하였다. 사육조건은 온도 23±2℃, 습도는 50±10%의 상태를 유지시켜 주었다.
난황항체의 효과를 알아보기 위하여 특이항체난황분말을 PBS(Phosphate Beffered Saline)에 용해시켜 제조한 30%의 난황 항체수용액을 제조하여 공격접종 4일 전부터 매일 처리군에 경구투여하였다.
오리간염바이러스(Duck virus hepatitis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium), 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer) 및 대장균(Escherichia coli) 감염은 접종 전 9시간 동안 금식시킨 후 오리간염바이러스 (Duck virus hepatitis) 1.0×103.5ELD50 , 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium) 1.0×107CFU/ml , 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer) 1.0×107CFU/ml 및 대장균(Escherichia coli) 1.0×107CFU/ml 의 균을 모두 혼합한 병원체를 경구투여하였고, 그 후 5시간 동안 금식시킨 다음, 부검 전까지 30% 난황항체 수용액을 매일 경구투여하였다.
음성 대조군(A그룹)으로 10마리는 생리식염수를 경구투여를 하였고, 양성 대조군(B그룹)으로 10마리는 병원체만을 경구투여 하였다. 처리군은 특이항체난황분말을 경구투여한 군(C그룹)과 특이항체난황분말과 병원체를 모두 투여한 군(D그룹)으로 나누었다.
실험예 1-1: 마우스의 혈구분석
모든 혈청은 에테르(ether)로 마취 후 실험동물의 복대정맥에서 채혈하여 혈구분석기(Forcyte, Oxford Science, Inc. USA)를 이용하여 염증인자인 호중구(neutrophil, NE), 단핵구(monocyte, MO), 림프구(lymphocyte, LY), 호산구(eosinophil, EO), 호염구(basophil, BA)를 분석하였다.
혈구분석은 병원체 경구 투여 후 4일째와 7일째에 실시하였다.
병원체 경구 투여 후 4일째
혈구 처리구
A그룹 B그룹 C그룹 D그룹
NE(K/μL) 1.35±0.26b 2.05±0.39a 1.10±0.34b 2.03±0.45a
LY(K/μL) 0.11±0.05b 0.22±0.04a 0.13±0.04b 0.16±0.02b
MO(K/μL) 0.12±0.04c 1.16±0.24a 0.13±0.03c 0.79±0.13b
EO(K/μL) 0.04±0.02a 0.15±0.05b 0.05±0.03a 0.10±0.04b
BA(K/μL) 0.05±0.03 0.05±0.04 0.07±0.05 0.06±0.04
ab같은 줄(row)에서 다른 문자는 유의적 차이를 의미한다(P<0.05).
병원체 경구 투여 후 4일째 채혈한 혈액을 분석한 결과(표 1 및 도 2), 병원체만을 투여한 군(B군)보다 특이항체난황을 투여한 군(C 및 D그룹)이 단핵구(monocyte, MO), 림프구(lymphocyte, LY), 호산구(eosinophil, EO)가 감소하였고, 호염구(basophil, BA)는 군간에 차이가 없었다.
병원체 경구 투여 후 7일째
혈구 처리구
A그룹 B그룹 C그룹 D그룹
NE(K/μL) 1.23±0.47b 3.31±0.46a 1.56±0.37b 1.45±0.35a
LY(K/μL) 0.11±0.08b 0.56±0.11a 0.20±0.07b 0.15±0.02b
MO(K/μL) 0.95±0.40c 2.46±0.40a 1.20±0.37c 0.96±0.40b
EO(K/μL) 0.06±0.03a 0.23±0.03b 0.09±0.05a 0.06±0.02b
BA(K/μL) 0.02±0.04 0.06±0.04 0.07±0.02 0.06±0.03
ab같은 줄(row)에서 다른 문자는 유의적 차이를 의미한다(P<0.05).
병원체 경구 투여 후 7일째 채혈한 혈액을 분석한 결과(표 2 및 도 3), 병원체만을 투여한 군(B그룹)에 비해 특이항체난황을 투여한 군(C 및 D그룹)은 호중구(NE), 림프구(LY), 단핵구(MO), 호산구(EO)가 감소하였고, 호염구(BA)는 처리구간 차이가 없었다(P>0.05)
실험예 1-1를 통해 염증인자인 호중구(neutrophil, NE), 단핵구(monocyte, MO), 림프구(lymphocyte, LY), 호산구(eosinophil, EO), 호염구(basophil, BA)를 분석한 결과, 병원체를 투여한 양성대조군에 비해 특이항체난황을 투여한 군이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 1-2: 마우스의 혈액화학적 분석
모든 혈청을 에테르(ether)로 마취한 후 실험동물의 복대정맥에서 채혈하여 원심분리기로 혈장을 분리한 다음, 간 손상과 간 기능 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT), 알카라인 포스페이트(alkaline phosphate, ALP), 총 빌리루빈(total bilirubin, TBIL), 알부민(albumin, ALB)을 혈액 생화학 자동분석기(DriChem 3500i, Fujifilm)를 이용하여 수치를 측정하였다.
혈액화학적 분석은 병원체를 경구 투여한 후, 4일째와 7일째 실시하였다.
병원체 경구 투여 후 4일째

처리구
A그룹 B그룹 C그룹 D그룹
ALB 2.83±0.10a 2.13±0.16b 2.90±0.14a 2.77±0.13a
ALP 72.25±5.40b 86.33±6.50a 71.00±8.30b 80.50±6.30a
ALT 40.50±8.40b 61.20±7.60a 43.50±4.50b 55.20±10.40a
TBIL 0.16±0.05c 0.23±0.06ab 0.17±0.07b 0.20±0.06b
abc같은 줄(row)에서 다른 문자는 유의적 차이를 의미한다(P<0.05).
병원체 경구 투여 후 4일째 혈장에서 ALT, ALP, TBIL, ALB를 측정한 결과(표 3 및 도 4), ALB가 병원체만을 투여한 군(B그룹)은 2.13±0.16에 비해 특이항체난황을 투여한 C그룹과 특이항체난황 및 병원체를 투여한 D그룹은 2.90±0.14 과 2.77±0.13로 증가하였고, ALP 및 ALT는 감소하였다.
그리고 유의적으로 차이는 나타나지 않았지만 TBIL도 B그룹에 비해 C 및 D그룹이 감소하였다.
병원체 경구 투여 후 7일째
처리구
A그룹 B그룹 C그룹 D그룹
ALB 2.78±0.09a 2.32±0.10b 2.84±0.07a 2.81±0.15a
ALP 71.20±6.00b 82.00±5.60a 73.20±6.40b 74.30±7.40b
ALT 41.20±7.50b 55.20±8.60a 42.30±7.60b 43.20±9.80b
TBIT 0.20±0.07 0.25±0.06 0.22±0.05 0.23±0.08
ab같은 줄(row)에서 다른 문자는 유의적 차이를 의미한다(P<0.05).
병원체 경구 투여 후 7일째 혈장에서 ALT, ALP, TBIL, ALB를 측정한 결과(표 4 및 도 5), ALB가 병원체만을 투여한 B그룹은 2.32±0.10로 특이항체난황분말을 투여한 C 그룹 및 특이항체난황분말과 병원체를 투여한 D그룹에 비해 감소하였고, ALP 와 ALT는 증가(P<0.05)하였으며, TBIL은 처리구간에 차이가 없었다(P<0.05).
실험예 1-2를 통해 간 손상 지표인 ALB, ALT, ALP, TBIL를 분석한 결과, 병원체를 투여한 양성 대조군(B그룹)에 비해 특이항체난황분말을 투여한 군(C 및 D 그룹)의 ALB는 증가하고, ALT 및 ALP는 감소한 것을 확인함으로써 간손상 억제 효과를 확인할 수 있다.
실험예 1-3: 마우스의 장내 미생물 분석
오리간염바이러스(Duck virus hepatitis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium), 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer) 및 대장균(Escherichia coli)을 공격접종 한 마우스에 각각에 대한 IgY를 함유하는 특이항체난황분말을 투여하여 4일후 , 7일 후에 마우스 맹장에서 시료를 1g씩 채취하여 분석하였다.
총균수 측정을 위해 PCA(plate count agar)를 사용하였으며 살모넬라 타이피뮤리엄은 SS Agar , 대장균은 MacConkey Agar , 유산균은 MRS Agar에 도말하여 37℃ 배양기(incubator)에서 24~36시간 배양하고 균체를 확인하였다. 처리구당 3반복 진행되었으며, 각 집락수를 계수하여 CFU/ml 로 나타내었다.
병원체 경구 투여 후 4일째, 단위: log10 CFU/mL
처리구
A그룹 B그룹 C그룹 D그룹
대장균 4.71±0.15b 5.19±0.15a 4.67±0.16b 5.23±0.13a
살모넬라 타이피뮤리움 0.00±0.00c 4.32±0.16a 0.00±0.00c 4.11±0.13b
유산균 8.42±0.20ab 7.93±0.41b 8.52±0.16a 8.26±0.26ab
abc같은 줄(row)에서 다른 문자는 유의적 차이를 의미한다(P<0.05).
병원체 경구 투여 후 4일째 마우스의 장내 미생물총 변화를 측정한 결과(표 5), 대장균은 병원체만을 투여한 B그룹이 특이항체난황분말을 투여한 C그룹에 비해 증가하였고, 살모넬라 타이피뮤리엄은 B그룹에 비해 C그룹은 검출되지 않았고, 특이항체난황분말과 병원체를 투여한 D그룹은 감소하였다. 또한, B그룹은 가장 낮은 유산균수가 검출되었다.
병원체 경구 투여 후 7일째, 단위: log10 CFU/mL
처리구
A그룹 B그룹 C그룹 D그룹
대장균 4.52±0.16b 5.22±0.14a 4.53±0.25b 4.82±0.13a
살모넬라 타이피뮤리움 0.00±0.00c 3.61±0.11a 0.00±0.00c 2.53±0.16b
유산균 7.21±0.20ab 6.40±0.34b 7.41±0.28a 6.83±0.23ab
abc같은 줄(row)에서 다른 문자는 유의적 차이를 의미한다(P<0.05).
병원체 경구 투여 후 7일째 마우스의 장내 미생물총 변화를 측정한 결과(표 6), 대장균은 병원체만을 접종한 B그룹에 비해 특이항체난황분말을 투여한 C그룹 및 특이항체난황분말과 병원체를 투여한 D그룹에서 적게 검출되었다.
살모넬라 타이피뮤리움은 C그룹에서는 검출되지 않았고, B그룹보다 D그룹에서 적게 검출되었으며, 유산균은 상기 4일째와 마찬가지로 B그룹이 가장 낮게 검출되었다.
실험예 1-3을 통해 장내 미생물 분석을 분석한 결과, 대장균과 살모넬라는 양성대조군에 비해 특이항체난황분말을 투여한 군에서 감소한 것을 확인할 수 있었고, 유산균은 양성대조군 B그룹이 가장 낮은 수로 검출되었다.
실험예 2: 오리에서 특이항체난황으로부터 수득된 IgY 의 오리간염바이러스( Duck virus hepatitis ), 살모넬라 타이피뮤리움 ( Salmonella Thyphimurium ), 리메렐라 아나티페스티퍼 ( Rimeriella anatipestifer ) 및 대장균( Escherichia coli )에 대한 방어효과 측정
경기도 안성소재의 오리농장에서 6,000수의 오리를 가지고 일반 시판사료를 대조군(특이항체난황분말 비투여군)으로 하고 일반 시판사료에 특이항체난황 분말 0.2%를 첨가한 것을 시험군으로 나누어 2처리 3반복으로 사양실험을 실시하였다. 사료와 물은 자유급식토록 하였으며, 시험기간은 부화시부터 출하시까지 44일 동안 실시하였다.
실험예 2-1: 오리의 성장률 분석
실험예 2-1은 특이항체난황분말을 섭취한 오리의 사료효율, 폐사율 및 생산비를 측정하였다.
오리의 성장률 분석

처리구
특이항체난황분말 비투여군 특이항체난황분말 0.2% 투여군
사료효율(Gain/Feed) 2.5 2.1
폐사율(Mortality, %) 13 5
생산비(원)/1수 5730 5556
오리의 성장률을 측정한 결과(표 7), 특이항체난황분말 0.2% 투여군은 특이항체난황분말 비투여군보다 사료요구율이 감소하였고, 폐사율도 특이항체난황분말 비투여군은 13%인데 비해 특이항체난황분말 0.2% 투여군은 5%로 감소하였다.
따라서 오리 1마리당 생산비 단가는 특이항체난황분말 비투여군이 5,730원에 비하여 특이항체난황분말 0.2%투여군은 5,556원으로 감소하였는데, 이로부터 오리 사육시 특이항체난황분말 투여로 인한 질병예방효과로 농가소득을 증대할 수 있다는 사실을 확인하였다.
실험예 2-2: 오리의 혈구분석
모든 혈청을 오리의 바깥목정맥(External Jugular Vein)에서 채혈하여 혈액검사를 위하여 'gimsa염색'을 한 후에 이염색백혈구(Heterophil, HE), 단핵구(monocyte, MO), 림프구(lymphocyte, LY), 호산구(eosinophil, EO), 호염구(basophil, BA)를 카운팅하였다.
오리의 혈구분석
처리구
특이항체난황분말 비투여군 특이항체난황분말 0.2% 투여군
LY (K/μL) 17.33±2.07* 13.17±1.47
HE(K/μL) 2.67±0.82* 1.50±0.55
MO(K/μL) 0.83±0.41 0.67±0.52
EO(K/μL) 0.17±0.41 -
BA(K/μL) 0.67±0.52* -
*같은 줄(row)에서 다른 문자는 유의적 차이를 의미한다(P<0.05).
오리의 혈구분석을 실시한 결과(표 8 및 도 6) , 림프구, 이염색백혈구, 호염구에 대해 특이항체난황분말 비투여군은 각각 17.33±2.07, 2.67±0.82, 0.67±0.52인데 반해 특이항체난황분말 0.2% 투여군은 13.17±1.47 1.50±0.55, 0.00±0.00로 염증인자인 림프구와 이염색성 백혈구가 특이항체난황분말 비투여군에 비해 감소하였다(P<0.05).
실험예 2-3: 오리의 혈액화학적 분석
모든 혈청을 에테르(ether)로 마취한 후 실험동물의 복대정맥에서 채혈하여 원심분리기로 혈장을 분리한 다음, 간 손상과 간 기능 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT), 알카라인 포스페이트(alkaline phosphate, ALP), 총 빌리루빈(total bilirubin, TBIL), 알부민(albumin, ALB)을 혈액 생화학 자동분석기(DriChem 3500i, Fujifilm)를 이용하여 수치를 측정하였다.
오리의 혈액화학적 분석

처리구
특이항체난황분말 비투여군 특이항체난황분말 0.2% 투여군
ALB (g/dL) 1.38±0.18* 1.16±0.17
ALP (U/L) 1084.67±176.99* 768.20±141.79
ALT (U/L) 70.83±7.31* 46.90±3.18
TBIL (mg/dL) 0.65±0.18 0.58±0.10
*같은 줄(row)에서 다른 문자는 유의적 차이를 의미한다(P<0.05).
특이항체난황분말에 대한 혈장에서 ALT, ALP, TBIL, ALB를 측정한 결과(표 9 및 도 7), ALP, ALT의 경우 특이항체난황분말 비투여군이 1084.67±176.99, 70.83±7.31로 특이항체난황분말 0.2% 투여군에 비해 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
상기의 결과로부터 특이항체난황분말 0.2% 투여군의 간 기능 및 간 손상의 지표물질인 ALT 및 ALP가 특이항체난황분말 비투여군에 감소한 것으로 보아(P<0.05), 간 손상 억제 효과를 확인할 수 있다.
실험예 2-4: 육안병변 및 병리조직학적 분석
육안 및 병리조직학적 병변을 확인하여 오리의 바깥목정맥(External Jugular Vein)에서 채혈과 방혈한 후 장기를 채취해 10% 중성 포르말린에 고정한 다음 수세와 포매과정을 거쳐 파라핀 블록을 만들고 슬라이드를 제작하여 'hematoxylin & eosin (H&E)' 염색을 실시한 후, 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.
특이항체난황분말을 투여하기 전 2주령 오리를 부검한 결과(도 8 및 도 9), 육안소견상(도 8) 간이 종대되었고 점상출혈 및 반상출혈이 나타났다. 또한 간의 표면은 붉은색으로 변하였고 때때로 반점이 형성되어 있었다. 병리조직학적(도 9)으로는 간세포의 괴사와 간의 지방침착, 다양한 염증반응과 출혈이 나타났다.
특이항체난황분말을 투여한 후에는 오리의 육안(도 8) 및 병리조직학적(도 9)으로 별다른 병변이 발견되지 않았다.
특이항체난황분말을 투여한 실험군에서 대조군에서 발생한 출혈 및 간괴사가 나타나지 않는 것으로 보아 오리의 질병예방 및 치료에 효과가 있을 것으로 사료된다.
실시예 2: 오리 사료 첨가용 조성물 제조
실시예 2에서는 상기 실시예 1에서 수득된 특이항체난황분말을 이용하여 오리 사료 첨가용 조성물을 제조하였다.
먼저, 석류(Punica granatum) 분말 10kg, 벵갈퀸스(Aegle marmelos) 분말 15kg, 구두치(Tinospora cordifolia) 분말 5kg, 향부자(Cyperus rotundus) 분말 5kg, 호라레나 안티다이센트리카(Holarrhena antidysentrica) 분말 5kg, 판야나무(Salmalia malabarica) 분말 2kg, 아요완(Trachyspermum ammi) 분말 2kg, 소돔사과(Calotropis procera) 분말 10kg, 생강(Zingiber officinalis) 분말 1kg, 매자나무(Berberis aristata) 분말 10kg 및 카오린 35kg를 혼합하여 허브혼합분말을 제조하였다.
그리고 실시예 1에서 수득한 특이항체난황분말 50kg과 허브혼합분말 50kg를 혼합하여 오리 사료 첨가용 조성물을 제조하였다.
실험예 3: 실시예 2의 조성물의 효과 검증
경기도 안성소재의 오리농장에서 대조군과 시험군(실시예 2 투여군)으로 나누어 2처리 3반복으로 사양실험을 실시하였다(실험군은 급여 사료에 실시예 2의 조성물을 0.2 중량% 첨가). 사료와 물은 자유 급식토록 하였으며, 시험기간은 부화시부터 출하시까지 44일 동안 실시하였다.

처리구
대조군 시험군
개시마리수 120 120
오리 평균 개시체중(g) 52.5 52.7
종료마리수 98 115
오리 평균 종료체중(g) 2843 3275
총 폐사마리수 22 5
폐사율(%) 18% 4%
측정결과(표 10), 대조군에 비해 시험군은 폐사율이 현저히 낮게 나타났고, 오리의 평균체중도 증가한 것을 확인할 수 있었다.
도 1은 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium), 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer) 및 대장균(Escherichia coli)으로 면역된 산란계에서 수득한 계란의 IgY항체 역가를 ELISA로 측정한 도이다.
도 2는 마우스에 병원체를 경구투여한 후 4일째 되는 날 채혈한 혈액에서 호중구(neutrophil, NE), 단핵구(monocyte, MO), 림프구(lymphocyte, LY), 호산구(eosinophil, EO), 호염구(basophil, BA)를 분석한 도이다.
도 3은 마우스에 병원체를 경구투여한 후 7일째 되는 날 채혈한 혈액에서 호중구(neutrophil, NE), 단핵구(monocyte, MO), 림프구(lymphocyte, LY), 호산구(eosinophil, EO), 호염구(basophil, BA)를 분석한 도이다.
도 4는 마우스에 병원체를 경구투여한 후 4일째 되는 날 채혈된 혈장에서 간 손상과 간 기능 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT), 알카라인 포스페이트(alkaline phosphate, ALP), 총 빌리루빈(total bilirubin, TBIL), 알부민(albumin, ALB)의 수치를 혈액 생화학 자동분석기(DriChem 3500i, Fujifilm)를 이용하여 측정한 도이다.
도 5는 마우스에 병원체를 경구투여한 후 7일째 되는 날 채혈된 혈장에서 간 손상과 간 기능 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT), 알카라인 포스페이트(alkaline phosphate, ALP), 총 빌리루빈(total bilirubin, TBIL), 알부민(albumin, ALB)의 수치를 혈액 생화학 자동분석 기(DriChem 3500i, Fujifilm)를 이용하여 측정한 도이다
도 6은 오리에 특이항체난황분말을 경구투여한 후, 채혈한 혈액에서 이염색백혈구(heterophil, HE), 림프구(lymphocyte, LY), 호염구(basophil, BA)를 분석한 도이다.
도 7은 오리에 특이항체난황분말을 경구투여한 후, 채혈된 혈장에서 간 손상과 간 기능 지표인 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT), 알카라인 포스페이트(alkaline phosphate, ALP), 총 빌리루빈(total bilirubin, TBIL), 알부민(albumin, ALB)의 수치를 혈액 생화학 자동분석기(DriChem 3500i, Fujifilm)를 이용하여 측정한 도이다.
도 8은 특이항체난황을 투여하기 전과 특이항체난황분말을 투여한 후의 오리를 부검하여 육안으로 관찰한 도이다.
도 9는 특이항체난황을 투여하기 전과 특이항체난황분말을 투여한 후의 오리를 부검하여 병리조직학적으로 분석한 도이다.

Claims (3)

  1. 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황을 포함하는 오리 사료 첨가용 조성물.
  2. 오리간염바이러스(Duck virus hepatitis)에 대한 IgY, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Thyphimurium)에 대한 IgY, 리메렐라 아나티페스티퍼(Rimeriella anatipestifer)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황 1.0~50.0 중량%; 석류(Punica granatum), 벵갈퀸스(Aegle marmelos), 구두치(Tinospora cordifolia), 향부자(Cyperus rotundus), 호라레나 안티다이센트리카(Holarrhena antidysentrica), 판야나무(Salmalia malabarica), 아요완(Trachyspermum ammi), 소돔사과(Calotropis procera), 생강(Zingiber officinalis), 매자나무(Berberis aristata) 및 카오린을 포함하는 허브혼합분말 50.0~99.0 중량%로 조성되는 것을 특징으로 하는 오리 사료 첨가용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    허브혼합분말은,
    석류(Punica granatum) 9.9~17.9 중량%, 벵갈퀸스(Aegle marmelos) 8.91~16.91 중량%, 구두치(Tinospora cordifolia) 3.95~9.95 중량%, 향부자(Cyperus rotundus) 1.85~5.85 중량%, 호라레나 안티다이센트리카(Holarrhena antidysentrica) 2.27~6.27 중량%, 판야나무(Salmalia malabarica) 0.92~2.92 중량%, 아요완(Trachyspermum ammi) 0.8~2.8 중량%, 소돔사과(Calotropis procera) 8.41~14.41 중량%, 생강(Zingiber officinalis) 0.26~1.26 중량%, 매자나무(Berberis aristata) 4.48~10.48 중량% 및 카오린 24.75~44.75 중량%로 이루어진 것을 특징으로 하는 오리 사료 첨가용 조성물.
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