CN103687625A

CN103687625A - 交叉保护性沙粒病毒疫苗及其使用方法

Info

Publication number: CN103687625A
Application number: CN201280034401.8A
Authority: CN
Inventors: 凯特·布罗德里克; 尼兰詹·萨尔德赛; 凯瑟琳·卡什曼; 康妮·施马尔约翰
Original assignee: Inovio Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Inovio Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2032-07-11
Also published as: KR20140045557A; EP2731628A4; US20140249467A1; WO2013055418A2; AU2012321315B2; EP2731628B1; EP2731628A2; ES2758713T3; KR102314421B1; EP3662935A1; AU2012321315A1; CA2841852C; CN103687625B; CA2841852A1; WO2013055418A3; JP6117781B2; US9446114B2; JP2014523436A; KR102071228B1; KR20200013062A

Abstract

本发明涉及单独或同时靶向多种沙粒病毒剂的DNA疫苗。

Description

交叉保护性沙粒病毒疫苗及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年7月11日提交的美国临时申请号61/506,579和2011年7月12日提交的美国临时申请号61/507,062的权益，所述美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。

联邦资助的研究和开发

关于本发明的主题开发的活动至少部分地由美国政府军队合同号W81XWH-12-0154资助，并且因此美国可以在本发明中具有某些权利。

发明领域

本发明涉及有效于引出针对沙粒病毒的保护性免疫应答的基于DNA的疫苗，以及制造和使用所述疫苗的方法。

发明背景

沙粒病毒(AV)是啮齿动物传播的病毒，所述病毒引起急性和经常致命性的出血热，并具有相关的不适、严重水肿、失血以及高死亡率。拉沙病毒(LASV)是西非地区特有的旧大陆沙粒病毒。已在美国、欧洲和加拿大报道过拉沙热的输入性病例。据估计，每年发生300,000例至500,000例之间的拉沙热病例，在住院患者中有15%至20%的死亡率。新大陆沙粒病毒(呼宁(Junin)病毒(JUNV)、马秋博(Machupo)病毒(MACV)、瓜纳瑞托(Guanarito)病毒以及萨比亚(Sabia)病毒)是南美洲特有的，并且已知每年引起成千上万例严重出血热病例。沙粒病毒是CDC A类生物威胁剂，并且在新兴疾病爆发或被这些病毒生物恐怖袭击的不利情况下，将不存在可供公众使用的FDA批准的曝露前或曝露后治疗剂或疫苗。已报道了鉴别可以在小鼠中引出免疫应答的HLA I类限制性表位的研究。参见Botten,J.等,J.Vir.9947-9956(2010年10月)。

对于因爆发和高度的发病率和死亡率而最近受到所有关注的沙粒病毒，存在非常少的可供使用的治疗。不存在获得许可的疫苗用于AV预防，并且仅获得许可用于治疗人AV感染的药物为抗病毒药物病毒唑。如果在曝露早期服用，病毒唑帮助减小与AV感染相关的发病率和死亡率，但要遭受到高毒性和副作用。存在对于以下的明确未满足的需要：开发低成本和/或对治疗有疗效的药物和用于在世界AV特有区域进行预防以及用于经由生物防御威胁或通过在世界特有的各地部署美国军事人员来防治曝露的有效疫苗。

此外，还存在对多药剂沙粒病毒疫苗的未满足的需要。如更早所指出，不存在可供使用的竞争性有效的预防法或疗法。据我们所知，由FDA批准的用于在试验性新药(IND)身份下限制使用的呼林减毒活疫苗(候选#1)是用于沙粒病毒感染所测试的唯一疫苗。然而，随后此疫苗还在动物研究中显示出不能针对其它沙粒病毒株进行交叉保护。

因此，仍存在对提供有疗效药物的疫苗或用于沙粒病毒的有效疫苗以及单独或同时靶向多种沙粒病毒剂的疫苗的需要。

附图简述

图1(A)、图1(B)、图1(C)和图1(D)展示出用非优化的(包含SEQID NO:3)与优化的构建体(包含SEQ ID NO:1)进行疫苗接种的豚鼠的血清病毒血症评分和发病率评分。

图1(B2)和图1(D2)展示出分别添加非侵害性电穿孔(NTVEP)的血清病毒血症评分和发病率评分的图1(B)和图1(D)的数据。

图2(A)和图2(B)展示出豚鼠中非优化(包含SEQ ID NO:3)和密码子优化的(包含SEQ ID NO:1)LASV DNA疫苗的存活曲线。

图3(A)和图3(B)展示出参与反激发(back challenge)研究的豚鼠的重量和温度。

图4展示出用LASV致命激发存活的LASV-GPC或模拟疫苗接种的猴子的BAERCOM听觉筛分。

图5(A)、图5(B)和图5(C)展示出接受LASV-GPC(包含SEQ IDNO:2)或模拟(包含SEQ ID NO:3)DNA疫苗的食蟹猴(cynomolgusmacaque)的存活曲线、血清病毒血症评分以及发病率评分。

图6(A)、图6(B)和图6(C)展示出接受LASV-GPC(包含SEQ IDNO:2)或模拟(包含SEQ ID NO:3)DNA疫苗的食蟹猴的所选择的血液化学值。

图7展示出接受LASV-GPC(包含SEQ ID NO:2)或模拟(包含SEQ ID NO:3)DNA疫苗的食蟹猴的选择的血液学值。

图8展示出针对豚鼠优化的LASV-GPC密码子(LASV-GPC GP)、针对非人灵长类动物优化的LASV-GPC密码子(LASV-GPC NHP)与参比LASV GPC(对照)之间的序列比对。

详述

本发明的一方面提供包括核苷酸编码序列的DNA疫苗，所述核苷酸编码序列编码一种或多种能够在有需要的受试者中产生针对沙粒病毒的保护性免疫应答的免疫原性蛋白。编码序列编码沙粒病毒的糖蛋白前体，并且是针对感兴趣的受试者进行密码子优化的。另外，编码序列可以是其与糖蛋白前体至少98%同源的免疫原性片段。

在一些实施方案中，编码序列基本上由以下组成：LASV(LASV-GPC)的糖蛋白前体结构域、LCMV(LCMV-GPC)的糖蛋白前体结构域、MACV(MACV-GPC)的糖蛋白前体结构域、JUNV(JUNV-GPC)的糖蛋白前体结构域、GTOV(GTOV-GPC)的糖蛋白前体结构域、WWAV(WWAV-GPC)的糖蛋白前体结构域或PICV(PICV-GPC)的糖蛋白前体结构域。优选地，片段包括：包括残基441至449的LASV-GPC的片段、包括残基447至455的LMCV-GPC的片段、包括残基444至452的MACV-GPC的片段、包括残基429至437的JUNV-GPC的片段、包括残基427至435的GTOV-GPC的片段、包括残基428至436的WWAV-GPC的片段或包括残基455至463的PICV-GPC的片段。

在一个优选的实施方案中，DNA疫苗基本上由所述编码序列之一—单一药剂或单价疫苗组成。在另一个优选的实施方案中，DNA疫苗基本上由所述编码序列的至少两个—复合药剂或多价疫苗组成。优选地，单价或多价疫苗包括所公开的LASV-GPC，并且更优选地SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或编码SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的核苷酸编码序列。

在一些实施方案中，所提供的DNA疫苗进一步包含选自由以下组成的组的佐剂：IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

在本发明的一方面中，提供了诱导针对沙粒病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括施用本文提供的DNA疫苗，以及电穿孔所述受试者。在一些实施方案中，电穿孔步骤包括将具有能量的电穿孔脉冲递送至发生施用步骤的所述受试者上的部位。优选地，施用步骤和电穿孔步骤都发生在所述受试者的真皮内层中。

所公开的本发明涉及新型DNA候选疫苗，其在受试者中针对一种或在一些情况下针对多种沙粒病毒(LASV、LCMV、MACV、JUNV、GTOV、WWAV以及PICV)产生保护性免疫应答，所述沙粒病毒涵盖旧大陆病原体和新大陆病原体。

所提供的疫苗包含AV GPC结构域DNA免疫原以便增加免疫应答的多样性和针对多种相关但相异的病毒的交叉保护。本文进一步描述了基因优化过的免疫原，特别是针对沙粒病毒优化的GPC结构域，其能够靶向更广谱的病原体。疫苗的一个实施方案是优化的LASV编码序列，其可以额外地包括靶向LASV、LCMV、MACV、JUNV、GTOV、WWAV以及PICV病毒并且优选MACV和JUNV病毒的疫苗以便得到复合药剂制剂。

可以用高度创新的制造方法和优化的疫苗制剂来组合疫苗以便增强复合药剂制剂的效力。传统上，仅能够制造出浓度为2mg/mL至4mg/mL的DNA。此物理限制使得难以在足够高以达到保护性疗效的剂量水平下组合靶向多抗原的DNA质粒。通过利用如在美国专利号7,238,522和美国专利公布号2009-0004716中描述的专有制造方法，可以制造出浓度>10mg/mL且具有高纯度的DNA质粒，所述专利整体并入本文。此高浓度制剂还有益于在小的注射体积(0.1mL)下进行有效递送，如用于常规ID注射。

疫苗还可以用基于高度创新和有效电穿孔(EP)的DNA递送系统来组合以便增加所注射的DNA疫苗的效力。具有浅电穿孔深度和低/瞬态电参数的EP递送系统使新装置对预防应用和群体疫苗接种的耐受性大得多。

用所提供的制造方法和电穿孔递送装置组合的此DNA疫苗尤其可以提供以下益处：

·无载体诱导的应答-反复加强；复合疫苗/组合疫苗

·比在灵长类动物中和人中的病毒载体效力更大

·制造优点

本文提供了单一药剂LASV候选疫苗的细节，所述单一药剂LASV候选疫苗已显示出在受试者中对在豚鼠和非人灵长类动物激发模型中的致死引出100%保护。在非人灵长类动物模型中，LASV候选疫苗显示出促进此疫苗方法的临床转化。先前在具有任何其它沙粒病毒候选疫苗(具载体型或非具载体型)的文献中还没有实现针对两种不同激发模型的这种成功。

LASV候选疫苗是靶向旧大陆病毒和新大陆病毒两者的复合药剂候选疫苗。GPC抗原(病毒的免疫原性组分)在LASV、MACV以及JUNV中不是高度保守的，在不同沙粒病毒亚型(分别为LASV-MACV/JUNV和MACV-JUNV)中具有42%至71%范围内的同源性并且在不同亚型内的序列之中具有2%至10%的差异。因此，开发复合药剂疫苗不是显而易见的并且充满若干技术挑战。

本文所提供的候选疫苗已优化了GPC候选疫苗用于各靶标的病毒亚型，以使得它们单独针对各自的株系(例如，LASV、JUNV、MACV)有效并且共同对这些和其它沙粒病毒株进行交叉保护。制造候选疫苗以使得质粒组分处于高浓度(>10mg/mL)。候选疫苗的组分可以被组合用于用EP进行递送。相对于不带有EP的DNA递送，EP递送已显示出改进DNA转染和基因表达效率超过1000倍，并且改进免疫原性和疗效超过10至100倍。复合DNA疫苗-低注射体积-EP递送使得此方法尤其适用于预防性疫苗接种并且具体是复合药剂疫苗递送。

本文所描述的DNA疫苗方法拥有优于其它竞争性减毒活病毒/死病毒方法以及其它基于载体的方法(Ad5、MVA、YF)的独特安全优势，因为DNA疫苗是非复制的，不能整合到基因组中，并且不像载体，不能引起可以进一步限制具载体的疫苗的效力的抗载体血清学。DNA疫苗如今经过几百个不同的疫苗试验已递送至好几千人受试者，从安全角度来看具有较少的注意。与EP递送一起，DNAEP疫苗(HIV、HPV、流感、HCV、前列腺癌、黑素瘤)已经由肌肉内或真皮内途径递送至超过150人以上的受试者和超过350次以上的疫苗接种，并且安全特性(safety profile)不值得注意。

在一个实施方案中，候选疫苗可以具有以下性能说明：

将在豚鼠(品系13)和食蟹猴中进行激发。如在研究小节中所指出，存在两种建立的模型用于沙粒病毒激发。

在一些实施方案中，候选疫苗将包含所有2种或更多种候选疫苗(LASV、LCMV、MACV、JUNV、GTOV、WWAV以及PICV)，它们可以赋予交叉保护；而在其它实施方案中，仅存在两种候选疫苗的组合，并且更优选地两种(一种旧大陆和一种新大陆质粒)的实例如LASV与或者JUNV或者MACV赋予针对AV的所有多个株的保护。在一个实例中，DNA疫苗包含两种DNA疫苗质粒(LASV+JUNV/MACV)。在另一个实例中，DNA疫苗包含候选疫苗和细胞因子质粒。在另一个实例中，DNA疫苗包含三种质粒候选疫苗，包括LASV、JUNV和MACV。

存在一些实施方案，其中候选疫苗还包括分子佐剂，例如IL-12和IL-28以及RANTES。佐剂可以增加免疫应答的宽度、它们的幅度或改变疫苗的免疫表型以便赋予疫苗以额外的益处，如：改进的交叉株疗效(宽度)和/或在更低剂量下的100%疗效(效力)。

在一些实施方案中，候选疫苗是靶向LASV的单一质粒。此候选单一质粒已显示出在保护豚鼠和非人灵长类动物(“NHP”)不受致命激发影响方面高度有效。

定义

本文中所使用的术语仅是用于描述具体实施方案的目的并且不意图进行限制。如在说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包括复数对象，除非上下文另外清楚地指明。

针对本文中数值范围的叙述，明确涵盖具有相同精确度的介于其间的每个数字。例如，针对6至9的范围，除了6和9之外还涵盖数字7和8，并且针对6.0至7.0的范围，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

佐剂

本文中所使用的“佐剂”意指添加至本文所描述的DNA疫苗中以便增强由DNA构建体编码的抗原的免疫原性的任何分子，所述分子构成DNA疫苗和下文中所描述的编码核酸序列。

编码序列

本文中所使用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括可操作连接至调节元件的起始信号和终止信号，所述调节元件包括能够在向其施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。

互补

本文中所使用的“互补”或“互补的”意指核酸可以意味着核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

电穿孔

本文中互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“动电学增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲以便在生物膜中诱导微观路径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧穿至另一侧。

片段

关于核酸序列而在本文中所使用的“片段”意指核酸序列或其一部分，所述序列编码在与沙粒病毒GPC抗原发生交叉反应的哺乳动物中能够引出免疫应答的多肽。片段可以是选自以下的至少一个的DNA片段：编码共有氨基酸序列的各种核苷酸序列和包含所述序列的构建体。DNA片段可以包含用于免疫球蛋白前导的编码序列，如IgE或IgG序列。DNA片段可以编码以下列出的蛋白质片段。

关于多肽序列的“片段”意指在与沙粒病毒抗原发生交叉反应的哺乳动物中能够引出免疫应答的多肽，所述沙粒病毒抗原包括例如拉沙病毒(LASV)、脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、呼宁病毒(JUNV)、马秋博病毒(MACV)、淋巴细胞瓜纳瑞托病毒(GTOV)、白水河阿罗约病毒(White-water Arroyo virus)(WWAV)以及皮钦德病毒(Pichinde virus)(PICV)。

LASV糖蛋白前体(LASV-GPC)序列为约491个氨基酸，并且优选地被密码子优化。LASV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的LASV-GPC，并且优选地含有GPC区的残基441至449的片段。在一些实施方案中，LASV-GPC的片段包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。

LCMV糖蛋白前体(LCMV-GPC)序列为约498个氨基酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号NP_694851，其整体并入本文。LCMV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的LCMV-GPC，并且优选地片段包含残基447至455。

JUNV糖蛋白前体(JUNV-GPC)序列为约485个氨基酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号BAA00964，其整体并入本文。JUNV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的JUNV-GPC，并且优选地片段包含残基429至437。

MACV糖蛋白前体(MACV-GPC)序列为约496个氨基酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号AAN05425，其整体并入本文。MACV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的MACV-GPC，并且优选地片段包含残基444至452。

GTOV糖蛋白前体(GTOV-GPC)序列为约496个氨基酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号AAN05423，其整体并入本文。GTOV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的GTOV-GPC，并且优选地片段包含残基427至435。

WWAV糖蛋白前体(WWAV-GPC)序列为约496个氨基酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号AAK60497，其整体并入本文。WWAV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的WWAV-GPC，并且优选地片段包含残基428至436。

PICV糖蛋白前体(PICV-GPC)序列为约496个氨基酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号AAC32281，其整体并入本文。PICV-GPC的片段可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的PICV-GPC，并且优选地片段包含残基455至463。

基因构建体

本文中所使用的术语“基因构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作连接至调节元件的起始信号和终止信号，所述调节元件包括能够在向其施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。本文中所使用的术语“可表达的形式”是指包含可操作连接至编码蛋白质的编码序列的必要调节元件的基因构建体，这样使得当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。

同源性

使用ClustalW软件产生多重序列比对的同源性和系统发生图。

同一的

在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下，本文中所使用的“同一的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的与在指定区上相同的残基。可以通过以下来计算百分比：最优比对两个序列、比较两个序列的指定区、确定同一残基发生在这两个序列中的位置的数目以便得到匹配的位置的数目、用匹配的位置的数目除以指定区中的位置的总数目以及使结果乘以100以便得到序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同的长度或比对产生一个或多个交错末端以及比较的指定区仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。可以手动或通过使用计算机序列算法如BLAST或BLAST2.0进行同一性。

免疫应答

本文中所使用的“免疫应答”意指响应于引入抗原如沙粒病毒抗原来激活宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统。免疫应答可以呈细胞应答或体液应答或这两者的形式。

核酸

本文中所使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描写也定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描写的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖大致上同一的核酸及其互补链。单链提供了在严格的杂交条件下可以杂交至靶标序列的探针。因此，核酸还涵盖在严格的杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或双链的，或可以包含双链序列和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂交体，其中核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤。可以通过化学合成方法或通过重组方法获得核酸。

可操作连接

本文中所使用的“可操作连接”意指基因的表达是在所述基因与其空间连接的启动子的控制下。启动子可以位于其控制下的基因的5’(上游)或3’(下游)。启动子与基因之间的距离可以近似与所述启动子与启动子源自其中的基因中控制的基因之间的距离相同。如在本领域中已知的，可以接纳此距离的变化而不失去启动子功能。

启动子

本文中所使用的“启动子”意指合成的或天然来源的分子，其能够在细胞中赋予、激活或增强核酸的表达。启动子可以包含一个或多个特异性的转录调节序列以便进一步增强表达和/或以便改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远侧的增强子或抑制子元件，其可以位于距离转录起始位点高达几千个碱基对。启动子可以源自以下来源，包括：病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物。启动子可以调节基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子以及CMV IE启动子。

严格的杂交条件

本文中所使用的“严格的杂交条件”意指在所述条件下第一核酸序列(例如，探针)将杂交至第二核酸序列(例如，靶标)中的条件，如在核酸的复杂混合物中。严格的条件是依赖序列的并且在不同的情况中将会不同。严格的条件可以被选择为在限定的离子强度、pH下低于特定序列的热熔点(T_m)的约5℃至10℃。T_m可以是在所述温度下处于平衡时50%互补于靶标的探针杂交至靶标序列(因为靶标序列过量存在，所以在T_m下，平衡时50%的探针被占据)的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)。严格的条件可以是其中在pH7.0至8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子，如约0.01M至1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且针对短探针(例如，约10至50个核苷酸)的温度为至少约30℃，且针对长探针(例如，大于约50个核苷酸)的温度为至少约60℃的那些条件。严格的条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。为了选择性的或特异性的杂交，正信号可以是背景杂交的至少2倍至10倍。示例性的严格杂交条件包括以下：50%甲酰胺、5×SSC以及1%SDS、在42℃下孵育；或5×SSC、1%SDS、在65℃下孵育、其中在65℃下用0.2×SSC和0.1%SDS洗涤。

大致上互补

本文中所使用的“大致上互补”意指第一序列在具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、180个、270个、360个、450个、540个、630个、720个、810个、900个、990个、1080个、1170个、1260个、1350个或1440个或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一于第二序列的互补链，或这两个序列在严格的杂交条件下杂交。

大致上同一

本文中所使用的“大致上同一”意指第一序列与第二序列在具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、180个、270个、360个、450个、540个、630个、720个、810个、900个、990个、1080个、1170个、1260个、1350个或1440个或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一，或相对于核酸，如果第一序列大致上互补于第二序列的互补链。

亚型或血清型

“亚型”或“血清型”：在本文中可互换使用并且是关于沙粒病毒抗原，意指沙粒病毒抗原的基因变体，这样使得一种亚型(或变体)被除了不同亚型的免疫系统识别。

变体

关于核酸而在本文中使用的“变体”意指：(i)参考的核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考的核苷酸序列或其部分的互补链；(iii)大致上同一于参考的核酸或其补体的核酸；或(iv)在严格条件下杂交至参考的核酸、其互补链的核酸，或大致上同一于其的序列。

关于肽或多肽的“变体”通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还可以意指具有以下氨基酸序列的蛋白质，所述序列大致上同一于具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质。氨基酸的保守取代，即用具有相似性质(例如，亲水性、带电区的程度和分布)的不同氨基酸替换氨基酸在本领域中通常被认为涉及微小变化。这些微小变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴别，如本领域中所理解。Kyte等,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。本领域中已知的是，具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍保留蛋白质功能。一方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用来显现取代，这将产生保留生物功能的蛋白质。在肽的背景下考虑氨基酸的亲水性容许计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是一种已报道与抗原性和免疫原性很好地关联的有用测量。美国专利号4,554,101，其以引用的方式完全并入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽，如本领域中所理解。可以用彼此具有亲水性值为±2之内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者都受到所述氨基酸的具体侧链的影响。与所述观察一致，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且具体是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它性质所显现。

载体

本文中所使用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA载体或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并且优选地是DNA质粒。

赋形剂和疫苗的其它组分

疫苗可以进一步包含其它组分，如转染促进剂、药学上可接受的赋形剂、佐剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂可以是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染促进剂可以是聚-L-谷氨酸。聚-L-谷氨酸可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可以与基因构建体一起施用而使用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。疫苗中的转染剂的浓度为小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在替代性质粒中表达或在疫苗中以蛋白质形式与以上质粒组合递送的其它基因。佐剂可以选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关的上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信号序列缺失的IL-15并且任选地包括来自IgE的信号肽。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。

可以是有用的佐剂的其它基因包括编码以下的那些：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能片段。

疫苗可以进一步包含在1994年4月1日提交的美国序号021,579中所描述的基因疫苗促进剂，所述专利文献以引用的方式完全并入。

可以根据待使用的施用方式配制疫苗。可注射的疫苗药物组合物可以是无菌的、不含致热原以及不含微粒。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇以及乳糖。疫苗可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲的盐水。疫苗可以进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下稳定延长的时间段，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

疫苗接种的方法

本文中提供了一种对受试者进行疫苗接种的方法。所述方法使用电穿孔作为递送疫苗的机理。可以经由微创装置进行电穿孔。

密码子优化的AV GPC抗原

核苷酸序列—编码序列和构建体以及质粒

LASV糖蛋白前体(LASV-GPC)核苷酸编码序列为约1476个核苷酸，并且优选地被密码子优化。LASV-GPC的免疫原性片段的编码序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的所编码的LASV-GPC，并且优选地含有GPC区的残基441至449的片段。在一些实施方案中，LASV-GPC的编码序列为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，LASV-GPC的片段的编码序列包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，LASV-GPC的片段的编码序列包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

LCMV糖蛋白前体(LCMV-GPC)核苷酸编码序列为约1494个核苷酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号NP_694851，其整体并入本文。LCMV-GPC的免疫原性片段的编码序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的LCMV-GPC，并且优选地片段包含残基447至455。

JUNV糖蛋白前体(JUNV-GPC)核苷酸编码序列为约1455个核苷酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号BAA00964，其整体并入本文。JUNV-GPC的免疫原性片段的编码序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的JUNV-GPC，并且优选地片段包含残基429至437。

MACV糖蛋白前体(MACV-GPC)核苷酸编码序列为约1488个核苷酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号AAN05425，其整体并入本文。MACV-GPC的免疫原性片段的编码序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的MACV-GPC，并且优选地片段包含残基444至452。

GTOV糖蛋白前体(GTOV-GPC)核苷酸编码序列为约1488个核苷酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号AAN05423，其整体并入本文。GTOV-GPC的免疫原性片段的编码序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的GTOV-GPC，并且优选地片段包含残基427至435。

WWAV糖蛋白前体(WWAV-GPC)核苷酸编码序列为约1488个核苷酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号AAK60497，其整体并入本文。WWAV-GPC的免疫原性片段的编码序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的WWAV-GPC，并且优选地片段包含残基428至436。

PICV糖蛋白前体(PICV-GPC)核苷酸编码序列为约1488个核苷酸，并且优选地被密码子优化—参见NCBI登录号AAC32281，其整体并入本文。PICV-GPC的免疫原性片段的编码序列可以包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的PICV-GPC，并且优选地片段包含残基455至463。

本文提供了基因构建体，其可以包含编码本文公开的AV GPC抗原(包括其免疫原性片段)的核酸序列。基因构建体可以作为功能性染色体外分子存在于细胞中。基因构建体可以是线性微染色体，包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒。

基因构建体还可以是重组病毒载体的基因组的部分，包括重组腺病毒、重组腺病毒相关的病毒以及重组痘苗。基因构建体可以是减毒活微生物或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。

基因构建体可以包含用于基因表达核酸的编码序列的调节元件。调节元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多腺苷酸化信号。

核酸序列可以构成基因构建体，其可以是载体。载体可以能够以有效于在哺乳动物中引出免疫应答的量而在哺乳动物的细胞中表达抗原。载体可以是重组的。载体可以包含编码抗原的异源核酸。载体可以是质粒。载体可以对用编码抗原的核酸转染细胞有用，在其中发生抗原表达的条件下培养和维持所转化的宿主细胞。

可以优化编码序列的稳定性和高水平的表达。在一些例子中，密码子被选择来减少RNA的二级结构形成，如由于分子内键合所形成的。

载体可以包含编码抗原的异源核酸，并且可以进一步包含起始密码子和终止密码子，所述起始密码子可以位于抗原编码序列的上游，而所述终止密码子可以位于抗原编码序列的下游。起始密码子和终止密码子可以在抗原编码序列的框架中。载体还可以包含可操作连接至抗原编码序列的启动子。可操作连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子(如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复区(LTR)启动子)、莫洛尼病毒启动子、禽类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV立即早期启动子、埃-巴二氏病毒(EBV)启动子)或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。所述启动子的实例描述在美国专利申请公布号US20040175727中，其内容整体并入本文。

载体还可以包含多腺苷酸化信号，其可以位于AV GPC蛋白编码序列的下游。多腺苷酸化信号可以是SV40多腺苷酸化信号、LTR多腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多腺苷酸化信号或人β-球蛋白多腺苷酸化信号。SV40多腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的多腺苷酸化信号。

载体还可以包含位于AV GPC蛋白编码序列上游的增强子。增强子可以是DNA表达所必需的。增强子可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或EBV的病毒增强子。多核苷酸功能增强描述在美国专利号5,593,972、5,962,428以及WO94/016737中，这些专利文献各自的内容以引用的方式完全并入。

载体还可以包含哺乳动物复制起点，以便在染色体外维持载体并且在细胞中产生多个拷贝的载体。载体可以是来自Invitrogen(SanDiego,CA)的pWRG7077(参见下文Schmaljohn等)、pVAX1、pCEP4或pREP4，所述载体可以包含埃-巴二氏病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，这可以产生无整合的高拷贝的游离型复制。载体可以是pVAX1或具有变化的pVax1变体，如本文中所描述的变体质粒。变体pVax1质粒是骨架载体质粒pVAX1(Invitrogen,Carlsbad CA)的2998个碱基对变体。CMV启动子位于碱基137至724处。T7启动子/引发位点处于碱基664至683处。多克隆位点处于碱基696至811处。牛GH多腺苷酸化信号处于碱基829至1053处。卡那霉素抗性基因处于碱基1226至2020处。pUC起点处于碱基2320至2993处。基于从Invitrogen可获得的pVAX1的序列，在用作本文中列出的质粒1至6的骨架的pVAX1的序列中发现以下突变：

C>G241 在CMV启动子中

C>T 1942 骨架，牛生长激素多腺苷酸化信号(bGHpolyA)的下游

A>- 2876 骨架，卡那霉素基因的下游

C>T 3277 在高拷贝数突变的pUC复制起点(Ori)中(参见Nucleic Acid Research1985)

G>C 3753 在RNASeH位点上游的pUC Ori的最末端

在骨架中位于CMV启动子上游的碱基对2、3以及4由ACT变为CTG。

载体的骨架可以是pAV0242。载体可以是复制缺陷的腺病毒类型5(Ad5)载体。

载体还可以包含调节序列，其可以很好地适用于在载体施用至其中的哺乳动物或人细胞中的基因表达。AV GPC编码序列可以包含密码子，其可以允许在宿主细胞中更有效地转录编码序列。

载体可以是pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif)，其可以用于大肠杆菌(Escherichia coli(E.coli))中的蛋白质产生。载体还可以是pYES2(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中的蛋白质产生。载体还可以具有MAXBAC^TM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif)，其可以用于昆虫细胞中的蛋白质产生。载体还可以是pcDNAI或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可以用于哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的蛋白质产生。载体可以是通过常规技术和容易获得的起始材料产生蛋白质的表达载体或系统，所述技术和起始材料包括Sambrook等,Molecular Cloning and Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor(1989)，其以引用的方式完全并入。

药物组合物

本文提供了根据本发明的药物组合物，在本文中又指示为DNA疫苗，其包含约1纳克至约10毫克的DNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含介于：1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克；或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克；或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10毫克或更多与2)高达并且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克；或高达并且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克；或高达并且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10毫克之间。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约10毫克的DNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5毫克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约50纳克至约1毫克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约0.1微克至约500微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约1微克至约350微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约5微克至约250微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约200微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约15微克至约150微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约100微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约75微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约30微克至约50微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约35微克至约40微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约100微克至约200微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约100微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约80微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约60微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约30纳克至约50微克的DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约35纳克至约45微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约0.1微克至约500微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约1微克至约350微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约25微克至约250微克的DNA。在一些优选的实施方案中，药物组合物包含约100微克至约200微克的DNA。

根据本发明的药物组合物根据待使用的施用方式来配制。在其中药物组合物为可注射的药物组合物的情况下，它们为无菌的、不含致热原以及不含微粒。优选使用等渗制剂。通常，用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇以及乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸盐缓冲的盐水是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，血管收缩剂被添加至制剂中。

优选地，药物组合物是疫苗，并且更优选地DNA疫苗。

本文提供了能够在哺乳动物中产生针对一种或多种AV的保护性免疫应答的疫苗。疫苗可以包含如本文中所讨论的基因构建体。

虽然不希望受到科学理论的约束，但是疫苗可以用来引出广泛针对一种或多种类型的AV的免疫应答(体液的、细胞的或这两者)。

DNA疫苗被公开在美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055以及5,676,594中，其以引用的方式完全并入本文。DNA疫苗可以进一步包含抑制其整合至染色体中的元件或试剂。疫苗可以是AV GPC蛋白的RNA。RNA疫苗可以被引入到细胞中。

疫苗可以是重组疫苗，其包含本文中所描述的基因构建体或抗原。疫苗还可以包含以一种或多种蛋白质亚单位的形式的一种或多种AV GPC核心蛋白；包含一种或多种AV GPC蛋白的一种或多种死病毒颗粒；或包含一种或多种AV GPC蛋白的一种或多种减毒病毒颗粒。减毒疫苗可以是减毒活疫苗、灭活的疫苗和使用重组载体递送编码一种或多种AV GPC蛋白的外源基因的疫苗、以及亚单位和糖蛋白疫苗。减毒活疫苗、使用重组载体递送外源抗原的那些、亚单位疫苗以及糖蛋白疫苗的实例描述在美国专利号：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319以及6,589,529中，所述专利文献各自以引用的方式并入本文。

疫苗可以包含针对来自世界多个具体地区的多种AV的载体和/或蛋白质。所提供的疫苗可以用来诱导免疫应答，包括治疗性或预防性免疫应答。可以产生针对AV GPC蛋白并且也广泛在多种AV病毒上的抗体和/或杀伤性T细胞。可以分离所述抗体和细胞。

疫苗可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染促进剂为聚-L-谷氨酸，并且更优选地，聚-L-谷氨酸以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，如免疫刺激性复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可以与基因构建体一起施用而使用。在一些实施方案中，DNA载体疫苗还可以包括转染促进剂，如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。优选地，转染促进剂为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。疫苗中的转染剂的浓度为小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。

佐剂

药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在替代性质粒中表达或在疫苗中以蛋白质形式与以上质粒组合递送的其它基因。佐剂可以选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关的上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86，包括信号序列缺失的IL-15并且任选地包括来自IgE的信号肽。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、1L-12、IL-18或其组合。优选地，佐剂为IL12、IL15、IL28以及RANTES。

可以是有用的佐剂的其它基因包括编码以下的那些：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。

递送方法

本文提供了一种用于递送药物制剂(优选疫苗)以便提供AV GPC蛋白的基因构建体和蛋白质的方法，所述基因构建体和蛋白质包含使它们成为特别有效的免疫原的表位，针对所述免疫原可以诱导对于AV病毒感染的免疫应答。可以提供递送疫苗或疫苗接种的方法来诱导治疗性和/或预防性免疫应答。疫苗接种方法可以在哺乳动物中产生针对多个AV病毒的免疫应答。可以将疫苗递送至个体以便调节哺乳动物免疫系统的活性并且增强免疫应答。疫苗的递送可以是AVGPC抗原转染为核酸分子，所述核酸分子在细胞中表达并且当免疫系统识别其时递送至细胞的表面并且诱导细胞应答、体液应答或细胞和体液应答。疫苗的递送可以通过向哺乳动物施用本文中所讨论的疫苗而用来在哺乳动物中针对多个AV病毒诱导或引出免疫应答。一旦疫苗递送至哺乳动物，载体随即进入哺乳动物的细胞中，转染的细胞便将表达和分泌AV GPC蛋白。这些分泌的蛋白质或合成的抗原将被免疫系统识别为外源的，这将发动免疫应答，其可以包括：针对抗原得到抗体和特异性针对抗原进行T细胞应答。在一些实施例中，用本文中所讨论的疫苗接种的哺乳动物将具有引发的免疫系统，并且当用AV病毒株激发时，所引发的免疫系统将允许快速清除后来的AV病毒，不论通过体液、细胞或这两者。可以将疫苗递送至个体以便调节个体的免疫系统的活性，从而增强免疫应答。

可以DNA疫苗的形式递送疫苗，并且递送DNA疫苗的方法描述在美国专利号4,945,050和5,036,006中，其均以引用的方式完全并入。

可以将疫苗施用至哺乳动物以便在哺乳动物中引出免疫应答。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、奶牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、大羊驼、羊驼、小鼠、大鼠或鸡，并且优选是人、奶牛、猪或鸡。

此页有意留为空白

提交时，不提供此页

施用途径

疫苗可以通过不同途径来施用，包括：经口、肠胃外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经由口腔施用、胸腔内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内以及关节内或其组合。对于兽医使用，可以根据正常的兽医实践呈适合地可接受的制剂施用组合物。兽医师可以容易地确定最适合于具体动物的给药方案和施用途径。可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微粒轰击枪”或其它物理方法如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用疫苗。

可以通过若干众所周知的技术将疫苗的载体递送至哺乳动物，所述技术包括具有和不具有体内电穿孔的DNA注射(又称为DNA疫苗接种)、脂质体介导、纳米颗粒促进、重组载体如重组腺病毒、重组腺病毒相关的病毒以及重组痘苗。AV GPC抗原可以经由DNA注射以及连同体内电穿孔来递送。

电穿孔

经由电穿孔疫苗的质粒进行的疫苗施用可以使用电穿孔装置来完成，所述电穿孔装置可以被配置来将具有有效使得可逆孔隙在细胞膜中形成的能量的脉冲递送至哺乳动物的希望的组织，并且优选具有能量的脉冲是相似于使用者所输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或把手组件。电穿孔部件可以包括并且并入有电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形发生器、阻抗测试器、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器部件、电源以及电源开关。可以使用体内电穿孔装置例如

EP系统(Inovio Pharmaceuticals,Inc.,BlueBell,PA)或Elgen电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals,Inc.)来完成电穿孔以便促进细胞被质粒所转染。可以促进本发明的DNA疫苗递送的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括描述在Draghia-Akli.等的美国专利号7,245,963、由Smith等递交的美国专利公布2005/0052630中的那些，所述专利文献的内容特此以引用的方式整体并入。可以用于促进DNA疫苗递送的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括提供在2007年10月17日提交的共同待决和共有的美国专利申请序号11/874072中的那些，所述专利申请根据美国法典第35卷第119条第(e)项要求了2006年10月17日提交的美国临时申请序号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序号60/978,982的权益，所有这些专利文献都特此整体并入。Draghia-Akli等的美国专利号7,245,963描述了模块化电极系统及其用于促进生物分子引入到身体内或植物中选择的组织的细胞中的用途。模块化电极系统可以包括多个针电极；皮下针；提供从可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电链路的电连接器；以及电源。操作者可以握住安装在支撑结构上的多个针电极并且牢牢地将它们插入到身体或植物中选择的组织中。然后经由皮下针将生物分子递送到所选择的组织中。激活可编程恒流脉冲控制器，并且将恒流电脉冲施加至多个针电极。所施加的恒流电脉冲促进生物分子引入到多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的整个内容特此以引用的方式并入。

Smith等递交的美国专利公布2005/0052630描述了一种电穿孔装置，其可以用来有效地促进生物分子引入到身体或植物中选择的组织的细胞中。电穿孔装置包括电动装置(“EKD装置”)，其操作是通过软件或固件来指定的。EKD装置基于使用者控制和输入脉冲参数而在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒流脉冲样式，并且允许电流波形数据的存储和获取。电穿孔装置还包括具有针电极阵列的可替换电极圆盘、用于注射针的中心注射通道以及可移除的导向圆盘。美国专利公布2005/0052630的整个内容特此以引用的方式并入。

在美国专利号7,245,963和美国专利公布2005/0052630中描述的电极阵列和方法可以适于深度渗透到不仅如肌肉的组织中，而且其它组织或器官中。由于电极阵列的配置，注射针(为了递送所选择的生物分子)也被完全插入到靶标器官中，并且在被电极预先勾勒的区域中，垂直于靶标组织施用注射。在美国专利号7,245,963和美国专利公布2005/005263中描述的电极优选地为20mm长和21号。

另外，在一些实施方案中涵盖并入有电穿孔装置及其用途，存在描述在以下专利中的那些电穿孔装置：1993年12月28日授权的美国专利5,273,525、2000年8月29日授权的美国专利6,110,161、2001年7月17日授权的美国专利6,261,281和2005年10月25日授权的美国专利6,958,060以及2005年9月6日授权的美国专利6,939,862。此外，涵盖提供在2004年2月24日授权的美国专利6,697,669中的主题的专利，其涉及使用任何各种装置递送DNA，以及指出注射DNA的方法的2008年2月5日授权的美国专利7,328,064被涵盖在本文中。以上专利以引用的方式整体并入。

制备疫苗的方法

本文提供了用于制备DNA质粒的方法，所述DNA质粒包含本文中讨论的DNA疫苗。在最后亚克隆步骤到哺乳动物表达质粒中之后，使用本领域中已知的方法，DNA质粒可以用来在大规模发酵罐中接种细胞培养物。

可以使用已知的装置和技术的组合配制或制造用于与本发明的EP装置一起使用的DNA质粒，但优选地使用优化的质粒制造技术制造它们，所述质粒制造技术技术被描述在2007年5月23日提交的美国公布申请号20090004716中。在一些实施例中，可以在大于或等于10mg/mL的浓度下配制这些研究中所使用的DNA质粒。除了描述在美国序号60/939792中的那些之外，制造技术还包括或并入有本领域普通技术人员通常已知的各种装置和实验方案，包括描述在2007年7月3日授权的许可使用的专利、美国专利号7,238,522中的那些。以上引用的申请和专利(分别是美国序号60/939,792和美国专利号7,238,522)特此整体并入。

实施例

在以下实施例中进一步说明了本发明。应该理解，这些实施例虽然指明了本发明的优选实施方案，但是它们仅以说明的方式给出。从以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种变化和修改以便使其适宜各种用法和条件。因此，除了本文中所显示和描述的那些之外，本领域技术人员从上述描述将对于本发明的各种修改变得清楚。

动物研究—豚鼠。将第13品系豚鼠(Cavia porcellus)分成每组6只动物的4个组(先导研究)或每组8只或5只动物的7个组(跟踪研究)。使动物麻醉，然后在3周的时间间隔里，施用真正的(LASV-GPC—SEQ ID NO:1(优化的)或SEQ ID NO:3(未优化的))或模拟的(空质粒)12μg(基因枪或GG)或100μg(经由肌肉内电穿孔装置(IM EP)、微创皮内装置(MID)或无创装置(NINV))DNA的疫苗接种。在最后一次疫苗接种之后四周，在4级生物安全等级(BSL)条件下进行病毒感染。每个动物施用1000pfu的单次皮下剂量的LASV。每日观察动物的疾病进展。在感染前第7天或感染后第0天、第7天、第14天、第21天以及第29天或第32天获取血液样品。当动物垂死时，使其安乐死。分析血清样品的病毒血症和血液化学值。对每只动物进行尸体解剖，并且分析组织的LASV特异性组织病理学和免疫组织化学的分析。

动物研究—非人灵长类动物。将食蟹猕猴(Macaca fasicularis)分成每组4只动物的2个组。使动物麻醉，然后在3周的时间间隔里，施用真正的或模拟的1mg DNA(SEQ ID NO:2)的疫苗接种。在最后一次疫苗接种之后四周，在BSL-4条件下进行病毒感染。每只动物施用1000pfu的单次肌肉内剂量的LASV。每日观察动物的疾病进展。在感染后第0天、第3天、第6天、第10天、第14天、第21天、第28天以及第45天获取血液样品。当动物垂死时，使其安乐死。分析血液样品的CBC、血液化学以及血清病毒血症。

病毒血症的分析。在37℃、5%CO2下，在轻柔旋转下，用血清的10倍连续稀释液吸附接种于6孔细胞培养板中的Vero细胞，保持1h，然后将含0.8%琼脂糖的具有10%胎牛血清的EBME覆层施加至每个孔。然后在37℃、5%CO2下，孵育细胞4天，然后用中性红(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色。对噬斑计数并且记录下来。

血液化学分析。经由Piccolo血液化学分析仪(Abaxis)上的13项普通化学检测(General Chemistry13-panel)旋转器分析灵长类动物血清样品的GLU、CRE、UA、CA、ALB、TP、ALT、AST、(ALP)、TBIL、GGT以及AMY。经由Abaxis VetScan血液化学分析仪分析豚鼠样品的全套代谢功能检测上的以上各项。

全血计数。对于灵长类动物研究，在Hemavet仪器(Drew Scientific)上分析约25ul体积的全EDTA血液。

组织的病理分析。将组织包埋于石蜡中，切片并且用苏木精和曙红染色。使用LASV特异性单克隆抗体和可商购的试剂盒(EnvisionSystem；DAKO,Carpinteria,CA)进行免疫组织化学分析。使组织脱石蜡，阻断，然后与一级抗体和二级抗体一起孵育，然后用苏木精复染。

LASV DNA的产生

通过将编码LASV(Josiah株)的糖蛋白前体(GPC)基因的cDNA克隆到更早所描述的质粒载体pWRG7077(Schmaljohn等,J.Vir.71,9563-9569(1997))中来产生LASV DNA疫苗。将LASV-GPC基因克隆到NotI/BgIII限制性位点中。表达处于CMV启动子的控制下。

通过肌肉内(IM)EP递送到豚鼠中并进行激发来测试疫苗的保护功效，这发展为类似于在非人灵长类动物(NHP)和人中所观察的出血性疾病。在3至4周的时间间隔里，使豚鼠(每组6只)通过肌肉内(IM)EP接受50μg或通过基因枪(GG)接受约5μg的DNA疫苗(包含SEQID NO:3)三次。在疫苗接种之后约4周，通过腹膜内(IP)施用1000个噬斑形成单位(pfu)的LASV(标准致死激发剂量)来激发豚鼠。所有对照豚鼠都死于LASV感染，而83%的疫苗接种的动物存活，并且死亡的单一动物显示出死亡时间延迟。在接种疫苗但不是对照豚鼠中进行激发之后，检测针对LASV的中和抗体，从而表明启动应答是由DNA疫苗引起(数据未示出)。

虽然此豚鼠研究证明了IM EP加LASV DNA疫苗可以引起保护性免疫，但是受激发的动物确实出现发热并且显示出轻微的疾病临床症状(图1A、图1C)；因此，寻求疫苗构建体和皮内递送方法的进一步改进。针对此目标，对LASV GPC DNA疫苗进行了优化以使哺乳动物密码子可获得性最大并且去除显示出危害表达的病毒元件。在第13品系豚鼠(每组8只)中测试此优化的疫苗(包含SEQ ID NO:1)，在3至4周的时间间隔里，使用参数经过修正的肌肉内电穿孔装置(IMEP)、用微创皮内装置(MID)或用无创装置(NINV)疫苗接种50μg的DNA三次。(MID)具有形状为三角形的电极间距，其中在一侧上具有3mm间隔的电极并且另外两侧上为5mm间隔的电极。NINV具有呈4×4模式的电极阵列，使得它与皮肤表面接触而不会渗透皮肤(或替代地进入皮肤到角质层中)。

在激发之后，用空质粒疫苗接种的所有豚鼠或没有接受疫苗的那些豚鼠出现发热，展现出疾病的症状、体重减轻并且在激发之后第15天到第18天死于感染(图1)。相比之下，通过任何EP方法用密码子优化的LASV DNA疫苗接种的所有豚鼠都在激发中存活。与用未优化的LASV DNA疫苗接种的豚鼠显示出疾病症状的先导研究不同，在此研究中，MID和IM EP组中的豚鼠都没有展现出疾病的症状，无发热并且维持恒定的体重。然而，在通过IM EP接受LASV DNA疫苗的一些豚鼠中观察到轻微的疾病症状，包括低热和轻微的病毒血症，这表明皮肤电穿孔在此研究中更有效。

图2展示出使用IM或MID皮肤EP装置，用密码子优化的LASVDNA或用空质粒对照进行疫苗接种的豚鼠(每组8只)的存活曲线。在最后一次疫苗接种之后4周，用1000pfu的LASV激发豚鼠。

为了证实疫苗和递送方法的功效和持久性，选择一小组通过MIDEP接种疫苗的豚鼠用于反激发实验。将这些豚鼠保持在BSL-4防护中，持续120天，并且然后连同4个重量匹配的未经过处理的豚鼠一起用1000pfu的LASV激发。每日观察豚鼠，持续30天，接着进行病毒感染，并且监测体重、温度以及疾病进展。在研究和存活的再感染期间，接种疫苗的动物从未患病(图3)。

图3展示出一小组通过MID EP接种疫苗的豚鼠的反激发实验的结果，其中图3A显示出组中体重的变化，并且图3B显示出各组的平均体温的变化。

进一步评估了在NHP中通过MID EP递送的密码子优化的LASVDNA疫苗(包含SEQ ID NO:2)。NHP模型是用于评价疫苗功效的信息量最大的模型，因为在这些动物中观察到的疾病最接近地模拟了人的疾病。

在3周的时间间隔里，使用MID EP装置，用1mg的LASV DNA疫苗(包含SEQ ID NO:2)或1mg的空载体质粒疫苗接种具有四个NHP的组三次，并且在最后一次疫苗接种之后4周，通过IM注射1000pfu的LASV来进行激发。监测从NHP收集的血液样品的CBC和血液化学，并且每日两次观察动物的疾病进展。在出血时间窗的期间(感染后第13天和第17天)，四个对照NHP中有两个死于疾病。其它两个对照NHP出现神经症状，包括共济失调和耳聋，如通过将它们在研究最后一天(激发后第45天)所产生的听力图与LASV DNA疫苗接种的NHP的那些听力图比较所表明(图4)。耳聋(单边或双边)是在约30%的LASV患者中发生的公认的LASV感染的结果，但根据我们的知识，这是NHP中的此疾病后果的第一个文件证据，并且可以充当疾病标记。

如在图4中所显示，NHP#2和NHP#7的听力图分别为用空质粒或LASV DNA疫苗接种的。由用0分贝刺激猴得到的听力图没有显示出响应。NHP#2的左耳和右耳的听力图在75分贝下没有显示出响应，相比之下，NHP#7的听力图显示出听力响应图案。

虽然两个对照NHP在感染中存活，但是在整个研究中，它们持续病重(感染后第45天)。相比之下，四个LASV DNA疫苗接种的NHP看起来在整个研究中都是健康的，从未发热，并且维持正常的CBC和血液化学(图5)。

图5展示出通过MID EP用LASV DNA疫苗或空质粒疫苗接种并用LASV激发的NHP的存活评分、病毒血症评分以及发病率评分。图5A显示出所有LASV DNA疫苗接种的NHP在LASV激发中存活，而用空质粒疫苗接种的4个对照NHP中有2个死于感染。图5B显示出全部4个空质粒疫苗接种的NHP出现病毒血症，但是2个存活的NHP能够在激发后28天清除病毒。LASV DNA疫苗接种的NHP在所有时间点都是无病毒血症的。C.发病率评分是NHP在研究期间的患病程度的量度。对照动物在死亡前病重。直到研究结束还未死亡的持续病重的2个NHP从未恢复到激发前的状况。LASV DNA疫苗接种的NHP从未患病。

图6显示出接受LASV-GPC(包含SEQ ID NO:2)或模拟DNA疫苗的猕猴的选择的血液化学值。

图7展示出用LASV-GPC(包含SEQ ID NO:2)和模拟DNA疫苗两者疫苗接种的猕猴(NHP)的CBC和血液化学。所展现的结果显示出NHP中正常的CBC和血液化学。

实验和方法

进行LASV DNA疫苗的剂量范围研究(1至8个月)：

有待评价第13品系豚鼠中的三种剂量的LASV DNA疫苗。在先前的研究中，在3周时间间隔里通过MID EP给予的50μg LASV DNA疫苗的三次疫苗接种为第13品系豚鼠提供了完全的保护性免疫。将比较通过MID EP(表1)给予的50μg、5μg以及1μg的在缩短的给药方案(3周分开给予两次疫苗接种)中的疫苗的保护功效。

表1

通过真皮内电穿孔递送至品系13豚鼠的LASV密码子优化的DNA疫苗的剂量范围评价。

确定JUNV和MACV DNA疫苗的交叉保护和复合药剂疫苗制剂的测量干扰

将测试DNA疫苗皮肤电穿孔系统作为复合药剂疫苗平台的总体适用性。将产生针对JUNV和MACV(其享有约96%的GPC氨基酸同源性)的密码子优化的DNA疫苗，并且将进行交叉激发研究(表2)。当确定JUNV和MACV疫苗为交叉保护性时，则旨在保护不受旧大陆和新大陆沙粒病毒影响的未来研究可以仅使用两种疫苗之一与LASV疫苗组合。此研究中的一组豚鼠将用所有三种DNA候选疫苗接种并且用LASV激发。

表2

先导研究评价：(1)JUNV和MACV密码子优化的DNA疫苗的交叉保护；以及(2)疫苗平台的复合药剂效力。

测量NHP激发模型中的免疫相关性、剂量减少以及细胞因子佐剂

将进行研究来测量通过EP用LASV DNA疫苗(包含SEQ IDNO:2)在具有和不具有细胞因子佐剂下疫苗接种非人灵长类动物(NHP)的免疫应答(参见以下表3中的清单)。在疫苗接种之后，将在BSL-4防护实验室中激发NHP。

将与LASV DNA疫苗、IL-28以及IL-12组合测试两种细胞因子DNA质粒。

在3周时间间隔里用1mg的LASV DNA疫苗(包含SEQ ID NO:2)接种NHP三次显示出在早期研究中显示对LASV的激发的保护。将进行研究来比较以下给药：在4周时间间隔里给予剂量1mg的疫苗三次与间隔8周给予相同剂量两次。另外，将比较单独或与表达IL-12或IL-28细胞因子的基因的质粒组合给予的半强度剂量疫苗(0.5mg)。这些细胞因子用以辅佐疫苗并且提供改进的细胞介导的免疫应答。

细胞免疫表型由LASV疫苗诱导，并且细胞因子佐剂将通过以下分析来评价：抗原特异性IFNg ELISPOT、细胞内细胞因子染色(包括测定多功能性T细胞分布)、经由CFSE稀释的增殖以及对于溶细胞性CD8+T细胞的标记的染色，包括表达Tbet、穿孔蛋白、颗粒酶B以及CD107a如在Hersperger等2010a、Hersperger等2010b、Morrow等2010b以及Migueles等2008中所描述。这些免疫测定的组合将允许特异性的询问针对LASV DNA疫苗的CD8+T细胞应答，其中特别强调CTL(细胞毒性淋巴细胞)表型和活性，如CD8+T细胞的此功能直接与消除病毒感染的细胞相关并且构成免疫系统控制和消除病毒感染的主要机理。采用IL-12和IL-28的先前研究已表明这些佐剂都能驱动疫苗特异性的CTL诱导，其展示出穿孔蛋白释放、颗粒酶B负荷和释放、以及CD107a表达的强劲增加。在除了佐剂之外还使用HIV抗原的NHP模型中进行所述研究，并且在PBMC以及从肠系膜淋巴结中收获的T细胞中都看到这些增加的应答，从而表明这些佐剂对外周血以及二级淋巴器官施加了影响。此外，IL-12和IL-28都能够长期对CTL表型和功能施加它们的影响，因为在最后免疫之后3个月进行的分析显示出增强的抗原特异性免疫应答的持续存在。

表3

具有和不具有IL-12或IL-28佐剂的NHP中的给药

LASV DNA疫苗效力测定的开发

为了能使IND提交，将需要有力的和可靠的效力测定。定量的流式细胞效力测定有待用于AV疫苗，例如LASV DNA疫苗。已经开发了类似的测定，并且在用于具有由汉坦病毒(hantavirus)感染引起的肾病综合症的出血热(Badger等2011)的DNA疫苗的第1阶段临床研究的支持下在USAMRIID已用了多于三年，并且支持用于委瑞内拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)的DNA疫苗的IND提交。通常，方法涉及用测试DNA转染细胞，并且将所测量的抗原表达与用从已知量的参比物质DNA的表达所产生的进行比较。

测定是快速的(小于一天)、高度可再现的，并且已经适于在良好实验室实践(GLP)指南下进行。因此，管理文件和程序已经到位。这应该极大地促进了适应用于测量LASV DNA疫苗的效力的测定。虽然单独的这项测定足以测量DNA疫苗的效力和稳定性，但因为对于LASV感染存在很少的保护性免疫的相关性，所以我们还将在第一年的每个稳定性时间点疫苗接种小组的豚鼠以便提供基因表达与抗原性相关联的信息。

豚鼠激发模型是用于AV评价AV疫苗功效的被接受的模型。使用MID装置，在3至4周时间间隔里用50ug的GPC DNA LASV疫苗疫苗接种动物3次。在最后疫苗接种之后三周，通过肌肉内注射1000pfu的LASV激发动物。如在图2中所显示出，大于90%的疫苗接种的动物在激发中存活，而截至激发后第15天，100%的对照(模拟疫苗接种的)动物死亡。图5显示出来自NHP研究的激发数据。在3周时间间隔里，用1mg的GPC DNA LASV疫苗或1mg的空载体疫苗接种具有4个NHP的组3次，并且在最后疫苗接种之后4周通过肌肉内注射1000pfu LASV来激发。4/4的疫苗接种的NHP存活并且没有显示出病毒血症的迹象，而4/4对照动物发展了病毒血症并且2/4对照动物死于激发。

Claims

1.一种包含核苷酸编码序列的DNA疫苗，所述核苷酸编码序列编码一种或多种能够在有需要的受试者中产生针对沙粒病毒的保护性免疫应答的免疫原性蛋白，所述DNA疫苗包含：

编码沙粒病毒的糖蛋白前体的编码序列，所述编码序列针对所述受试者进行密码子优化；或其与所述糖蛋白前体98%同源的免疫原性片段。

2.如权利要求1所述的DNA疫苗，其中所述编码序列基本上由以下组成：LASV(LASV-GPC)的糖蛋白前体结构域、LCMV(LCMV-GPC)的糖蛋白前体结构域、MACV(MACV-GPC)的糖蛋白前体结构域、JUNV(JUNV-GPC)的糖蛋白前体结构域、GTOV(GTOV-GPC)的糖蛋白前体结构域、WWAV(WWAV-GPC)的糖蛋白前体结构域或PICV(PICV-GPC)的糖蛋白前体结构域。

3.如权利要求2所述的DNA疫苗，其中所述片段包括：

包括残基441至449的LASV-GPC的片段，

包括残基447至455的LMCV-GPC的片段，

包括残基444至452的MACV-GPC的片段，

包括残基429至437的JUNV-GPC的片段，

包括残基427至435的GTOV-GPC的片段，

包括残基428至436的WWAV-GPC的片段，或

包括残基455至463的PICV-GPC的片段。

4.如权利要求1至3中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗基本上由所述编码序列之一组成。

5.如权利要求1至3中任一项所述的DNA疫苗，其中所述DNA疫苗基本上由所述编码序列的至少两个组成。

6.如权利要求1至5中任一项所述的DNA疫苗，其进一步包含选自由以下组成的组的佐剂：IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

7.如权利要求6所述的DNA疫苗，其中所述编码序列为：

SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或编码SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的核苷酸序列。

8.一种诱导针对沙粒病毒的保护性免疫应答的方法，其包括：

向有需要的受试者施用如权利要求1至6中任一项所述的DNA疫苗，以及

电穿孔所述受试者。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述电穿孔步骤包括：

将具有能量的电穿孔脉冲递送至发生施用步骤的所述受试者上的部位。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述施用步骤和电穿孔步骤都发生在所述受试者的真皮内层。