KR20140045557A - 교차-보호성 아레나바이러스 백신 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다중 아레나바이러스 물질을 단독으로 또는 동시에 표적화하는 DNA 백신에 관계한다.

Description

교차-보호성 아레나바이러스 백신 및 이의 사용 방법{CROSS-PROTECTIVE ARENAVIRUS VACCINES AND THEIR METHOD OF USE}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2011년 7월 11일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/506,579 및 2011년 7월 12일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/507,062를 우선권으로 주장하며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

연방정부-지원 연구 및 개발

본 발명의 주제의 개발과 관련된 활동은 미국 정부, 육군 계약 번호 W81XWH-12-0154에 의해 일부 지원을 받았으며, 따라서, 본 발명에 대해 미국 정부는 특정 권리를 가질 수 있다.

발명의 분야

본 발명은 아레나(arena) 바이러스에 대항하여 보호성 면역 반응을 유도하는데 효과적인 DNA 기반 백신 및 이를 만들고 이용하는 방법들에 관한 것이다.

아레나바이러스 (AV)는 설치류-매개 바이러스로서, 불쾌, 심각한 부종, 혈액 상실 및 높은 사망률과 연관된, 급성 및 종종 치명적 출혈열의 원인이 된다. 라사 바이러스 (LASV)는 서아프리카 지역에 만연된 Old World 아레나바이러스다. 미국, 유럽 및 캐나다에 라사열(Lassa fever)의 수입 경우들이 보고되었다. 매년 300,000 내지 500,000건의 라사열이 발생되며, 입원 환자의 15% - 20%에 이르는 치사율을 가지는 것으로 예측된다. New World 아레나바이러스, Junin (JUNV), Machupo (MACV), Guanarito, 그리고 Sabia 바이러스는 남미에 만연되며, 매년 수천건의 심각한 출혈열 사안을 야기하는 것으로 알려져 있다. 아레나 바이러스는 CDC Category A 생물학적 위협 물질이며, 그리고 새로운 질병 발병 또는 이들 바이러스를 이용한 생물테러 공격의 불행한 사건에서 FDA 승인된 대중들이 이용가능한 노출 전 또는 노출 후 치료 또는 백신은 없다. 마우스에서 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA 분류 I-한정된 에피토프를 식별하는 연구들이 보고되었다. Botten, J., et al., J. Vir. 9947-9956 (Oct 2010) 참고.

발생 및 높은 수준의 유병율 및 치사율로 인하여 아레나바이러스로 쏠리는 최근의 모든 관심에 있어서, 이용가능한 치료는 매우 적다. AV 예방을 위한 인가된 백신은 없으며, 인간 AV 감염의 치료용으로 인가된 유일한 약물은 항-바이러스 약물 리바비린(ribavirin)이다. 리바비린은 노출 초기에 복용하는 경우 AV 감염과 관련된 유병율 및 치사율의 감소에 도움이 되지만, 높은 독성 및 부작용에 시달린다. 전세계의 AV 만연 지역에서 치료를 위한 저비용 및/또는 효과적인 약물과 예방용 백신 뿐만 아니라 생물방어 위협 또는 세계의 만연 지역에서 US 군인 배치를 통하여 전투적 노출에 대비하여 저비용 및/또는 효과적인 약물과 예방용 백신 개발에 대한 명백한 요구가 있다.

더욱이, 다중물질(multiagent) 아레나바이러스 백신에 대한 필요도 여전히 존재한다. 초반에 명시된 것과 같이, 이용가능한 경쟁적 효과적인 예방 또는 치료법은 없다. 우리가 아는 한, FDA에 의해 연구중인 신약(IND) 상태하에 제한된 용도로 승인된 Junin 살아있는 감쇠된 바이러스 백신 (Candid#1)이 아레나 바이러스 감염에 대해 테스트된 유일한 백신이다. 그러나, 이 백신은 다른 아레나바이러스 계통에 대항하여 교차-보호할 수 없는 것으로 동물 연구에서 후속적으로 나타났다.

따라서, 아레나바이러스에 대한 유효량 약물 또는 효과적인 백신, 및 다중 아레나바이러스 물질을 단독으로 또는 동시에 표적으로 하는 백신에 대한 필요는 여전하다.

도 1(A), 1(B), 1(C), 및 1(D)는 혈청 바이러스혈증과 비-최적화된 구조체 (서열 번호:3을 포함) 대(對) 최적화된 구조체 (서열 번호:1을 포함)로 백신접종된 기니아 피그의 경우 유병율 득점을 나타낸다.
도 1(B2) 및 1(D2)는 도 1(B) 및 1(D)의 데이터를 나타내지만, 비-침습성 전기천공 (NIVEP)의 혈청 바이러스혈증 득점 및 유병율 득점이 각각 추가된다.
도 2(A) 및 2(B)는 기니아 피그에서 비-최적화된 (서열 번호:3을 포함) 및 코돈-최적화된 (서열 번호:1을 포함) LASV DNA 백신에 대한 생존 곡선을 나타낸다.
도 3(A) 및 3(B)는 역 도전 연구(back challenge study)에 등록된 기니아 피그에서 체중 및 체온을 나타낸다.
도 4는 LASV에 의한 치명적 공격에서 생존된 LASV-GPC 또는 모의-백신접종된 원숭이의 BAERCOM 청력 검사를 나타낸다.
도 5(A), 5(B), 및 5(C)는 LASV-GPC (서열 번호:2를 포함) 또는 모의 (서열 번호:3을 포함) DNA 백신을 제공받은 시아노모로구스 모카크(cynomolgus macaque)의 생존 곡선, 혈청 바이러스혈증 및 유병율 득점을 나타낸다.
도 6(A), 6(B), 및 6(C)는 LASV-GPC (서열 번호:2를 포함) 또는 모의 (서열 번호:3을 포함) DNA 백신을 제공받은 시아노모로구스 모카크(cynomolgus macaque)의 선택된 혈액 화학 값을 나타낸다.
도 7는 LASV-GPC (서열 번호:2를 포함) 또는 모의 (서열 번호:3을 포함) DNA 백신를 제공받은 시아노모로구스의 선택된 혈액학 값을 나타낸다.
도 8a-e는 기니아 피그 (LASV-GPC GP)에 코돈 최적화된 LASV-GPC, 비-인간 영장류 (LASV-GPC NHP)에 대해 코돈 최적화된 LASV-GPC, 및 참조 LASV GPC (대조군) 사이에 서열 배열을 나타낸다.

본 발명의 측면은 필요로 하는 대상에서 아레나바이러스에 대항하여 보호성 면역 반응을 생성시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 면역원성 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 DNA 백신을 제공한다. 이 코딩 서열은 아레나바이러스의 당단백질 전구물질을 인코드하고, 그리고 관심 대상에 대해 코돈 최적화된다. 추가적으로, 이 코딩 서열은 당단백질 전구물질에 대해 최소한 98% 상동성인 이의 면역원성 단편일 수 있다.

일부 구체예들에서, 이 코딩 서열은 필수적으로 LASV (LASV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, LCMV (LCMV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, MACV (MACV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, JUNV (JUNV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, GTOV (GTOV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, WWAV (WWAV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, 또는 PICV (PICV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인으로 구성된다. 바람직하게는, 이 단편들은 잔기 441-449를 포함하는 LASV-GPC의 단편, 잔기 447-455을 포함하는 LMCV-GPC의 단편, 잔기 444-452를 포함하는 MACV-GPC의 단편, 잔기 429-437을 포함하는 JUNV-GPC 단편, 잔기 427-435를 포함하는 GTOV-GPC의 단편, 잔기 428-436을 포함하는 WWAV-GPC, 또는 잔기 455-463을 포함하는 PICV-GPC의 단편을 포함한다.

한 가지 바람직한 구체예에서, DNA 백신은 필수적으로 전술한 코딩 서열중 하나로 구성된다 - 단일 물질 또는 단가(monovalent) 백신. 또다른 바람직한 구체예에서, DNA 백신은 전술한 코딩 서열중 최소한 두 개로 구성된다 - 다중 물질 또는 다가 백신. 바람직하게는, 단가 또는 다가 백신은 나타낸 LASV-GPC을 포함하며, 그리고 더 바람직하게는 서열 번호: 1 또는 2, 또는 서열 번호:4 또는 5를 인코드하는 뉴클레오티드 인코딩 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 제공된 DNA 백신은 IL-12, IL-15, IL-28, 또는 RANTES로 구성된 군으로부터 선택된 어쥬번트를 더 포함한다.

본 발명의 한 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 DNA 백신을 투여하고, 그리고 전술한 대상을 전기천공하는 것을 포함하는, 아레나바이러스에 대항한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 구체예들에서, 전기천공 단계는 전기천공 에너지 펄스를 투여 단계가 일어나는 전술한 대상의 부위로 전달하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 투여 단계 및 전기천공 단계는 모두 전술한 대상의 내피 층에서 일어난다.

개시된 발명은 구세계 및 신세계 병원균 모두를 포괄하는, 하나 또는 일부 경우 다중 아레나바이러스 (LASV, LCMV, MACV, JUNV, GTOV, WWAV, 및 PICV)에 대항하여 대상에서 보호성 면역 반응을 일으키는 신규한 DNA 백신 후보에 관련된다.

제공된 백신은 다음을 포함한다: 면역 반응의 다양성 및 다중 관련된 그러나 발산적(divergent) 바이러스에 대항한 교차-보호를 증가시키는 AV GPC 도메인 DNA 면역원. 광범위한 종류의 병원균을 표적할 수 있는, 아레나바이러스에 대한 유전적으로 최적화된 면역원, 구체적으로 최적화된 GPC 도메인이 본 명세서에서 더 설명된다. 백신의 한 구체예는 최적화된 LASV 인코딩 서열인데, 다중-물질 제제(formulation)를 얻기 위하여 LASV, LCMV, MACV, JUNV, GTOV, WWAV, 및 PICV 바이러스, 그리고 바람직하게는 MACV 및 JUNV 바이러스를 표적으로 하는 백신을 추가적으로 포함할 수 있다.

다중-물질 제제의 능력을 강화시키기 위하여, 백신은 매우 혁신적인 제조 공정 및 최적화된 백신 제제와 복합될 수 있다. 전통적으로, DNA는 오직 2-4 mg/mL 농도에서 제조되는 것이 가능하다. 이러한 물리적 제약은 보호성 효과를 획득하기 위하여 상당히 높은 약량 수준에서 항원을 표적으로 하는 DNA 플라스미드에 복합하는 것을 어렵게 한다. 전문이 여기에 참고자료로 편입된 US 특허 번호 7,238,522 및 US 특허 공개 번호 2009-0004716에서 설명된 저작권 제조 공정을 이용함으로써, DNA 플라스미드는 고순도의, > 10 mg/mL 농도에서 제작될 수 있다. 이러한 고농도 제제는 통상적인 ID 주사와 같은 작은 주사 용적(0.1 mL) 에서 효과적인 운반에 또한 유익하다.

백신은 매우 혁신적인 그리고 효과적인 전기천공 (EP) 기반 DNA 전달 시스템과 또한 복합되어, 주사된 DNA 백신의 효능을 증가시킬 수 있다. 얕은 전기천공 깊이 및 낮은/순간적 전기적 파라미터를 가진 EP 전달 시스템은 새로운 장치가 예방적 이용 및 대량 백신화에 상당히 더 내성이 있게 만든다.

제공된 제조 공정 및 전기천공 전달 장치와 복합된 DNA 백신은 무엇보다 다음의 장점을 제공할 수 있다:

● 벡터 유도된 반응없음 - 반복 부스터; 다중/복합 백신

● 영장류 및 인간에서 바이러스성 벡터보다 더 큰 효능

● 제조 장점

기니아 피그 및 비-인간 영장류 도전 모델에서 대상을 치사로부터 100% 보호를 유도하는 것을 보여준 단일 물질 LASV 백신 후보에 대한 상세한 설명이 본 명세서에서 제공된다. LASV 백신 후보는 비-인간 영장류 모델에서 백신 방법의 임상적 해석을 용이하게 실행하는 것을 보여주었다. 두 가지 상이한 도전 모델에 대한 이러한 성공은 임의의 다른 아레나바이러스 백신-벡터화된 또는 비-벡터화된-후보와 관련 문헌에서 기존에 이루지 못하였던 것이다.

LASV 백신 후보는 구세계 및 신세계 바이러스를 모두 표적으로 하는 다중-물질 후보백신이다. GPC 항원 (바이러스의 면역원성 성분)은 상이한 아레나바이러스 하위유형(각각 LASV-MACV/JUNV; 및 MACV-JUNV)에 대해 42-71% 상동성을 가지고, 상이한 하위유형내에 서열간에 2-10% 차이를 가진, LASV, MACV, 및 JUNV에 걸쳐 매우 보존된 것은 아니다. 따라서 다중-물질 백신의 개발은 자명하지 않으며, 몇 가지 새로운 기술적 도전으로 충만하다.

본 명세서에서 제공되는 백신 후보들은 각 표적화된 바이러스 하위유형에 대해 후보 GPC 백신을 최적화되어, 각 계통 (예를 들면, LASV, JUNV, MACV)에 대해 개별적으로 효과적이며, 그리고 이들 계통 및 다른 아레나바이러스 계통에 대항하여 집합적으로 교차-보호적이다. 백신 후보들은 플라스미드 성분들이 고농도 (> 10 mg/mL)가 되도록 제조된다. 백신 후보의 성분들은 전달용으로 EP와 복합될 수 있다. EP 전달은 EP없는 DNA 전달과 비교하여 DNA 형질감염(transfection) 및 유전자 발현 효과를 1000x 이상 증가시키고, 그리고 면역원성 및 효과를 10-100x 개선시키는 것으로 나타났다. 다중 DNA 백신-낮은 주사 용적-EP 전달은 이 방법이 예방적 백신접종, 그리고 구체적으로, 다중물질 백신 전달에 특히 적합하도록 만든다.

본 명세서에서 설명된 DNA 백신 방법은 다른 경합적 살아있는 감쇠된/죽은 바이러스 방법 및 다른 벡터 기반 방법(Ad5, MVA, YF)과 비교하여 확실한 안전성 장점을 가지는데, 그 이유는 DNA 백신은 비-복제이며, 게놈 안으로 통합되지 않고, 그리고 벡터와 달리, 벡터화된 백신의 효과를 추가로 더 제한시키는 항-벡터 혈청학을 야기하기 않는다. DNA 백신은 안전성 입장에서 기록될 만한 것이 거의 없이, 수백가지의 상이한 백신 시도에 대해 몇천명의 인간 대상으로 전달되었다. EP 전달과 함께, DNAEP 백신 (HIV, HPV, 인플루엔자, HCV, 전립선 암, 흑색종)은 150+ 대상에 걸쳐 그리고 근육내 또는 내피 경로를 통하여 350+ 이상의 백신접종으로 운반되었으며, 안전성 프로파일이 특별히 언급되지 않았다.

한 구체예에서, 백신 후보는 다음의 명세를 가질 수 있다:

기니아 피그 (계통 13) 및 시아노모로구스 모카크(cynomolgus macaques)에서 도전이 실행되었다. 연구 부분에서 명기된 것과 같이, 이들은 아레나바이러스 도전에 대해 모두 확립된 모델들이다.

일부 구체예들에서, 백신 후보들은 모두 2 또는 그 이상의 백신 후보들 (LASV, LCMV, MACV, JUNV, GTOV, WWAV, 및 PICV)을 포함하는데, 이들은 교차-보호를 부여할 수 있지만; 다른 구체예들에서, 단지 2개의 백신 후보의 조합이 있고, 그리고 더 바람직하게는 하나의 구세계 플라스미드와 하나의 신세계 플라스미드- 2개, 가령, LASV와 JUNV 또는 MACV는 모든 AV의 다중 계통에 대항하여 보호를 부여한다. 한 실시예에서, DNA 백신은 2개의 DNA 백신 플라스미드 (LASV + JUNV/MACV)를 포함한다. 또다른 실시예에서, DNA 백신은 백신 후보와 사이토킨 플라스미드를 포함한다. 또다른 실시예에서, DNA 백신은 LASV, JUNV, 및 MACV를 포함하는 3개의 플라스미드 백신 후보를 포함한다.

백신 후보들은 또한 분자 어쥬번트, 이를 테면, IL-12 및 IL-28, 및 RANTES를 포함하는 일부 구체예들이 있다. 이 어쥬번트들은 면역 반응의 폭, 이의 크기를 증가시킬 수 있고 또는 백신에게 추가 장점, 이를 테면, 개선된 교차-계통 효과 (폭) 및/또는 더 낮은 용량에서 100% 효과(효능)을 부여하기 위하여 백신의 면역 표현형을 변경시킬 수 있다.

일부 구체예들에서, 백신 후보는 LASV를 표적으로 하는 단일 플라스미드다. 이 단일 플라스미드 후보는 치명적 공격으로부터 기니아 피그 및 비-인간 영장류 ("NHP")을 보호하는데 매우 효과적인 것으로 나타났다.

정의

본 명세서에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예들을 설명하기 위함이며, 이에 제한되는 되지 않는다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 이용된 것과 같이, 단수 관사("a", "an" 및 "the")는 명시적인 다른 언급이 없는 한, 복수를 포함한다.

본 명세서에서 수치적 범위의 언급에 대해서는 이들 사이에 있는 각 숫자도 동일한 정확성으로 명시적으로 고려된다. 예를 들면, 6 - 9의 범위의 경우, 숫자 7 및 8이 6과 9에 추가적으로 고려되고, 6.0 7.0의 범위의 경우, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6,9, 및 7.0이 명시적으로 고려된다.

어쥬번트

본 명세서에서 이용된 것과 같이, "어쥬번트"는 DNA 백신 및 이하에서 설명되는 인코딩 핵산 서열로 구성된 DNA 구조체에 의해 인코드된 항원의 면역원성을 강화시키기 위하여 본 명세서에서 설명된 DNA 백신에 추가되는 임의의 분자를 의미한다.

코딩 서열

본 명세서에서 이용된 것과 같이 "코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"은 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 이 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개인 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 개시 및 종료 신호를 더 포함할 수 있다.

보체(Complement)

본 명세서에서 이용된 것과 같이, "보체" 또는 "보체의"는 핵산이 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체 사이에 Watson-Crick (이를 테면, A-T/U 및 C-G) 또는 Hoogsteen 염기쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다

전기천공

본 명세서에서 호환적으로 이용되는 "전기천공", "전기-투과성(electro-permeabilization)" 또는 "전기-역학 강화(electro-kinetic enhancement)" ("EP")는 생체-막에서 미세 경로(구멍)를 유도하기 위하여 막통과 전기장 펄스를 이용하는 것을 말한다; 이러한 구멍이 존재하면 생물분자들 이를 테면 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약물, 이온, 및 물이 세포 막의 한 측면에서 다른 측면으로 통과가 허용된다.

단편

핵산 서열에 대해 본 명세서에서 이용된 "단편"은 아레나바이러스 GPC 항원과 교차 반응할 수 있어, 포유류 안에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 인코드하는 핵산 서열 또는 이의 일부를 의미한다. 이 단편들은 콘센선스(consensus) 아미노산 서열들을 인코드하는 다양한 뉴클레오티드 서열들 및 이러한 서열들을 포함하는 구조체중 최소한 하나로부터 선택된 DNA 단편일 것이다. DNA 단편들은 예를 들면, IgE 또는 IgG 서열들과 같은 면역글로블린 리더에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. DNA 단편은 하기에서 제시된 단백질 단편들을 인코드할 수 있다.

폴리펩티드 서열들에 대해 "단편"은 이를 테면 라사 바이러스 (LASV), 맥락수막염 바이러스 (LCMV), Junin 바이러스 (JUNV), Machupo 바이러스 (MACV), 임파수성 Guanarito 바이러스 (GTOV), White-water Arroyo 바이러스 (WWAV), 및 Pichinde 바이러스 (PICV)를 포함하는 아레나바이러스 항원과 교차 반응하여 포유류에서 면역반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다.

LASV 당단백질 전구물질 (LASV-GPC) 서열은 약 491개의 아미노산으로, 바람직하게는 코돈 최적화된다. LASV-GPC의 단편들은 LASV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 GPC 영역의 잔기 441 내지 449를 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, LASV-GPC의 단편은 서열 번호:4 또는 5의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다.

LCMV 당단백질 전구물질 (LCMV-GPC) 서열은 약 498개의 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다 - NCBI 수탁 번호 NP_694851 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. LCMV-GPC의 단편은 LCMV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편은 잔기 447-455를 포함한다.

JUNV 당단백질 전구물질 (JUNV-GPC) 서열은 약 485개의 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다 - NCBI 수탁 번호 BAA00964 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. JUNV-GPC의 단편은 JUNV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편은 잔기 429-437을 포함한다.

MACV 당단백질 전구물질 (MACV-GPC) 서열은 약 496개 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다 - NCBI 수탁 번호 AAN05425 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. MACV -GPC의 단편은 MACV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편은 잔기 444-452를 포함한다.

GTOV 당단백질 전구물질 (GTOV -GPC) 서열은 약 496개 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAN05423 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. GTOV -GPC의 단편은 GTOV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편은 잔기 427-435를 포함한다.

WWAV 당단백질 전구물질 (WWAV -GPC) 서열은 약 496개의 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다 - NCBI 수탁 번호 AAK60497 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. WWAV -GPC의 단편은 WWAV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편은 잔기 428-436을 포함한다.

PICV 당단백질 전구물질 (PICV -GPC) 서열은 약 496개의 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다 - NCBI 수탁 번호 AAC32281 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. PICV -GPC의 단편은 PICV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편은 잔기 455-463을 포함한다.

유전 구조체

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "유전 구조체"는 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 이 코딩 서열은 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소들에 작동가능하도록 연계된 개시 및 종료 신호를 포함한다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "발현가능한 형태"는 이 코딩 서열이 개체의 세포 안에 존재할 때, 발현되도록 단백질이 인코드된 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된 필수 조절 요소들을 포함하는 유전자 구조체를 지칭한다.

상동성(Homology)

다중 서열 배열 및 필로그람(phylogram)의 상동성은 ClustalW 소프트웨어를 이용하여 생성되었다.

동일한(Identical)

"동일한" 또는 "동일성"은 2개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열들의 내용에서 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 서열들은 명시된 영역에 걸쳐 동일한 잔기의 명시된 비율을 보유한다는 것을 의미한다. 비율은 두 서열을 최적으로 배열하고, 명시된 영역에 걸쳐 두 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 서열이 발생된 위치의 숫자를 측정하여, 정합된 위치의 수를 산출하고, 명시된 영역내에서 총 위치 숫자로 정합된 수를 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 백분율을 얻음으로써 산출될 수 있다. 두 서열이 상이한 길이를 가지거나, 배열로 인하여 하나 또는 그 이상의 비켜놓아진(staggered) 말단이 만들어지고 그리고 명시된 영역의 비교가 오직 단일 서열만을 포함하는 경우에, 단일 서열의 잔기는 계산의 분모에 포함되지만, 분자에는 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 티민 (T) 및 우라실 (U)은 등가인 것으로 간주될 수 있다. 동일성은 수작업으로 또는 컴퓨터 서열 알고리즘 이를 테면, BLAST 또는 BLAST 2.0을 이용하여 실행될 수 있다.

면역 반응

본 명세서에서 이용된 것과 같이, "면역 반응"은 아레나바이러스 항원과 같은 항원의 도입에 반응하여 숙주의 면역계, 이를 테면, 포유류의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포성 또는 체액 반응, 또는 이 둘 모두의 형태일 수 있다.

핵산

"핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 본 명세서에서 이용된 것과 같이 서로 공유적으로 연결된 최소한 2개의 뉴클레오티드를 의미한다. 단일 가닥의 설명은 상보성 가닥의 서열로 또한 정의된다. 따라서, 핵산은 설명된 단일 가닥의 상보성 가닥을 또한 포괄한다. 핵산의 많은 변이체들이 주어진 핵산과 동일한 목적으로 이용될 수 있다. 따라서, 핵산은 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체를 또한 포괄한다. 단일 가닥은 엄격한(stringent) 혼성화 조건하에 표적 서열에 혼성화될 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화되는 프로브를 또한 포괄한다.

핵산은 단일 가닥으로 된 또는 이중 가닥으로 될 수 있거나, 또는 이중 가닥으로 된 서열 및 단일 가닥으로 된 서열 모두의 일부를 포함할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 모두, RNA, 또는 핵산이 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있는 하이브리드, 그리고 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 산틴 하이포산틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기 복합물일 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 획득될 수 있다.

작동가능하도록 연계된(Operably Linked)

"작동가능하도록 연계된"은 본 명세서에서 이용된 것과 같이 유전자의 발현이 공간적으로 연결된 프로모터의 조절 하에 있다는 것을 의미한다. 프로모터는 이의 조절 하에 유전자의 5' (상류) 또는 3' (하류)에 위치할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이에 거리는 프로모터가 유도된 유전자에서 이것이 조절하는 프로모터와 유전자 거리와 대략적으로 동일할 수 있다. 당분야에서 공지된 것과 같이, 이 거리에서 변화는 프로모터 기능의 상실없이 조정될 수 있다.

프로모터

본 명세서에서 이용된 것과 같이, "프로모터"는 세포 안에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 강화시킬 수 있는 합성 또는 자연적으로-유도된 분자를 의미한다. 프로모터는 하나 또는 그 이상의 특이적 전사 조절 서열들을 포함할 수 있어, 동일한 것의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 더 강화 및/또는 더 변경시킬 수 있다. 프로모터는 말단 인헨서(enhancer) 또는 리프레서(repressor) 요소들을 또한 포함할 수 있는데, 이는 전사의 시작 부위로부터 수천 염기쌍이 떨어져 있는 거리만큼에 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 원천으로부터 유도될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 장기에 대해 또는 생리학적 스트레스, 병원균, 금속 이온 또는 유도성 물질에 대해 유전자 성분의 발현을 구성적으로 또는 분화적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적 예로는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

엄격한 혼성화 조건

"엄격한 혼성화 조건"은 본 명세서에서 이용된 것과 같이 핵산의 복합 혼합물내에서 제 1 핵산 서열 (이를 테면, 프로브)이 제 2 핵산 서열 (이를 테면, 표적)에 혼성화될 수 있는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 명시된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대해 열 용융점(Tm)보다 약 5 - 10℃ 더 낮도록 선택될 수 있다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 혼성화되는 온도(명시된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에)가 될 수 있다(표적 서열들은 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서 프로브의 50%는 평형상태에서 점령된다). 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 이를 테면 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01-1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브의 경우(이를 테면, 약 10-50개의 뉴클레오티드) 최소한 약 30℃이고, 긴 프로브의 경우(이를 테면, 약 50개 이상의 뉴클레오티드) 최소한 약 60℃가 될 수 있다. 엄격한 조건은 탈안정화 물질 이를 테면, 포름아미드의 추가로 또한 얻을 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위하여, 양성 신호는 배경 혼성화보다 최소한 2 내지 10배가 될 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 항온처리, 또는, 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 항온처리, 그리고 65℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS로 세척.

실질적으로 상보성(Substantially Complementary)

"실질적으로 상보성"은 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 제 1 서열은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 또는 1440개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산에 걸쳐 제 2 서열의 보체에 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미하거나, 또는 두 서열은 엄격한 혼성화 조건하에 혼성화된다는 것을 의미한다.

실질적으로 동일한

"실질적으로 동일한"은 본 명세서에서 이용된 것과 같이 제 1 및 제 2 서열은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 또는 1440개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐, 또는 제 1 서열이 제 2 서열의 보체에 실질적으로 상보적인 경우, 핵산에 대해 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미한다.

하위유형( Subtype ) 또는 혈청형( Serotype )

"하위유형" 또는 "혈청형": 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 호환되며, 아레나바이러스 항원에 대해 언급될 때, 하나의 하위유형 (또는 변이체)는 상이한 하위유형과 별도로 면역계에서 인지되는, 아레나바이러스 항원의 유전적 변이체를 의미한다.

변이체(Variant)

핵산에 대해 본 명세서에서 이용된 "변이체"는 (i) 언급된 뉴클레오티드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 보체; (iii) 언급된 핵산 또는 이의 보체에 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건하에서 언급된 핵산, 이의 보체, 또는 이에 실질적으로 동일한 서열들에 혼성화되는 핵산을 의미한다.

펩티드 또는 폴리펩티드에 대하여 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결손, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열은 상이하지만, 최소한 하나의 생물학적 활성은 유지한다. 변이체는 최소한 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 가진 언급된 단백질에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 또한 의미한다. 아미노산의 보존적 치환, 예를 들면, 아미노산을 유사한 성질(이를 테면, 친수성, 하전 영역의 정도 및 분포)을 가진 상이한 아미노산으로 대체는 일반적으로 사소한 변화로 당업계에서 인지된다. 이들 사소한 변화는 당업계에서 이해되는 바와 같이 아미노산의 수치료(hydropathic) 지수를 고려하여 일부 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 수치료 지수는 이의 소수성 및 하전에 기초된다. 유사한 수치료 지수의 아미노산이 치환될 수 있고, 단백질의 기능은 유지된다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 한 측면에서, 수치료 지수 ±2를 가진 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 만들게 되는 치환을 밝히는데 이용될 수 있다. 펩티드의 문맥에서 아미노산의 친수성 고려는 항원성 및 면역원성과 잘 연관되는 것으로 보고된 유용한 척도인 펩티드의 최대 국소 평균 소수성의 산출을 허용한다. U.S. 특허 번호 4,554,101은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 당업계에 인지되는 것과 같이, 유사한 친수성 값을 보유하는 아미노산의 치환으로 생물학적 활성, 예를 들면 면역원성을 유지하는 펩티드를 만들 수 있다. 서로 ±2 범위내의 친수성 값을 가지는 아미노산으로 치환이 실시될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 모두 아미노산의 특정 측쇄에 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일관되게, 생물학적 기능과 필적되는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 성질들에 의해 드러나는 것과 같이, 아미노산의 상대적 유사성, 그리고 이들 아미노산의 특정 측쇄에 따라 달라지는 것으로 이해된다.

벡터

"벡터"는 본 명세서에서 이용된 것과 같이 복제의 원점을 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 벡터, 박테리오파아지, 박테리아의 인위적 염색체 또는 효모의 인위적 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체이외의 벡터, 및 바람직하게는 DNA 플라스미드이다.

부형제(Excipients) 및 백신의 다른 성분들

백신은 다른 성분들, 이를 테면 형질감염 촉진 물질, 약제학적 수용가능한 부형제, 어쥬번트를 더 포함할 수 있다. 약제학적 수용가능한 부형제는 비이클, 어쥬번트, 운반체, 또는 희석제와 같은 기능적 분자일 수 있다. 약제학적 수용가능한 부형제는 형질감염 촉진 물질일 수 있는데, 표면 활성 물질, 가령, 면역-자극 복합체 (ISCOMS), Freunds 불완전 어쥬번트, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체를 포함하는 LPS 유사체, 소포 이를 테면 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스성 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지의 형질감염 촉진 물질을 포함한다.

형질감염 촉진 물질은 다중음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중양이온, 또는 지질일 수 있다. 형질감염 촉진 물질은 폴리-L-글루타메이트일 수 있다. 폴리-L-글루타메이트은 6 mg/ml 미만의 농도로 백신에 존재할 수 있다. 형질감염 촉진 물질은 또한 표면 활성 물질 이를 테면, 면역-자극 복합체 (ISCOMS), Freunds 불완전 어쥬번트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 소포 이를 테면 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 및 히알루론산을 포함할 수 있고, 유전자 구조체와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, DNA 플라스미드 백신은 형질감염 촉진 물질 이를 테면 지질, 레시틴 리포좀 또는 당업계에 공지되어 다른 리포좀을 포함한, 리포좀, DNA-리포좀 혼합물(예를 들면 W09324640 참고), 칼슘 이온, 바이러스성 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 다른 형질감염 촉진 물질을 포함할 수 있다. 형질감염 촉진 물질은 다중음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중양이온, 또는 지질이다. 백신 안에 형질감염 물질의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.

약제학적 수용가능한 부형제는 어쥬번트일 수 있다. 어쥬번트는 대체 플라스미드에서 발현되는 다른 유전자이거나 또는 백신에서 상기 플라스미드와 복합된 단백질로 전달된다. 어쥬번트는 α-인터페론(IFN- α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포-유인 케모킨 (CTACK), 상피 흉선-발현된 케모킨 (TECK), 점막-연합된 상피 케모킨 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, 결손된 신호 서열 및 IgE로부터 신호 펩티드를 임의선택적으로 포함하는 IL-15를 포함하는 CD86으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 어쥬번트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이의 조합일 수 있다.

유용한 어쥬번트일 수 있는 다른 유전자는 다음을 인코드하는 것들을 포함한다: MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이형, CD40, CD40L, 맥관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 맥관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KIlLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능적 단편들.

백신은 1994년 4월 1일자로 제출된 U.S. 일련 번호 021,579에서 설명된 것과 같이 유전 백신 촉진 물질을 더 포함할 수 있고, 상기 출원은 전문이 참고자료로 편입된다.

백신은 이용되는 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 백신 약학 조성물은 무균, 발열원 없는 그리고 미립자 없는 것일 수 있다. 등장성 제제 또는 용액이 이용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토즈를 포함할 수 있다. 백신은 혈관수축 물질을 포함할 수 있다. 등장성 용액은 인산염 완충된 염수를 포함할 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 더 포함할 수 있다. 안정화제는 연장된 시간 동안 실온 또는 대기온도에서 제제가 안정적이 되도록 할 수 있는데, LGS 또는 다중양이온 또는 다중음이온을 포함한다.

백신접종 방법

대상을 백신접종 방법이 본 명세서에서 제공된다. 이 방법은 백신을 전달하는 기전으로 전기천공을 이용한다. 전기천공은 최소한의 침습성 장치를 통하여 실행될 수 있다.

AV GPC 항원, 최적화된 코돈

LASV 당단백질 전구물질 (LASV-GPC) 서열은 약 491개 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. LASV-GPC의 단편들은 LASV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함하며, 바람직하게는 단편은 GPC 영역의 잔기 441 내지 449를 포함한다. 일부 구체예들에서, LASV-GPC의 단편들은 서열 번호:4 또는 5의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다.

LCMV 당단백질 전구물질 (LCMV-GPC) 서열은 약 498개 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 NP_694851 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. LCMV-GPC의 단편들은 LCMV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 단편들은 잔기 447-455를 포함한다.

JUNV 당단백질 전구물질 (JUNV-GPC) 서열은 약 485개 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 BAA00964 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. JUNV-GPC의 단편들은 JUNV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 단편들은 잔기 429-437을 포함한다.

MACV 당단백질 전구물질 (MACV-GPC) 서열은 약 496개의 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAN05425 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. MACV -GPC의 단편들은 MACV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있으며, 단편들은 잔기 444-452를 포함한다.

GTOV 당단백질 전구물질 (GTOV -GPC) 서열은 약 496개 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAN05423 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. GTOV -GPC의 단편들은 GTOV -GPC최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함하며, 바람직하게는 단편들은 잔기 427-435을 포함한다.

WWAV 당단백질 전구물질 (WWAV -GPC) 서열은 약 496개 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAK60497 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. WWAV -GPC의 단편들은 WWAV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함하고, 바람직하게는 단편들은 잔기 428-436을 포함한다.

PICV 당단백질 전구물질 (PICV -GPC) 서열은 약 496개 아미노산이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAC32281 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. PICV -GPC의 단편들은 PICV -GPC를 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편들은 잔기 455-463을 포함한다.

뉴클레오티드 서열들 - 인코딩 서열 및 구조체 및 플라스미드

LASV 당단백질 전구물질 (LASV-GPC) 뉴클레오티드 인코딩 서열은 약 1476개 뉴클레오티드이며, 및 바람직하게는 코돈 최적화된다. LASV-GPC의 면역원성 단편의 인코딩 서열은 인코드된 LASV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 및 바람직하게는 단편들은 GPC 영역의 잔기 441 내지 449를 포함한다. 일부 구체예들에서, LASV-GPC의 인코딩 서열은 서열 번호.:1 및 2이다. 일부 구체예들에서, LASV-GPC의 단편들의 인코딩 서열은 서열 번호:4 또는 5의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다. 일부 구체예들에서, LASV-GPC의 단편들의 인코딩 서열은 서열 번호:1 또는 2의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다.

LCMV 당단백질 전구물질 (LCMV-GPC) 뉴클레오티드 인코딩 서열은 약 1494개 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 NP_694851 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. LCMV-GPC의 면역원성 단편의 인코딩 서열은 LCMV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편들은 잔기 447-455를 포함한다.

JUNV 당단백질 전구물질 (JUNV-GPC) 뉴클레오티드 인코딩 서열은 약 1455개 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 BAA00964 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. JUNV-GPC의 면역원성 단편들의 인코딩 서열은 JUNV-GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편들은 잔기 429-437을 포함한다.

MACV 당단백질 전구물질 (MACV-GPC) 뉴클레오티드 인코딩 서열은 약 1488개 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAN05425 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. MACV -GPC의 면역원성 단편들의 인코딩 서열은 MACV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편들은 잔기 444-452를 포함한다.

GTOV 당단백질 전구물질 (GTOV -GPC) 뉴클레오티드 인코딩 서열은 약 1488개 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAN05423 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. GTOV -GPC의 면역원성 단편들의 인코딩 서열은 GTOV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함하고, 바람직하게는 단편들은 잔기 427-435를 포함한다.

WWAV 당단백질 전구물질 (WWAV -GPC) 뉴클레오티드 인코딩 서열은 약 1488개 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAK60497 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. WWAV -GPC의 면역원성 단편들의 인코딩 서열은 WWAV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편들은 잔기 428-436을 포함한다.

PICV 당단백질 전구물질 (PICV -GPC) 뉴클레오티드 인코딩 서열은 약 1488개 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 코돈 최적화된다. - NCBI 수탁 번호 AAC32281 참고, 여기에 참고자료로 편입된다. PICV-GPC의 면역원성 단편들의 인코딩 서열은 PICV -GPC의 최소한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함할 수 있고, 바람직하게는 단편들은 잔기 455-463을 포함한다.

본 명세서에 나타낸 면역원성 단편을 포함하는 AV GPC 항원을 인코드하는 핵산을 포함할 수 있는 유전적 구조체가 제공된다. 유전적 구조체는 기능을 하는 염색체외 분자로 세포내에 존재할 수 있다. 유전적 구조체는 중심립(centromere), 텔로머(telomers) 또는 플라스미드 또는 코스미드를 포함하는 선형 미니염색체(linear minichromosome)일 수 있다.

유전적 구조체는 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연합된 바이러스 및 재조합 우두를 포함하는, 재조합 바이러스의 게놈의 일부일 수도 있다. 유전적 구조체는 세포 안에서 살아있는 감쇠된 살아있는 미생물 또는 재조합 미생물 벡터 안의 유전적 물질의 일부일 수 있다.

유전적 구조체는 핵산의 코딩 서열들의 유전자 발현을 위한 조절 요소들을 포함할 수 있다. 조절 요소들은 프로모터, 인헨서, 개시 코돈, 중지 코돈, 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다.

핵산 서열들은 벡터일 수 있는 유전적 구조체를 구성할 수 있다. 벡터는 포유류에서 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양으로 포유류의 세포에서 항원을 발현시킬 수 있다. 벡터는 재조합된 것일 수 있다. 벡터는 항원을 인코딩하는 이종기원의 핵산을 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드일 수 있다. 벡터는 항원을 인코드하는 핵산으로 세포를 형질감염시키는데 유용할 수 있고, 형질변환된 숙주 세포는 항원의 발현이 일어나는 조건하에 배양 및 유지된다.

코딩 서열은 안전성 및 높은 수준의 발현을 위하여 최적화될 수 있다. 일부 경우들에서, 코돈들은 분자내 결합으로 인하여 형성된 RNA의 2차 구조 형성을 감소시키도록 선택된다.

벡터는 항원을 인코딩하는 이종기원의 핵산을 포함할 수 있고, 항원 코딩 서열의 상류에 있는 개시 코돈, 그리고 항원 코딩 서열의 하류에 있는 중지 코돈을 더 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종료 코돈은 항원 코딩 서열과 동일한 프레임내에 있을 것이다. 벡터는 또한 항원 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된 프로모터를 더 포함할 수 있다. 항원 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된 프로모터는 유인원 바이러스 40 (SV40), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 프로모터 이를 테면, 소 면역결핍 바이러스 (BIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, Moloney 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 (ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 이를 테면 CMV 즉각 초기 프로모터, Epstein Barr 바이러스 (EBV) 프로모터, 또는 Rous 육종 바이러스 (RSV) 프로모터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 이를 테면, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 인간 메탈로티오닌과 같은 인간 유전자의 프로모터일 수도 있다. 프로모터는 천연 또는 합성의 조직 특이적 프로모터, 이를 테면 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수도 있다. 이러한 프로모터들의 예시들은 US 특허 출원 공개 번호 US20040175727에서 설명되며, 이의 내용은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

벡터는 AV GPC 단백질 코딩 서열의 하류에 있는 폴리아데닐화 신호을 또한 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 벡터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다(Invitrogen, San Diego, CA).

벡터는 AV GPC 단백질 코딩 서열의 인헨서 상류를 또한 포함할 수 있다. 인헨서는 DNA 발현을 위하여 필수적일 수 있다. 인헨서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 바이러스성 인헨서 이를 테면 CMV, HA, RSV 또는 EBV중 하나일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 기능 강화는 U.S. 특허 번호 5,593,972, 5,962,428, 및 WO94/016737에서 설명되며, 이들 각각은 전문이 참고자료로 편입된다.

벡터는 세포에서 벡터를 염색체외적으로 유지시키고, 벡터의 다중 복사체를 만들기 위하여, 포유류 복제 원점을 또한 포함할 수 있다. 벡터는 pWRG7077 (Schmaljohn et al., 아래, 참고), Invitrogen (San Diego, CA)의 pVAX1, pCEP4 또는 pREP4일 수 있으며, 이들은 Epstein Barr 바이러스 복제 원점 및 핵 항원 EBNA-1 코딩 영역을 포함할 수 있고, 통합없이 많은 에피좀 복제 사본을 만들 수 있다. 벡터는 변화를 가진 pVAX1 또는 pVax1 변이체, 이를 테면 본 명세서에서 기술된 변이체 플라스미드일 수 있다. 변이체 pVax1 플라스미드는 기본골격 벡터 플라스미드 pVAX1의 2998개 염기쌍 변이체다(Invitrogen, Carlsbad CA). CMV 프로모터는 염기 137-724에 위치한다. T7 프로모터/프라이밍 부위는 염기 664-683에 있다. 다중 클로닝 부위는 염기 696-811에 있다. 소의 GH 폴리아데닐화 신호는 염기 829-1053에 있다. 카나마이신 저항 유전자는 염기 1226-2020에 있다. pUC 원점은 염기 2320-2993에 있다. Invitrogen에서 이용가능한 pVAX1 서열에 기초하여, 다음의 돌연변이들은 여기에서 제시되는 플라스미드 1-6의 기본 골격으로 이용된 pVAX1의 서열에서 발견되었다:

C>G 241 CMV 프로모터에서

C>T 1942 기본골격, 소의 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 (bGHpolyA)의 하류

A> - 2876 기본골격, 카나마이신 유전자의 하류

C>T 3277 pUC 복제 원점 (Ori) 많은 복제 수 돌연변이(Nucleic Research 1985)

G>C 3753 pUC Ori 상류 RNASeH 부위 맨 끝

염기쌍 2, 3 및 4는 기본골격, CMV 프로모터의 상류 기본골격에서 ACT에서 CTG로 변화된다.

벡터의 기본골격은 pAV0242일 수 있다. 벡터는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5 (Ad5) 벡터일 수 있다.

벡터는 벡터가 투여되는 포유류 또는 인간 세포에서 유전자 발현에 적합한 조절 서열을 또한 포함할 수 있다. AV GPC 코딩 서열은 숙주 세포에서 코딩 서열의 더 효과적인 전사를 허용하는 코돈을 포함할 수 있다.

벡터는 대장균(E. coli)에서 단백질 생산에 이용될 수 있는 pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다. 벡터는 효모의 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서 단백질 생산에 이용될 수 있는 pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수 있다. 벡터는 곤충 세포에서 단백질 생산에 이용될 수 있는 MAXBAC™ 완전 베큘로바이러스 발현 시스템(Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수도 있다. 벡터는 포유류 세포 이를 테면 중국 헴스터 난소(CHO) 세포에서 단백질 생산에 이용될 수 있는 pcDNA I 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)일 수도 있다. 벡터는 Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)-전문이 참고자료로 편입된다-을 포함하는 바로 이용가능한 출발 물질들 및 통상적 기술에 의해 단백질을 생산하는 발현 벡터 또는 시스템일 수 있다.

약제학적 조성물

약 1 ng (nanograms) 내지 약 10 mg의 DNA를 포함하는, 본 명세서에서 DNA 백신으로도 명시된, 본 발명에 따른 약학 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 다음을 포함한다: 1) 최소한 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ng, 또는 최소한 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 또는 1000 ㎍(micrograms), 또는 최소한 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg 또는 그 이상; 및 2) 최대 그리고 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ng을 포함하고, 또는 최대 그리고 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 또는 1000 ㎍을 포함하고, 또는 최대 그리고 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약 5 ng 내지 약 10 mg의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약 25 ng 내지 약 5 mg의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 50 ng 내지 약 1 mg의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 0.1 내지 약 500 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 1 내지 약 350 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 5 내지 약 250 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 10 내지 약 200 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 15 내지 약 150 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 20 내지 약 100 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 25 내지 약 75 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 30 내지 약 50 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 35 내지 약 40 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 100 내지 약 200 ㎍ DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 10 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 20 ㎍ 내지 약 80 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 25 ㎍ 내지 약 60 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 30 ng 내지 약 50 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 약학 조성물은 약 35 ng 내지 약 45 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예들에서, 약학 조성물은 약 0.1 내지 약 500 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예들에서, 약학 조성물은 약 1 내지 약 350 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예들에서, 약학 조성물은 약 25 내지 약 250 ㎍의 DNA를 포함한다. 일부 바람직한 구체예들에서, 약학 조성물은 약 100 내지 약 200 ㎍ DNA를 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 이용되는 투여 방식에 따라 제형화된다. 약학 조성물이 주사가능한 약학 조성물인 경우, 이들은 멸균의, 발열원 없는 그리고 미립자 없는 것이다. 등장성 제제가 바람직하게 이용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토즈를 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 등장성 용액 이를 테면 인산염 완충된 염수가 바람직하다. 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다. 일부 구체예들에서, 혈관수축 물질이 제제에 추가된다.

바람직하게는 약학 조성물은 백신, 및 더 바람직하게는 DNA 백신이다.

하나 또는 그 이상의 AV에 대항하여 포유류에서 보호성 면역 반응을 발생시킬 수 있는 백신이 본 명세서에서 제공된다. 백신은 본 명세서에서 논의된 것과 같이 유전적 구조체를 포함할 수 있다.

과학적 이론에 구속되지는 않지만, 백신은 하나 또는 그 이상의 유형의 AV에 대항하여 광범위하게 면역 반응 (체액, 세포성, 또는 둘다)을 유도하는데 이용될 수 있다.

DNA 백신은 US 특허 번호 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055, 및 5,676,594에서 제시되며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. DNA 백신은 염색체로 통합을 저해시키는 요소들 또는 시약을 더 포함할 수 있다. 백신은 AV GPC 단백질의 RNA일 수 있다. RNA 백신은 세포안으로 도입될 수 있다.

백신은 본 명세서에서 설명된 유전적 구조체 또는 항원을 포함하는 재조합 백신일 수 있다. 백신은 하나 또는 그 이상의 단백질 소단위 형태로 하나 또는 그 이상의 AV GPC 코어 단백질, 하나 또는 그 이상의 AV GPC 단백질을 포함하는 하나 또는 그 이상의 죽은 바이러스성 미립자, 또는 하나 또는 그 이상의 AV GPC 단백질을 포함하는 하나 또는 그 이상의 감쇠된 바이러스성 미립자를 더 포함할 수 있다. 감쇠된 백신은 감쇠된 살아있는 백신, 죽은 백신 및 하나 또는 그 이상의 AV GPC 단백질을 인코드하는 외부 유전자를 전달하기 위하여 재조합 벡터를 이용하는 백신일 수 있고, 그리고 소단위 및 당단백질 백신일 수 있다. 감쇠된 살아있는 백신, 외부 항원을 전달하기 위하여 재조합 벡터를 이용하는 백신, 소단위 백신 및 당단백질 백신의 예는 U.S. 특허 번호: 4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,3 64; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 및 6,589,529에서 설명되며, 이들 각각은 여기에 참고자료로 편입된다.

백신은 세계의 다중 특정 지역들로부터 다중 AV에 지향되는 벡터 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 제공되는 백신을 이용하여 치료 또는 예방적 면역 반응을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있다. 항체들 및/또는 킬러 T 세포들은 AV GPC 단백질, 그리고 다중 AV 바이러스에 걸쳐 광범위하게 지향되도록 생성될 수 있다. 이러한 항체들 및 세포들이 단리될 수 있다.

백신은 약제학적 수용가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. 약제학적 수용가능한 부형제는 비이클, 어쥬번트, 운반체, 또는 희석제와 같은 기능적 분자일 수 있다. 약제학적 수용가능한 부형제는 표면 활성 물질, 이를 테면 면역-자극 복합체 (ISCOMS), Freunds 불완전 어쥬번트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체, 소포 이를 테면 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스성 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지의 형질감염 촉진 물질을 포함하는, 형질감염 촉진 물질일 수 있다.

형질감염 촉진 물질은 다중음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중양이온, 또는 지질이다. 형질감염 촉진 물질은 폴리-L-글루타메이트이고, 더 바람직하게는, 폴리-L-글루타메이트는 6 mg/ml 미만의 농도로 백신 안에 존재한다. 형질감염 촉진 물질은 표면 활성 물질 이를 테면 면역-자극 복합체 (ISCOMS), Freunds 불완전 어쥬번트, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 소포 이를 테면 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 또한 포함할 수 있고, 히알루론산은 유전적 구조체와 함께 투여될 수도 있다. 일부 구체예들에서, DNA 벡터 백신은 형질감염 촉진 물질 이를 테면 지질, 레시틴 리포좀 또는 DNA-리포좀 혼합물과 같이 당업계에 공지된 다른 리포좀(예를 들면 W09324640 참고)을 포함하는 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스성 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지의 형질감염 촉진 물질을 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 형질감염 촉진 물질은 다중음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 다중음이온, 다중양이온, 또는 지질이다. 백신에서 형질감염 물질의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.

어쥬번트

약제학적 수용가능한 부형제는 어쥬번트일 수 있다. 어쥬번트는 대체 플라스미드에서 발현되는 또는 백신에서 상기 플라스미드와 복합된 단백질로 전달될 수 있는 다른 유전자일 수 있다. 어쥬번트는 α-인터페론(IFN- α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포-유인 케모킨 (CTACK), 상피 흉선-발현된 케모킨 (TECK), 점막-연합된 상피 케모킨 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, 결손된 신호 서열을 보유하는, 그리고 IgE로부터 신호 펩티드를 임의선택적으로 포함하는 IL-15를 포함하는 CD86으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 어쥬번트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 이 어쥬번트는 IL12, IL15, IL28, 및 RANTES이다.

어쥬번트로 유용한 다른 유전자들은 다음을 인코딩하는 것들을 포함한다: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이형, CD40, CD40L, 맥관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 맥관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능적 단편들.

전달 방법

AV 바이러스성 감염에 대한 면역 반응이 유도되도록 특별히 효과적인 면역원으로 만들게 하는 에피토프를 포함하는 AV GPC 단백질의 유전적 구조체 및 단백질을 제공하는 약학 제제, 바람직하게는 백신을 전달하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 백신을 전달하는 방법, 또는 백신접종은 치료 및/또는 예방적 면역 반응을 유도하기 위하여 제공될 수 있다. 백신접종 과정은 다수의 AV 바이러스에 대항하여 포유류에서 면역반응을 일으킬 수 있다. 백신은 포유류의 면역계의 활성화를 조절하고, 면역 반응을 강화시키기 위하여 개인에게 전달될 수 있다. 백신의 전달은 세포에서 발현되고, 면역계가 인지하는 세포의 표면으로 전달되어, 세포성, 체액, 또는 세포성 및 체액 반응을 유도하는 핵산 분자로써 AV GPC 항원의 형질감염일 수 있다. 백신의 전달을 이용하여 본 명세서에서 논의되는 포유류 백신을 투여함으로써, 다중 AV 바이러스에 대항하여 포유류 안에서 면역 반응을 유도 또는 도출할 수 있다. 포유류에게 백신을 전달할 때 그리고 그 결과 포유류의 세포로 벡터가 전달될 때, 형질감염된 세포들은 AV GPC 단백질을 발현 및 분비할 것이다. 이들 분비된 단백질, 또는 합성 항원은 면역계에 의해 이물질로 인지될 것이고, 다음을 포함하는 면역 반응이 증가될 것이다: 항원에 대항하여 만들어진 항체들, 그리고 이 항원에 특이적인 T-세포 반응. 일부 실시예에서, 본 명세서에서 논의된 백신으로 백신접종을 맞은 포유류는 AV 바이러스성 계통으로 도전을 받았을 때, 준비된(primed) 면역계를 가질 것이고, 이 준비된 면역계는 체액, 세포성, 또는 이 둘 모두 이건 간에 후속적으로 AV 바이러스를 신속하게 제거할 것이다. 백신은 개체에게 전달되어 개체의 면역계의 활성을 조절하고, 이로써 면역 반응이 강화될 것이다.

백신은 DNA 백신 형태로 전달될 수 있고, U.S. 특허 번호 4,945,050 및 5,036,006에서 DNA 백신을 전달하는 방법들이 설명되며, 이들 각각은 참고자료로 편입된다.

백신은 포유류에게 투여되어, 포유류에서 면역 반응이 도출될 수 있다. 포유류는 인간, 비-인간 영장류, 소, 돼지, 양, 염소, 영양, 바이손(bison), 물소, 솟과 동물, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 마우스, 쥐, 또는 닭일 수 있고, 바람직하게는 인간, 소, 돼지, 또는 닭일 수 있다.

투여 경로

백신은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입을 통하여, 볼 투여를 통하여, 흉막내로, 정맥내, 동맥내, 복막내, 피부아래, 근육내, 비강내, 수막강내, 및 동맥내 또는 이의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의학적 용도로, 조성물은 정상적인 수의학적 절차에 따라 적절하게 수용가능한 제제로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적합한 투약 섭생 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 백신은 전통적인 주사기, 바늘없는 주사 장치, "미세투여(microprojectile) 투하 총", 또는 다른 물리적 방법 이를 테면 전기천공 ("EP"), "유체역학적 방법", 또는 초음파에 의해 투여될 수 있다.

백신의 벡터는 생체내 전기천공과 함께 또는 전기천공없는 DNA 주사(또한 DNA 백신접종이라고도 함), 조정된 리포좀, 촉진된 나노입자, 재조합 벡터 이를 테면 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연합된 바이러스 및 재조합 우두를 포함하는 몇 가지 공지의 기술에 의해 포유류로 전달될 수 있다. AV GPC 항원은 DNA 주사 및 생체내 전기천공과 함께 전달될 수 있다.

전기천공

백신 플라스미드의 전기천공을 통한 백신 투여는 세포 막에서 가역적 구멍이 형성되도록 만드는데 효과적인 에너지 펄스를 포유류의 바람직한 조직으로 전달되도록 설계된 전기천공 장치를 이용하여 이루어질 수 있으며, 에너지의 바람직한 펄스는 사용자에 의해 사전설정된 전류 흐름과 유사한 정전류다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공 성분은 다음을 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소들중 하나 또는 그 이상을 포함하거나 통합한다: 콘트롤러, 전류 파형 생성기, 임피던스 테스터, 파형 로거(waveform logger), 입력 요소, 상태 보고 요소(status reporting element), 통신 접속구, 메모리 성분, 파워 소스, 및 파워 스위치. 플라스미드에 의한 세포의 형질감염을 촉진시키기 위하여 생체내 전기천공 장치, 예를 들면 CELLECTRA® EP 시스템 (Inovio Pharamceuticals, Inc., Blue Bell, PA) 또는 Elgen 전기천공기(Inovio Pharamceuticals, Inc.)를 이용하여 전기천공이 실행될 수 있다. 본 발명의 DNA 백신 전달을 촉진시킬 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예들은 Draghia-Akli, et al.의 U.S. 미국 특허 번호 7,245,963, Smith, et al.의 U.S. 특허 공개 2005/0052630에서 설명되며, 이들 내용은 각각 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 촉진 전달의 DNA 백신의 전달을 촉진시키는데 이용될 수 있는 다른 전기천공 장치 및 전기천공 방법들은 2006년 10월 17일자 U.S. 가출원 일련 번호 60/852,149 및 2007년 10월 10일자 제출된 U.S. 가출원 번호 60/978,982를 35 USC 119(e) 근거하여 우선권 주장하는 2007년 10월 17일자로 제출된 공동-계류 및 공동-소유의 U.S. 특허 출원 일련 번호 11/874072에서 설명되는 것들을 포함하고 있으며, 이들 모두는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. Draghia-Akli, et al의 U.S. 미국 특허 번호 7,245,963은 모듈식 전극 시스템과 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포로 생물 분자의 도입을 촉진시키는데 이의 용도를 설명한다. 모듈 전극 시스템은 다수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그램된 정전류 펄스 콘트롤러로부터 다수의 바늘 전극으로 전도적 연결을 제공하는 전기 커넥터; 그리고 파워 소스를 포함할 수 있다. 오퍼레이터는 서포트 구조에 탑재된 다수의 바늘 전극을 쥐고, 신체 또는 식물의 선택된 조직으로 이를 단단히 삽입시킬 수 있다. 그 다음 생물분자들은 피하 바늘을 경유하여 선택된 조직으로 전달된다. 예정된 정전류 펄스 콘트롤러가 활성화되고, 정전류 전기 펄스가 다수의 바늘 전극에 제공된다. 제공된 정전류 전기 펄스는 생물 분자를 다수의 전극 사이에 있는 세포 안으로 진입을 촉진시킨다. U.S. 특허 번호 7,245,963의 전체 내용은 여기에 참고자료로 편입된다.

Smith, et al.에 의해 제출된 U.S. 특허 공개 2005/0052630은 신체 또는 식물의 선택된 조직의 세포로 생물분자의 진입을 효과적으로 촉진시키는데 이용될 수 있는 전기천공 장치를 설명한다. 전기천공 장치는 전기-역학 장치 ("EKD 장치")을 포함하는데, 이것의 작동은 소프트웨어 또는 펌웨어에 명시된다. EKD 장치는 사용자 콘트롤러에 근거하여 배열된 전극들과 펄스 파라미터의 입력 사이에 예정된 정전류 펄스 패턴을 만들고, 전류 파형 데이터의 저장 및 획득을 허용한다. 전기천공 장치는 바늘 전극 배열을 가지는 대체가능한 전극 디스크, 주사 바늘을 위한 중앙 주사 채널 및 제거가능한 가이드 디스크를 또한 포함한다. U.S. 특허 공개 2005/0052630의 전체 내용은 여기에 참고자료로 편입된다.

U.S. 특허 번호 7,245,963 및 U.S. 특허 공개 2005/0052630에서 설명된 전극 배열 및 방법들은 조직 이를 테면 근육 뿐만 아니라, 다른 조직 또는 장기로 깊이 침투되기에 적합할 수 있다. 전극 배열의 외형으로 인하여, 주사 바늘(선택된 생물분자의 전달을 위하여)은 표적 장기로 완전하게 삽입되고, 전극에 의해 사전-윤곽을 드러낸 지역의 표적 조직에 주사는 수직으로 투여된다. U.S. 특허 번호 7,245,963 및 U.S. 특허 공개 2005/005263에서 설명된 전극들은 바람직하게는 20 mm 길이 및 21 가우지이다.

추가적으로, 전기천공 장치 및 이의 이용이 통합된 일부 구체예들에서, 다음 특허에서 설명된 전기천공 장치가 있다: 1993년 12월 28일자로 등록된 US 특허 5,273,525, 2000년 8월 29일자로 등록된 US 특허 6,110,161 , 2001년 7월 17일자로 등록된 US 특허 6,261,281, 및 2005년 10월 25일자로 등록된 US 특허 6,958,060, 및 2005년 9월 6일자로 등록된 US 특허 6,939,862. 더욱이, 다양한 장치의 이용을 통하여 DNA 전달에 관련된 2004년 2월 24일자로 등록된 US 특허 6,697,669에서 제공된 당해 물질을 포함하고, DNA 주사 방법에 관한 2008년 2월 5일자로 등록된 US 특허 7,328,064 또한 본 명세서에서 고려된다. 상기 특허들은 전문이 참고자료로 편입된다.

백신을 준비하는 방법

본 명세서에서 논의된 DNA 백신을 포함하는 DNA 플라스미드를 준비하는 방법들이 본 명세서에서 제공된다. 포유류 발현 플라스미드 안으로 최종 서브클로닝 이후, DNA 플라스미드를 이용하여 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 대규모 발효 탱크 안 세포 배양물에 접종할 수 있다.

본 발명의 EP 장치와 함께 이용되는 DNA 플라스미드는 공지의 장치 및 기기술의 조합을 이용하여 제형화 또는 제조될 수 있지만, 바람직하게는 2007년 5월 23일자로 제출된 US 공개 출원 번호 20090004716에서 설명된 최적화된 플라스미드 제조에 의해 제조된다. 일부 실시예에서, 본 연구에서 이용된 DNA 플라스미드는 10 mg/mL와 대등한 또는 이보다 높은 농도에서 제형화될 수 있다. 제조 기술은 인가된 특허, 2007년 7월 3일자로 등록된 US 특허 번호 7,238,522에서 설명된 것들을 포함하는, U.S. 일련번호 60/939792에서 설명된 것들에 추가하여, 당업계에 공지되어 있는 다양한 장치 및 프로토콜을 포함 또는 통합한다. 상기-언급된 출원 및 특허, US 일련 번호 60/939,792 및 US 특허 번호 7,238,522는 각각 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

실시예

본 발명은 다음의 실시예에서 더 설명된다. 이들 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들이지만, 오직 설명을 위하여 제공됨을 인지해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수 특징들을 확인하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고, 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명을 다양하게 변화 및 수정할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 나타내고 설명된 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변화는 전술한 내용으로부터 당업자에게 자명할 것이다.

동물 연구 - 기니아 피그. 계통 13 기니아 피그 (Cavia porcellus)는 각 6마리의 동물 4개 집단(파일롯 연구) 또는 각 8마리 또는 5마리의 동물 7개 집단(후속 연구)로 나누었다. 동물들을 마취시키고, 그 다음 12 μg (유전자 총 또는 GG) 또는 100 μg (근육내 전기천공 장치 (IM EP)를 통하여, 최소한의 침습 내피 장치 (MID), 또는 비침습 장치 (NINV))의 DNA를 3주 간격으로 진짜(LASV-GPC - 서열 번호: 1 (최적화된) 또는 서열 번호:3 (비-최적화된)) 또는 모의 (비어있는 플라스미드) 백신접종을 투여하였다. 최종 백신접종 후 4주 시점에, 생물학적안전성 수준 (BSL)-4 조건하에서 바이러스 감염이 실시되었다. 각 동물에게 1000 pfu의 LASV의 단일 s.c. 용량이 투여되었다. 질병 진행에 대해 매일 동물들을 관찰하였다. 감염전 -7일 또는 감염 후 0, 7, 14, 21 및 29 또는 32일 시점에 혈액 시료를 채취하였다. 동물이 빈사상태가 되면 안락사시켰다. 바이러스혈증 및 혈액 화학 값을 위하여 혈청 시료를 분석하였다. 각 동물을 부검하였고, LASV-특이적 조직병리 및 면역조직화학 분석을 위하여 조직을 분석하였다.

동물 연구 - 비인간 영장류. 시아노모로구스 모카크(cynomolgus macaques) (Macaca fasicularis)는 각 4마리 동물의 2개 집단으로 나누었다. 동물들을 마취시키고, 3주 간격으로 1 mg DNA (서열 번호:2)의 진짜 또는 모의 백신접종을 투여하였다. 최종 백신접종 후 4주 시점에, BSL-4 조건 하에서 바이러스 감염이 실시되었다. 각 동물에게 1000 pfu의 LASV의 단일 i.m. 용량이 투여되었다. 질병 진행에 대해 매일 동물들을 관찰하였다. 감염 후 0, 3, 6, 10, 14, 21, 28 및 45일 시점에 혈액 시료를 채취하였다. 동물이 빈사상태가 되면 안락사시켰다. CBC 및 혈액 화학 및 혈청 바이러스혈증을 위하여 혈액 시료를 분석하였다.

바이러스혈증의 분석. 6-웰 세포 배양 플레이트에 접종된 Vero 세포는 37℃, 5% CO2에서 부드럽게 회전시키면서 1시간 동안 10-배 혈청 희석액에 흡착되었고, 그 다음 10% 태아 소 혈청과 함께 EBME에서 0.8% 아가로즈 오버레이가 각 웰에 제공되었다. 그 다음 4일 동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리되었고, 중성 레드(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 착색되었다. 플락을 헤아리고 기록하였다.

혈액 화학 분석. 영장류 혈청 시료는 Piccolo Blood Chemistry Analyzer Abaxis)에서 General Chemistry-13 패널 로터를 통하여 GLU, CRE, UA, CA, ALB, TP, ALT, AST, (ALP), TBIL, GGT, 및 AMY에 대해 분석되었다. 기니아 피그 시료는 Abaxis VetScan Blood Chemistry Analyzer를 통하여 Comprehensive Metabolic Panel에서 상기 것들에 대해 분석되었다.

온전한 혈액 카운트. 영장류 연구를 위하여, 대략 25 ul 용적의 전체 EDTA 혈액이 Hemavet Instrument (Drew Scientific)에서 분석되었다.

조직의 병리학적 분석. 조직을 파라핀에 내장시키고, 절단하고, 헤마토실린 및 에오신으로 착색시켰다. LASV-특이적 단클론 항체 및 시판되는 이용가능한 키트(Envision System; DAKO, Carpinteria, CA)를 이용하여 면역조직화학을 실시하였다. 조직의 파라핀을 제거하였고, 차단시키고, 그 다음 1차 항체 및 2차 항체와 함께 항온처리하고, 그 다음 헤마토실린으로 카운터착색시켰다.

조직의 병리학적 분석. 조직을 파라핀에 내장시키고, 절단하고, 헤마토실린 및 에오신으로 착색시켰다. LASV-특이적 단클론 항체 및 시판되는 이용가능한 키트(Envision System; DAKO, Carpinteria, CA)를 이용하여 면역조직화학을 실시하였다. 조직의 파라핀을 제거하였고, 차단시키고, 그 다음 1차 항체 및 2차 항체와 함께 항온처리하고, 그 다음 헤마토실린으로 카운터착색시켰다.

LASV DNA의 생성

LASV DNA 백신은 앞서 언급된 것과 같이(Schmaljohn et al., J. Vir. 71, 9563-9569 (1997)), LASV (Josiah 계통)의 당단백질 전구물질 (GPC) 유전자를 인코딩하는 cDNA를 플라스미드 벡터 pWRG7077 안으로 클로닝시켜 만들었다. LASV-GPC 유전자는 NotI/BgIII 제한 부위 안으로 클론되었다. CMV 프로모터의 조절하에서 발현되었다.

백신의 보호성 효과는 기니아 피그로 근육내 (IM) EP 전달 및 공격에 의해 테스트되었는데, 이 공격에 의해 비인간 영장류 (NHP) 및 인간에서 관찰되는 것과 유사한 출혈성 질병이 발생한다. 기니아 피그 (집단에 6 마리)는 3 내지 4주 간격으로 3회 50 μg의 DNA 백신 (서열 번호:3을 포함)을 근육내 (IM) EP로 제공받거나, 또는 유전자 총(GG)에 의해 ~5 μg을 제공받았다. 백신접종 후 약 4주 시점에, 기니아 피그는 복막내 (IP) 투여에 의해 표준 치명 공격 용량인 1000 플락 형성 단위(pfu)의 LASV의 공격을 받았다. 모든 대조군 기니아 피그는 LASV 감염으로 쓰러졌지만, 반면 백신접종된 동물들의 83%는 생존하였고, 죽은 한 마리 동물은 죽기까지 시간이 지연되었다. 공격 이후 LASV에 대한 중화 항체들이 대조군 기니아 피그에서는 탐지되지 않았지만, 백신접종된 동물에서는 탐지되었는데, 이것은 프라이밍 반응이 DNA 백신에 의해 촉발되었음을 나타낸다(데이터 나타내지 않음).

이 기니아 피그 연구에서 LASV DNA 백신의 IM EP는 보호성 면역을 유도할 수 있지만, 공격받은 동물들은 열이 나고, 약한 임상적 질병 사인을 보였다(도 1A, 1C); 따라서, 백신 구조체 및 내피 전달 방법등에 대한 추가 개선이 추구되었다. 이 목적을 위하여, 포유류 코돈 이용가능성을 최적화시키고, 발현을 절충시키는 것으로 바이러스 요소들을 제거하기 위하여 LASV GPC DNA 백신은 최적화되었다. 이 최적화된 백신 (서열 번호:1을 포함)은 계통 13 기니아 피그 (한 집단에 8마리)에서 테스트되었는데, 동물들은 최소한의 침습 내피 장치(MID) 또는 비침습 장치(NINV)와 함께, 개정된 파라미터를 가진 근육내 전기천공 장치 (IM EP)를 이용하여 3-4주 간격으로 50 μg의 DNA로 3회 백신접종되었다. (MID)는 한 면에서 전극은 3mm 떨어지고, 다른 두 면에서는 전극들이 5mm 떨어진 모양의 삼각 형 전극 배치를 가진다. NINV는 피부를 침투하지 않고(또는 대안으로 피부의 각질층으로 진입) 피부 표면과 접촉되는 4x4 패턴의 전극 배열을 가진다.

공격 이후, 비어있는 플라스미드로 백신접종된 기니아 피크 또는 백신을 제공받지 않은 것들은 열이 나기 시작하고, 질병의 징후를 나타내고, 체중 감소 및 공격 후 15 내지 18일 사이에 감염으로 죽었다(도 1). 대조적으로, 임의의 EP 방법에 의해 코돈 최적화된 LASV DNA 백신을 접종받은 모든 기니아 피그는 공격으로부터 생존하였다. 비-최적화된 LASV DNA 백신으로 접종을 받은 기니아 피그는 본 연구에서 질병의 징후를 보인 파일롯 연구와 달리, MID 및 IM EP 집단의 기니아 피그는 모두 질병의 징후를 보이지 않았고, 열도 없었으며, 체중도 일정하게 유지되었다. 그러나 LASV DNA 백신을 IM EP로 제공받은 기니아 피그 일부에서는 낮은 열과 약간의 바이러스혈증을 포함하는 약한 질병 징후가 관찰되었는데, 이는 피부 전기천공이 본 연구에서 더 효과적임을 제시한다.

도 2는 IM 또는 MID 피부 EP 장치를 이용하여 코돈 최적화된 LASV DNA 또는 비어있는 플라스미드 대조군으로 백신 접종을 맞은 기니아 피그 (한 집단에 8마리)의 생존 곡선을 나타낸다. 최종 백신접종 이후 4주 시점에 1000 pfu의 LASV로 공격을 받았다.

백신 및 전달 방법의 효과 및 내구성을 확인하기 위하여, MID EP-백신접종된 기니아 피그의 하위집단이 역-도전 실험에 선택되었다. 이들 기니아 피그는 120 일간 BSL-4 격리 유지되었고, 그 다음 4마리의 체중이 정합되는 순수 기니아 피그와 함께 1000 pfu의 LASV로 공격받았다. 바이러스 감염 이후 30일간 매일 기니아 피그를 관찰하였고, 체중, 체온 및 질병 진행을 점검하였다. 백신접종된 동물들은 연구 기간 동안 아프지 않았으며, 재감염에도 생존하였다(도 3).

도 3은 MID EP-백신접종된 기니아 피그의 하위집단의 역-도전 실험 결과를 나타내는데, 도 3A는 집단 체중의 변화를 나타내고, 도 3B는 집단의 평균 체온의 변화를 나타낸다.

NHP에서 MID EP에 의해 전달된 코돈-최적화된 LASV DNA 백신 (서열 번호:2를 포함)이 추가 평가되었다. NHP 모델은 이들 동물에서 관찰되는 질병이 인간 질병과 가장 닮았기 때문에, 백신 효과 평가에 가장 유익한 모델이다.

4마리 NHP 집단은 1 mg의 LASV DNA 백신 (서열 번호:2를 포함) 또는 1 mg의 비어있는 벡터 플라스미드를 3주 간격으로 3회 MID EP 장치를 이용하여 백신접종을 맞고, 최종 백신 접종 후 4주차에 IM 주사를 통하여 1000 pfu의 LASV의 공격을 받았다. NHP로부터 채집된 혈액 시료는 CBC 및 혈액 화학에 대해 감시되었고, 질병 진행에 대해 매일 두 차례 동물들을 관찰하였다. 4마리 대조군 NHP중 두 마리는 출혈 윈도우 동안 질병으로 죽었다(감염후 13일 및 17일). 다른 두 마리 대조군 NHP는 운동실조 및 연구 최종 일자 (공격 후 45일)에 발생된 이들의 청력도를 LASV DNA-백신접종된 NHP의 것과 비교하여 나타난 것과 같이(도 4) 청력상실을 포함하는 신경계 징후가 발생되었다. 청력상실(한쪽 또는 양쪽)은 LASV 환자들의 대략 30%에서 발생하는 LASV 감염의 결과로 잘 알려져 있지만, 우리가 아는 한, NHP에서 이 질병의 결과의 1차 기록이며, 질병 표식으로 삼을 수 있다.

도 4에 나타난 것과 같이, NHP #2 및 NHP #7의 청력도는 각각 비어있는 플라스미드 또는 LASV DNA 백신을 접종받은 것이다. 두 원숭이에게 0 데시빌 자극에서 청력도는 반응을 보이지 않았다. NHP #2의 좌우측 귀의 청력도는 75 데시빌에서 반응을 보이지 않았지만, 대조적으로 NHP #7의 청력도는 듣기 반응 패턴을 보였다.

두 마리 대조군 NHP은 감염으로부터 생존하였지만, 연구내내(감염후 45일) 결정적으로 아파했었다. 대조적으로 LASV DNA-백신접종된 4마리 NHP는 연구 내내 건강해 보였으며, 열도 없었고, 정상적인 CBC 및 혈액 화학을 유지하였다(도 5).

도 5는 LASV DNA 백신 또는 비어있는 플라스미드를 MID EP에 의해 백신접종을 맞고, LASV 공격을 받은 NHP의 생존, 바이러스혈증 및 유병율 득점을 나타낸다. 도 5A에서는 모든 LASV DNA-백신접종된 NHP는 LASV 공격에서 생존하였지만, 비어있는 플라스미드으로 접종된 4마리 대조군 NHP중 2마리는 감염으로 죽었다는 것을 보여준다. 도 5B는 비어있는 플라스미드-백신접종된 4마리 NHP 모두는 바이러스혈증을 나타내지만, 살아있는 2마리 NHP는 공격후 28일까지 바이러스를 처리할 수 있었다는 것을 보여준다. LASV DNA-백신접종된 NHP는 모든 시점에서 무바이러스혈증(aviremic)이었다. C. 유병율 득점은 연구 동안에 NHP가 어떻게 아프게 되었는지의 척도다. 대조군 동물들은 죽기 전 심각하게 아프게 되었다. 죽지 않은 2마리 NHP는 연구 종료까지 만성적으로 아팠고, 공격-이전 상태로 회복되지 않았다. LASV DNA-백신접종된 NHP들은 결코 아프지 않았다.

도 6은 LASV-GPC (서열 번호:2를 포함) 또는 모의 DNA 백신을 제공받은 게잡이원숭이(cynomolgus)의 선택된 혈액 화학값를 보여준다

도 7은 LASV-GPC (서열 번호:2를 포함) 및 모의 DNA 백신으로 모두 접종된 게잡이원숭이(NHP)의 CBC 및 혈액 화학을 나타낸다. 결과는 NHP에서 정상적인 CBC 및 혈액 화학을 나타낸다.

실험 및 방법

LASV DNA 백신의 용량 범위 연구 실시 (1-8 개월):

계통 13 기니아 피그에서 3가지 용량의 LASV DNA 백신이 평가된다. 기존 연구에서, 3주 간격으로 MID EP에 의해 제공된 50 μg의 LASV DNA 백신의 3회 백신접종은 계통 13 기니아 피그에게 완전한 보호성 면역을 제공하였다. MID EP (표 1)에 의해 제공된 50 μg, 5 μg 및 1 μg 용량의 단축된 섭생(3주 간격으로 2회 백신접종)에서 백신 보호 효과가 비교될 것이다.

JUNV 및 MACV DNA 백신의 교차 보호 결정 및 다중-물질 백신 제제의 간섭 측정

다중-물질 백신 플랫포옴으로써 DNA 백신-피부 전기천공 시스템의 전반적인 응용성이 테스트될 것이다. JUNV 및 MACV (GPC 아미노산 약 96% 상동성을 공유)에 대한 코돈 최적화된 DNA 백신이 생성될 것이며, 교차 공격 연구 (표 2)가 실행될 것이다. JUNV 및 MACV 백신의 교차 보호성이 결정될 때, 그 다음 Old World 및 New World 아레나바이러스로부터 보호를 목표로 한 추가 연구는 LASV 백신과 복합된 두 백신 중 하나만을 이용할 것이다. 본 연구에서 기니아 피그 집단은 후보 DNA 백신 세 가지 모두로 백신 접종받고, LASV 공격을 받을 것이다.

NHP 공격 모델에서 면역 상관관계, 용량 감소 및 사이토킨 어쥬번트 측정

사이토킨 어쥬번트와 함께 또는 없이, EP에 의해 LASV DNA 백신 (서열 번호:2를 포함)이 접종된 비인간 영장류의 면역 반응을 측정하기 위한 연구가 실행될 것이다 (하기 표 3 참고). 백신접종 이후, NHP는 BSL-4 격리 실험실에서 공격받을 것이다.

LASV DNA 백신, IL-28, 및 IL-12와 복합되어 2개 사이토킨 DNA 플라스미드가 테스트될 것이다.

1 mg의 LASV DNA 백신 (서열 번호:2를 포함)으로 3주 간격으로 3회 백신접종을 맞은 NHP는 LASV의 공격으로부터 보호를 나타내었다. 1 mg 용량의 백신이 4주 간격으로 3회 제공된 경우와 동일한 용량으로 8주 간격을 두고 2회 제공된 경우를 비교하는 연구가 실행될 것이다. 추가적으로, 절반-강도 용량인 백신 (0.5 mg) 단독으로, 또는 IL-12 또는 IL-28 사이토킨의 유전자를 발현하는 플라스미드와 복합된 경우가 비교될 것이다. 이들 사이토킨은 백신을 보조하는 의도이며, 개선된 세포 매개된 면역 반응을 제공한다.

LASV 백신 및 사이토킨 어쥬번트에 의해 유도된 세포성 면역 표현형은 다음의 분석에 의해 평가될 것이다: 항원-특이적 IFNg ELISPOT, 세포내 사이토킨 착색 (다중기능 T 세포 프로파일에 대한 분석 포함), CFSE-희석을 통한 증식, 및 Hersperger et al 2010a, Hersperger et al 2010b, Morrow et al 2010b 및 Migueles et al 2008에서 설명된 것과 같이, Tbet, Peforin, Granzyme B 및 CD107a를 포함하는 세포용해성 CD8+ T 세포 표식들에 대한 착색. 이들 면역분석 조합은 CTL (세포독성 림프세포) 표현형 및 활성에서 특별히 강조되는, LASV DNA 백신에 대해 CD8+ T 세포 반응의 특이적 심문을 허용하는데, 그 이유는 CD8+ T 세포의 이러한 기능은 바이러스 감염된 세포의 제거와 직접적으로 관련있으며, 그리고 면역계에 의한 바이러스 감염의 조절 및 제거를 주요 기전을 구성한다. IL-12 및 IL-28을 이용하는 기존 연구들에서 이들 두 어쥬번트는 Perforin 방출, Granzyme B 적하(loading) 및 방출, 및 CD107a의 발현을 강력하게 증가시키는 것을 보여주었던 백신 특이적 CTL을 유도할 수 있다는 것을 보여주었다. 이 연구는 어쥬번트에 추가하여 HIV 항원을 이용하여 NHP 모델에서 실시되었는데, 이들 증가된 반응은 PBMC 뿐만 아니라, 장관막 림프절(Mesenteric Lymph Nodes)로부터 수거된 T 세포들 모두에서 볼 수 있었고, 이것은 이들 어쥬번트가 말초 혈액 뿐만 아니라 2차 림프 장기에 영향을 발휘한다는 것을 제시한다. 더욱이, IL-12 및 IL-28은 모두 장기적으로 CTL 표현형 및 기능에 이들의 영향을 발휘할 수 있었는데, 최종 면역주사후 3개월에 실시된 분석에서 증가된 항원 특이적 면역 반응이 지속됨을 보여주었기 때문이다.

LASV DNA 백신에 대한 효능 분석 측정

IND 굴복이 가능하도록, 강력하고 신뢰성있는 효능 분석이 필요할 것이다. 정량적 유동 세포분석 효능 분석이 AV 백신, 예를 들면 LASV DNA 백신에 이용되었다. 한타바이러스 감염에 의한 신장 증후군과 함께 출혈열에 대해 DNA 백신의 단계 1 임상 연구를 뒷받침하고(Badger et al. 2011), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스에 대한 DNA 백신의 IND 굴복을 뒷받침하기 위하여 유사한 분석이 이미 개발되었고, 3년이상 사용되었다. 전반적으로, 이 방법은 테스트 DNA를 세포에 형질감염시키고, 참고 물질 DNA의 공지의 양으로부터 발현과 생성된 양과 측정된 항원 발현을 비교하는 것을 포함한다.

이 분석은 신속하고(1일 미만), 상당히 재생가능하며, 그리고 Good Laboratory Practice (GLP) 지침에 따라 수행하도록 이미 개조되었다. 결과적으로, 관리 서류 및 절차들이 이미 자리를 잡았다. 이것은 LASV DNA 백신의 효능을 측정하기 위한 분석의 적합성을 상당히 촉진시킬 것이다. 이 분석만으로도 DNA 백신의 효능 및 안정성을 측정하는데 충분하지만, LASV 감염에 대한 보호성 면역과 상관관계가 거의 없기 때문에, 우리는 유전자 발현과 항원성의 상관관계의 정보를 제공하기 위하여 첫해 각 안정성 시점에서 기니아 피크 소집단을 또한 백신접종할 것이다.

기니아 피그 도전 모델은 AV 백신 효과를 평가하기 위한 AV의 인가된 모델이다. 이 동물들은 50 ug의 GPC DNA LASV 백신을 3-4주 간격으로 3회 MID 장치를 이용하여 백신접종을 맞았다. 최종 백신 접종 후 3주차에 이 동물들은 i.m. 주사로 1000 pfu의 LASV로 공격을 받았다. 도 2에서 나타낸 것과 같이,백신접종된 동물의 90% 이상이 공격에서 생존하였고, 대조군 (모의 백신접종된) 동물들 100%는 공격 후 15일 시점에서 죽었다. 도 5는 NHP 연구의 공격 데이터를 나타낸다. 4마리 NHP 집단은 1 mg GPC DNA LASV 백신 또는 1 mg의 비어있는 벡터로 3주간격으로 3회 백신접종을 맞았고, 최종 백신접종 후 4주 차에 i.m. 주사에 의해 1000 pfu LASV로 공격받았다. 4/4 백신접종된 NHP는 생존하였고, 바이러스혈증의 신호를 보이지 않았지만, 반면 4/4 대조군 동물에서는 바이러스혈증이 발생하였고, 2/4는 공격으로 죽었다.

<110> INOVIO PHARMACEUTICALS, INC. BRODERICK, Kate SARDESAI, Niranjan Y CASHMAN, Kathleen A SCHMALJOHN, Connie S <120> CROSS-PROTECTIVE ARENAVIRUS VACCINES AND THEIR METHOD OF USE <130> VGX0125 <150> US 61/506579 <151> 2011-07-11 <150> US 61/507062 <151> 2011-07-12 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LASV Josiah GP <400> 1 atgggccaga tcgtgacctt cttccaggaa gtcccccacg tcatcgagga agtcatgaac 60 atcgtcctga tcgccctgtc cgtgctggcc gtgctgaagg gcctgtacaa cttcgccacc 120 tgtggcctgg tcggactggt caccttcctg ctgctgtgcg gccggtcctg caccacctcc 180 ctgtacaagg gcgtgtacga gctgcagacc ctggaactga acatggaaac cctgaacatg 240 accatgcccc tgagctgcac caagaacaac tcccaccact acatcatggt cggcaacgag 300 accggactgg aactgaccct gaccaacacc tccatcatca accacaagtt ctgcaacctg 360 tccgacgccc acaagaagaa cctgtacgac cacgccctga tgtccatcat ctccaccttc 420 cacctgtcca tccccaactt caaccagtac gaggccatgt cctgcgactt caacggcggc 480 aagatcagcg tgcagtacaa cctgtcccac tcctacgccg gcgacgccgc caaccactgc 540 ggcaccgtgg 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Tyr Lys Gly 50 55 60 Val Tyr Glu Leu Gln Thr Leu Glu Leu Asn Met Glu Thr Leu Asn Met 65 70 75 80 Thr Met Pro Leu Ser Cys Thr Lys Asn Asn Ser His His Tyr Ile Met 85 90 95 Val Gly Asn Glu Thr Gly Leu Glu Leu Ser Leu Thr Asn Thr Ser Ile 100 105 110 Ile Asn His Lys Phe Cys Asn Leu Ser Asp Ala His Lys Lys Asn Leu 115 120 125 Tyr Asp His Ala Leu Met Ser Ile Ile Ser Thr Phe His Leu Ser Ile 130 135 140 Pro Asn Phe Asn Gln Tyr Glu Ala Met Ser Cys Asp Phe Asn Gly Gly 145 150 155 160 Lys Ile Ser Val Gln Tyr Asn Leu Ser His Ser Tyr Ala Gly Asp Ala 165 170 175 Ala Asn His Cys Gly Thr Val Ala Asn Gly Val Leu Gln Thr Phe Met 180 185 190 Arg Met Ala Trp Gly Gly Ser Tyr Ile Ala Leu Asp Ser Gly Arg Gly 195 200 205 Asn Trp Asp Cys Ile Met Thr Ser Tyr Gln Tyr Leu Ile Ile Gln Asn 210 215 220 Thr Thr Trp Glu Asp His Cys Gln Phe Ser Arg Pro Ser Pro Ile Gly 225 230 235 240 Tyr Leu Gly Leu Leu Ser Gln Arg Thr Arg Asp Ile Tyr Ile Ser Arg 245 250 255 Arg Leu Leu Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu Ser Asp Ser Glu Gly Lys 260 265 270 Asp Thr Pro Gly Gly Tyr Cys Leu Thr Arg Trp Met Leu Ile Glu Ala 275 280 285 Glu Leu Lys Cys Phe Gly Asn Thr Ala Val Ala Lys Cys Asn Glu Lys 290 295 300 His Asp Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg Leu Phe Asp Phe Asn Lys 305 310 315 320 Gln Ala Ile Gln Arg Leu Lys Ala Glu Ala Gln Met Ser Ile Gln Leu 325 330 335 Ile Asn Lys Ala Val Asn Ala Leu Ile Asn Asp Gln Leu Ile Met Lys 340 345 350 Asn His Leu Arg Asp Ile Met Gly Ile Pro Tyr Cys Asn Tyr Ser Lys 355 360 365 Tyr Trp Tyr Leu Asn His Thr Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Pro Lys 370 375 380 Cys Trp Leu Val Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Glu Thr His Phe Ser 385 390 395 400 Asp Asp Ile Glu Gln Gln Ala Asp Asn Met Ile Thr Glu Met Leu Gln 405 410 415 Lys Glu Tyr Met Glu Arg Gln Gly Lys Thr Pro Leu Gly Leu Val Asp 420 425 430 Val Phe Val Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Leu Ile Ser Ile Phe Leu His 435 440 445 Leu Val Lys Ile Pro Thr His Arg His Ile Val Gly Lys Ser Cys Pro 450 455 460 Lys Pro His Arg Leu Asn His Met Gly Ile Cys Ser Cys Gly Leu Tyr 465 470 475 480 Lys Gln Pro Gly Val Pro Val Lys Trp Lys Arg 485 490

Claims (10)

1. 아레나바이러스에 대항한 보호성 면역 반응을 필요로 하는 대상에서 아레나바이러스에 대항한 보호성 면역 반응을 발생시킬 수 있는 다음을 포함하는 하나 또는 그 이상의 면역원성 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하는 DNA 백신:
   아레나바이러스의 당단백질 전구물질을 인코드하는 코딩 서열, 전술한 대상에 대해 최적화된 코돈; 또는 이 당단백질 전구물질에 98% 상동성인 이의 면역원성 단편.
2. 청구항 1에 있어서, 전술한 코딩 서열은 필수적으로 LASV (LASV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, LCMV (LCMV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, MACV (MACV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, JUNV (JUNV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, GTOV (GTOV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, WWAV (WWAV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인, 또는 PICV (PICV-GPC)의 당단백질 전구물질 도메인으로 구성된, DNA 백신.
3. 청구항 2에 있어서, 전술한 단편은 다음을 포함하는, DNA 백신:
   잔기 441-449를 포함하는 LASV-GPC의 단편,
   잔기 447-455를 포함하는 LMCV-GPC의 단편,
   잔기 444-452를 포함하는 MACV-GPC,
   잔기 429-437을 포함하는 JUNV-GPC,
   잔기 427-435를 포함하는 GTOV-GPC,
   잔기 428-436을 포함하는 WWAV-GPC, 또는
   잔기 455-463을 포함하는 PICV-GPC.
4. 청구항 1 내지 3중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 DNA 백신은 전술한 코딩 서열중 하나로 필수적으로 구성된, DNA 백신.
5. 청구항 1 내지 3중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 DNA 백신은 전술한 코딩 서열중 최소한 2개로 필수적으로 구성된, DNA 백신.
6. 청구항 1 내지 5중 임의의 한 항에 있어서, IL-12, IL-15, IL-28, 또는 RANTES로 구성된 군으로부터 선택된 어쥬번트를 더 포함하는, DNA 백신.
7. 청구항 6에 있어서, 이 코딩 서열은 서열 번호: 1 또는 2, 또는 서열 번호: 4 또는 5를 인코드하는 뉴클레오티드 서열인, DNA 백신.
8. 다음을 포함하는 아레나바이러스에 대항한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법:
   청구항 1 내지 6중 임의의 한 항에 따른 DNA 백신을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하고, 그리고
   전술한 대상을 전기천공한다.
9. 청구항 8에 있어서, 전기천공 단계는 다음을 포함하는 방법:
   전기천공 에너지 펄스를 투여 단계가 일어나는 전술한 대상의 부위로 전달한다.
10. 청구항 9에 있어서, 투여단계 및 전기천공 단계 모두 전술한 대상의 내피층에서 일어나는, 방법.

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