CN116789767B - 一种抗新型冠状病毒病多肽组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗新型冠状病毒病多肽组合物及其应用,采用S蛋白衍生肽、ACE2衍生肽、膜融合抑制多肽,针对以新型冠状原始毒株WT和奥密克戎毒株Omicron毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒和以VSV‑G为包膜蛋白的假病毒进行抑制实验,结果表明,S蛋白衍生肽、ACE2衍生肽、膜融合抑制多肽及其组合物对以VSV‑G蛋白为包膜蛋白的假病毒无抑制作用,但对以新型冠状原始毒株WT和奥密克戎毒株Omicron毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒均有抑制作用,而且多肽组合物对病毒的抑制效果要明显好于任一种多肽对病毒的抑制效果,多肽组合物对病毒的IC50(半数抑制浓度)显著低于其中任一种多肽对病毒的IC50。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域,具体涉及一种抗新型冠状病毒病多肽组合物及其应用。
背景技术
新型冠状病毒主要表达刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)4种结构性抗原蛋白。其中,S蛋白与人的细胞表面血管紧张素转化酶2(ACE2)结合并在病毒感染细胞过程中起最重要作用。S蛋白主要由S1和S2亚基组成,S1亚基包括N末端结构域(NTD)、受体结合区域(RBD),S2亚基包括膜融合肽(FP)、肽重复序列1和2(HR1,HR2)跨膜结构域和胞内结构域。其中,RBD中的受体结合基序(RBM)为S蛋白与ACE2主要结合区域,FP在病毒S蛋白与ACE2结合并变构后参与病毒与细胞膜融合过程。具体来说,新型冠状状病毒通过S蛋白上受体结合域RBD与宿主细胞的受体ACE2结合,这是病毒感染的起始步骤。当S蛋白与细胞表面受体ACE2特异结合后,发生构象变化,在宿主蛋白酶的切割下被激活,S蛋白构象发生改变,膜融合肽释放,插入到宿主细胞膜上,随后S2亚基上的两个七肽重复序列形成六螺旋束,拉近病毒包膜与宿主细胞膜之间的距离,进而促使病毒与宿主细胞融合,介导病毒的进入。
目前开发的多肽类抑制剂对于相对应的冠状病毒而言都有着不错的抑制活性,但是病毒在不停适应宿主的过程中发生各种变异,病毒容易逃逸单一的抑制剂。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对上述问题,提出一种高效的抗新型冠状病毒病多肽组合物,其中的三种多肽抑制剂能够针对病毒入侵三个步骤更好地抑制各种病毒变异株,为治疗或预防新型冠状病毒提供可行的治疗方案,为药物开发提供指导。而且,本领域内还未见使用三种多肽组合物用于抑制新型冠状病毒的相关报道。本发明首次检测证实S蛋白衍生肽、ACE2衍生肽、膜融合抑制多肽三种多肽及其组合物(Mix)对新型冠状病毒入侵的抑制作用,发现三种多肽的组合物抑制效果明显好于单独使用任意一种多肽的抑制效果,三种多肽组合物的半抑制浓度IC50比单独使用任意一种多肽的最低IC50低近20倍。
(二)技术方案
为了达到上述目的,本发明采用的主要技术方案包括:
一方面,本发明提供一种抗新型冠状病毒病多肽组合物,其包括:多肽1、多肽2和多肽3;所述多肽1的氨基酸序列是ALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFEL;所述多肽2的氨基酸序列是EEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSGLGKGDFR;所述多肽3的氨基酸序列是DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL。
进一步地,本技术方案中的多肽均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
根据本发明较佳实施例,所述的抗新型冠状病毒病多肽组合物中,所述多肽1、所述多肽2和所述多肽3三者按摩尔比为(0.5~8):(0.5~8):(0.5~8)进行混配。
根据本发明较佳实施例,所述的抗新型冠状病毒病多肽组合物中,所述多肽1的浓度范围0.1~6000nM,所述多肽2的浓度范围为0.1~6000nM,所述多肽3的浓度范围0.1~6000nM。
优选地,所述的抗新型冠状病毒病多肽组合物中,所述多肽1、所述多肽2、所述多肽3的摩尔比为1:1:1;所述多肽1的浓度为500nM,所述多肽2的浓度为500nM,所述多肽3的浓度为500nM。
进一步地,所述多肽组合物给药方式不限定于注射给药,注射液的溶剂为生理盐水。
另一方面,本发明还提供了一种抗新型冠状病毒病多肽组合物的应用。
进一步地,所述多肽组合物,可应用于制备包括预防新型冠状病毒病、治疗新型冠状病毒病和减轻新型冠状病毒病的药物。
(三)有益效果
本发明针对新型冠状病毒入侵三个步骤,提供了一种抗新型冠状病毒病病的多肽组合物,采用多肽组合物可进行有针对性的抑制,组合物中的S蛋白衍生肽、ACE2衍生肽可以直接抑制S蛋白与ACE2的相互作用,膜融合抑制多肽用于抑制膜融合。实验已经证实,该多肽组合物抑制病毒入侵效果好,其IC50低且远低于单独使用任意一种多肽的IC50。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为三种多肽及其组合物对病毒的抑制效果。其中Mock代表没有加任何病毒和多肽到细胞培养液中的荧光素酶活性,Control代表只加入病毒未加任何多肽到细胞培养液中的荧光素酶活性,471多肽、p6多肽、HR2P多肽分别代表加入浓度为S蛋白衍生肽、ACE2衍生肽或膜融合抑制多肽到细胞培养液中的荧光素酶活性,Mix1:2:1代表加入浓度为500nM的471多肽、p6多肽和HR2P多肽配比为1:2:1的多肽组合物到细胞培养液中的荧光素酶活性,Mix1:1:2代表加入浓度为500nM的471多肽、p6多肽和HR2P多肽配比为1:1:2的多肽组合物到细胞培养液中的荧光素酶活性,Mix2:1:1代表加入浓度为500nM的471多肽、p6多肽和HR2P多肽配比为2:1:1的多肽组合物到细胞培养液中的荧光素酶活性,Mix1:1:1代表加入浓度为500nM的471多肽、p6多肽和HR2P多肽配比为1:1:1的多肽组合物到细胞培养液中的荧光素酶活性。荧光素酶活性可反映对以新型冠状原始毒株(WT)和奥密克戎毒株(Omicron)毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒的抑制效果。
图2为浓度为500nM的471多肽、p6多肽和HR2P多肽及其配比为1:1:1的多肽组合物,对以VSV-G VSV-G为包膜蛋白的假病毒的抑制效果。
图3为三种多肽及其组合物在不同浓度时抑制WT毒株和Omicron毒株的量效关系曲线。其中采用的浓度分别为0nM、0.1nM、0.3nM、0.9nM、2.7nM、8.1nM、24.3nM、72.9nM、218.7nM、500nM、656.1nM、1968.3nM、5904.9nM。
图4为浓度为500nM的471多肽、p6多肽和HR2P多肽及其配比为1:1:1的多肽组合物抑制WT毒株和Omicron毒株的IC50。
具体实施方式
以下结合本发明的具体实施例进行说明。本实施例中的多肽均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1、细胞传代
(1)将盛放原代293T细胞培养瓶中的细胞培养液吸出,然后用适量的磷酸盐缓冲液PBS润洗1次,并将PBS弃去。
(2)将消化液加入到培养瓶中,轻轻摇动培养瓶,使瓶底的原代293T细胞全部浸入消化液中,然后将培养瓶放入37℃培养箱中对原代293T细胞进行消化;消化液采用0.25%Trypsin-EDTA;
(3)待消化30~60s后,将培养瓶置于显微镜下进行观察,发现原代293T细胞逐渐贴壁且趋于圆形,在贴壁293T细胞还未漂起时,将消化液弃去,并加入培养液终止消化;培养液为90% DMEM+10% FBS+1%双抗。
(4)将贴壁细胞小心吹打下来,形成293T细胞悬液,然后将一部分293T细胞悬液置于37℃培养箱中进行培养,按细胞密度2~5×104进行隔天传代,细胞传代比例为1:3,最后对细胞培养液进行荧光素酶检测;将另一部分293T细胞悬液分盘,准备进行转染以获得假病毒。
2、假病毒的制备和检测
将慢病毒包装辅助质粒(psPAX2)、膜蛋白质粒(pcDNA3.0-SRAS-CoV-2-S/VSV-G)、带有GFP及Luciferase双报告系统质粒(Lenti-GFP-Luc)(4.5μg)分别转染至293T细胞,2天后收集上清,利用0.45μM过滤器过滤后,分别获得以新型冠状原始毒株(WT)和奥密克戎毒株(Omicron)毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒上清和以VSV-G为包膜蛋白的假病毒上清。将假病毒上清加入到上述获得的细胞培养液中,进行荧光素酶检测。
3、293T-ACE2细胞的制备
ACE2即血管紧张素转化酶II,是冠状病毒的功能受体,可介导病毒入侵和细胞融合。首先构建ACE2表达质粒,随后将其转染至293T细胞中,通过嘌呤霉素进行筛选后获得稳定表达ACE2的293T细胞293T-ACE2。
实施例1
将制备得到的以新型冠状原始毒株WT和奥密克戎毒株Omicron毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒上清和浓度为500nM的471多肽在37℃下孵育30分钟,随后加入293T-ACE2细胞培养液中,2天后,利用Promega公司的报告基因裂解液(passive lysis buffer)进行细胞裂解,获得细胞裂解液。
将获得的细胞裂解液20μL加入96孔板中,随后加入100μL萤光素酶检测试剂(萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒,Promega),混匀后于Synergy Mx多功能微孔板检测仪上进行检测。
实施例2
将实施例1中加入的471多肽换为浓度500nM的p6多肽,其他条件均与实施例1相同。
实施例3
将实施例1中加入的471多肽换为浓度500nM的HR2P多肽,其他条件均与实施例1相同。
实施例4
在实施例1的基础上,又加入浓度均为500nM的P6多肽和HR2P多肽,且471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比为1:1:1,其他条件均与实施例1相同。
实施例5
在实施例4的基础上,调整三种多肽的含量,使471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比为1:2:1,其他条件均与实施例4相同。
实施例6
在实施例4的基础上,调整三种多肽的含量,使471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比为1:1:2,其他条件均与实施例4相同。
实施例7
在实施例4的基础上,调整三种多肽的含量,使471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比为2:1:1,其他条件均与实施例4相同。
将未加任何病毒和多肽的细胞培养液的荧光素酶活性检测结果,只加入以新型冠状原始毒株WT和奥密克戎毒株Omicron毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒未加任何多肽的细胞培养液的荧光素酶活性检测结果,以及实施例1~4的实验检测结果进行对照,如图1所示。可知,未加任何病毒和多肽的细胞培养液其荧光素酶活性很低,加入以新型冠状原始毒株WT和奥密克戎毒株Omicron毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒后细胞培养液的荧光素酶活性明显升高,说明新型冠状病毒成功感染;加入471多肽,可使荧光素酶活性降低25%左右,说明471多肽能够抑制新型冠状病毒入侵;加入p6多肽,可使荧光素酶活性降低70%左右,说明p6多肽能够抑制新型冠状病毒入侵;加入HR2P多肽,可使荧光素酶活性降低50%左右,说明HR2P多肽能够抑制新型冠状病毒入侵;加入471多肽、P6多肽和HR2P多肽的组合物,荧光素酶活性降低90%左右,说明多肽组合物能够更好地抑制新型冠状病毒入侵。
通过实施例5~7的实验检测结果可知,471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比为1:2:1的多肽组合物,可使荧光素酶活性降低85%左右,说明增加P6多肽含量对病毒抑制效果没有帮助,反而会降低抑制效果;471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比为1:1:2的多肽组合物,可使荧光素酶活性降低80%左右,说明增加HR2P多肽对病毒抑制效果没有帮助,反而会降低抑制效果;471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比为2:1:1的多肽组合物荧光素酶活性降低85%左右,说明增加471多肽对病毒抑制效果没有帮助,反而会降低抑制效果。实施例5~7与实施例4的实验检测结果对照如图1所示,可知,471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比1:1:1的多肽组合物对病毒的抑制效果最好。因为在新型冠状病毒入侵时,嵌在新型冠状病毒脂质包膜上的刺突糖蛋白(S)识别人宿主细胞的受体ACE2,当发生受体结合之后,S蛋白就开始发生弯折,拉近了病毒和细胞表面的距离,然后当距离足够近的时候,发生膜融合,之后病毒的RNA基因组也就进入细胞内部。本发明利用的S蛋白衍生肽,ACE2衍生肽可以直接抑制S蛋白与ACE2的相互作用,膜融合抑制多肽抑制膜融合,三种多肽组合物可以分别针对病毒入侵三个步骤进行有效协同地病毒抑制。
对比例1~4
在实施例1~4的基础上,将以新型冠状原始毒株WT和奥密克戎毒株Omicron毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒上清更换为以VSV-G为包膜蛋白的假病毒上清,其他条件均与实施例1~4相同。
将未加任何病毒和多肽的细胞培养液的荧光素酶活性检测结果,只加入以VSV-G为包膜蛋白的假病毒未加任何多肽的细胞培养液的荧光素酶活性检测结果,以及对比例1~4的检测结果进行对照,如图2所示,表明未加任何病毒和多肽的细胞培养液其荧光素酶活性很低,加入以VSV-G为包膜蛋白的假病毒后细胞培养液的荧光素酶活性明显升高,说明VSV-G病毒成功感染;471多肽、P6多肽和HR2P多肽及其组合物都对VSV-G为包膜蛋白的假病毒入侵没有抑制效果,表明了多肽及其组合物对于新型冠状病毒入侵的特异性。
实施例8
将制备得到的以新型冠状原始毒株WT和奥密克戎毒株Omicron毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒上清和471多肽、P6多肽和HR2P多肽的摩尔比为1:1:1,浓度均为0.1nM的多肽组合物在37℃下孵育30分钟,随后加入293T-ACE2(稳定表达ACE2的293T细胞系),2天后,利用Promega公司的报告基因裂解液(passive lysis buffer)进行细胞裂解,获得细胞裂解液。
将获得的细胞裂解液20μL分别加入96孔板中,随后加入100μL检测萤光素酶检测试剂(萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒,Promega),混匀后于Synergy Mx多功能微孔板检测仪上进行检测。
实施例9
在实施例8的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为0.3nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例10
在实施例8的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为0.9nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例11
在实施例8的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为2.7nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例12
在实施例8的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为8.1nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例13
在实施例8的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为24.3nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例14
在实施例8的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为72.9nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例15
在实施例8的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为218.7nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例16
在实施例6的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为656.1nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例17
在实施例6的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为1968.3nM,其他条件均与实施例8相同。
实施例18
在实施例6的基础上,调整471多肽、P6多肽和HR2P多肽的浓度均为5904.9nM,其他条件均与实施例8相同。
将实施例4与实施例8~18的实验检测结果对照可知,多肽组合物的浓度越大抑制效果越好。结果表明多肽组合物在浓度为500nM时,已经达到了理想的抑制效果,如图3所示。
总结上述结论,结果表明471多肽、P6多肽和HR2P多肽及其组合物对新型冠状原始毒株WT和奥密克戎毒株Omicron毒株S蛋白为包膜蛋白的假病毒都有一定的抑制作用,而且多肽组合物的抑制效果明显强于其中任意一种单独多肽的抑制效果,多肽组合物的浓度为500nM,三种多肽摩尔比为1:1:1时具有更好的抑制效果,其IC50远小于单独任一种多肽的IC50,如图4所示。
应当说明的是,上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种抗新型冠状病毒病多肽组合物,其特征在于,包括:多肽1、多肽2和多肽3;所述多肽1的氨基酸序列为SEQ ID No.1;所述多肽2的氨基酸序列为 SEQ ID No.2;所述多肽3的氨基酸序列为SEQ ID No.3;所述多肽1 、所述多肽2 和所述多肽3按摩尔比为1:1:1进行混配。
2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒病多肽组合物,其特征在于,所述多肽1的浓度范围218.7~6000nM,所述多肽2的浓度范围为218.7~6000nM,所述多肽3的浓度范围218.7~6000nM。
3.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒病多肽组合物,其特征在于,所述多肽1的浓度为500nM,所述多肽2的浓度为500nM,所述多肽3的浓度为500nM。
4.一种权利要求1~3任一项所述的抗新型冠状病毒病多肽组合物的应用,其特征在于,在制备包括预防新型冠状病毒病、治疗新型冠状病毒病和减轻新型冠状病毒病的药物中的应用。
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