CN111705006A

CN111705006A - 表达新型冠状病毒s蛋白的口服重组酵母及其制备与应用

Info

Publication number: CN111705006A
Application number: CN202010529961.7A
Authority: CN
Inventors: 黄金海; 张丽琳; 郭艳余
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: AU2021287664A1; US20230302118A1; JP2023529432A; BR112022025193A2; EP4166649A1; CA3182052A1; CN111705006B; WO2021249031A1

Abstract

本发明公开了一种表达新型冠状病毒S蛋白的口服重组酵母及其制备与应用，其包含S蛋白的16位至1035位氨基酸，优选RBD结构域和FP融合肽。将体外构建的S蛋白截断体完整转录单位GPD‑S(RBD‑FP)‑TU，通过同源重组整合于酵母基因组，利用Aga1‑Aga2表面展示系统将S蛋白展示于酵母细胞表面，获得S蛋白表面展示型的重组酵母菌株ST1814G‑S(RBD‑FP)，并利用所得菌株制备口服重组酵母。本发明的口服重组酵母成本低廉、生产使用安全、操作简便、安全有效，具有免疫保护作用，为COVID‑19的防控提供选择。

Description

表达新型冠状病毒S蛋白的口服重组酵母及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种表达新型冠状病毒S蛋白的口服重组酵母及其应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染导致的急性呼吸系统传染病。

SARS-CoV-2为单股正链RNA病毒，分类地位为巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae).与SARS (Severe AcuteRespiratory Syndrome)、MERS(Middle East Respiratory Syndrome) 同属于beta类冠状病毒。基因组29,903bp，编码主要的结构蛋白包括刺突蛋白 (Spike glycoprotein,S)、囊膜蛋白(Envelop,E)、核衣壳蛋白(nucleocapsid phosphoprotein N)、膜蛋白(membraneglycoprotein,M)等。在SARS-CoV和 MERS-CoV中刺突蛋白S通过不同的受体结合结构域(receptor-binding domains, RBDs)与宿主细胞结合。MERS-CoV的S蛋白与宿主细胞二肽基肽酶Ⅳ (dipeptidyl peptidase 4,DPP-4,also known as CD26)结合^[1]，而SARS-CoV与SARS-CoV-2一致，细胞表面的血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2,ACE2)是S蛋白RBD的结合位点^[2,3]。有研究表明SARS-CoV与 SARS-CoV-2的RBD区域存在差别，主要存在于C端318-507aa^[4]，二者不具有完全的保护性，因而需要研发特异性的抗新型冠状病毒保护制剂。

比较成熟的异源蛋白表达系统包括酵母细胞、原核表达系统和杆状病毒昆虫细胞表达系统。相较于后两者，酵母细胞兼具成熟的翻译后修饰能力和培养周期短、安全、便捷、生产成本低等优势^[5]。利用酵母表面展示技术(Yeast surface display, YSD)将外源蛋白展示于酵母细胞表面，可制备口服型保护制剂。同时酵母细胞壁多糖对机体的免疫系统具有调节作用，可抗病毒、增强免疫功能，促进免疫器官发育，因而酵母口服制剂的开发具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新型冠状病毒刺突蛋白S表面展示型重组酵母及其应用，具体将其用于口服制剂的研制。

本发明的目的之二在于提供所述口服重组酵母的制备方法。

本发明的目的之三在于提供所述口服重组酵母的用途。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组酵母，ST1814G-S(RBD-FP)，其包含S蛋白的16位至1035位氨基酸。

一种新型冠状病毒S蛋白的截短体，优选为第300至1000位氨基酸，序列特征为SEQ ID No.1，为包含第330位至521的RBD结构域和第816至833位FP 融合肽。

表达所述蛋白截短体的基因，包含刺突蛋白S的RBD结构域,即从第991位至1563位碱基和FP结构域，即从第2449位至2499位碱基，其核苷酸序列为 SEQ ID No.2。

构建所述重组酵母的质粒GPD-S(RBD-FP)-TU，序列特征为SEQ ID No.3，由权利要求3所述基因片段和POT-GPD-TU载体组成。

制备新型冠状病毒S蛋白重组酵母的方法，将体外构建的S蛋白截短体完整转录单位GPD-S(RBD-FP)-TU，通过同源重组整合于酵母基因组，利用Aga1-Aga2 表面展示系统将S蛋白展示于酵母细胞表面，获得S蛋白表面展示型的重组酵母菌株ST1814G-S(RBD-FP)，并利用所得菌株制备口服重组酵母。

具体包括以下步骤：

(1)SARS-CoV-2刺突蛋白S编码基因的PCR扩增：参考SARS-CoV-2病毒基因序列NC_045512.2，合成S基因，序列特征为SEQ No.2；以pcDNA3.1-CoV-S 质粒为模板，设计引物扩增S蛋白编码基因S(RBD-FP)用于酵母载体连接；

(2)Aga2基因与SARS-CoV-2刺突蛋白S编码序列S(RBD-FP)串联：通过BamHI 单酶切线性化POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接S基因片段至表面展示表达载体 GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-S(RBD-FP)-TU，其序列特征为SEQ No.3.重组质粒转化至E.coli DH5a中，用S基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；

(3)S蛋白酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-S(RBD-FP)-TU与同源臂URRs、筛选标签Leu编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含S基因序列的重组基因，转化到酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Western blot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证。

新型冠状病毒S蛋白的重组酵母在制备用于抗新型冠状病毒药物中的应用。

本发明有益效果：本发明基于新型冠状病毒与宿主细胞ACE2受体结合时触发侵染启动的刺突蛋白S，制成了包含受体结合域及与病毒致病相关FP结构域的S蛋白截短体表面展示型口服重组酵母制剂。通过口服途径激发机体保护性免疫反应，并借助酵母细胞壁多糖对机体先天性免疫系统的调节作用，发挥更加有效的免疫保护。与新型的腺病毒疫苗、mRNA疫苗相比，口服重组酵母制剂成本低、可实现大规模放大生产，安全可靠，具有良好的应用开发前景，为新型冠状病毒的免疫防控提供选择。

本发明中所述的新型冠状病毒S蛋白口服重组酵母制剂在国内属于首次报道，表面展示菌株构建及制剂制备具有一定的创新性，为COVID-19的防控提供新思路与制剂。

附图说明

图1：新型冠状病毒S蛋白编码基因结构模式图；

图2：S(RBD-FP)基因PCR扩增结果；

图3：GPD-S(RBD-FP)-TU质粒转化大肠杆菌后的转化子检测；1-10泳道分别代表不同的大肠杆菌转化子菌落PCR检测结果，CK+是以S(RBD-FP)基因PCR产物为模板的扩增，CK-为ddH₂O对照；

图4：GPD-S(RBD-FP)-TU完整转录单位拼接模式图；

图5：GPD-S(RBD-FP)-TU完成酵母转化后在SD-leu培养基中的生长情况；

图6：ST1814G-S(RBD-FP)重组酵母的基因型验证；分别对应大肠杆菌的2号和 3号转化子进行酵母转化后验证基因型。泳道1-6分别为6个不同的酵母转化子， CK+为质粒GPD-S(RBD-FP)-TU为模板的PCR扩增，CK-为ddH₂O为模板的阴性对照；

图7：ST1814G-S(RBD-FP)酵母菌株的Western blot验证，S蛋白截短体经His 抗体检测后出现两条带。分子量大的为糖基化修饰的S蛋白截短体，分子量小的为蛋白酶切后产物；泳道3-1，3-4和3-6对应3株不同的酵母转化子；

图8：ST1814G-S(RBD-FP)重组酵母中S(RBD-FP)蛋白的免疫荧光观察；以 ST1814G空菌株为对照；

图9：ST1814G-S(RBD-FP)重组酵母的生长曲线及其与蛋白表达趋势的关系；a 为菌体的生长曲线，以ST1814G为对照，表达蛋白的菌株生长趋势与对照组一致；b为不同培养时间点的蛋白表达情况分析，泳道1-5分别代表培养1d至培养5d；

图10：BALB/c小鼠口服酵母重组菌后血清中特异性IgA和IgG的检测；A：ELISA 检测未口服组(Blank)、口服原始空白酵母(Host)与口服重组酵母(FP)后血清中 IgG的情况；B：ELISA检测未口服组(Blank)、口服原始空白酵母(Host)与口服重组酵母(FP)后血清中IgA的情况。

具体实施方式

以下结合实例进一步阐述本发明，其中的内容不应理解为限定该发明的范围。实施例中所述试剂除特别说明，均为商业化试剂。

实施例1.GPD-S(RBD-FP)-TU载体的构建

(1)S(RBD-FP)基因的扩增

S蛋白编码基因由S1亚基和S2亚基两部分组成。其中S1亚基包含RBD结构域，可结合宿主细胞ACE2受体的PD域(peptidase domain)；S2亚基含有融合肽FP(hydrophobicfusion peptide)序列，帮助病毒与宿主细胞膜靠近并发生融合，类似的结构在SARS-CoV中同样存在^[8,9]。根据S基因序列结构(图1所示)，设计并合成引物，CoV-S-F(SEQ ID NO.4:

GACGATAAGGTACCAGGATCCATGAAGTGTACGTTGAAATCCT)和CoV-S-R (SEQ ID NO.5:gaattccaccacactggatccTCTGCCTGTGATCAACCTAT)，根据已有报道的病毒基因组序列(Genbank号MT407658.1)，人工合成了S蛋白的基因片段，并构建了pcDNA3.1-CoV-S质粒，以该质粒为模板，扩增包含RBD和FP区域的 S蛋白编码基因S(RBD-FP)。PCR扩增体系为：

使用以下PCR程序进行扩增：

PCR产物大小为2106bp。

PCR结果如图2所示，最右侧泳道为S(RBD-FP)基因的扩增结果。

(2)GPD-S(RBD-FP)-TU载体的构建

将S(RBD-FP)基因连接到实验室已构建的POT-GPD-TU载体上^[7]。 POT-GPD-TU载体经BamHI酶切线性化后与S(RBD-FP)基因连接，S(RBD-FP) 基因N端与Aga2连接并串联融合表达，基因C端带有载体上的His标签。利用无缝克隆试剂盒(C112-01,Vazyme)获得连接产物，并转化E.coli DH5α。大肠杆菌转化子经Amp抗性平板筛选，并用S基因检测引物(S-F331: aatattacaaacttgtgccct(SEQ ID NO.6)和S-R 524:aacagttgctggtgcatgtag(SEQ IDNO.7))进行PCR验证及测序。

结果如图3所示，PCR扩增产物大小为579bp，阳性转化子为No.1-8和9 号，选择其中2号和3号测序，与预期结果一致，表明GPD-S(RBD-FP)-TU质粒构建成功。

实施例2.新型冠状病毒酵母重组菌株ST1814G-S(RBD-FP)的构建及检测

(1)酵母转化片段的构建

用BsaI酶切载体GPD-S(RBD-FP)-TU，同时，BsmB I酶切同源臂质粒(URR1 和URR2)和选择性标记质粒(LEU)。参照Dai课题组的实验步骤^[6]，将URRs 同源臂、LEU选择性标签、GPD-S(RBD-FP)-TU转录单位，按照特异性前后缀序列进行拼接，T4连接酶16℃过夜连接，拼接产物(如图4)用于酵母转化。

(2)ST1814G-S(RBD-FP)重组酿酒酵母菌株的构建

①菌株活化：挑取ST1814G单菌落接种到3mL YPD液体培养基中，30℃、 220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按1：50的比例转接到5mL新鲜的YPD 培养基中，使其初始OD为0.1～0.2，30℃、220rpm培养至OD600为0.5～0.8。 2500rpm离心5min收集5mL菌液的菌体，并用1mL无菌水洗涤细胞，弃去上清。

②酵母转化：向离心后的菌体沉淀中加入100μL 0.1M的醋酸锂，重悬细胞，12000rpm离心20s弃去上清。加入50μL0.1M醋酸锂，重悬细胞，12000rpm 离心20s收集菌体。然后在离心管中依次加入240μL 50％的PEG4000、36μL 1M 醋酸锂、100μg鲑鱼精DNA、2μg片段DNA，剧烈震荡至完全混匀。30℃ 200rpm 30min，42℃ 25min，6000rpm离心15s收集菌体，去除转化液，加入1mL的 YPD液体培养基于30℃孵育2h，2500rpm离心5min收集菌体，用50μL去离子水重悬细胞，尽可能温和的吹吸混匀，将菌体涂布在SD-leu固体培养基表面，30℃培养箱生长2～3天，直至形成典型菌落。挑取单菌落在SD-leu平板划线纯化，同步接种至3mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm过夜培养，用于基因型验证。

③ST1814G-S(RBD-FP)菌株的基因型验证

选择在SD-leu培养基中生长的酵母，提取其基因组PCR验证S(RBD-FP)基因是否成功整合到基因组。酵母基因组的提取方法参照文献进行^[10]。取100μL 培养后的菌液6000rpm离心1min弃去上清，用100μL裂解液(200mM LiOAc,1％ SDS)重悬细胞，70℃孵育5min.加入300μL无水乙醇混匀，于15000g离心3 min收集细胞碎片。70％乙醇清洗后加入50-100μL ddH₂O重悬沉淀。15000g离心15s后吸取上清作为基因组模板进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：

使用以下PCR程序进行扩增：

以基因组DNA为模板进行PCR扩增，同时以质粒GPD-S(RBD-FP)-TU为阳性对照，ddH₂O为阴性对照。

实验结果如图5所示，质粒GPD-S(RBD-FP)-TU的2号和3号大肠杆菌转化子经酶切、连接后转化酵母细胞，虽二者均可在SD-leu的选择性培养基生长，但仅3号质粒可获得基因型正确的重组酵母菌株ST1814G-S(RBD-FP)。正确的重组酵母编号为No.1,No.4和No.6(图6)。

④ST1814G-S(RBD-FP)菌株的表型验证

由于GPD-S(RBD-FP)-TU载体插入片段S(RBD-FP)的C端带有His标签，利用Western blot抗His抗体检测目的基因S(RBD-FP)的表达情况，利用激光共聚焦显微镜观察蛋白展示情况。

Western Blot:

收集2mL 48h的YPD培养液，6000rpm离心1min收集菌体，加入酸洗玻璃珠，60μLPEB缓冲液重悬菌体，玻璃珠法破壁5次，加入15μL 5×SDS上样缓冲液，沸水浴5min，4℃下12000rpm离心10min，小心吸取上清，8μL上清用于12％SDS-PAGE电泳。

SDS-PAGE电泳结束后，通过湿转法将蛋白分离胶转移至与其同等大小的 PVDF膜上，转膜条件为300mA 100min；转膜完成后，在室温下，用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜1h；将膜完全浸没在用5％BSA 1:2000稀释的鼠抗His单克隆抗体(HT501,Transgene)中，4℃孵育过夜；回收一抗，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10min；用5％BSA 1:5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗(LK2003,Sungene Biotech)室温孵育1h；TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次；避光向PVDF膜正面滴加化学发光显色底物(34075,ThermoFisher)，通过Bio-rad 化学发光成像仪曝光，观察蛋白表达情况。

免疫荧光：

收取500μL诱导48h的ST1814G-S(RBD-FP)菌液，4000rpm，离心5min 收集菌体；取诱导48h后的ST1814G作为阴性对照；用500μL PBST洗涤菌体 3次，4000rpm，5min，弃上清；分别用200μL PBST 1:2000稀释的6*His-Tag 抗体重悬菌体，4℃旋转结合1h；回收一抗；500μL PBST洗涤菌体3次，同上离心弃上清；加入200μL PBST 1:5000稀释的FITC-标记的羊抗鼠二抗，37℃ 避光孵育30min，回收二抗；500μL PBST洗涤菌体3次，同上离心弃上清；用 50μL PBS重悬菌体，取10μL菌液滴于干净的载玻片上，盖上盖玻片，四周涂上指甲油固定盖玻片，在激光共聚焦显微镜下观察。

结果如图7所示，重组酵母菌株No.1,No.4和No.6均可表达S蛋白。S蛋白分子量理论值为78KDa，但实际观测结果为135KDa和23KDa两条带。S蛋白有多个糖基化位点，分子量增加考虑糖基化所致。分子量变小推测被蛋白酶切割所致。免疫荧光结果如图8所示，对照组ST1814G未出现荧光(图8上)；而实验组ST1814G-S(RBD-FP)则有明显绿色荧光出现(图8下)，说明S蛋白成功表达且定位在重组酿酒酵母细胞表面。

⑤ST1814G-S(RBD-FP)菌株的生长及蛋白表达规律

取ST1814G-S(RBD-FP)菌株4号转化子单菌落，接种于20mL YPD液体培养基中，间隔24h取样2mL进行OD₆₀₀测定，并以最初时间点菌量最低值为标准，调整菌体量一致，制备不同时间点的蛋白样品，进行Western blot检测。

结果如图9所示，从9-a图生长曲线分析，S(RBD-FP)蛋白截短体的表达对菌体的生长没有影响，菌体生长趋势与对照组一致，随培养时间的延长菌体量逐渐增加。同时，蛋白的表达量也随培养时间的延长而增加，培养5d时表达量最高(图9-b)。

实施例3.新型冠状病毒S蛋白重组酵母的制备

以ST1814G-S(RBD-FP)No.4号菌株为种子，取单菌落接种20mL YPD液体培养基，30℃培养过夜，再取过夜培养的种子液以1:100稀释接种至新鲜的 1L YPD液体培养基中，培养3-4d后离心收集菌体，PBS清洗一次，经抽真空冷冻干燥后制得重组菌株干粉。

实施例4.新型冠状病毒S蛋白酵母重组菌株的应用

SPF级BALB/c小鼠分为三组，每组6只，分别于第1、6、11和23天喂饲ST1814G-S(RBD-FP)No.4酵母菌株，10⁷cfu/只小鼠，以ST1814G空白酵母菌株为对照。第四次免疫后，眼球采血检测IgG和IgA抗体水平。

应用试验设计原核表达SARS-COV2 S蛋白RBD结构域，获得纯化蛋白，抗体制备，应用纯化的RBD蛋白，羊抗小鼠IgG、IgA-HRP酶结合物，间接ELISA 检测IgG和IgA水平。

结果如图10所示，喂食ST1814G-S(RBD-FP)No.4重组酵母组的血清中S 蛋白特异性的IgG(图10A)和IgA(图10B)的水平明显升高，表明重组酿酒酵母菌株可以很好的激发机体的体液免疫和粘膜免疫，可作为新型免疫防护制剂，为新型冠状病毒防控提供选择。

尽管本发明内容是结合上述实施例进行说明，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,本发明的范围由所附权利要求书限定，其他的任何在限定范围内所作的改变或修饰，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。

References:

[1].Meyerholz,D.K.,A.M.Lambertz and P.B.McCray,Dipeptidyl Peptidase 4Distribution in the Human Respiratory Tract.The American Journal of Pathology[J].2016.186(1):p.78-86.

[2].Zhou,P.,et al.,A pneumonia outbreak associated with a newcoronavirus of probable bat origin [J].Nature,2020.

[3].Ge,X.,et al.,Isolation and characterization of a bat SARS-likecoronavirus that uses the ACE2 receptor[J].Nature,2013.503(7477):p.535-538.

[4].Tian,X.,et al.,Potent binding of 2019 novel coronavirus spikeprotein by a SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody[J].EmergingMicrobes&Infections,2020.9(1):p. 382-385.

[5].Chen,W.and G.Georgiou,Cell-Surface display of heterologousproteins:From high- throughput screening to environmental applications[J].Biotechnology and Bioengineering,2002. 79(5):p.496-503.

[6].Guo,Y.,et al.,YeastFab:the design and construction of standardbiological parts for metabolic engineering in Saccharomyces cerevisiae[J].Nucleic Acids Research,2015.43(13):p.e88-e88

[7].黄金海.一种制备非洲猪瘟病毒P30、P54酵母疫苗的方法[P].中国专利:201911286530.6, 2019-12-13

[8].Yan,R.,et al.,Structural basis for the recognition of the SARS-CoV-2 by full-length human ACE2.Science(New York,N.Y.),2020:p.eabb2762.

[9].Song,W.,et al.,Cryo-EM structure of the SARS coronavirus spikeglycoprotein in complex with its host cell receptor ACE2.PLOS Pathogens,2018.14(8):p.e1007236.

[10].

M.,et al.,Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques,2011.50(5):p.325-328.

序列表

<110> 天津大学

<120> 表达新型冠状病毒S蛋白的口服重组酵母及其制备与应用

<130> 2020

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 702

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 1

Met Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln

1 5 10 15

Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro

20 25 30

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

35 40 45

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

50 55 60

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

65 70 75 80

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

85 90 95

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

100 105 110

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

115 120 125

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

130 135 140

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

145 150 155 160

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

165 170 175

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

180 185 190

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

195 200 205

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

210 215 220

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys

225 230 235 240

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu

245 250 255

Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala

260 265 270

Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp

275 280 285

Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr

290 295 300

Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr

305 310 315 320

Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg

325 330 335

Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu

340 345 350

Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile

355 360 365

Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg

370 375 380

Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser

385 390 395 400

Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile

405 410 415

Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser

420 425 430

Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser

435 440 445

Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln

450 455 460

Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr

465 470 475 480

Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile

485 490 495

Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser

500 505 510

Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val

515 520 525

Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly

530 535 540

Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu

545 550 555 560

Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr

565 570 575

Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala

580 585 590

Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe

595 600 605

Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu

610 615 620

Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu

625 630 635 640

Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln

645 650 655

Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe

660 665 670

Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys

675 680 685

Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg

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<210> 2

<211> 2106

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

atgaagtgta cgttgaaatc cttcactgta gaaaaaggaa tctatcaaac ttctaacttt 60

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 120

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 180

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 240

tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 300

tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 360

gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 420

aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 480

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 540

ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 600

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 660

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 720

gtcaatttca acttcaatgg tttaacaggc acaggtgttc ttactgagtc taacaaaaag 780

tttctgcctt tccaacaatt tggcagagac attgctgaca ctactgatgc tgtccgtgat 840

ccacagacac ttgagattct tgacattaca ccatgttctt ttggtggtgt cagtgttata 900

acaccaggaa caaatacttc taaccaggtt gctgttcttt atcaggatgt taactgcaca 960

gaagtccctg ttgctattca tgcagatcaa cttactccta cttggcgtgt ttattctaca 1020

ggttctaatg tttttcaaac acgtgcaggc tgtttaatag gggctgaaca tgtcaacaac 1080

tcatatgagt gtgacatacc cattggtgca ggtatatgcg ctagttatca gactcagact 1140

aattctcctc ggcgggcacg tagtgtagct agtcaatcca tcattgccta cactatgtca 1200

cttggtgcag aaaattcagt tgcttactct aataactcta ttgccatacc cacaaatttt 1260

actattagtg ttaccacaga aattctacca gtgtctatga ccaagacatc agtagattgt 1320

acaatgtaca tttgtggtga ttcaactgaa tgcagcaatc ttttgttgca atatggcagt 1380

ttttgtacac aattaaaccg tgctttaact ggaatagctg ttgaacaaga caaaaacacc 1440

caagaagttt ttgcacaagt caaacaaatt tacaaaacac caccaattaa agattttggt 1500

ggttttaatt tttcacaaat attaccagat ccatcaaaac caagcaagag gtcatttatt 1560

gaagatctac ttttcaayaa agtgacactt gcagatgctg gcttcatcaa acaatatggt 1620

gattgccttg gtgatattgc tgctagagac ctcatttgtg cacaaaagtt taacggcctt 1680

actgttttgc cacctttgct cacagatgaa atgattgctc aatacacttc tgcactgtta 1740

gcgggtacaa tcacttctgg ttggaccttt ggtgcaggtg ctgcattaca aataccattt 1800

gctatgcaaa tggcttatag gtttaatggt attggagtta cacagaatgt tctctatgag 1860

aaccaaaaat tgattgccaa ccaatttaat agtgctattg gcaaaattca agactcactt 1920

tcttccacag caagtgcact tggaaaactt caagatgtgg tcaaccaaaa tgcacaagct 1980

ttaaacacgc ttgttaaaca acttagctcc aattttggtg caatttcaag tgttttaaat 2040

gatatccttt cacgtcttga caaagttgag gctgaagtgc aaattgatag gttgatcaca 2100

ggcaga 2106

<210> 3

<211> 8449

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttagg 60

acggatcgct tgcctgtaac ttacacgcgc ctcgtatctt ttaatgatgg aataatttgg 120

gaatttactc tgtgtttatt tatttttatg ttttgtattt ggattttaga aagtaaataa 180

agaaggtaga agagttacgg aatgaagaaa aaaaaataaa caaaggttta aaaaatttca 240

acaaaaagcg tactttacat atatatttat tagacaagaa aagcagatta aatagatata 300

cattcgatta acgataagta aaatgtaaaa tcacaggatt ttcgtgtgtg gtcttctaca 360

cagacaagat gaaacaattc ggcattaata cctgagagca ggaagagcaa gataaaaggt 420

agtatttgtt ggcgatcccc ctagagtctt ttacatcttc ggaaaacaaa aactattttt 480

tctttaattt ctttttttac tttctatttt taatttatat atttatatta aaaaatttaa 540

attataatta tttttatagc acgtgatgaa aaggacccag gtggcacttt tcggggaaat 600

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 660

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 720

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 780

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 840

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 900

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 960

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 1020

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 1080

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1140

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1200

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1260

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1320

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1380

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtggtagtcg cggtatcatt 1440

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1500

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1560

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1620

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1680

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1740

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1800

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1860

agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1920

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1980

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 2040

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 2100

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2160

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2220

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2280

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2340

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2400

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2460

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata 2520

cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 2580

cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag 2640

gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 2700

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct 2760

cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg gccgcgaata ccccgggtcg 2820

agaggtctcg gttggcagtg actcggtctc tacctggctt cattatcaat actgccattt 2880

caaagaatac gtaaataatt aatagtagtg attttcctaa ctttatttag tcaaaaaatt 2940

agccttttaa ttctgctgta acccgtacat gcccaaaata gggggcgggt tacacagaat 3000

atataacatc gtaggtgtct gggtgaacag tttattcctg gcatccacta aatataatgg 3060

agcccgcttt ttaagctggc atccagaaaa aaaaagaatc ccagcaccaa aatattgttt 3120

tcttcaccaa ccatcagttc ataggtccat tctcttagcg caactacaga gaacaggggc 3180

acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat 3240

gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt atctatctca ttttcttaca ccttctatta 3300

ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa 3360

attattcccc tacttgacta ataagtatat aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt 3420

aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta cttttatagt tagtcttttt tttagtttta 3480

aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca cacataaaca aacaaagatg atgcagttac 3540

ttcgctgttt ttcaatattt tctgttattg cttcagtttt agcacaggaa ctgacaacta 3600

tatgcgagca aatcccctca ccaactttag aatcgacgcc gtactctttg tcaacgacta 3660

ctattttggc caacgggaag gcaatgcaag gagtttttga atattacaaa tcagtaacgt 3720

ttgtcagtaa ttgcggttct cacccctcaa caactagcaa aggcagcccc ataaacacac 3780

agtatgtttt taagcttctg caggctagtg gtggtggtgg ttctggtggt ggtggttctg 3840

gtggtggtgg ttctgctagc atgactggtg gacagcaaat gggtcgggat ctgtacgacg 3900

atgacgataa ggtaccagga tccatgaagt gtacgttgaa atccttcact gtagaaaaag 3960

gaatctatca aacttctaac tttagagtcc aaccaacaga atctattgtt agatttccta 4020

atattacaaa cttgtgccct tttggtgaag tttttaacgc caccagattt gcatctgttt 4080

atgcttggaa caggaagaga atcagcaact gtgttgctga ttattctgtc ctatataatt 4140

ccgcatcatt ttccactttt aagtgttatg gagtgtctcc tactaaatta aatgatctct 4200

gctttactaa tgtctatgca gattcatttg taattagagg tgatgaagtc agacaaatcg 4260

ctccagggca aactggaaag attgctgatt ataattataa attaccagat gattttacag 4320

gctgcgttat agcttggaat tctaacaatc ttgattctaa ggttggtggt aattataatt 4380

acctgtatag attgtttagg aagtctaatc tcaaaccttt tgagagagat atttcaactg 4440

aaatctatca ggccggtagc acaccttgta atggtgttga aggttttaat tgttactttc 4500

ctttacaatc atatggtttc caacccacta atggtgttgg ttaccaacca tacagagtag 4560

tagtactttc ttttgaactt ctacatgcac cagcaactgt ttgtggacct aaaaagtcta 4620

ctaatttggt taaaaacaaa tgtgtcaatt tcaacttcaa tggtttaaca ggcacaggtg 4680

ttcttactga gtctaacaaa aagtttctgc ctttccaaca atttggcaga gacattgctg 4740

acactactga tgctgtccgt gatccacaga cacttgagat tcttgacatt acaccatgtt 4800

cttttggtgg tgtcagtgtt ataacaccag gaacaaatac ttctaaccag gttgctgttc 4860

tttatcagga tgttaactgc acagaagtcc ctgttgctat tcatgcagat caacttactc 4920

ctacttggcg tgtttattct acaggttcta atgtttttca aacacgtgca ggctgtttaa 4980

taggggctga acatgtcaac aactcatatg agtgtgacat acccattggt gcaggtatat 5040

gcgctagtta tcagactcag actaattctc ctcggcgggc acgtagtgta gctagtcaat 5100

ccatcattgc ctacactatg tcacttggtg cagaaaattc agttgcttac tctaataact 5160

ctattgccat acccacaaat tttactatta gtgttaccac agaaattcta ccagtgtcta 5220

tgaccaagac atcagtagat tgtacaatgt acatttgtgg tgattcaact gaatgcagca 5280

atcttttgtt gcaatatggc agtttttgta cacaattaaa ccgtgcttta actggaatag 5340

ctgttgaaca agacaaaaac acccaagaag tttttgcaca agtcaaacaa atttacaaaa 5400

caccaccaat taaagatttt ggtggtttta atttttcaca aatattacca gatccatcaa 5460

aaccaagcaa gaggtcattt attgaagatc tacttttcaa yaaagtgaca cttgcagatg 5520

ctggcttcat caaacaatat ggtgattgcc ttggtgatat tgctgctaga gacctcattt 5580

gtgcacaaaa gtttaacggc cttactgttt tgccaccttt gctcacagat gaaatgattg 5640

ctcaatacac ttctgcactg ttagcgggta caatcacttc tggttggacc tttggtgcag 5700

gtgctgcatt acaaatacca tttgctatgc aaatggctta taggtttaat ggtattggag 5760

ttacacagaa tgttctctat gagaaccaaa aattgattgc caaccaattt aatagtgcta 5820

ttggcaaaat tcaagactca ctttcttcca cagcaagtgc acttggaaaa cttcaagatg 5880

tggtcaacca aaatgcacaa gctttaaaca cgcttgttaa acaacttagc tccaattttg 5940

gtgcaatttc aagtgtttta aatgatatcc tttcacgtct tgacaaagtt gaggctgaag 6000

tgcaaattga taggttgatc acaggcagag gatccagtgt ggtggaattc tgcagatatc 6060

cagcacagtg gcggccgctc gagtctagag ggcccttcga aggtaagcct atccctaacc 6120

ctctcctcgg cctcgattct acgcgtaccg gtcatcatca ccatcaccat tgatagccga 6180

atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat aaaaaaaata agtgtataca 6240

aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt attcttgagt aactctttcc 6300

tgtaggtcag gttgctttct caggtatagc atgaggtcgc tcttattgac cacacctcta 6360

ccggcctctg agagagaccc aagacactgc ggatcgagac cactagtacc ggtctgcagc 6420

gcgagggggg gcccggtgcc caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg 6480

gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 6540

gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 6600

tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta 6660

agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 6720

cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 6780

gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 6840

aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 6900

cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 6960

acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 7020

tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta 7080

acgtttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 7140

gcatagggta ataactgata taattaaatt gaagctctaa tttgtgagtt tagtatacat 7200

gcatttactt ataatacagt tttttagttt tgctggccgc atcttctcaa atatgcttcc 7260

cagcctgctt ttctgtaacg ttcaccctct accttagcat cccttccctt tgcaaatagt 7320

cctcttccaa caataataat gtcagatcct gtagacacca catcatccac ggttctatac 7380

tgttgaccca atgcgtcacc cttgtcatct aaacccacac cgggtgtcat aatcaaccaa 7440

tcgtaacctt catctcttcc acccatgtct ctttgagcaa taaagccgat aacaaaatct 7500

ttgtcgctct tcgcaatgtc aacagtaccc ttagtatatt ctccagtaga tagggagccc 7560

ttgcatgaca attctgctaa catcaaaagg cctctaggtt cctttgttac ttcttctgcc 7620

gcctgcttca aaccgctaac aatacctggg cccaccacac cgtgtgcatt cgtaatgtct 7680

gcccattctg ctattctgta tacacccgca gagtactgca atttgactgt attaccaatg 7740

tcagcaaatt ttctgtcttc gaagagtaaa aaattgtact tggcggataa tgcctttagc 7800

ggcttaactg tgccctccat ggaaaaatca gtcaagatat ccacatgtgt ttttagtaaa 7860

caaattttgg gacctaatgc ttcaactaac tccagtaatt ccttggtggt acgaacatcc 7920

aatgaagcac acaagtttgt ttgcttttcg tgcatgatat taaatagctt ggcagcaaca 7980

ggactaggat gagtagcagc acgttcctta tatgtagctt tcgacatgat ttatcttcgt 8040

ttcctgcagg tttttgttct gtgcagttgg gttaagaata ctgggcaatt tcatgtttct 8100

tcaacactac atatgcgtat atataccaat ctaagtctgt gctccttcct tcgttcttcc 8160

ttctgttcgg agattaccga atcaaaaaaa tttcaaagaa accgaaatca aaaaaaagaa 8220

taaaaaaaaa atgatgaatt gaattgaaaa gctgtggtat ggtgcactct cagtacaatc 8280

tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 8340

tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgacaat ctccgggagc 8400

tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagattaa 8449

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

gacgataagg taccaggatc catgaagtgt acgttgaaat cct 43

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

gaattccacc acactggatc ctctgcctgt gatcaaccta t 41

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

aatattacaa acttgtgccc t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 7

aacagttgct ggtgcatgta g 21

Claims

1.一种表达新型冠状病毒S蛋白的重组酵母，ST1814G-S(RBD-FP)，其包含S蛋白的16位至1035位氨基酸。

2.一种新型冠状病毒S蛋白的截断体，优选为第300至1000位氨基酸，序列特征为SEQID No.1，为包含第330位至521的RBD结构域和第816至833位FP融合肽。

3.表达权利要求2所述蛋白截断体的基因，其特征在于，包含刺突蛋白S的RBD结构域,即从第991位至1563位碱基和FP结构域，即从第2449位至2499位碱基，其核苷酸序列为SEQID No.2。

4.构建权利要求1所述重组酵母的质粒GPD-S(RBD-FP)-TU，序列特征为SEQ ID No.3，由权利要求3所述基因片段和POT-GPD-TU载体组成。

5.制备新型冠状病毒S蛋白重组酵母的方法，其特征在于，将体外构建的S蛋白截断体完整转录单位GPD-S(RBD-FP)-TU，通过同源重组整合于酵母基因组，利用Aga1-Aga2表面展示系统将S蛋白展示于酵母细胞表面，获得S蛋白表面展示型的重组酵母菌株ST1814G-S(RBD-FP)，并利用所得菌株制备口服重组酵母。

6.根据权利要求5所述制备新型冠状病毒S蛋白重组酵母的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)SARS-CoV-2刺突蛋白S编码基因的PCR扩增：参考SARS-CoV-2病毒基因序列NC_045512.2，合成S基因，序列特征为SEQ No.2；以pcDNA3.1-CoV-S质粒为模板，设计引物扩增S蛋白编码基因S(RBD-FP)用于酵母载体连接；

(2)Aga2基因与SARS-CoV-2刺突蛋白S编码序列S(RBD-FP)串联：通过BamHI单酶切线性化POT-GPD-TU载体，无缝克隆连接S基因片段至表面展示表达载体GPD-POT-TU上，获得重组质粒GPD-S(RBD-FP)-TU，其序列特征为SEQ No.3.重组质粒转化至E.coli DH5a中，用S基因检测引物进行PCR及测序验证，获得阳性克隆；

(3)S蛋白酵母重组菌株的构建：将重组质粒GPD-S(RBD-FP)-TU与同源臂URRs、筛选标签Leu编码序列进行酶切拼接，获得完整的包含S基因序列的重组基因，转化到酿酒酵母基因组，经营养缺陷型平板筛选后获得重组菌株，利用检测引物进行基因水平检测，Westernblot、免疫荧光进行蛋白表达水平验证。

7.新型冠状病毒S蛋白的重组酵母在制备用于抗新型冠状病毒药物中的应用。