BR102022006089A2 - Sequência nucleotídica quimérica, vetor de expressão em mamíferos, vacina de rna, proteína quimérica de fusão, uso na produção de vacina contra coronavírus - Google Patents

Abstract

A presente invenção pertence ao campo técnico da Biotecnologia. Mais especificamente, é descrita uma sequência nucleotídica quimérica, a correspondente proteína de fusão codificada, que compreende um poliepitopo resultante da seleção e justaposição de múltiplos epítopos de uma proteína de coronavírus para indução de resposta imune em mamíferos. Em uma concretização, referida proteína de fusão compreende: a) um primeiro peptídeo que consiste de epítopos presentes na sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab); b) um primeiro espaçador; c) uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1). Em uma concretização, a poliproteína da replicase é definida pela SEQ ID NO: 96 flanqueadas de um fragmento gD compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 98 na porção N-terminal e outro fragmento gD compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 100 na região C-terminal. O uso da proteína de fusão apresenta resultados surpreendentes para a indução de resposta imune celular e humoral contra coronavírus, SARS-CoV-2 e vírus relacionados.

Description

SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA QUIMÉRICA, VETOR DE EXPRESSÃO EM MAMÍFEROS, VACINA DE RNA, PROTEÍNA QUIMÉRICA DE FUSÃO, USO NA PRODUÇÃO DE VACINA CONTRA CORONAVÍRUS Campo da Invenção

[0001] A presente invenção pertence ao campo técnico da Biotecnologia. Mais especificamente, é descrita uma sequência nucleotídica quimérica, a correspondente proteína de fusão codificada, que compreende um poliepitopo resultante da seleção e justaposição de múltiplos epítopos de uma proteína de coronavírus para indução de resposta imune em mamíferos. Em uma concretização, referida proteína de fusão compreende: a) um primeiro peptídeo que consiste de epítopos presentes na sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab); b) um primeiro espaçador; c) uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1). Em uma concretização, a poliproteína da replicase é definida pela SEQ ID NO: 96 flanqueadas de um fragmento gD compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 98 na porção N-terminal e outro fragmento gD compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 100 na região C-terminal. O uso da proteína de fusão apresenta resultados surpreendentes para a indução de resposta imune celular e humoral contra coronavírus, SARS-CoV-2 e vírus relacionados.

Antecedentes da Invenção

[0002] A re-emergência do betacoronavírus SARS-CoV-2 resultou, até o momento, em mais de 107 milhões de infecções e mais de dois milhões de mortes no mundo (Amanat & Krammer, 2020). A rápida propagação desse vírus associada à alta taxa de morbidade, bem como a ausência de estratégias terapêuticas e/ou profiláticas confirmadas cientificamente reforçam a urgência do desenvolvimento de vacinas. O caráter pandêmico da COVID-19 impulsionou a corrida pelo desenvolvimento de tratamentos terapêuticos, de modo que dezenas de drogas e candidatos vacinais estão sendo testados no contexto clínico e pré-clínico (W.-H. Chen et al., 2020; Sun et al., 2020).

[0003] Os sintomas da COVID-19 podem variar de ausentes e leves até severos, e inclui febre, tosse seca, dispneia, mialgia, cansaço, leucopenia, chegando até pneumonia. O sistema imune do paciente contribui amplamente para o quadro. Em casos mais graves, um fenômeno chamado de cytokine storm, uma abrupta e intensa liberação de citocinas pró-inflamatórias (IFN-α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-18, IL-33, TNF-α, TGFβ) e quimiocinas (CCL2, CCL3, CCL5, CXCL8, CXCL9, CXCL10) resultam em um acúmulo de fluidos nos pulmões, falência múltipla e óbito (Li et al., 2020). O vírus causador da doença pertence à mesma família do MERS-CoV e SARS-CoV, sendo responsáveis por síndromes respiratórias agudas que se tornaram epidemias nas duas últimas décadas.

[0004] O SARS-CoV-2 pertence à família Coronaviridae, ordem Nidovirales, que é dividida em quatro gêneros (Alpha-, Beta-, Gama-, Delta-coronavirus), sendo a maioria destes vírus zoonóticos (Grifoni et al., 2020). Tratam-se de vírus envelopados com RNA fita simples de orientação positiva, e genomas entre 26 e 32 kb com 29,8 kb, o genoma de SARS-CoV-2 possui 14 ORFs (do inglês Open Reading Frame(s)) que codificam 27 proteínas. Na região 5’ ficam as ORFs orf1ab e orf1a em overlap que codificam duas poliproteínas que são processadas em 15 proteínas não estruturais (nsp1-nsp10 e nsp12-nsp16), e na região 3’ ficam as 4 proteínas estruturais (spike, envelope, membrana e nucleocapsídeo) e 8 proteínas acessórias (3a, 3b, p6, 7a, 7b, 8b, 9b, e orf14) (Wu et al., 2020), conforme mostra a Figura 1.

[0005] Ensaios de microscopia eletrônica revelaram que SARS-CoV e SARSCoV-2 apresentam grande similaridade e entram nas células usando o mesmo receptor, a enzima conversora de angiotensina (ACE2), ao qual a proteína glicosilada do spike se liga e sofre mudanças conformacionais irreversíveis antes de entrar na célula (Wrapp et al., 2020). A glicoproteína S de SARS-CoV 2 possui 77% de similaridade com a spike do SARS-CoV e é um alvo natural por seu papel crítico na ligação ao receptor e consequente fusão das membranas do vírus e do hospedeiro sendo, portanto, considerada o antígeno principal (Yuan et al., 2020).

[0006] A maioria das estratégias vacinais em desenvolvimento tem como alvo a proteína viral spike, a qual está presente na superfície do vírion e é responsável pela interação do vírus com o receptor celular ACE2, sendo, portanto, o principal alvo de anticorpos neutralizantes (Roper & Rehm, 2009). Entretanto, na resposta natural desenvolvida contra o coronavírus nem sempre há indução de anticorpos antígeno-específicos de longa duração. Estudos préclínicos com estratégias vacinais baseadas em SARS-CoV-1 inativado mostraram que, mesmo com a indução de anticorpos com capacidade neutralizante e protetora, parte dos animais imunizados apresentou complicações clínicas após o desafio, sendo relatado dano pulmonar com infiltração eosinofílica em camundongos e aumento da gravidade da doença em furão (Tseng et al., 2012; Weingartl et al., 2004). Dados epidemiológicos do surto de SARS-CoV-1 na China em 2005 sugerem que anticorpos neutralizantes de reação cruzada, detectáveis durante as primeiras duas semanas da doença, estavam correlacionados com altas taxas de mortalidade precoce pelo SARS (Yang et al., 2005). Estudos posteriores demonstraram que anticorpos gerados contra variantes da proteína S, tendem a aumentar a infecção de macrófagos humanos por um mecanismo conhecido por aumento da infecção mediado por anticorpo (ADE) (Wang et al., 2014). Esse fenômeno é a base patogênica do vírus da peritonite infecciosa felina (FIPV, um coronavírus tipo II) e a dengue grave (Tirado & Yoon, 2003).

[0007] Baseado em dados da literatura de dengue, sabe-se que quando a resposta vacinal é acompanhada da ativação de células T CD8+ , o efeito patogênico dos anticorpos é neutralizado (Zellweger et al., 2014). Além disso, de acordo com estudos prévios utilizando SARS-CoV-1, a transferência adotiva de células T CD8+ promove a redução da carga viral, recuperação clínica e proteção em condições experimentais (Zhao et al., 2010). Em pacientes convalescentes, foi possível detectar células T CD8+ e CD4+ de memória até quatro anos após a infecção primária, as quais foram responsivas à reestimulação in vitro, e resultaram na elevada produção de citocinas e moléculas com papel antiviral, como IFNγ, perforina e granzima B (H. Chen et al., 2005). Estes resultados evidenciam que as células T desempenham um papel crítico na mediação de proteção contra SARS-CoV-2.

[0008] Os linfócitos T citotóxicos (CTL) reconhecem antígenos como peptídeos curtos (geralmente com aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos de comprimento) apresentados por moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (Townsend & Bodmer, 1989). A caracterização desses fragmentos de antígenos, denominados determinantes de epítopos imunogênicos, tem permitido o desenho de estratégias de imunização baseadas no uso de vacinas que contenham esses segmentos (Berzofsky et al., 2001; Melief & Van Der Burg, 2008). Como um produto da tecnologia de DNA recombinante, foi possível o desenvolvimento de uma classe de novas biomoléculas com características quiméricas e propriedade multi-antígeno. Ao fundir geneticamente dois ou mais segmentos antigênicos de uma ou várias proteínas alvo, o produto obtido pode possuir os determinantes imunogênicos das distintas proteínas alvos originais. Desse modo, a fusão de diferentes epítopos provenientes de diferentes fontes pode induzir resposta imunológica específica multivalente contra diferentes patógenos/antígenos através de uma construção única, estratégia essa denominada vacina de poliepítopo ou multiepítopo. De maneira geral, estratégias vacinais que empregam esse método têm sido estudadas para o tratamento de doenças infecciosas e câncer. Existem alguns trabalhos que usam dessa estratégia para a criação de vacinas contra COVID-19. Entretanto, as estratégias desenvolvidas têm proteínas estruturais como alvo Kar et al., 2020; Naz et al., 2020; Oladipo et al., 2021; Safavi et al., 2020; Saha et al., 2021; Sohail et al., 2021; Tahir Ul Qamar et al., 2020).

[0009] A glicoproteína D (gD) tem a capacidade de interagir com o receptor HVEM (do inglês Herpes Virus Entry Mediator), que promove ativação de células do sistema imunológico de modo direto pela produção de NF-kB (Sciortino et al., 2008) ou, indiretamente, pelo bloqueio da ligação de BTLA (do inglês B and T Lymphocyte Attenuator) e CD160 a este receptor que resultaria em sinais co-inibitórios (Steinberg et al., 2011). É conhecida na técnica a utilização da fusão de antígenos à gD para o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra tumores induzidos pelo vírus papiloma humano (HPV) tanto na forma de vacina de DNA (Diniz et al., 2010; Diniz et al., 2013; Aps et al., 2015; Diniz et al., 2016) como na forma de vacina de proteína purificada (Porchia et al., 2011; Porchia et al., 2017), cujos resultados demonstram um aumento significativo na indução de linfócitos T CD8+ locais e sistêmicos específicos contra os antígenos tumorais geneticamente fusionados à gD

[0010] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:

[0011] O documento PI 0904880-4 revela a construção de dois plasmídeos, um contendo gene expressando a oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV-16) fusionada à glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1) e outro plasmídeo contendo o gene que expressa a interleucina-2, destinados ao controle de tumores.

[0012] O documento PI 1003749-7 revela uma proteína híbrida, formada pela fusão genética da oncoproteína E7 do vírus do papiloma humano tipo-16 (HPV16) com uma forma modificada da glicoproteína D do herpes simples tipo 1 com destino a ser adjuvante vacinal a outros antígenos e/ou como ingrediente ativo em composições farmacêuticas para o controle de tumores.

[0013] Os documentos US8962816 e US9724406 revelam proteínas quiméricas, nas quais um ou mais antígenos são introduzidos na região Cterminal de uma glicoproteína D (gD) de herpes simples tipo 1, com vistas a melhorar a resposta imune de um indivíduo ao antígeno de modo mais acentuada, quando comparada a proteína sem a fusão com gD. Estes documentos revelam possíveis aplicações para vacinas contra influenza, malária, câncer de colo de útero e HIV/AIDS.

[0014] A literatura científica que circunscreve a invenção, sem porém antecipála ou sugeri-la, inclui os documentos a seguir.

[0015] Amanat, F., & Krammer, F. (2020). Perspective SARS-CoV-2 Vaccines: Status Report. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2020.03.007

[0016] Aps, L. R., Diniz, M. O., Porchia, B. F., Sales, N. S., Moreno, A. C. R., & Ferreira, L. C. (2015). Bacillus subtilis spores as adjuvants for DNA vaccines. Vaccine, 33(20), 2328-2334. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.03.043

[0017] Berzofsky, J. A., Ahlers, J. D., & Belyakov, I. M. (2001). Strategies for designing and optimizing new generation vaccines. In Nature Reviews Immunology (Vol. 1, Issue 3, pp. 209–219). European Association for CardioThoracic Surgery. https://doi.org/10.1038/35105075

[0018] Chen, H., Hou, J., Jiang, X., Ma, S., Meng, M., Wang, B., Zhang, M., Zhang, M., Tang, X., Zhang, F., Wan, T., Li, N., Yu, Y., Hu, H., Yang, R., He, W., Wang, X., & Cao, X. (2005). Response of Memory CD8 + T Cells to Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Coronavirus in Recovered SARS Patients and Healthy Individuals. The Journal of Immunology, 175(1), 591–598. https://doi.org/10.4049/jimmunol.175.1.591

[0019] Chen, W.-H., Strych, U., Hotez, P. J., & Bottazzi, M. E. (2020). The SARS-CoV-2 Vaccine Pipeline: an Overview. Current Tropical Medicine Reports. https://doi.org/10.1007/s40475-020-00201-6

[0020] Diniz, M. O., Lasaro, M. O., Ertl, H. C., & Ferreira, L. C. (2010). Immune responses and therapeutic antitumor effects of an experimental DNA vaccine encoding human papillomavirus type 16 oncoproteins genetically fused to herpesvirus glycoprotein D. Clinical and Vaccine Immunology, 17(10), 1576- 1583. https://doi.org/10.1128/CVI.00264-10

[0021] Diniz, M. O., Cariri, F. A., Aps, L. R., & Ferreira, L. C. (2013). Enhanced therapeutic effects conferred by an experimental DNA vaccine targeting human papillomavirus-induced tumors. Human gene therapy, 24(10), 861-870. https://doi.org/10.1089/hum.2013.102

[0022] Diniz, M. O., Sales, N. S., Silva, J. R., & Ferreira, L. C. S. (2016). Protection against HPV-16–Associated Tumors Requires the Activation of CD8+ Effector Memory T Cells and the Control of Myeloid-Derived Suppressor Cells. Molecular cancer therapeutics, 15(8), 1920-1930. https://doi.org/10.1158/1535-7163

[0023] Dos Santos Franco, L., Oliveira Vidal, P., & Amorim, J. H. (2017). In silico design of a Zika virus non-structural protein 5 aiming vaccine protection against zika and dengue in different human populations. Journal of Biomedical Science, 24(1), 1–10. https://doi.org/10.1186/s12929-017-0395-z

[0024] Grifoni, A., Weiskopf, D., Ramirez, S. I., Mateus, J., Dan, J. M., Moderbacher, C. R., Rawlings, S. A., Sutherland, A., Premkumar, L., Jadi, R. S., Marrama, D., de Silva, A. M., Frazier, A., Carlin, A. F., Greenbaum, J. A., Peters, B., Krammer, F., Smith, D. M., Crotty, S., & Sette, A. (2020). Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell, 181(7), 1489-1501.e15. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.015

[0025] Kar, T., Narsaria, U., Basak, S., Deb, D., Castiglione, F., Mueller, D. M., & Srivastava, A. P. (2020). A candidate multi-epitope vaccine against SARSCoV-2. Scientific Reports, 10(1). https://doi.org/10.1038/s41598-020-67749-1

[0026] Li, X., Geng, M., Peng, Y., Meng, L., & Lu, S. (2020). Molecular immune pathogenesis and diagnosis of COVID-19. In Journal of Pharmaceutical Analysis (Vol. 10, Issue 2, pp. 102–108). Xi’an Jiaotong University. https://doi.org/10.1016/j.jpha.2020.03.001

[0027] Melief, C. J. M., & Van Der Burg, S. H. (2008). Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. In Nature Reviews Cancer (Vol. 8, Issue 5, pp. 351–360). Nat Rev Cancer. https://doi.org/10.1038/nrc2373

[0028] Naz, A., Shahid, F., Butt, T. T., Awan, F. M., Ali, A., & Malik, A. (2020). Designing Multi-Epitope Vaccines to Combat Emerging Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) by Employing Immuno-Informatics Approach. Frontiers in Immunology, 11, 1663. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01663

[0029] Porchia, B. F., Diniz, M. O., Cariri, F. A., Santana, V. C., Amorim, J. H., Balan, A., & Ferreira, L. C. S. (2011). Purified herpes simplex type 1 glycoprotein D (gD) genetically fused with the type 16 human papillomavirus E7 oncoprotein enhances antigen-specific CD8+ T cell responses and confers protective antitumor immunity. Molecular pharmaceutics, 8(6), 2320-2330. https://doi.org/10.1021/mp200194s

[0030] Porchia, B. F., Moreno, A. C. R., Ramos, R. N., Diniz, M. O., de Andrade, L. H. T., Rosa, D. S., ... & Ferreira, L. C. S. (2017). Herpes simplex virus glycoprotein D targets a specific dendritic cell subset and improves the performance of vaccines to human papillomavirus-associated tumors. Molecular cancer therapeutics, 16(9), 1922-1933. https://doi.org/10.1158/1535-7163

[0031] Oladipo, E. K., Ajayi, A. F., Onile, O. S., Ariyo, O. E., Jimah, E. M., Ezediuno, L. O., Adebayo, O. I., Adebayo, E. T., Odeyemi, A. N., Oyeleke, M. O., Oyewole, M. P., Oguntomi, A. S., Akindiya, O. E., Aremu, V. O., Aboderin, D. O., & Oloke, J. K. (2021). Designing a conserved peptide-based subunit vaccine against SARS-CoV-2 using immunoinformatics approach. In Silico Pharmacology, 9(1). https://doi.org/10.1007/s40203-020-00062-x

[0032] Roper, R. L., & Rehm, K. E. (2009). SARS vaccines: where are we? Expert Review of Vaccines, 8(7), 887–898. https://doi.org/10.1586/erv.09.43

[0033] Safavi, A., Kefayat, A., Mahdevar, E., Abiri, A., & Ghahremani, F. (2020). Exploring the out of sight antigens of SARS-CoV-2 to design a candidate multi-epitope vaccine by utilizing immunoinformatics approaches. Vaccine, 38(48), 7612–7628. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2020.10.016

[0034] Saha, R., Ghosh, P., & Burra, V. L. S. P. (2021). Designing a next generation multi-epitope based peptide vaccine candidate against SARS-CoV-2 using computational approaches. 3 Biotech, 11(2), 47. https://doi.org/10.1007/s13205-020-02574-x

[0035] Sciortino, M. T., Medici, M. A., Marino-Merlo, F., Zaccaria, D., GiuffrèCuculletto, M., Venuti, A., Grelli, S., & Mastino, A. (2008). Involvement of HVEM receptor in activation of nuclear factor κB by herpes simplex virus 1 glycoprotein D. Cellular Microbiology, 10(11), 2297–2311. https://doi.org/10.1111/j.1462- 5822.2008.01212.x

[0036] Sohail, M. S., Ahmed, S. F., Quadeer, A. A., & McKay, M. R. (2021). In silico T cell epitope identification for SARS-CoV-2: Progress and perspectives. In Advanced Drug Delivery Reviews (Vol. 171, pp. 29–47). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.addr.2021.01.007

[0037] Steinberg, M. W., Cheung, T. C., & Ware, C. F. (2011). The signaling networks of the herpesvirus entry mediator (TNFRSF14) in immune regulation. Immunological Reviews, 244(1), 169–187. https://doi.org/10.1111/j.1600- 065X.2011.01064.x

[0038] Sun, K., Chen, J., & Viboud, C. (2020). Early epidemiological analysis of the coronavirus disease 2019 outbreak based on crowdsourced data: a population-level observational study. The Lancet Digital Health, 2(4), e201– e208. https://doi.org/10.1016/S2589-7500(20)30026-1

[0039] Tahir Ul Qamar, M., Shahid, F., Aslam, S., Ashfaq, U. A., Aslam, S., Fatima, I., Fareed, M. M., Zohaib, A., & Chen, L. L. (2020). Reverse vaccinology assisted designing of multiepitope-based subunit vaccine against SARS-CoV-2. Infectious Diseases of Poverty, 9(1). https://doi.org/10.1186/s40249-020-00752- w

[0040] Tirado, S. M. C., & Yoon, K. J. (2003). Antibody-dependent enhancement of virus infection and disease. Viral Immunology, 16(1), 69–86. https://doi.org/10.1089/088282403763635465

[0041] Townsend, A., & Bodmer, H. (1989). Antigen recognition by class Irestricted T lymphocytes. In Annual Review of Immunology (Vol. 7, pp. 601– 624). Annu Rev Immunol. https://doi.org/10.1146/annurev.iy.07.040189.003125

[0042] Tseng, C.-T., Sbrana, E., Iwata-Yoshikawa, N., Newman, P. C., Garron, T., Atmar, R. L., Peters, C. J., & Couch, R. B. (2012). Immunization with SARS Coronavirus Vaccines Leads to Pulmonary Immunopathology on Challenge with the SARS Virus. PLoS ONE, 7(4), e35421. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035421

[0043] Wang, S. F., Tseng, S. P., Yen, C. H., Yang, J. Y., Tsao, C. H., Shen, C. W., Chen, K. H., Liu, F. T., Liu, W. T., Chen, Y. M. A., & Huang, J. C. (2014). Antibody-dependent SARS coronavirus infection is mediated by antibodies against spike proteins. Biochemical and Biophysical Research Communications, 451(2), 208–214. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.07.090

[0044] Weingartl, H., Czub, M., Czub, S., Neufeld, J., Marszal, P., Gren, J., Smith, G., Jones, S., Proulx, R., Deschambault, Y., Grudeski, E., Andonov, A., He, R., Li, Y., Copps, J., Grolla, A., Dick, D., Berry, J., Ganske, S., … Cao, J. (2004). Immunization with Modified Vaccinia Virus Ankara-Based Recombinant Vaccine against Severe Acute Respiratory Syndrome Is Associated with Enhanced Hepatitis in Ferrets. Journal of Virology, 78(22), 12672–12676. https://doi.org/10.1128/JVI.78.22.12672-12676.2004

[0045] Wrapp, D., Wang, N., Corbett, K. S., Goldsmith, J. A., Hsieh, C. L., Abiona, O., Graham, B. S., & McLellan, J. S. (2020). Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. In bioRxiv. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.02.11.944462

[0046] Wu, F., Zhao, S., Yu, B., Chen, Y. M., Wang, W., Song, Z. G., Hu, Y., Tao, Z. W., Tian, J. H., Pei, Y. Y., Yuan, M. L., Zhang, Y. L., Dai, F. H., Liu, Y., Wang, Q. M., Zheng, J. J., Xu, L., Holmes, E. C., & Zhang, Y. Z. (2020). A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, 579(7798), 265–269. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2008-3

[0047] Yang, Z. Y., Werner, H. C., Kong, W. P., Leung, K., Traggiai, E., Lanzavecchia, A., & Nabel, G. J. (2005). Evasion of antibody neutralization in emerging severe acute respiratory syndrome coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(3), 797– 801. https://doi.org/10.1073/pnas.0409065102

[0048] Yuan, M., Wu, N. C., Zhu, X., Lee, C. C. D., So, R. T. Y., Lv, H., Mok, C. K. P., & Wilson, I. A. (2020). A highly conserved cryptic epitope in the receptor binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science, 368(6491), 630– 633. https://doi.org/10.1126/science.abb7269

[0049] Zellweger, R. M., Eddy, W. E., Tang, W. W., Miller, R., & Shresta, S. (2014). CD8 + T Cells Prevent Antigen-Induced Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Disease in Mice. The Journal of Immunology, 193(8), 4117–4124. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1401597

[0050] Zhao, J., Zhao, J., & Perlman, S. (2010). T cell responses are required for protection from clinical disease and for virus clearance in severe acute respiratory syndrome coronavirus-infected mice. Journal of Virology, 84(18), 9318–9325. https://doi.org/10.1128/JVI.01049-10

[0051] Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui, aos olhos dos inventores, aplicação industrial, novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica. É um dos objetivos da presente invenção proporcionar uma vacina alternativa e/ou uma alternativa para a obtenção de vacinas contra Coronavírus, SARSCoV-2 ou COVID-19 e vírus relacionados.

Sumário da Invenção

[0052] A presente invenção provê uma sequência polipeptídica quimérica que compreende um poliepitopo resultante da seleção e justaposição de múltiplos epítopos de uma proteína de coronavírus, para indução de resposta imune em mamíferos.

[0053] As sequências nucleotídicas de DNA ou RNA codificadoras do referido polipeptídeo são também objeto da invenção, assim como os vetores de expressão em mamíferos que compreendem as referidas sequências nucleotídicas.

[0054] A presente invenção provê uma vacina alternativa e/ou uma alternativa para a obtenção de vacinas indutora de imunidade celular e/ou humoral contra Coronavírus, SARS-CoV-2 ou COVID-19 e vírus relacionados. Em uma concretização, tendo como elementos antigênicos as proteínas não estruturais do vírus.

[0055] Em uma concretização, a presente invenção proporciona uma vacina para induzir uma resposta imunológica combinada de células T CD8+ produtoras de moléculas antivirais em adição à resposta humoral contra SARSCoV-2.

[0056] O uso in vivo da presente invenção proporciona surpreendente potencial para promover a redução da carga viral, recuperação clínica e proteção contra Coronavírus, SARS-CoV-2 ou COVID-19 e vírus relacionados, entre outras vantagens.

[0057] Em uma concretização, os elementos ou alvos antigênicos da vacina da invenção se encontram nas proteínas não-estruturais codificadas pela ORF1ab da cepa brasileira de SARS-CoV-2, em contraste às tecnologias já existentes na técnica que focam principalmente na proteína Spike (proteína S) do vírus.

[0058] Em uma concretização, a presente invenção proporciona a associação dos epítopos imunogênicos dessas regiões comparando com os HLAs (sistema antígeno leucocitário humano) mais frequentes na população humana brasileira, sendo eles: C*02:02, A*32:01, A*68:02, A*01:01, B*08:01, A*65:02, B*51:01, B*35:01; onde cada alelo é frequente em pelo menos 3% da população do Brasil. Em outras concretizações, a associação dos epítopos imunogênicos é comparada com HLAs de grupos étnicos específicos e personalizada a diferentes populações.

[0059] Em uma concretização, são utilizados separadores, preferencialmente definidos pela sequência de aminoácidos definido pela SEQ ID NO: 94 adicionados entre os peptídeos. Dentre outras razões, estes separadores podem facilitar a estruturação do antígeno após a tradução intracelular na expressão e/ou facilitar o processamento do antígeno.

[0060] Em uma concretização, a sequência que contém o multiepítopo está inserida na sequência da glicoproteína D (gD) do herpes vírus. A gD, entre outras vantagens, apresenta efeito adjuvante para a ativação de linfócitos T, relacionado à sua capacidade de interação com receptor HVEM (do inglês Herpes Vírus Entry Mediator) que promove ativação de células do sistema imunológico.

[0061] A presente invenção apresenta os seguintes objetos:

[0062] Em um primeiro objeto, a presente invenção proporciona uma sequência nucleotídica quimérica compreendendo as sequências codificantes, em fase, de uma pluralidade de epítopos de uma proteína de coronavirus.

[0063] Em uma concretização, a referida proteína de coronavirus é uma proteína não estrutural do vírus, como a proteína da replicase 1ab. Em uma concretização, as sequências codificantes de múltiplos epítopos da replicase 1ab são alinhadas em fase, de forma que o produto codificado é uma proteína quimérica de um poliepitopo de replicase 1ab.

[0064] Em uma concretização, a referida sequência nucleotídica adicionalmente compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).

[0065] Em uma concretização, a referida sequência nucleotídica adicionalmente compreende uma sequência nucleotídica codificante de um primeiro polipeptídeo espaçador.

[0066] Em uma concretização, a referida sequência nucleotídica compreende:

• a) uma sequência nucleotídica que codifica um primeiro peptídeo compreendendo epítopos presentes na sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab);
• b) uma sequência nucleotídica codificante de um primeiro polipeptídeo espaçador; e
• c) uma sequência nucleotídica que codifica uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).

[0067] Em uma concretização, a sequência nucleotídica codificadora do poliepitopo compreende uma combinação, em fase, das sequências nucleotídicas selecionadas dentre SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91.

[0068] Em uma concretização a sequência nucleotídica codificadora do poliepitopo é definida pela SEQ ID NO: 95.

[0069] Em uma concretização a sequência nucleotídica codificadora da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1) é definida pela SEQ ID NO: 97 e/ou SEQ ID NO: 99.

[0070] Em um segundo objeto, é provido um vetor de expressão compreendendo:

• - a sequência nucleotídica quimérica codificadora do poliepitopo, referida acima; e
• - um ou mais promotores de expressão funcionalmente ligados à referida sequência nucleotídica.

[0071] Em uma concretização, a sequência polipeptídica do poliepitopo compreende uma combinação das sequências polipeptídicas selecionadas dentre as SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92.

[0072] Em um terceiro objeto, é provida uma vacina de RNA compreendendo uma sequência de RNA que codifica o poliepitopo referido acima.

[0073] Em uma concretização a referida sequência de RNA compreende uma combinação das sequências de RNA selecionadas dentre SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 158. Em uma concretização, a referida sequência de RNA adicionalmente compreende a SEQ ID NO: 105 Em uma concretização, a referida sequência de RNA adicionalmente compreende a SEQ ID NO: 161 e/ou SEQ ID NO: 162.

[0074] Em um quarto objeto, a presente invenção proporciona uma sequência polipeptídica quimérica compreendendo uma pluralidade de epítopos de uma proteína de coronavirus.

[0075] Em uma concretização, a referida proteína de coronavirus é uma proteína não estrutural do vírus, como a proteína da replicase 1ab. Em uma concretização, múltiplos epítopos da replicase 1ab são alinhados, formando uma proteína quimérica de um poliepitopo de replicase 1ab.

[0076] Em uma concretização, a referida sequência polipeptídica adicionalmente compreende uma sequência polipeptídica de uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).

[0077] Em uma concretização, a referida sequência polipeptídica adicionalmente compreende uma sequência de um primeiro polipeptídeo espaçador.

[0078] Em uma concretização, a proteína quimérica de fusão compreende:

• a) um primeiro peptídeo que consiste em epítopos presentes na sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab);
• b) um primeiro espaçador; e
• c) forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1)

[0079] Em uma concretização, a sequência peptídica compreendendo o poliepitopo é definida pela SEQ ID NO: 96.

[0080] Em uma concretização, a sequência peptídica da forma modificada da gD é definida pela SEQ ID NO: 98 e/ou SEQ ID NO: 100.

[0081] Como um quinto objeto é provido o uso da sequência nucleotídica quimérica, da sequência quimérica de RNA ou da proteína de fusão, para a preparação de uma vacina contra coronavírus, Sars-CoV-2 e/ou vírus relacionados.

[0082] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e serão descritos detalhadamente a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0083] São apresentadas as seguintes figuras:

[0084] A figura 1 revela a organização do genoma de SARS-CoV-2 mostrando a disposição das ORFs (Do inglês Open Reading Frame) e a distribuição das proteínas estruturais e não estruturais (Wu et al., 2020).

[0085] A figura 2 mostra a) um esquema da estrutura gênica de Sars-CoV-2 e b) os alelos alvos de duas regiões: NSa e NSb.

[0086] A figura 3 mostra a análise da expressão in vitro dos antígenos vacinais. Após 36 horas da transfecção com cada plasmídeo vacinal, as células foram submetidas à imunodetecção da proteína gD. Em (a) foi realizado análise por citometria de fluxo. Em (b), após a fixação da monocamada de células na placa, foi feita a imunofluorescência com anticorpo contra a glicoproteína D, onde em verde está marcando as células positivas para a expressão do antígeno recombinante codificado pelas vacinas de DNA e em azul o núcleo das células, como aumento de 20x ou 40x.

[0087] A figura 4 mostra a avaliação da resposta celular induzida pelas vacinas de DNA associadas à eletroporação por ICS. Camundongos C57BL/6 com 5-6 semanas receberam duas doses intramuscular das vacinas (50ug pgDPOLIEP, 50ug NSA + 50ugNSB ou 50ug de pcDNA3.1) juntamente com a eletroporação, havendo duas semanas entre as aplicações. Duas semanas após a última dose, os animais foram eutanasiados e as células do baço foram usadas para estimulo ex vivo com peptídeos do SARS-CoV-2 para avaliação de funcionalidade (a). A subpopulação de linfócitos T CD8 (CD3+CD8+ ) que experienciaram o encontro com o antígeno in vivo (CD49d+CD11ahi), foram avaliadas para frequência relativa de células produtoras de IFNγ (a), TNF (b) e IFNγ+TNF (c), bem como a contagem absoluta das células produtoras de IFNγ (d), TNF (e) e IFNγ+TNF (f). Os dados representam a média ± SEM e teste de Mann-Whitney unicaudal, onde *p<0.05 ∗∗p < 0.01, ∗∗∗p < 0.001, ∗∗∗∗p < 0.0001.

[0088] A figura 5 mostra a avaliação da resposta celular induzida pelas vacinas de DNA associadas a eletroporação por ELISPOT. Camundongos C57BL/6 com 5-6 semanas receberam duas doses intramuscular das vacinas (50ug pgDPOLIEP, 50ug NSA + 50ugNSB ou 50ug de pcDNA3.1) juntamente com a eletroporação, havendo duas semanas entre as aplicações. Duas semanas após a última dose, os animais foram eutanasiados e as células do baço foram usadas para estímulo ex vivo com peptídeos do SARS-CoV-2 para avaliação da produção de IFN-γ. Os dados representam a média ± SEM e teste de MannWhitney unicaudal, onde *p<0.05 ∗∗p < 0.01, ∗∗∗∗p < 0.0001.

[0089] A figura 6 mostra uma representação esquemática de uma concretização da invenção, na qual: em A) é mostrada esquematicamente uma concretização de sequência polipeptídica quimérica da invenção (POLIEP) que compreende as sequências polipeptídicas de um poliepitopo de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92; em B) é mostrada a sequência nucleotídica quimérica da invenção na concretização em que compreende as SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 e duas sequencias nucleotídicas de fragmentos da gD, uma em 5´e outra a 3´, sequências estas ligadas funcionalmente em um vetor de expressão plasmidial (pgDPOLIEP) que funciona como vacina de DNA e compreende um promotor CMV; em C) é mostrada esquematicamente uma concretização de sequência polipeptídica quimérica da invenção (gDPOLIEP) que compreende as sequências polipeptídicas de um poliepitopo de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 flanqueadas de um fragmento gD compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 98 na porção N-terminal e outro fragmento gD compreendendo a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 100 na região C-terminal

Descrição Detalhada da Invenção

[0090] A presente invenção provê uma vacina alternativa e/ou uma alternativa para a obtenção de vacinas indutora de imunidade celular e/ou humoral contra Coronavírus, SARS-CoV-2 ou COVID-19 e vírus relacionados.

[0091] A presente invenção provê sequência nucleotídica quimérica compreendendo as sequências codificantes, em fase, de uma pluralidade de epítopos de uma proteína de coronavírus, e/ou do polipeptídeo químérico de fusão

[0092] Em uma concretização, a referida proteína de coronavírus é uma proteína não estrutural do vírus, como a proteína da replicase 1ab. Em uma concretização, as sequências codificantes de múltiplos epítopos da replicase 1ab são alinhadas em fase. O produto codificado é uma proteína quimérica de um poliepítopo de replicase 1ab.

[0093] Em uma concretização, a sequência nucleotídica codificadora do poliepitopo compreende uma combinação, em fase, das sequências nucleotídicas selecionadas dentre SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91

[0094] Em uma concretização, a sequência nucleotídica codificadora do poliepitopo é definida pela SEQ ID NO: 95.

[0095] Em uma concretização, a referida sequência nucleotídica adicionalmente compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).

[0096] Em uma concretização a sequência nucleotídica codificadora da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1) é definida pela SEQ ID NO: 97 e/ou SEQ ID NO: 99.

[0097] Em uma concretização, a referida sequência nucleotídica adicionalmente compreende uma sequência nucleotídica codificante de um primeiro polipeptídeo espaçador.

[0098] Em uma concretização, a referida sequência nucleotídica quimérica compreende:

• a) uma sequência nucleotídica que codifica um primeiro peptídeo compreendendo epítopos presentes na sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab);
• b) uma sequência nucleotídica codificante de um primeiro polipeptídeo espaçador; e
• c) uma sequência nucleotídica que codifica uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).

[0099] Em uma concretização, a referida sequência nucleotídica quimérica é definida pela SEQ ID NO: 101.

[0100] Um vetor de expressão em mamíferos, compreendendo a referida sequência nucleotídica quimérica também integra os objetos da invenção.

[0101] Em uma concretização, referido vetor de expressão é uma vacina de DNA para induzir imunidade celular e humoral, tendo como alvos antigênicos as proteínas não estruturais do vírus, proporcionando a indução de uma resposta imunológica combinada de células T CD8+ produtoras de moléculas antivirais em adição à resposta humoral contra SARS-CoV-2.

[0102] Em uma concretização, o uso da invenção proporciona surpreendente promoção da redução da carga viral, recuperação clínica e proteção contra Coronavírus, SARS-CoV-2 ou COVID-19 e vírus relacionados.

[0103] Em uma concretização, os antígenos de Sars-Cov2 referidos foram fusionados geneticamente a outra proteína viral, a glicoproteina D (gD) do Herpes Virus Simples tipo 1 (HSV-1). Esta fusão apresentou aumento da imunogenicidade dos antígenos dos antígenos. A gD apresentou efeito adjuvante para a ativação de linfócitos T.

[0104] A presente invenção provê uma vacina de RNA compreendendo uma sequência de RNA que codifica uma pluralidade de epítopos de uma proteína não estrutural de coronavirus.

[0105] Em uma concretização, a referida vacina compreende as sequências codificantes de múltiplos epítopos da replicase 1ab alinhadas em fase.

[0106] Em uma concretização, a referida vacina compreende uma combinação das sequências de RNA selecionadas dentre SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 158.

[0107] A presente invenção provê uma proteína quimérica de fusão compreendendo uma pluralidade de epítopos de uma proteína não estrutural de coronavirus.

[0108] A presente invenção provê uma proteína quimérica de fusão compreendendo uma combinação das sequências peptídicas da replicase 1ab selecionadas dentre SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92.

[0109] Em uma concretização, a dita proteína quimérica de fusão compreende a SEQ ID NO: 96.

[0110] Em uma concretização, a dita proteína quimérica de fusão compreende adicionalmente compreender uma sequência polipeptídica de uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).

[0111] Em uma concretização, a dita a sequência polipeptídica da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1) é definida pela pela SEQ ID NO: 98 e/ou SEQ ID NO: 100.

[0112] Em uma concretização, a dita proteína quimérica de fusão adicionalmente compreende uma sequência de um primeiro polipeptídeo espaçador, preferencialmente definido pela SEQ ID NO: 94.

[0113] Em uma concretização, a dita proteína de fusão compreende:

• a) um primeiro peptídeo que consiste em epítopos presentes na sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab);
• b) um primeiro espaçador;
• c) forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).

[0114] Em uma concretização, o primeiro peptídeo consiste em epítopos presentes na sequência de aminoácidos das regiões NSa conforme definido na SEQ ID NO: 110 e/ou NSb conforme definido na SEQ ID NO: 112 na PR1ab.

[0115] Em uma concretização, espaçador consistir na sequência de aminoácidos GGGS conforme definido na SEQ ID NO: 94.

[0116] Em uma concretização, a invenção proporciona um vetor compreendendo as sequências codificantes da proteína de fusão definida acima. Em uma concretização, o dito vetor compreende adicionalmente uma região promotora e sequência de Kozak, em que o promotor é preferencialmente CMV e o dito vetor é pcDNA3.1.

[0117] OS resultados mostrados neste pedido de patente demonstram que, surpreendentemente, camundongos que receberam a vacina da invenção, na concretização de DNA pgDPOLIEP, exibiram as células T CD8+ com um fenótipo Th1 dominante uma vez estimulado com peptídeos (pep), com números significativamente maiores de células produtoras de IFNγ-, TNF- e IL2., em comparação com as outras vacinas de DNA contendo a porção NSA e NSB ou o vetor pcDNA3.1.

[0118] A vacina da invenção na concretização compreendendo as sequências nucleotidicas quimérica codificantes da proteína de fusão (denominada pgDPOLIEP) induziu a maior produção de IFNγ quando comparada com as formulações onde foi administrado o pgDNSA + pgDNSB ou o vetor vacinal vazio pDNA3.1. Em conjunto, os resultados demonstram que a pgDPOLIEP é imunogênica capaz de induzir resposta imune do tipo celular pela indução de linfócitos T CD8+ produtores de IFNγ e TNF.

Exemplos

[0119] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Exemplo 1 - Construção da vacina pgDPOLIEP

[0120] Para a escolha das sequências alvo dentro das proteínas não estruturais do Covid19, realizou-se uma análise associativa entre os epítopos preditos e as moléculas de HLA tipo I, mais frequentes na população Brasil. Para as mesmas regiões escolhidas, foram preditas os epítopos ligantes do MHC H-2Kb (C57BL/6). A frequência alélica da classe I do HLA, na população brasileira, foi recuperada do banco de dados NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/ihwg.cgi). Alelos frequentes em pelo menos 3% da população brasileira foram selecionados (HLA: C*02:02, A*32:01, A*68:02, A*01:01, B*08:01, A*65:02, B*51:01, B*35:01) (Dos Santos Franco et al., 2017). Os epítopos dentro da sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab) foram previstos usando o recurso de análise IEDB (Immune epitope database) (http://tools.immuneepitope.org/mhci/), de acordo com o método recomendado. Os epítopos preditos dentro da PR1ab foram classificados pelo seu valor percentual e para cada molécula de HLA considerada, foram selecionados os 5 melhores com um percentil inferior a 0.5. Foram considerados epítopos com 8, 9, 10 e 11 aminoácidos de comprimento para HLA de Classe I.

[0121] Após a análise associativa, foram selecionadas duas regiões na PR1ab que concentram a maioria das sequências alvo para humanos e camundongos (NSa e NSb). A sequência nucleotídica codificante de ambas as regiões, bem como a dos peptídeos preditos em sequência e ligados pela sequência codificante dos aminoácidos GGGS, foi inserida no vetor vacinal pcDNA3.1 em fusão com a glicoproteína D (gD) do herpes vírus, com a adição da sequência de Kozak e sob o controle do promotor CMV. Os três plasmídeos (pCovid_NSa, pCovid_NSb e pCovid_Poliept), compreendendo, respectivamente, a Seq ID 1, 2 e 3, bem como os respectivos peptídeos codificados (purificados por HPLC de fase reversa com ≥ 95% de pureza), foram sintetizados e obtidos comercialmente (Genscript) Figura 2 e Tabela 1.

Exemplo 2 - Avaliação da expressão da gDPOLIEP in vitro

[0122] Os plasmídeos vacinais foram validados mediante transfecção em células eucarióticas seguida de imunodetecção das proteínas alvo. Para isso, células HEK293-T foram cultivadas (DMEM+10% SFB) em placas de 24 poços (10x5 células/poço) por 24 horas (37 ºC, 5% CO2). Após atingir confluência de 70-80%, as células foram transfectadas com os plasmídeos recombinantes (pgDNSA, pgDNSB e pgDPOLIEP) ou controles (pCDNA3.1) utilizando o Kit Lipofectamine 2000 (ThermoFisher), de acordo as instruções do fabricante. Transcorridas 24-48 horas de transfecção, as células foram tripsinizadas, lavadas com solução PBS (2 vezes) e fixadas/permeabilizadas com tampão Cytofix (BD Biosciences) de acordo as instruções do fabricante. Após novo ciclo de lavagem, as células foram incubadas (30 min em gelo) com anticorpo monoclonal anti-gD, previamente diluídos. Após ciclo de lavagem, as células foram incubadas com anticorpo anti-IgG de camundongo/humano conjugado ao fluorocromo AlexaFluor 488 (Invitrogen) por 30 min em gelo. Após novo ciclo de lavagem as células foram ressuspendidas em PBS + 2% SFB e avaliadas por citometria de fluxo em equipamento BD LSRFortessaTM (BD Biosciences). Os dados obtidos foram analisados em software FlowJo v.10 (TreeStar, OR, USA). Como demonstrado na figura 3a, a partir da imunodetecção da gD foi possível determinar a expressão in vitro do antígeno vacinal gDPOLIEP, visto o aumento na frequência de células marcadas como positivas para expressão da gD.

[0123] A detecção da expressão das proteínas alvo em células transfectadas foi avaliada também pela técnica de imunofluorescência. Para isso, as células transfectadas conforme descrito acima foram diretamente fixadas com solução de paraformaldeído (PFA) a 4 % em PBS (300 µl/poço) por 15 minutos, em temperatura ambiente (TA). Após fixação, as células foram permeabilizadas com solução de Triton X-100 a 0,1 % em PBS (300 µl/poço) por 10 minutos a TA. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS e bloqueadas com solução de BSA 2% em PBS (30 min., TA). Após etapa de bloqueio, foram adicionados aos poços o mAb anti-gD ou soro hiperimune, diluídos previamente em solução de bloqueio (200 µl/poço). Transcorrido 1 hora, os poços foram lavados (3 vezes) com PBS, as células foram incubadas (45 min., TA) com anticorpo anti-IgG de camundongo/humano conjugado com AlexaFluor 488 (Invitrogen), sob agitação. Após novo ciclo de lavagem, as células foram incubadas (20 min., TA) com corante para núcleo Hoechst 33342 (Life Technologies) diluído (1/500) em PBS (200 µL/poço). Após novo ciclo de lavagem, as células foram visualizadas em microscópio de imunofluorescência Evos FL (Thermo Fisher Scientific) e imagens foram capturadas com aumentos de 100x e 200x. Como demonstrado na figura 3b, a partir da imunodetecção da gD seguida de marcação secundária com FITC, foi possível determinar a expressão in vitro do antígeno vacinal gDPOLIEP, visto pela marcação de células em verde nos campos visualizados.

Exemplo 3 - Avaliação in vivo da imunogenicidade das vacinas

[0124] Os experimentos com animais foram conduzidos de acordo aos Princípios Éticos da Experimentação Animal estabelecidos pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA). Camundongos da linhagem C57BL/6 foram inoculados por via intramuscular de acordo aos seguintes grupos de imunização: 1) plasmídeo controle (pCDNA3.1); 2) plasmídeos pgDNSA e pgDNSB combinados; 3) plasmídeo poliepitopo (pgDPOLIEP). Cada grupo de animais (n=5-10) recebeu duas doses (50 µg/animal) das formulações vacinais, sendo adotado um intervalo de 2 semanas entre as doses. Imediatamente após administração das vacinas os animais foram eletroporados no local da aplicação, sendo aplicados 2 pulsos elétricos de 45 V cada, com intervalo de duração de 450 ms (pulsos que formam poros na membrana celular), e 4 pulsos de 20 V cada, com duração de 450 ms (pulsos de transferência), utilizando o equipamento NEPA21 SuperEletroporador (NepaGeneCo., Ltd.; Chiba, Japão).

[0125] A detecção de citocinas intracelulares (ICS) foi realizada em esplenócitos de camundongos imunizados, 14 dias após a administração da última dose vacinal. Para obtenção de esplenócitos, o baço dos camundongos imunizados foi coletado, após eutanásia, e submetidos à maceração para obtenção de suspensão celular. As células obtidas foram tratadas por 5 minutos no gelo com Ack Lising Buffer (BioSource International) até ruptura das hemácias e então centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos. Após 2 ciclos de lavagem com meio RPMI, os esplenócitos obtidos foram cultivados a uma proporção de 106 células/poço por 2 horas (37ºC, 5% CO2) na presença de estímulo antígeno-específico (peptídeos: pep4- VSFCYMHHM; pep5- VAYFNMVYM) seguido da adição de Brefeldin A (GolgiPlug; BD Biosciences) e estímulo por mais 4 horas. As células foram incubadas com meio RPMI (controle negativo) ou em combinação com PMA/ionomicina (controle positivo). Após o período de estímulo, as células foram lavadas com PBS (2x), seguido pela marcação com anticorpos conjugado com fluoróforo contra CD3 e murino (clone 145-2C11, Tonbo), CD8α (clone 53–6.7, BioLegend), CD11a (clone M17/4, eBioscience), CD49d (clone R1-2, eBioscience), todos usados na diluição de 1:200. As células foram então fixadas e permeabilizadas com Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience) e coradas com monoclonais conjugados com fluoróforo contra IFNγ de camundongo (clone XMG1.2, Tonbo) e TNF (clone MP6-XT22, eBioscience). Os dados foram coletados em um equipamento BD LSRFortessa™ e analisados usando o software FlowJo. Para detecção da citocina IFNγ secretadas pelos esplenócitos dos animais imunizados foi realizado pela técnica de ELISPOT. Brevemente, os esplenócitos dos animais imunizados foram estimulados in vitro de forma análoga ao descrito anteriormente, porém sem adição de Brefeldin A

[0126] Com o objetivo de caracterizar a resposta de células T induzida após a vacinação, células do baço foram coletadas e obtidas por meio das técnicas descritas acima. Conforme demonstrado na figura 4, após duas doses intramusculares da vacina de DNA pgDPOLIEP (50μg), foi avaliada a resposta das células T CD8+ vacina-específica por ensaio de ICS usando 2 peptídeos restritos a H2-Db, contidos na vacina de DNA. Foi determinado o número de células do baço capazes de produzir IFNy, bem como as frequências de produção de IFNγ e TNF por células T CD8+ ativadas e experimentadas com antígeno (CD49d+CD11ahiCD8αlo). Notavelmente, as células T CD8+ de camundongos que receberam a vacina de DNA pgDPOLIEP exibiram um fenótipo Th1 dominante uma vez estimulado com pep, com números e significativamente maiores de células produtoras de IFNγ-, TNF- e IL-2, uma vez em comparação com as outras vacinas de DNA contendo a porção NSA e NSB ou o vetor pcDNA3.1 (fig. 4a-f).

[0127] Com o objetivo de detectar células produtoras de IFNγ, as células do baço dos animais após duas doses intramusculares das vacinas de DNA foram submetidas ao ensaio de ELISPOT (fig. 5). Como demonstrado, a formulação composta pela pgDPOLIEP induziu a maior produção de IFNγ quando comparada com as formulações onde foi administrado o pgDNSA + pgDNSB ou o vetor vacinal vazio pDNA3.1. Em conjunto, os resultados demonstram que a pgDPOLIEP é imunogênica capaz de induzir resposta imune do tipo celular pela indução de linfócitos T CD8+ produtores de IFNγ e TNF.

[0128] Os versados na arte imediatamente compreenderão que a invenção é semelhantemente aplicável a outros veículos vacinais, ou seja, o uso da invenção não se limita à incorporação das sequências codificantes da proteína de fusão por um vetor tipo DNA. Exemplos incluem: a incorporação da sequência nucleotídica quimérica da invenção a vetores virais vacinais, como os de adenovírus usados atualmente (Janssen, Oxford) para vacinas contra SarsCov2; a incorporação da sequência nucleotídica quimérica da invenção a microrganismos que expressão a proteína de fusão da invenção, para subsequente inoculação da referida proteína, preferencialmente purificada; o uso da sequência quimérica de RNA da invenção a vetores vacinais de RNA, como aqueles usados atualmente (Moderna, Pfizer) para vacinas contra SarsCov2.

[0129] O conceito inventivo ora revelado e exemplificado de uma ou mais formas foi tratado como segredo industrial e não foi previamente revelado até o momento do depósito deste pedido de patente ou de sua prioridade. Este segredo industrial é ativo imaterial da depositante. A eventual futura publicação do pedido de patente não constitui, em si, autorização de uso por terceiros, servindo apenas como: (i) cientificação a terceiros da existência do referido segredo industrial na data do depósito; (ii) indicação inequívoca de seu detentor; e (iii) estímulo ao desenvolvimento de novas melhorias a partir do conceito ora revelado, para evitar o reinvestimento no desenvolvimento do mesmo bem já detido pelo depositante.

[0130] Desde logo se adverte que eventual uso comercial requer autorização da detentora e que o uso não autorizado enseja sanções previstas em Lei. Neste contexto, se esclarece que a partir da revelação do presente conceito inventivo, os versados na arte poderão considerar outras formas de concretizar a invenção não idênticas às meramente exemplificadas acima, mas que na hipótese de pretensão de uso comercial tais formas poderão ser consideradas como estando dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (22)

1. Sequência nucleotídica quimérica caracterizada por compreender as sequências codificantes, em fase, de uma pluralidade de epítopos de uma proteína não estrutural de coronavirus.
2. Sequência nucleotídica quimérica de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de compreender as sequências codificantes de múltiplos epítopos da replicase 1ab, alinhadas em fase.
3. Sequência nucleotídica quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 caracterizada pelo fato de que a sequência nucleotídica codificadora do poliepitopo compreende uma combinação, em fase, das sequências nucleotídicas selecionadas dentre SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91
4. Sequência nucleotídica quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizada pelo fato de que a sequência nucleotídica codificadora do poliepitopo ser definida pela SEQ ID NO: 95.
5. Sequência nucleotídica quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender uma sequência nucleotídica que codifica uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).
6. Sequência nucleotídica quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizada pelo fato de que a sequência nucleotídica codificadora da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1) são definidas pelas SEQ ID NO: 97 e/ou SEQ ID NO: 99.
7. Sequência nucleotídica quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender uma sequência nucleotídica codificante de um primeiro polipeptídeo espaçador.
8. Sequência nucleotídica quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizada pelo fato de compreender:

   • a) uma sequência nucleotídica que codifica um primeiro peptídeo compreendendo epítopos presentes na sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab);
   • b) uma sequência nucleotídica codificante de um primeiro polipeptídeo espaçador; e
   • c) uma sequência nucleotídica que codifica uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).
9. Sequência nucleotídica quimérica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por ser definida pela SEQ ID NO: 101.
10. Vetor de expressão em mamíferos caracterizado por compreender:

    • - a sequência nucleotídica quimérica codificadora do poliepitopo, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; e
    • - um ou mais promotores de expressão funcionalmente ligados à referida sequência nucleotídica.
11. Vacina de RNA caracterizada por compreender uma sequência de RNA que codifica uma pluralidade de epítopos de uma proteína não estrutural de coronavirus.
12. Vacina de RNA de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por compreender as sequências codificantes de múltiplos epítopos da replicase 1ab alinhadas em fase.
13. Vacina de RNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12 caracterizada por compreender uma combinação das sequências de RNA selecionadas dentre SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 158.
14. Proteína quimérica de fusão caracterizada por compreender uma pluralidade de epítopos de uma proteína não estrutural de coronavirus.
15. Proteína quimérica de fusão de acordo com a reivindicação 14 caracterizada por compreender uma combinação das sequências peptídicas da replicase 1ab selecionadas dentre SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92.
16. Proteína quimérica de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 15 caracterizada por compreender a SEQ ID NO: 96.
17. Proteína quimérica de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16 caracterizada por adicionalmente compreender uma sequência polipeptídica de uma forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).
18. Proteína quimérica de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 caracterizada pelo fato de que a sequência polipeptídica da forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1) definida pela SEQ ID NO: 98 e/ou SEQ ID NO: 100.
19. Proteína quimérica de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18 caracterizada por adicionalmente compreender uma sequência de um primeiro polipeptídeo espaçador.
20. Proteína quimérica de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20 caracterizada por compreender:

    • a) um primeiro peptídeo que consiste em epítopos presentes na sequência de aminoácidos da poliproteína da replicase 1ab (PR1ab);
    • b) um primeiro espaçador; e
    • c) forma modificada da glicoproteína D (gD) do herpes simples tipo-1 (HSV-1).
21. Proteína quimérica de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos definida pela SEQ ID NO: 108.
22. Uso da sequência nucleotídica quimérica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou da proteína quimérica de fusão conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 21 caracterizado por ser para a preparação de uma vacina contra coronavírus, Sars-CoV-2 e/ou vírus relacionados.

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