PL239831B1

PL239831B1 - Chimeryczne cząsteczki wiruso-podobne eksponujące sekwencje antygenowe wirusa HCV do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia wirusem HCV i/lub HBV

Info

Publication number: PL239831B1
Application number: PL427320A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna GRZYB; Katarzyna Grzyb; Anna Czarnota; Krystyna Bieńkowska-Szewczyk
Original assignee: Univ Gdanski
Priority date: 2018-10-01
Filing date: 2018-10-01
Publication date: 2022-01-17
Also published as: PL427320A1

Description

PL 239 831 B1

Opis wynalazku

Przedmiot wynalazku mieści się w dziedzinie prewencji zakażenia wirusem zapalenia wątroby typy C - HCV i zapalenia wątroby typu B - HBV. Wynalazek dotyczy chimerycznych cząstek wiruso-podobnych, białek chimerycznych, opartych na białku sHBsAg wirusa HBV eksponującym wybrane sekwencje antygenowe HCV w wybranych układach. Wynalazek dotyczy sekwencji wybranych epitopów - czterech sekwencji antygenowych rejonów glikoproteiny E2 w kombinacji po dwie sekwencje w jednym zastosowaniu i jednej sekwencji antygenowej rejonu glikoproteiny E2 zastosowanej odrębnie - do zastosowania w leczeniu prewencyjnym HCV i/lub HBV, a dokładniej do zastosowania jako składnika rekombinowanej szczepionki opartej na tych epitopach w postaci chimerycznych cząsteczek wiruso-podobnych opartych na białku sHBsAg.

Szacuje się, że na świecie żyje ponad 70 milionów ludzi zainfekowanych wirusem zapalenia wątroby typu C (z ang. Hepatitis C Virus - HCV) a corocznie odnotowuje się 1.75 miliona nowych przypadków zakażenia. Wg. najbardziej aktualnego raportu Światowej Organizacji Zdrowia (WHO - Global Hepatitis Report, 2017) liczba zgonów spowodowana wirusami zapalenia wątroby jest porównywalna z liczbą zgonów spowodowanych wirusem HIV czy gruźlicą.

W Polsce, w wyniku różnych badań prowadzonych na terenie całego kraju, liczbę zakażonych wirusem HCV szacuje się obecnie na około 150 tys. osób (Polska Grupa Ekspertów, Hepatologia, 2018, 18: 1-9; „Raport Polskiej Grupy Ekspertów HCV dotyczące leczenia wirusowych zapaleń wątroby typu C w roku 2018). Jednakże ze względu na brak powszechnych badań diagnostycznych mających na celu określenie rzeczywistej skali problemu liczba ta może być znacznie większa. Do zakażeń wirusem HCV dochodzi różnymi drogami. Już na początku badań nad HCV zaobserwowano związek między objawami chorobowymi, a wcześniejszym kontaktem pacjenta z krwią lub produktami krwiopochodnymi. Obecnie jednak, ze względu na obowiązujące procedury szpitalne, w krajach rozwiniętych rzadko dochodzi do zakażeń HCV podczas procedur medycznych. Jednak w krajach rozwijających się nadal pozostaje to jedną z częstszych dróg zakażeń. Najpopularniejszą drogą zakażeń w krajach rozwiniętych jest dożylne przyjmowanie narkotyków (około 60% nowych zakażeń), przeniesienie wirusa z matki na dziecko oraz kontakty seksualne. Ze względu na niezwykłą różnorodność ludzkich zachowań, które zawierają ryzyko kontaktu z krwią lub produktami krwiopochodnymi, można wymienić wiele więcej czynności potencjalnie niosących ze sobą ryzyko zakażenia wirusem HCV. Są to m. in. zabiegi kosmetyczne z użyciem igieł: kolczykowanie, tatuowanie czy akupunktura. Większość z tych zabiegów jest wykonywana w regionach, w których nie przeprowadza się rutynowych badań przesiewowych w kierunku infekcji HCV, trudno więc określić ich wpływ na rozprzestrzenianie się epidemii.

Około 80% infekcji wirusem HCV przechodzi w fazę chroniczną, która przez lata może nie dawać żadnych specyficznych objawów, dlatego też zakażenia HCV często nazywa się „cichą epidemią”. Przewlekła postać choroby w 20% przypadków prowadzi do ciężkiego uszkodzenia wątroby, marskości wątroby i w efekcie często do rozwinięcia się raka wątrobowo komórkowego. Często jedynym ratunkiem dla chorych jest przeszczep wątroby, który nie prowadzi niestety do wyleczenia. Przeszczepiona wątroba jest od razu zakażana cząstkami wirusa krążącymi we krwi. W ciągu kilku do kilkudziesięciu dni po przeszczepie u pacjentów odnotowuje się wzrost wiremii. Przez lata standardem leczenia antywirusowego była terapia dwulekowa, podczas której podawane były: interferon i ribawiryna. Terapia ta obciążona była jednak poważnymi skutkami ubocznymi, a jej skuteczność nie przekraczała 50%. Intensywne badania prowadzone w ostatnich latach pozwoliły na dokładniejsze poznanie biologii wirusa HCV i w efekcie doprowadziły do odkrycia nowych leków działających bezpośrednio na cząsteczki wirusowe (ang. Direct acting antivirals - DAAs), które osiągają skuteczność powyżej 90%. Jednak zarówno cena leków jak i koszty hospitalizacji są bardzo wysokie i znacznie obciążają budżet pacjentów oraz państwa. Co więcej, stosowanie terapii opartej na lekach DAAs skutkuje selekcją wariantów opornych na leczenie (z ang. resistance associated variants - RAVs), których obecność stanowi coraz większy problem w przebiegu leczenia.

Z tego względu, opracowanie skutecznej i powszechnie dostępnej szczepionki chroniącej przed zakażeniem jest ważnym celem aktualnych badań nad HCV. Istotnym elementem badawczym w opracowaniu szczepionki jest wybór miejsca antygenowego, czyli takiego białka HCV lub jego fragmentu epitopu, który będzie wzbudzał długotrwałą i skuteczną odpowiedź humoralną.

PL 239 831 B1

HCV jest małym, osłonkowym wirusem należącym do rodziny Flaviviridae. Nukleokapsyd tego wirusa otoczony jest osłonką lipidową, w której zakotwiczone są heterodimery glikoprotein E1 i E2. Glikoproteiny te odgrywają istotną rolę w cyklu życiowym wirusa i ze względu na swoją ekspozycję na powierzchni cząsteczki wirusowej stanowią główny cel dla przeciwciał neutralizujących.

Przeszkodą w tworzeniu uniwersalnej szczepionki chroniącej przed zakażeniem HCV jest wysoka zmienność glikoprotein E1 i E2, która pozwala wirusowi na ucieczkę przed układem immunologicznym gospodarza. Według badań filogenetycznych wyróżnia się siedem genotypów oraz wiele subtypów wirusa, a poziom zróżnicowania między nimi sięga nawet 35%. Ponadto podczas infekcji organizmu wirus różnicuje się tworząc blisko spokrewnione warianty w obrębie jednego zainfekowanego organizmu (quasi-gatunki).

Zmienność sekwencji manifestuje się głównie w sekwencji glikoproteiny E2, która zawiera regiony hiper-zmienne (z ang. hypervariable regions - HVRs). Regiony te stanowią wysoko immunogenne sekwencje, które dzięki nieustannym zmianom działają jako tak zwane „przynęty dla przeciwciał”. Ze względu na silną immunogenność, znane jest wykorzystanie rejonów hiper-zmiennych glikoproteiny E2 jako głównego celu antygenowego w szczepionkach przeciwko HCV, co opisano w publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO2002010416 oraz publikacji: Netter H. J. et al., Journal of Virology, 2000, 2130-2141; Antigenicity and Immunogenicity of Novel Chimeric Hepatitis B Surface Antigen Particles with Exposed Hepatitis C Virus Epitopes oraz P.T.K. Vietheer et al., Antiviral Therapy, 2007, 12(4): 477-487; Immunizations with chimeric hepatitis B virus-like particles to induce potential anti-hepatitis C virus neutralizing antibodies.. We wcześniej testowanych szczepionkach wykorzystywane były obie glikoproteiny E1 oraz E2 w formie pełnej, tylko jedno z białek heterodimeru glikoprotein E1E2 np. monomeryczna forma E2 lub E1 lub skrócone formy monomerów oraz heterodimerów glikoprotein E1 i E2, pozbawione domen transmembranowych. Należy w tym miejscu podkreślić, że regiony hiper-zmienne są elementem wszystkich szczepionek opartych na pełnych lub pozbawionych domen transmembranowych formach glikoproteiny E2 wirusa HCV np. takich jak opisano w publikacjach: Beaumont E. et al., Hepatology, 2013, 57:1303-1313; Chimeric hepatitis B virus/hepatitis C virus envelope proteins elicit broadly neutralizing antibodies and constitute a potential bivalent prophylactic vaccine. oraz Frey S. E. et al., Vaccine, 2010, 28:6367-6373; Safety and immunogenicity of HCV E1E2 vaccine adjuvanted with MF59 administered to healthy adults.

Co istotne, mechanizm „przynęty dla przeciwciał” powoduje skierowanie większości odpowiedzi immunologicznej w kierunku wysoko zmiennych rejonów przy jednoczesnym braku lub obniżonej ilości przeciwciał wiążących się do rejonów silnie konserwowanych. W efekcie w przypadku podania szczepionki zawierającej regiony hiper-zmienne (np. szczepionki oparte na pełnej lub skróconej formie glikoproteiny E2) lub szczepionki zawierającej tylko różne warianty regionów hiper-zmiennych wirusa HCV (np. szczepionka oparta na cząsteczkach wiruso-podobnych eksponujących region hiper-zmienny pierwszy - HVR1) obserwuje się wzbudzenie odpowiedzi immunologicznej przeciwciał, które mają znacznie ograniczoną zdolność do rozpoznania różnych genotypów, subtypów i quasi-gatunków wirusa HCV.

Przeciwciała neutralizujące poprzez efekt steryczny lub poprzez wiązanie się z miejscem biorącym udział w oddziaływaniu cząsteczka wirusowa - receptor komórki gospodarza zapobiegają wnikaniu wirusa do komórki i rozprzestrzenianiu się infekcji. Jednak jak wcześniej wspomniano wzbudzenie specyficznej odpowiedzi przeciwciał neutralizujących skierowanych przeciwko wybranym, konserwowanym fragmentom nie jest możliwy w przypadku wykorzystania jako immunogenu pełnej formy glikoproteiny E1 oraz E2 wirusa HCV. Jest to związane z obecnością dobrze wyeksponowanych oraz wysoko immunogennych regionów HVR i relatywnie słabą ekspozycją i immunogennością regionów silnie konserwowanych. Z tego powodu prawdziwym wyzwaniem jest zarówno identyfikacja takich regionów, dobranie kombinacji epitopów umożliwiających zwiększenie potencjału immunogenu jako uniwersalnej szczepionki oraz ekspozycja wybranych epitopów, w taki sposób aby uzyskać możliwie wysokie miano przeciwciał szeroko neutralizujących wirusa HCV.

Istnieje szereg silnie konserwowanych epitopów znajdujących się w sekwencji glikoproteiny E2 jak i E1, które jednocześnie odgrywają ważną rolę w wiązaniu cząsteczki wirusowej do receptorów komórki gospodarza i mogą stanowić doskonały cel dla przeciwciał neutralizujących, zatem możliwość wyboru epitopów w tych białkach jest duża, a tym samym znalezienie najbardziej skutecznej wymaga szeregu prac naukowych.

PL 239 831 B1

Znalezienie i opracowanie skutecznych sekwencji antygenowych stanowi cel wynalazku.

Jednym ze znanych spośród wielu możliwych rejonów glikoproteiny E2 jest tzw. domena neutralizująca (z ang. neutralizing face) glikoproteiny E2, zawierająca frontalną część glikoproteiny (rejon 421-459 lub 422-444), która częściowo pokrywa się z tzw. epitopem I glikoproteiny E2 (rejon 412-423) oraz położoną dalej sekwencję odpowiedzialną za wiązanie tetraspaniny CD81, która jest głównym receptorem wejścia dla wirusa HCV - rejon 519-535 (Kong L et al. Science, 2013, 342(6162):

1090-1094; Hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein core structure.) Ponadto w literaturze opisano szereg innych, silnie konserwowanych fragmentów glikoproteiny E2 mogących mieć znaczenie w procesie wejścia wirusa do komórki gospodarza m.in. silnie konserwowane rejony 454-463, 496-515 oraz rejon 611-619 zaangażowany w wiązanie CD81 oraz wiele innych rejonów, pokrywających się częściowo lub w całości z wcześniej wspomnianymi sekwencjami (publikacje Tzarum N et al. Frontiers in Immunology, 2018, 9: 1315; „The Neutralizing Face of Hepatitis C Virus E2 Envelope Glycoprotein., Deng K et al. PLoS ONE, 2015, 10(9):e0138756; Antibodies Targeting Novel Neutralizing Epitopes of Hepatitis C Virus Glycoprotein Preclude Genotype 2 Virus Infection. oraz Lavie M et al. Journal of Virology, 2014, 88(i8):10584-10597; Identification of Conserved Residues in Hepatitis C Virus Envelope Glycoprotein E2 That Modulate Virus Dependence on CD81 and SRB1 Entry Factors).

W obrębie sekwencji glikoproteiny E1 opisany został natomiast rejon 314-324 zdolny do wzbudzenia przeciwciał neutralizujących rozpoznających większość genotypów wirusa HCV oraz częściowo nakładający się na niego rejon 313-327 (publikacje Meunier J-C et al. Journal of Virology, 2008, 82(2):966-973; Isolation and Characterization of Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibodies to the E1 Glycoprotein of Hepatitis C Virus. oraz Kong L et al. Journal of molecular biology, 2015, 427(16):2617-2628; Structure of hepatitis C virus envelope glycoprotein E1 antigenic site 314-324 in complex with antibody IGH526.).

Epitopami HCV, których znane jest wykorzystanie jako pojedynczych sekwencji w szczepionkach przeciwko HCV i/lub HBV są rejony HVR1 oraz silnie konserwowany rejon 412-423.

W opisie wynalazku WO2002010416 oraz w publikacji Netter H. J. et al., Journal of Virology, 2000, 2130-2141; Antigenicity and Immunogenicity of Novel Chimeric Hepatitis B Surface Antigen Particles with Exposed Hepatitis C Virus Epitopes. Ujawniono chimeryczną cząsteczkę wiruso-podobną opartą na małym białku powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B eksponującym sekwencje pochodzące z wirusa HCV. Przedstawione w powyższych dokumentach konstrukty zawierały część lub całość rejonu hiper-zmiennego pierwszego (HVR1) glikoproteiny E2 wirusa HCV. Ponadto konstrukty z pełną sekwencją HVR1 zawierały dodatkowe sekwencje położone poniżej sekwencji rejonu HVR1, w tym część lub całość rejonu 412-425 glikoproteiny E2 wirusa HCV. Surowice otrzymane po szczepieniach zwierząt tymi konstruktami wykazywały się znaczną immunogennością, jednak ograniczoną zdolnością do wiązania glikoprotein E1E2 pochodzących z różnych genotypów wirusa HCV wynikającą prawdopodobnie z obecności rejonu HVR1 w chimerycznych cząsteczkach i w efekcie wzbudzania przeciwciał rozpoznających tylko bardzo ograniczone spektrum wariantów wirusa HCV (publikacje: Vietheer P.T.K. et al., Antiviral Therapy, 2007, 12(4): 477-487; Immunizations with chimeric hepatitis B virus-like particles to induce potential anti-hepatitis C virus neutralizing antibodies. oraz Netter H. J. et al., Vaccine, 2003, 21; 2692-2697; Immunogenicity of recombinant HBsAg/HCV particles in mice preimmunised with hepatitis B virus-specific vaccine.).

W zgłoszeniu patentowym P.410950 oraz w publikacji Czarnota A. et al., Microbial Cell Factories, 2016, 15:62; Immunogenicity of Leishmania-Derived Hepatitis B Small Surface Antigen Particles Exposing Highly Conserved E2 Epitope of Hepatitis C Virus. opisano chimeryczne cząsteczki sHBsAg eksponujące silnie konserwowany epitop 412-425 glikoproteiny E2 wirusa HCV. Przyjęta strategia dotyczyła silnie konserwowanego rejonu 412-425. Strategia szczepień oparta na pojedynczym epitopie 412-425 jest obarczona pewnym ryzykiem, gdyż istnieją warianty sekwencji 412-425 pozwalające na ucieczkę wirusa przed przeciwciałami neutralizującymi. Możliwość ucieczki jest spowodowana zdolnością rejonu 412-423 do przesunięcia miejsca N-glikozylacji z Ser417 lub Thr417 do Asn15, które skutecznie zapobiega wiązaniu neutralizujących przeciwciał rozpoznających epitop 412-423 (Li Y et al., The Journal of Biological Chemistry, 2015, 290(16):10117-10125; Structural Basis for Penetration of the Glycan Shield of Hepatitis C Virus E2 Glycoprotein by a Broadly Neutralizing Human Antibody”).

W związku z powyższym, wyselekcjonowanie właściwych epitopów glikoproteiny E2, które umożliwiłyby uzyskanie skutecznej odpowiedzi w postaci przeciwciał neutralizujących wszystkie warianty wirusa HCV jest bardzo skomplikowane.

PL 239 831 B1

Z proponowanych mechanizmów wzbudzania odpowiedzi przeciwko pojedynczym fragmentom białka jest ich ekspozycja na powierzchni cząsteczek wiruso-podobnych (ang. virus-like particles - VLP). Cząsteczki wiruso-podobne są małymi, wysoko immunogennymi strukturami tworzonymi z multimerów białek wirusowych. Dzięki multimerycznej, przestrzennej strukturze VLP spowodują agregację receptorów BCR (ang. B cell receptor) na powierzchni limfocytów B i w efekcie aktywują odpowiedź humoralną organizmu. Jednocześnie są zdolne do pobudzania odpowiedzi limfocytów T, zarówno pomocniczych jak i cytotoksycznych oraz komórek dendrytycznych. Ze względu na dobre właściwości immunogenne są one wykorzystywane w szczepionkach nowej generacji np. w dostępnej w Polsce od roku 2007 szczepionce przeciwko wirusowi brodawczaka ludzkiego (ang. Human Papilloma Virus - HPV) czy w szczepionce przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu B (ang. Hepatitis B Virus - HBV).

Wirus zapalenia wątroby typu B posiada materiał genetyczny złożony z częściowo dwuniciowego DNA, które w czterech częściowo nachodzących na siebie ramkach odczytu koduje białka strukturalne i funkcjonalne wirusa. Wirion HBV ma około 42 nm średnicy i utworzony jest z rdzenia budowanego przez białko C. Rdzeń ten osłonięty jest osłonką białkowo-lipidową tworzoną przez antygen powierzchniowy wirusa HBV - HBsAg, występujący w trzech formach długiej, średniej krótkiej. Krótka forma tego białka - sHBsAg o długości około 226 aminokwasów ma ciekawe właściwości tworzenia cząsteczek wiruso-podobnych. Te małe struktury o średnicy około 22 nm pozbawione są wirulencji, jednakże są wysoko immunogenne i zdolne do wyzwalania silnej odpowiedzi immunologicznej. Struktura trzeciorzędowa sHBsAg tworzy hydrofilowe pętle. Na jednej z tych pętli znajduje się silnie konserwowana determinanta „a” przeciwko której kierowana jest najsilniejsza odpowiedź immunologiczna. Ze względu na zdolność do tworzenia silnie immunogennych cząsteczek VLP oraz silnie konserwowaną i wyeksponowaną determinantę „a” białko sHBsAg jest wykorzystywane w dostępnych szczepionkach przeciwko wirusowi HBV. Szczepionki te zaprojektowane zostały przy wykorzystaniu techniki rekombinacji DNA i są produkowane w drożdżowym systemie ekspresji. System ten pozwala na uzyskanie prawidłowo sfałdowanego białka sHBsAg w dużej ilości i przy niskich kosztach. Białko to ulega ekspresji w wielu innych systemach, w tym w ssaczym, gdzie w przeciwieństwie do systemu drożdżowego jest prawidłowo glikozylowane i wyprowadzane do pożywki. Jednak ekspresja białek w komórkach ssaczych niesie ze sobą wysokie koszty produkcji.

Ze względu na silną immunogenność determinanty „a” białka HBsAg i jej zdolność do wzbudzania silnej odpowiedzi zarówno komórkowej jak i humoralnej jest ona często wykorzystywana jako potencjalny nośnik antygenów patogenów człowieka. W ciągu ostatnich lat badane były potencjalne szczepionki oparte na białku sHBsAg niosącym antygeny m. in. wirusa polio, ludzkiego wirusa niedoboru odporności (ang. human immuno-deficiency virus - HIV), zarodźca malarii oraz wirusa chikungunya.

Oprócz nośnika antygenów opartego na białku HBsAg do ekspozycji epitopów pochodzących z wirusa HCV można wykorzystać m.in. inne białka posiadające zdolność tworzenia cząsteczek wirusopodobnych np. białko rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B (z ang. Hepatits B core antygen HBcAg) czy białka strukturalne flaviwirusów np. japońskiego zapalenia mózgu, (publikacje Sominskaya I et al. Clinical and Vaccine Immunology, 2010, 17(6):1027-1033; Construction and Immunological Evaluation of Multivalent Hepatitis B Virus (HBV) Core Virus-Like Particles Carrying HBV and HCV Epitopes, oraz Saga R et al. Scientific Reports, 2016, 6:28688; Bivalent vaccine platform based on Japanese encephalitis virus (JEV) elicits neutralizing antibodies against JEV and hepatitis C virus..

Oprócz tego krótkie peptydy mogą zostać chemicznie skoniugowane lub zamknięte w chemicznie otrzymanych nanostrukturach np. liposomach (Jiao X et al. J Gen Virol, 2004, 85: 1545-1553; Enhanced hepatitis C virus NS3 specific Th1 immune responses induced by co-delivery of protein antigen and CpG with cationic liposomes.).

Dodatkowo epitopy mogą być podawane w formie pojedynczych peptydów lub peptydów w formie cyklicznej, jednak taka prezentacja immunogenów zwykle okazuje się skutkować słabą odpowiedzią układu odpornościowego szczepionych zwierząt (Sandomenico A et al. Journal of Virology, 2016, 90(7):3745-3759; Generation and Characterization of Monoclonal Antibodies against a Cyclic Variant of Hepatitis C Virus E2 Epitope 412-422.).

Celem wynalazku jest wyselekcjonowanie epitopów antygenowych HCV i opracowanie na ich podstawie białek chimerycznych do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV, które zdolne są do wzbudzania odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał neutralizujących wiele genotypów wirusa zapalenia wątroby typu C. Nieoczekiwanie okazało się, że przyjęcie odmiennej strategii od głównego nurtu badań nad szczepionką HCV - wykorzystania pełnej formy glikoproteiny powierzchniowej E2 zawierającej regiony hiper-zmienne pozwala na zaprojektowanie szczepionki, która

PL 239 831 B1 indukuje odpowiedź humoralną skierowaną przeciwko wielu genotypom i subtypom wirusa HCV. Ponadto nieoczekiwanie się okazało, że wykorzystanie kilku sekwencji antygenowych stwarza możliwość wykorzystania konstruktów, jako uniwersalnej szczepionki bez ryzyka ucieczki wirusa HCV poprzez wprowadzanie punktowej mutacji w pojedynczym epitopie.

Według wynalazku wykorzystuje się w opracowanej sekwencji białek chimerycznych wybrane sekwencje antygenowe oznaczona na sekwencjach Seq. 2 albo Seq. 3 albo Seq. 4 w kombinacji z Seq. 5 lub samą Seq. 5 (wszystkie wyeksponowane na powierzchni Seq. 1 (białka nośnikowego)).

Wynalazek dotyczy białek chimerycznych opartych na wybranych sekwencjach zawierających sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B oraz umiejscowione w określonym, dobranym miejscu sekwencje antygenowe według wynalazku pojedynczo lub w kompozycji. Białka chimeryczne przedstawiono na Seq. 6-14.

Wynalazek umożliwia jego zastosowanie w opracowaniu:

- szczepionki na bazie wytypowanych sekwencji antygenowych i/lub białek chimerycznych zapewnia wzbudzanie odpowiedzi immunologicznej w postaci przeciwciał skierowanych przeciwko HCV i/lub HBV,

- biwalentnej szczepionki do profilaktyki i/lub leczenia HBV i HCV, gdzie poprzez zastosowanie chroni i/lub hamuje zachorowalność powodowaną przez HBV i/lub HCV. Szczepionkę można stosować w celu prewencji/profilaktyki i/lub leczenia infekcji HBV i/lub HCV.

Wytypowane sekwencje antygenowe można wykorzystać w celu otrzymania czynnych biologicznie i immunogennych cząsteczek wiruso-podobnych złożonych z małego białka powierzchniowego wirusa HBV (HBsAg), które charakteryzują się: wysoką immunogennością, wzbudzaniem humoralnej odpowiedzi immunologicznej.

Wykorzystuje się sekwencje 412-425 albo 434-446 albo 502-520 w połączeniu z 523-535 albo samej sekwencji 523-535. Wbudowane w dużą pętlę hydrofilową białka HBsAg regiony 412-425, 434-446, 502-520, 523-535 z glikoproteiny E2 wirusa HCV - pojedynczo jak i w kompozycji kilku sekwencji, które charakteryzują się: małą zmiennością pomiędzy genotypami wirusa HCV, obecnością miejsca wiązania dla przeciwciał neutralizujących wirusa.

W wynalazku używa się terminy zwłaszcza zdefiniowane następująco:

białko fuzyjne - oznacza to samo co białko chimeryczne;

biwalentna szczepionka - oznacza szczepionkę wzbudzającą odpowiedź immunologiczną przeciwko dwóm różnym patogenom (lub dwóm różnym serotypom patogenów). W tym przypadku oznacza szczepionkę wzbudzającą odpowiedź immunologiczną zarówno przeciwko wirusowi HBV i/lub HCV; białka chimeryczne - oznacza białka pokazane na Seq. 6-14, uzyskane w wyniku ekspresji genów rekombinowanych, powstałych w wyniku połączenia dwóch lub większej ilości genów/sekwencji, które wyjściowo kodowały różne białka. W wynalazku oznaczają połączenie krótkiej formy antygenu powierzchniowego wirusa HBV (HBsAg) przedstawionego na Seq. 1 oraz regionów glikoproteiny E2 wirusa HCV przedstawionych na Seq. 2 i/lub Seq. 3 i/lub Seq. 4 i/lub Seq. 5 i/lub, ich wybranych według wynalazku kombinacji, w ten sposób, że te sekwencje lub ich kombinacje znajdują się wewnątrz dużej, hydrofilowej pętli białka HBsAg przedstawionego na Seq. 1;

duża hydrofilowa pętla białka HBsAg- oznacza wysoko immunogenny region małego białka powierzchniowego HBsAg, znajdujący się w pozycji 99-170 białka przedstawionego na Seq. 1 (Genbank accession number - AF397207.1);

białko HBsAg - małe białko powierzchniowe subtypu adw wirusa HBV o długości 226 aminokwasów, opisywane także jako sHBsAg lub forma S białka HBsAg. Sekwencja białka przedstawiona na Seq. 1;

rejon 412-425 - oznacza wybrany według wynalazku rejon znajdujący się w pozycji od 412 do 425 sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 wirusa HCV izolatu H77 (Genbank accession numer AF011751.1) przedstawionej na Seq. 2. Region ten zawiera konserwowaną sekwencję rozpoznawaną przez przeciwciała neutralizujące o szerokim spektrum działania, które zdolne są do wiązania się z glikoproteiną E2 pochodzącą z różnych genotypów HCV;

rejon 434-446 - oznacza wybrany rejon znajdujący się w pozycji 434 do 446 sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 wirusa HCV izolatu H77 (Genbank accession numer - AF011751.1) przedstawiony na wzorze sekwencji Seq. 3. Region ten zawiera konserwowaną sekwencję rozpoznawaną przez przeciwciała neutralizujące o szerokim spektrum działania, które zdolne są do wiązania się z glikoproteiną E2 pochodzącą z różnych genotypów HCV;

PL 239 831 B1 rejon 502-520 - oznacza rejon o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Seq. 4. Jest to zmodyfikowany rejon znajdujący się w pozycji od 502 do 520 sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 wirusa HCV izolatu H77 (Gen bank accession numer - AF011751.1) o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Seq. 15 w którym sekwencje kodujące cysteiny w pozycjach 503 oraz 508 zostały zamienione na sekwencje kodujące alaniny. Region ten zawiera konserwowaną sekwencję rozpoznawaną przez przeciwciała neutralizujące o szerokim spektrum działania, które zdolne są do wiązania się z glikoproteiną E2 pochodzącą z różnych genotypów HCV; rejon 523-535 - oznacza wybrany rejon znajdujący się w pozycji 523 do 535 sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E2 wirusa HCV izolatu H77 (Gen bank accession numer - AF011751.1) o przedstawionej na Seq. 5. Region ten zawiera konserwowaną sekwencję rozpoznawaną przez przeciwciała neutralizujące o szerokim spektrum działania, które zdolne są do wiązania się z glikoproteiną E2 pochodzącą z różnych genotypów HCV;

subtyp adw wirusa HBV - oznacza wariant wirusa HBV posiadający determinanty „a”, „d” oraz „w”. Wirus HBV posiada trzy determinanty, z których determinanta „a” jest uniwersalna i wspólna dla wszystkich subtypów. Regiony flankujące determinantę „a” nazywane są determinantami d/y oraz w/r. Ze względu na rodzaj aminokwasu w pozycji 122 dla determinanty d/y oraz 160 dla determinanty w/r każdy izolat wirusa HBV można przypisać do danego subtypu.

Wynalazek przedstawiono na rysunku i w przykładach wykonania.

Fig. 1 (A, B, C) - przedstawia schematy chimerycznych konstruktów Seq. 6 do Seq. 14 użytych w poniższym badaniu. W przypadku konstruktów niosących dwa rejony pochodzące z glikoproteiny E2 osłonki wirusa HCV pierwszy został umieszczony w pozycji I110/S117(A111-116) a drugi w pozycji P127/A128 małego białka powierzchniowego wirusa HBV (HBsAg) w obrębie dużej, hydrofilowej pętlibiałka HBsAg przedstawionego na Seq. 1.

Fig. 2 - przedstawia wyniki testu Western Blot. Białka Seq. 1, Seq. 6, Seq. 7 oraz Seq. 8 zostały rozdzielone na żelu SDS-PAGE w warunkach redukujących, przeniesione na membranę PVDF a następnie były wykrywane przeciwciałami anty-HBsAg. Marker masy cząsteczkowej w kDa umieszczono po lewej stronie żelu.

Fig. 3 - przedstawia przykładowe zdjęcia cząstek wiruso-podobnych Seq. 6 oglądanych w mikroskopie elektronowym. W eksperymencie zastosowano barwienie negatywowe octanem uranylu. Czarne strzałki wskazują pojedynczą cząsteczkę wiruso-podobną złożoną z chimerycznego białka. Czarna linia = 50 nm.

Fig. 4 - przedstawia badanie zdolności surowic do specyficznego rozpoznawania epitopów pochodzących z glikoproteiny E2 wirusa HCV. Wcześniej zsyntetyzowane peptydy Seq. 3, Seq. 4 oraz Seq. 5 skoniugowane z biotyną naniesiono na płytkę 96-dołkową opłaszczoną streptawidyną. Peptydy nanoszono w ilości 1 μg/studzienkę. Peptydy wykrywano surowicami w rozcieńczeniach 250, 10³, 5*10³, 10⁴, 5*10⁴.

Fig. 5 - przedstawia badanie zdolności surowic myszy szczepionych chimerycznymi białkami przedstawionymi na Seq. 6, Seq. 7, Seq. 8 oraz Seq. 1 do specyficznego rozpoznawania białka HBsAg. Oczyszczone białko HBsAg uzyskane w systemie drożdżowym (yHBsAg) naniesiono na płytkę 96 dołkową w ilości 0,5 μg/studzienkę. Białko wykrywano surowicami w rozcieńczeniach 10³, 5*10⁵, 10⁴, 2,5*10⁴, 105,1,25*105.

Poszczególne sekwencje według wynalazku przedstawiono odrębnie zgodnie z akceptowanymi wymogami.

P r z y k ł a d 1

Uzyskanie ekspresji wybranych białek przedstawionych na Seq. 6, Seq. 7, Seq. 8 w komórkach pierwotniaka Leishmania tarentolae i oczyszczenie cząsteczek wiruso-podobnych poprzez ultrawirowanie na gradiencie.

Opis uzyskiwania ekspresji opisany w przykładzie 1, dla osoby w stanie techniki można zastosować analogicznie dla innych sekwencji według wynalazku.

Ekspresja

Geny kodujące białka przedstawione na Seq. 6, Seq. 7 oraz Seq. 8 (Fig. 1) zostały zsyntetyzowane (Life Technologies Inc. USA) w oparciu o sekwencję z bazy danych (sekwencja białka HBsAg GenBank accesion number - AF397207.1 sekwencja glikoproteiny E2 wirusa HCV - GenBank accesion numer - AF011751.1), w pozycję odpowiadającą dużej, hydrofilowej pętli białka HBsAg przedstawionego na Seq. 1 wprowadzono sekwencję lub kombinację sekwencji rejonów przedstawionych na Seq. 3, Seq. 4 oraz Seq. 5. Jako kontrola używany był konstrukt kodujący naturalnie występujące białko HBsAg przedstawiony na Seq. 1. Następnie przy użyciu miejsc restrykcyjnych Bglll oraz Notl zsyntetyzowane fragmenty

PL 239 831 B1 zostały wklonowane do plazmidu pLEXSY_l-blecherry3 (Jena Bioscience GmBH, Germany) pod kontrolę promotora T7 z operatorem tetracyklinowym. Poprawność wprowadzenia insertów potwierdzono sekwencjonowaniem. Tak przygotowane wektory ekspresyjne zostały użyte do elektroporacji komórek L. tarentolae. Elektroporację, selekcję poliklonalną, hodowlę komórek oraz indukcję ekspresji chimerycznych białek przeprowadzano wg. procedury dla systemu Lexsy (Jena Bioscience GmBH, Germany).

Liza i formowanie cząsteczek wiruso-podobnych

Indukowane hodowle (OD600~4.5) były wirowane (4500 rpm, 10 min). Osady komórek z 50 ml hodowli były przemywane buforem PBS a następnie lizowane w 5 ml buforu (0,6% Tween 20 w PBS) oraz sonifikowane. Następnie całość lizatu wirowano (8500 rpm. 30 min.). Po wirowaniu zebrano supernatant, który inkubowano w temperaturze pokojowej przez (12-48 h). W celu potwierdzenia ekspresji chimerycznych białek przedstawionych na Seq. 6, Seq. 7 oraz Seq. 8, przeprowadzono analizę metodą Western Blot z użyciem specyficznych przeciwciał anty-HBsAg (OriGene Technologies) (Fig. 2). Uzyskane wyniki potwierdzają prawidłową ekspresję wszystkich zaprojektowanych wariantów. Wszystkie konstrukty posiadają spodziewaną masę molekularną (około 27 kDa) oraz są prawidłowo rozpoznawane przez przeciwciała skierowane przeciwko małemu białku powierzchniowemu wirusa HBV (sHBsAg).

Oczyszczanie

W celu oczyszczenia chimerycznych cząstek przygotowano gradient OpitPrep (AxisShield) w PBS z frakcjami od 6% do 30%, na który nanoszono po 3,5 ml otrzymanych lizatów komórkowych. Całość wirowano (28000 rpm, 4°C, 16 h). Wszystkie powstałe na gradiencie frakcje zostały zbadane na obecność chimerycznych cząsteczek metodą Western Blot z użyciem przeciwciał anty-HBsAg (Origene Technologies). Frakcje zawierające najwięcej poszukiwanego białka były zbierane i zagęszczane przy pomocy filtrów do wirowania Amicon 30 NMLW (Millipore Inc. USA). Do pomiaru stężenia białka w przygotowanych preparatach zastosowano metodę Bradforda (A=595 nm). Oszacowano, że ilość białka wynosi około 8 mg/l hodowli. Tak oczyszczony preparat przechowywano w 4°C. Powyższe procedury pozwoliły na efektywne, jednoetapowe oczyszczenie chimerycznych cząstek wiruso-podobnych opartych na chimerycznych białkach przedstawionych na Seq. 6, Seq. 7 oraz Seq. 8.

Mikroskopia elektronowa

W celu potwierdzenia obecności cząstek wiruso-podobnych 10 μl próbek zawierających białka przedstawione na Seq. 6, Seq. 7 oraz Seq. 8 nanoszono na niklowe siatki pokryte błoną węglową i barwiono octanem uranylu. Preparaty oglądano z wykorzystaniem mikroskopu elektronowego (Fig. 3). Wyniki z mikroskopii elektronowej potwierdziły obecność chimerycznych cząsteczek wiruso-podobnych o średnicy ~ 25 nm, co jest zgodne z danymi literaturowymi.

Opisane wyżej procedury zostały przeprowadzone dla konstruktu Seq. 6 posiadającego pojedynczy epitop pochodzący z wirusa HCV zlokalizowany w pozycji 128 białka sHBsAg przedstawionego na Seq. 1 oraz dla konstruktów Seq. 7 i Seq. 8, które posiadają dwa epitopy pochodzące z wirusa HCV zlokalizowane w pozycjach 111 oraz 128 białka sHBsAg przedstawionego na Seq. 1. W związku z tym analogicznie - dla osoby w stanie techniki w oczywisty sposób na podstawie opisu powyższego - skonstruowano, poddano ekspresji, oczyszczono i scharakteryzowano inny opisany przez nas konstrukt zawierający pojedynczy epitop (Seq. 5) w pozycji 111 białka sHBsAg przedstawionego na Seq. 1 tzn. konstrukt przedstawiony na Seq. 9. oraz konstrukty zawierające dwa epitopy (Seq. 2, Seq. 3, Seq. 4, Seq. 5) w pozycjach 111 oraz 128 białka sHBsAg przedstawionego na Seq. 1 tzn. konstrukty przedstawione na Seq. 10-14.

P r z y k ł a d 2

Potwierdzenie skuteczności chimerycznych cząsteczek wiruso-podobnych eksponujących sekwencje antygenowe wirusa HCV, jako immunogenu wzbudzającego odpowiedź humoralną skierowaną przeciwko specyficznym fragmentom glikoproteiny E2 wirusa HCV oraz małemu białku powierzchniowemu wirusa HBV.

Szczepienie myszy

W celu zbadania immunogenności cząstek wiruso-podobnych do szczepień zastosowano model mysi. Oczyszczone antygeny oparte na chimerycznych białkach przedstawionych na Seq. 6, Seq. 7, Seq. 8 oraz kontrolny konstrukt przedstawiony na Seq. 1 zostały zawieszone w PBS oraz zmieszane w stosunku 1:1 z adiuwantem (Addavax; Invivogen, USA) bezpośrednio przed szczepieniem. Dla każdego chimerycznego konstruktu grupa w postaci sześciu myszy BALB/c została zaszczepiona podskórnie mieszaniną antygen/adiuwant w dawce 15 μg/mysz. Grupa kontrolna złożona z trzech myszy BALB/c została zaszczepiona mieszaniną PBS/adiuwant. W dniu 14 i 28 od pierwszego szczepienia myszy zostały doszczepione mniejszą ilością tego samego antygenu w dawce 10 μg/mysz, natomiast

PL 239 831 B1 grupie kontrolnej podano mieszaninę PBS/adiuwant. W dniu 42 wszystkie myszy zostały skrwawione, a z zebranych próbek wyizolowano surowice.

ELISA z wykorzystaniem peptydów oraz białka yHBsAg

W otrzymanych surowicach oznaczono miano przeciwciał skierowanych przeciwko konserwowanym rejonom glikoproteiny E2 wirusa HCV przedstawionych na Seq. 3, Seq. 4 oraz Seq. 5 wykorzystując syntetyczne peptydy skoniugowane ze streptawidyną. Dla peptydu Seq. 5 surowice myszy zaszczepionych konstruktami Seq. 6 lub Seq. 7 lub Seq. 8 osiągnęły takie samo miano na poziomie 10⁴. Dodatkowo, surowice z myszy zaszczepionych konstruktem Seq. 7 wykazywały się wysokim poziomem przeciwciał skierowanych przeciwko peptydowi Seq. 4 (miano 10³) a surowice z myszy zaszczepionych konstruktem Seq. 8 wykrywały peptyd Seq. 3 osiągając miano 5*10³. (Fig. 4).

Przeprowadzono także analizę surowic pod kątem obecności przeciwciał skierowanych specyficznie przeciwko białku HBsAg. W tym celu płytki 96-dołkowe zostały opłaszczone zakupionym białkiem HBsAg pochodzącym z drożdżowego systemu ekspresji (yHBsAg). Wszystkie konstrukty uzyskały pozytywny sygnał dla białka yHBsAg. Jednakże w surowicach myszy szczepionych konstruktem Seq. 6 zaobserwowano podobnie silną odpowiedź przeciwciał skierowanych przeciwko białku yHBsAg jak w surowicach myszy szczepionych konstruktem kontrolnym przedstawionym na Seq. 1 (Fig. 5).

We wszystkich eksperymentach, jako wynik negatywny przyjęto wartości (n<0,15), gdzie 0,15 stanowi trzykrotność wartości kontroli negatywnej (A450~0,05). Wyniki immunizacji potwierdzają silną odpowiedź immunologiczną w postaci przeciwciał skierowanych przeciwko konserwowanym rejonom glikoproteiny E2 wirusa HCV, co potwierdza użyteczność wszystkich opisanych chimerycznych cząsteczek wiruso-podobnych jako szczepionki przeciwko wirusowi HCV. Jednakże warto zauważyć, że konstrukty zawierające dwie sekwencje antygenowe (przedstawione na Seq. 7, oraz Seq. 8) wzbudzają odpowiedź przeciwciał skierowaną przeciwko obydwóm wyeksponowanym epitopom HCV. W związku z tym mogą zapobiegać mechanizmowi ucieczki wirusa HCV przed układem immunologicznym polegającego na wprowadzeniu mutacji w obrębie jednej z sekwencji antygenowych (przedstawionych na Seq. 2 - Seq. 5). Co więcej wszystkie konstrukty wzbudziły odpowiedź humoralną skierowaną przeciwko białku HBsAg, co stwarza możliwość do wykorzystania tych konstruktów jako potencjalnej biwalentnej szczepionki przeciwko wirusom HBV oraz HCV.

W tym przykładzie pokazano, że konstrukt Seq. 6 posiadający pojedynczy epitop pochodzący z wirusa HCV zlokalizowany w pozycji 128 białka sHBsAg przedstawionego na Seq. 1 jest w stanie wzbudzić specyficzną odpowiedź przeciwciał skierowanych zarówno przeciwko specyficznym epitopom glikoproteiny E2 jak i białku HBsAg. Analogiczną odpowiedź przeciwciał otrzymano dla innego konstruktu zawierającego pojedynczy epitop Seq. 5 w pozycji 111 białka sHBsAg przedstawionego na Seq. 1 tzn. dla konstruktu Seq. 9.

W powyższym przykładzie opisano także przebieg szczepień i otrzymaną odpowiedź immunologiczną dla konstruktów zawierających dwa epitopy pochodzące z wirusa HCV, zlokalizowane w pozycjach 111 oraz 128 białka sHBsAg przedstawionego na Seq. 1. - Seq. 7 oraz oraz Seq. 8. Wykazano, że wszystkie te konstrukty są w stanie wzbudzić specyficzną odpowiedź przeciwciał skierowanych zarówno przeciwko specyficznym epitopom glikoproteiny E2 oraz przeciwko białku HBsAg.

Analogiczne wyniki otrzymano dla opisanych w wynalazku konstruktów zawierające dwa epitopy (Seq. 2, Seq. 3, Seq. 4, Seq. 5) w pozycjach 111 oraz 128 białka sHBsAg przedstawionego na Seq. 1 tzn. dla konstruktów przedstawionych na Seq. 10-14.

Dodatkowo wykazano, że wykorzystanie dwóch sekwencji antygenowych pochodzących z wirusa HCV pozwala na uniknięcie mechanizmu ucieczki wirusa przed układem immunologicznym poprzez wprowadzenie mutacji w obrębie jednej z sekwencji antygenowych przedstawionych na Seq. 2 - Seq. 5. Zastosowanie kompozycji według wynalazku stanowi zatem korzystny wariant według wynalazku.

PL 239 831 Β1

SEQUENCE LISTING < 110> Uniwersytet Gdański < 120> Kompozycje sekwencji antygenowych wirusa HCV do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia wirusem HCV i/lub HBV chimeryczne cząsteczki wiruso-podobne eksponujące sekwencje antygenowe wirusa HCV, szczepionka przeciwko wirusowi HCV i/lub HBV oparta na chimerycznych cząsteczkach wiruso-podobnych.

< 130> sHBsAg VLPs <160> 29 < 170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 226 < 212> PRT < 213> Hepatitis B virus subtype adw2 <220>

<223> sHBsAg

<400> 1

Met 1

Glut

Asn

Ile

Ala 5

Ser

Gly

Leu

Gly 10

Pro

Leu

Val

Leu 15

Gin

Ala

GLy

Phe

Phe 20

Leu

Thr

Lys

Ile 25

Leu

Thr

Ile

Pro

Gin 30

Ser

Leu

Asp

Ser

Trp 35

Trp

Thr

Ser

Leu

Asn 40

Phe

Leu

Gly

Thr 45

Pro

Val

Cys

Leu

Gly 50

Gin

Asn

Ser

Gin

Ser 55

Gin

Ile

Ser

His 60

Ser

Pro

Thr

Cys

Cys 65

Pro

Ile

Cys

Pro 70

Gly

Tyr

Arg

Trp

Met 75

Cys

Leu

Arg

Phe 80

Ile

Phe

Leu

Cys 85

Ile

Leu

Cys 90

Leu

Ile

Phe

Leu

Leu 95

Val

Leu

Asp

Tyr 100

Gin

Gly

Met

Leu

Pro 105

Val

Cys

Pro

Leu

Ile 110

Pro

Gly

Ser

Thr 115

Thr

Ser

Thr

Gly

Pro 120

Cys

Lys

Thr

Cys

Thr 125

Thr

Pro

Ala

Gin

Gly 130

Thr

Ser

Met

Phe

Pro 135

Ser

Cys

Thr 140

Lys

Pro

Thr

Asp

Gly 145

Asn

Cys

Thr

Cys

Ile 150

Pro

Ile

Pro

Ser

Ser 155

Trp

Ala

Phe

Ala

Lys 160

Tyr

Leu

Trp

Glu

Trp 165

Ala

Ser

Val

Arg

Phe 170

Ser

Trp

Leu

Ser

Leu 175

Leu

Val

Pro

Phe

Val 180

Gin

Trp

Phe

Val

Gly 185

Leu

Ser

Pro

Thr

Val 190

Trp

Leu

Ser

Val

Ile 195

Trp

Met

Trp

Tyr 200

Trp

Gly

Pro

Ser

Leu 205

Tyr

Asn

Ile

Leu

Ser 210

Pro

Phe

Met

Pro

Leu 215

Leu

Pro

Ile

Phe

Phe 220

Cys

Leu

Trp

Val

PL 239 831 Β1

Tyr Ile 225 <210> 2 <211> 14 < 212> PRT < 213> Hepatitis C virus <220>

<223> 412-425 <400> 2

Gin Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His 15 10

Ile Asn Ser Thr < 210> 3 <211> 13 < 212> PRT <213> Hepatitis C virus <220>

<223> 434-446 <400> 3

Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gin His Lys

10 <210> 4 <211> 19 < 212> PRT < 213> Artificial Seguence <220>

<223> 502-520 <400> 4

Val Ala Gly Pro Val Tyr Ala Phe Thr 1 5

Thr Thr Asp

Pro Ser Pro Val Val Val Gly

15 < 210> 5 <211> 13 < 212> PRT < 213> Hepatitis C virus <220>

<223> 523-535 <400> 5

PL 239 831 BI

Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Ala Asn 15 10

Asp Thr Asp <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> sHBsAg_523-535 <220>

<221> PEPTIDE <222> 128 . .140 <223> Seq. 5 <400> 6

Met 1

Glu

Asn

Ile

Ala 5

Ser

Gly

Leu

Gly 10

Pro

Leu

Val

Leu 15

Gin

Ala

Gly

Phe

Phe 20

Leu

Thr

Lys

Ile 25

Leu

Thr

Ile

Pro

Gin 30

Ser

Leu

Asp

Ser

Trp 35

Trp

Thr

Ser

Leu

Asn 40

Phe

Leu

Gly

Thr 45

Pro

Val

Cys

Leu

Gly 50

Gin

Asn

Ser

Gin

Ser 55

Gin

Ile

Ser

His 60

Ser

Pro

Thr

Cys

Cys 65

Pro

Ile

Cys

Pro 70

Gly

Tyr

Arg

Trp

Met 75

Cys

Leu

Arg

Phe 80

Ile

Phe

Leu

Cys 85

Ile

Leu

Cys 90

Leu

Ile

Phe

Leu

Leu 95

Val

Leu

Asp

Tyr 100

Gin

Gly

Met

Leu

Pro 105

Val

Cys

Pro

Leu

Ile 110

Pro

Gly

Ser

Thr 115

Thr

Ser

Thr

Gly

Pro 120

Cys

Lys

Thr

Cys

Thr 125

Thr

Pro

Gly

Ala

Pro 130

Thr

Tyr

Ser

Trp

Gly 135

Ala

Asn

Asp

Thr

Asp 140

Ala

Gin

Gly

Thr

Ser 145

Met

Phe

Pro

Ser

Cys 150

Cys

Thr

Lys

Pro 155

Thr

Asp

Gly

Asn

Cys 160

Thr

Cys

Ile

Pro

Ile 165

Pro

Ser

Trp

Ala 170

Phe

Ala

Lys

Tyr

Leu 175

Trp

Glu

Trp

Ala

Ser 180

Val

Arg

Phe

Ser

Trp 185

Leu

Ser

Leu

Val 190

Pro

Phe

Val

Gin

Trp 195

Phe

Val

Gly

Leu

Ser 200

Pro

Thr

Val

Trp

Leu 205

Ser

Val

Ile

Trp

Met 210

Met

Trp

Tyr

Trp

Gly 215

Pro

Ser

Leu

Tyr

Asn 220

Ile

Leu

Ser

Pro

Phe 225

Met

Pro

Leu

Pro 230

Ile

Phe

Cys

Leu 235

Trp

Val

Tyr

Ile

<210> 7 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence

PL 239 831 Β1 <220>

<223> sHBsAg_434-446_523-535 <220>

<221> PEPTIDE < 222> 111..123 < 223> Seq. 3 <220>

< 221> PEPTIDE < 222> 135..147 < 223> Seq. 5 <400> 7

Met

Glu

Asn

Ile

Ala

Ser

Gly

Leu

Gly

Pro

Leu

Val

Leu

Gin

1 Ala

Gly

Phe

5 Leu

Leu

Thr

Lys

Ile

10 Leu

Thr

Ile

Pro

Gin

15 Ser

Leu

Asp

Ser

Trp

20 Trp

Thr

Ser

Leu

Asn

25 Phe

Leu

Gly

Thr

30 Pro

Val

Cys

Leu

Gly

35 Gin

Asn

Ser

Gin

Ser

40 Gin

Ile

Ser

His

45 Ser

Pro

Thr

Cys

50 Pro

Pro

Ile

Cys

Pro

55 Gly

Tyr

Arg

Trp

Met

60 Cys

Leu

Arg

Phe

65 Ile

Ile

Phe

Leu

Cys

70 Ile

Leu

Cys

75 Leu

Ile

Phe

Leu

80 Val

Leu

Asp

Tyr

85 Gin

Gly

Met

Leu

Pro

90 Val

Cys

Pro

Leu

Ile

95 Asn

Thr

Gly

Trp

Leu

100 Ala

Gly

Leu

Phe

Tyr

105 Gin

His

Lys

Ser

Thr

110 Gly

Pro

Cys

Lys

Thr

115 Cys

Thr

Pro

Gly

120 Ala

Pro

Thr

Tyr

Ser

125 Trp

Gly

Ala

Asn

Asp

130 Thr

Asp

Ala

Gin

Gly

135 Thr

Ser

Met

Phe

Pro

140 Ser

Cys

Thr

145 Lys

Pro

Thr

Asp

Gly

150 Asn

Cys

Thr

Cys

Ile

155 Pro

Ile

Pro

Ser

160 Trp

Ala

Phe

Ala

Lys

165 Tyr

Leu

Trp

Glu

Trp

170 Ala

Ser

Val

Arg

Phe

175 Ser

Trp

Leu

Ser

Leu

180 Leu

Val

Pro

Phe

Val

185 Gin

Trp

Phe

Val

Gly

190 Leu

Ser

Pro

Thr

Val

195 Trp

Leu

Ser

Val

Ile

200 Trp

Met

Trp

Tyr

205 Trp

Gly

Pro

Ser

Leu

210 Tyr

Asn

Ile

Leu

Ser

215 Pro

Phe

Met

Pro

Leu

220 Leu

Pro

Ile

Phe

225 Cys

Leu

Trp

Val

Tyr 245

230 Ile

235

240

< 210> 8 <211> 252 < 212> PRT < 213> Artificial Sequence

PL 239 831 Β1 <220>

<223> sHBsAg_502-52 <220>

<221> PEPTIDE <222> 111..129 <223> Seq. 4 <220>

<221> PEPTIDE <222> 141..153 <223> Seq. 5 <400> 8

Met Glu Asn Ile Ala 1 5

Ala Gly Phe Phe Leu 20

Asp Ser Trp Trp Thr 35

Leu Gly Gin Asn Ser 50

Cys Pro Pro Ile Cys 65

Ile Ile Phe Leu Cys 85

Leu Leu Asp Tyr Gin 100

Gly Pro Val Tyr Ala 115

Asp Ser Thr Gly Pro 130

Tyr Ser Trp Gly Ala 145

Pro Ser Cys Cys Cys 165

Pro Ile Pro Ser Ser 180

Ser Val Arg Phe Ser 195

Phe Val Gly Leu Ser 210

Trp Tyr Trp Gly Pro 225 Leu Leu Pro Ile Phe 245

523-535

Ser Gly Leu Leu Gly 10

Leu Thr Lys Ile Leu 25

Ser Leu Asn Phe Leu 40

Gin Ser Gin Ile Ser 55

Pro Gly Tyr Arg Trp 70

Ile Leu Leu Leu Cys 90

Gly Met Leu Pro Val 105

Phe Thr Pro Ser Pro 120

Cys Lys Thr Cys Thr 135

Asn Asp Thr Asp Ala 150

Thr Lys Pro Thr Asp 170

Trp Ala Phe Ala Lys 185

Trp Leu Ser Leu Leu 200

Pro Thr Val Trp Leu 215

Ser Leu Tyr Asn Ile 230

Phe Cys Leu Trp Val 250

Pro Leu Leu Val Leu 15

Thr Ile Pro Gin Ser 30

Gly Gly Thr Pro Val 45

Ser His Ser Pro Thr 60

Met Cys Leu Arg Arg 75

Leu Ile Phe Leu Leu 95

Cys Pro Leu Ile Val 110

Val Val Val Gly Thr 125

Thr Pro Gly Ala Pro 140

Gin Gly Thr Ser Met 155

Gly Asn Cys Thr Cys 175

Tyr Leu Trp Glu Trp 190

Val Pro Phe Val Gin 205

Ser Val Ile Trp Met 220

Leu Ser Pro Phe Met 235

Tyr Ile

Gin

Leu

Cys

Phe 80

Val

Ala

Thr

Phe 160 Ile

Ala

Trp

Met

Pro

240 <210> 9 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence

PL 239 831 Β1 <220>

<223> sHBsAg_523-535 <220>

<221> PEPTIDE <222> 111..123 <223> Seg. 5 <400> 9

Met 1

Glu

Asn

Ile

Ala 5

Ser

Gly

Leu

Gly 10

Pro

Leu

Val

Leu 15

Gin

Ala

Gly

Phe

Phe 20

Leu

Thr

Lys

Ile 25

Leu

Thr

Ile

Pro

Gin 30

Ser

Leu

Asp

Ser

Trp 35

Trp

Thr

Ser

Leu

Asn 40

Phe

Leu

Gly

Thr 45

Pro

Val

Cys

Leu

Gly 50

Gin

Asn

Ser

Gin

Ser 55

Gin

Ile

Ser

His 60

Ser

Pro

Thr

Cys

Cys 65

Pro

Ile

Cys

Pro 70

Gly

Tyr

Arg

Trp

Met 75

Cys

Leu

Arg

Phe 80

Ile

Phe

Leu

Cys 85

Ile

Leu

Cys 90

Leu

Ile

Phe

Leu

Leu 95

Val

Leu

Asp

Tyr 100

Gin

Gly

Met

Leu

Pro 105

Val

Cys

Pro

Leu

Ile 110

Gly

Ala

Pro

Thr

Tyr 115

Ser

Trp

Gly

Ala

Asn 120

Asp

Thr

Asp

Ser

Thr 125

Gly

Pro

Cys

Lys

Thr 130

Cys

Thr

Pro

Ala 135

Gin

Gly

Thr

Ser

Met 140

Phe

Pro

Ser

Cys

Cys 145

Cys

Thr

Lys

Pro

Thr 150

Asp

Gly

Asn

Cys

Thr 155

Cys

Ile

Pro

Ile

Pro 160

Ser

Trp

Ala

Phe 165

Ala

Lys

Tyr

Leu

Trp 170

Glu

Trp

Ala

Ser

Val 175

Arg

Phe

Ser

Trp

Leu 180

Ser

Leu

Val

Pro 185

Phe

Val

Gin

Trp

Phe 190

Val

Gly

Leu

Ser

Pro 195

Thr

Val

Trp

Leu

Ser 200

Val

Ile

Trp

Met

Met 205

Trp

Tyr

Trp

Gly Ile 225

Pro 210 Phe

Ser Phe

Leu Cys

Tyr Leu

Asn Trp 230

Ile 215 Val

Leu Tyr

Ser Ile

Pro

Phe

Met 220

Pro

Leu

Pro

<210> 10 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Seguence <220>

<223> sHBsAg_412-425_523-535 <220>

<221> PEPTIDE

PL 239 831 BI < 222> 111..124 < 223> Seq. 2 <220>

< 221> PEPTIDE < 222> 136. .148 < 223> Seq. 5 <400> 10

Met Glu Asn Ile 1

Ala Gly Phe Phe 20

Asp Ser Trp Trp 35

Leu Gly Gin Asn 50

Cys Pro Pro Ile 65

Ile Ile Phe Leu

Leu Leu Asp Tyr 100

Ile Asn Thr Asn 115

Cys Lys Thr Cys 130

Asn Asp Thr Asp 145

Thr Lys Pro Thr

Trp Ala Phe Ala 180

Trp Leu Ser Leu 195

Pro Thr Val Trp 210

Ser Leu Tyr Asn 225

Phe Cys Leu Trp

Ala Ser Gly Leu 5

Leu Leu Thr Lys

Thr Ser Leu Asn

Ser Gin Ser Gin

Cys Pro Gly Tyr 70

Cys Ile Leu Leu 85

Gin Gly Met Leu

Gly Ser Trp His 120

Thr Thr Pro Gly 135

Ala Gin Gly Thr 150

Asp Gly Asn Cys 165

Lys Tyr Leu Trp

Leu Val Pro Phe

200

Leu Ser Val Ile

215

Ile Leu Ser Pro 230

Val Tyr Ile 245

Leu Gly Pro Leu 10

Ile Leu Thr Ile 25

Phe Leu Gly Gly

Ile Ser Ser His

Arg Trp Met Cys 75

Leu Cys Leu Ile 90

Pro Val Cys Pro 105

Ile Asn Ser Thr

Ala Pro Thr Tyr 140

Ser Met Phe Pro 155

Thr Cys Ile Pro 170

Glu Trp Ala Ser 185

Val Gin Trp Phe

Trp Met Met Trp

220

Phe Met Pro Leu

235

Leu Val Leu Gin 15

Pro Gin Ser Leu

Thr Pro Val Cys 45

Ser Pro Thr Cys

Leu Arg Arg Phe 80

Phe Leu Leu Val 95

Leu Ile Gin Leu

110

Ser Thr Gly Pro 125

Ser Trp Gly Ala

Ser Cys Cys Cys 160

Ile Pro Ser Ser 175

Val Arg Phe Ser 190

Val Gly Leu Ser 205

Tyr Trp Gly Pro

Leu Pro Ile Phe

240 <210> 11 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220>

<223> sHBsAg 523-535 502-520 <220>

<221> PEPTIDE <222> 111..123

PL 239 831 Β1 <223> Seq. 5 <220>

<221> PEPTIDE <222> 135..153 <223> Seq. 4 <400> 11

Met Glu Asn Ile 1

Ala Gly Phe Phe 20

Asp Ser Trp Trp 35

Leu Gly Gin Asn 50

Cys Pro Pro Ile 65

Ile Ile Phe Leu

Leu Leu Asp Tyr 100

Pro Thr Tyr Ser 115

Lys Thr Cys Thr 130

Ser Pro Val Val 145

Pro Ser Cys Cys

Pro Ile Pro Ser

180

Ser Val Arg Phe 195

Phe Val Gly Leu 210

Trp Tyr Trp Gly 225

Leu Leu Pro ILe

Ala Ser Gly Leu 5

Leu Leu Thr Lys

Thr Ser Leu Asn

Ser Gin Ser Gin 55

Cys Pro Gly Tyr 70

Cys Ile Leu Leu 85

Gin Gly Met Leu

Trp Gly Ala Asn 120

Thr Pro Val Ala 135

Val Gly Thr Thr 150

Cys Thr Lys Pro 165

Ser Trp Ala Phe

Ser Trp Leu Ser 200

Ser Pro Thr Val 215

Pro Ser Leu Tyr 230

Phe Phe Cys Leu 245

Leu GLy Pro Leu 10

Ile Leu Thr Ile 25

Phe Leu Gly Gly

Ile Ser Ser His 60

Arg Trp Met Cys 75

Leu Cys Leu Lle 90

Pro Val Cys Pro 105

Asp Thr Asp Ser

Gly Pro Val Tyr 140

Asp Ala Gin Gly 155

Thr Asp Gly Asn 170

Ala Lys Tyr Leu 185

Leu Leu Val Pro

Trp Leu Ser Val 220

Asn Ile Leu Ser 235

Trp Val Tyr ILe 250

Leu Val Leu GLn 15

Pro Gin Ser Leu 30

Thr Pro Val Cys 45

Ser Pro Thr Cys

Leu Arg Arg Phe 80

Phe Leu Leu Val 95

Leu Ile Gly Ala 110

Thr Gly Pro Cys 125

Ala Phe Thr Pro

Thr Ser Met Phe

160

Cys Thr Cys Ile 175

Trp Glu Trp Ala 190

Phe Val Gin Trp 205

Ile Trp Met Met

Pro Phe Met Pro

240 <210> 12 <211> 247 < 212> PRT < 213> Artificial Seguence <220>

<223> sHBsAg_523-535_412-425 <220>

<221> PEPTIDE <222> 111..123 <223> Seq. 5

PL 239 831 Β1 <220>

< 221> PEPTIDE < 222> 135..148 <223> Seg. 2 <400> 12

Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gin 15 1015

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro Gin Ser Leu 20 2530

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys 35 4045

Leu Gly Gin Asn Ser Gin Ser Gin Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys 50 5560

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg ArgPhe

70 7580

Ile Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu LeuVal

9095

Leu Leu Asp Tyr Gin Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Gly Ala 100 105110

Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Ser Thr Gly Pro Cys 115 120125

Lys Thr Cys Thr Thr Pro Gin Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser Trp His 130 135140

Ile Asn Ser Thr Ala Gin Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys CysCys

145 150 155160

Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro SerSer

165 170175

Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 180 185190

Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val GLn Trp Phe VaL Gly Leu Ser 195 200205

Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 210 215220

Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Ile Phe 225 230 235240

Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile 245 <210> 13 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Seguence <220>

<223> sHBsAg_523-535_434-446 <220>

<221> PEPTIDE <222> 111..123 <223> Seg. 5

PL 239 831 Β1 <220>

<221> PEPTIDE <222> 135..147 <223> Seq. 3 <400> 13

Met 1

Glu

Asn

Ile

Ala 5

Ser

Gly

Leu

Gly 10

Pro

Leu

Val

Leu 15

Gin

Ala

Gly

Phe

Phe 20

Leu

Thr

Lys

Ile 25

Leu

Thr

Ile

Pro

Gin 30

Ser

Leu

Asp

Ser

Trp 35

Trp

Thr

Ser

Leu

Asn 40

Phe

Leu

Gly

Thr 45

Pro

Val

Cys

Len

Gly 50

Gin

Asn

Ser

Gin

Ser 55

Gin

Ile

Ser

His 60

Ser

Pro

Thr

Cys

Cys 65

Pro

Ile

Cys

Pro 70

Gly

Tyr

Arg

Trp

Met 75

Cys

Leu

Arg

Phe 80

Ile

Phe

Leu

Cys 85

Ile

Leu

Cys 90

Leu

Ile

Phe

Leu

Leu 95

Val

Leu

Asp

Tyr 100

Gin

Gly

Met

Leu

Pro 105

Val

Cys

Pro

Leu

Ile 110

Gly

Ala

Pro

Thr

Tyr 115

Ser

Trp

Gly

Ala

Asn 120

Asp

Thr

Asp

Ser

Thr 125

Gly

Pro

Cys

Lys

Thr 130

Cys

Thr

Pro

Asn 135

Thr

Gly

Trp

Leu

Ala 140

Gly

Leu

Phe

Tyr

Gin 145

His

Lys

Ala

Gin

Gly 150

Thr

Ser

Met

Phe

Pro 155

Ser

Cys

Thr 160

Lys

Pro

Thr

Asp

Gly 165

Asn

Cys

Thr

Cys

I le 170

Pro

Ile

Pro

Ser

Ser 175

Trp

Ala

Phe

Ala

Lys 180

Tyr

Leu

Trp

Glu

Trp 185

Ala

Ser

Val

Arg

Phe 190

Ser

Trp

Leu

Ser

Leu 195

Leu

Val

Pro

Phe

Val 200

Gin

Trp

Phe

Val

Gly 205

Leu

Ser

Pro

Thr

Val 210

Trp

Leu

Ser

Val

Ile 215

Trp

Met

Trp

Tyr 220

Trp

Gly

Pro

Ser

Leu 225 Cys

Tyr Leu

Asn Trp

Ile Val

Leu Tyr 245

Ser 230 Ile

Pro

Phe

Met

Pro

Leu 235

Leu

Pro

Ile

Phe

Phe 240

<210> 14 <211> 246 < 212> PRT < 213> Artificial Seguence <220>

<223> sHBsAg 523-535 523-535 <220>

<221> PEPTIDE <222> 111..123 <223> Seq. 5

PL 239 831 Β1 <220>

<221> PEPTIDE < 222> 135. .147 < 223> Seq. 5 < 400> 14

Met Glu Asn Ile 1

Ala Gly Phe Phe 20

Asp Ser Trp Trp 35

Leu Gly Gin Asn 50

Cys Pro Pro Ile 65

Ile Ile Phe Leu

Leu Leu Asp Tyr 100

Pro Thr Tyr Ser 115

Lys Thr Cys Thr 130

Asp Thr Asp Ala 145

Lys Pro Thr Asp

ALa Phe ALa Lys 180

Leu Ser Leu Leu 195

Thr Val Trp Leu 210

Leu Tyr Asn Ile 225

Cys Leu Trp Val

Ala Ser Gly Leu 5

Leu Leu Thr Lys

Thr Ser Leu Asn 40

Ser Gin Ser Gin 55

Cys Pro Gly Tyr 70

Cys Ile Leu Leu 85

Gin Gly Met Leu

Trp Gly Ala Asn 120

Thr Pro Gly Ala 135

Gin Gly Thr Ser 150

Gly Asn Cys Thr 165

Tyr Leu Trp Glu

Val Pro Phe Val

200

Ser Val Ile Trp 215

Leu Ser Pro Phe 230

Tyr Ile 245

Leu Gly Pro Leu 10

Ile Leu Thr Ile 25

Phe Leu GLy GLy

Ile Ser Ser His 60

Arg Trp Met Cys 75

Leu Cys Leu Lle 90

Pro Val Cys Pro 105

Asp Thr Asp Ser

Pro Thr Tyr Ser

140

Met Phe Pro Ser 155

Cys Ile Pro Ile 170

Trp Ala Ser Val 185

Gin Trp Phe Val

Met Met Trp Tyr 220

Met Pro Leu Leu 235

Leu Val Leu Gin 15

Pro Gin Ser Leu 30

Thr Pro VaL Cys 45

Ser Pro Thr Cys

Leu Arg Arg Phe 80

Phe Leu Leu Val 95

Leu Lle Gly Ala 110

Thr Gly Pro Cys 125

Trp Gly Ala Asn

Cys Cys Cys Thr 160

Pro Ser Ser Trp 175

Arg Phe Ser Trp 190

Gly Leu Ser Pro 205

Trp Gly Pro Ser

Pro Ile Phe Phe

240 <210> 15 <211> 19 <212> PRT < 213> Hepatitis C virus <220>

<223> 502-520 <400> 15

Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly 15 10 15

Thr Thr Asp

Claims

PL 239 831 B1

Zastrzeżenia patentowe

1. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 6 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.
2. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 7 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1, sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 3 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.
3. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 8 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1, sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 4 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.
4. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 9 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.
5. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 10 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1, sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 2 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.
6. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 11 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1, sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 4 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.
7. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 12 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1, sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 2 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.
8. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 13 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1, sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 3 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.
9. Białko chimeryczne przedstawione na Seq. 14 zawierające sekwencję małego białka powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B o sekwencji przedstawionej na Seq. 1, sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 oraz sekwencję antygenową przedstawioną na Seq. 5 do zastosowania w leczeniu prewencyjnym zakażenia HCV i/lub HBV.