PT778781E - Vacinas de conjugados de polissacarido pneumococico-pneumolisina recombinante para imunizacao contra infeccoes pneumococcicas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "VACINAS DE CONJUGADOS DE POLISSACÁRIDO PNEUMOCÓCICO-PNEUMOLISINA RECOMBINANTE PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA INFECÇÕES PNEUMOCÓCCICAS"

Campo do invento

Este invento está relacionado com um conjugado imunogénico de polissacárido-proteína, compreendendo um polissacárido oxidado de Strepto-coccal pneumoniae e a proteína pneumolisina de S. pneumoniae que é expressa por via recombinante, em que a referida pneumolisina não foi tomada toxóide ou não foi produzida por mutagénese dirigida antes da conjugação com o referido polissacárido oxidado.

Fundamentos do invento

Streptococcal pneumoniae (S. pneumoniae) é o principal agente patogénico da pneumonia bacteriana e é também uma das principais causas da otite média bacteriana ( infecções do ouvido médio), meningite e bacteriémia. Existem pelo menos 83 tipos de organismos pneumocócicos, cada um deles com uma estrutura química diferente no que respeita ao polissacárido capsular. O polissacárido capsular é o principal factor de virulência dos pneumococos e induz uma resposta de anticorpos em adultos. Presentemente, está disponível uma vacina polivalente de 23 polissacáridos (como seja Pnu-Imune®, American Cyanamid Company, Wayne, NJ) para adultos e crianças com mais de dois anos de idade. A preparação desta vacina de polissacárido pneumocócico purificado -2-está descrita na Patente U.S. Nos. 4 242 501, 4 221 906 e 4 686 102 (entradas da Bibliografia 1,2 e 3). No entanto, as crianças com menos de dois anos de idade não induzem uma boa resposta imune a este tipo de vacina. US-A-4902506 descreve conjugados imunogénicos produzidos por aminação redutora. O fragmento de polímero pode ser um polissacárido oxidado de S. pneumoniae, incluindo o serotipo 14. A toxina bacteriana pode ser uma toxina de estreptococos ou toxóide; no entanto, não existe uma descrição específica de que a toxina bacteriana possa ser pneumolisina.

Phillips et al., Carbohydrate Research, 121, 243-255 (1983), descrevem a análise da estrutura da unidade repetitiva de oligossacárido do polissacárido capsular penumocócico tipo 18C, incluindo oxidação do açúcar com periodato.

Para modificar as características imunológicas e aumentar a imunogenicidade do polissacárido em crianças com menos de dois anos de idade, o polissacárido foi conjugado covalentemente com um veículo proteico para formar um conjugado de polissacárido-proteína. A preparação do conjugado de polissacárido-proteína está descrita na Patente U.S. No. 4 673 574 (4). A patente está relacionada com a preparação de conjugados imunogénicos compreendendo um fragmento de polissacárido derivado do polímero capsular de S. pneumoniae ou de Haemophilus influenzae tipo b contendo um ou mais grupos redutores e uma toxina bacteriana ou toxóide, especificamente a toxina da difteria não tóxica (como seja CRM197) como veículo proteico.

Foi descrito um esforço para aumentar a imunogenicidade de um polissacárido em que se usou mutagénese dirigida para obter toxóides não tóxicos de uma proteína tóxica de S. pneumoniae, pneumolisina. Os toxóides de -3 -pneumolisina mutante resultantes foram conjugados com o polissacárido capsular pneumocócico Tipo 19F através da utilização de um agente de ligação ou espaçador, o ácido 6-aminocapróico. O conjugado aumentou a imunogenicidade do grupo polissacárido Tipo 19F comparado com a do polissacárido não conjugado (5, 6). Um estudo de continuidade indicou que a pneumolisina nativa não tomada toxóide é inadequada para a inclusão numa vacina devido à sua toxicidade (7).

No entanto, apesar destes e doutros esforços, não existe uma vacina eficaz contra S. pneumoniae em crianças com menos de dois anos de idade. Assim, verifica-se a necessidade de tal vacina.

Sumário do invento

Constitui um objectivo deste invento proporcionar conjugados imunogénicos de polissacárido-proteína compreendendo um polissacárido oxidado derivado do polissacárido capsular de S. pneumoniae, e um veículo proteico, a proteína pneumolisina de S. pneumoniae que é expressa por via recombinante, em que a referida pneumolisina não foi tomada toxóide ou não foi produzida por mutagénese dirigida antes da conjugação com o referido polissacárido oxidado. A pneumolisina não foi tomada toxóide; no entanto, o conjugado resultante possui uma toxicidade grandemente reduzida.

Numa realização deste invento, o polissacárido oxidado é conjugado directamente com a proteína pneumolisina. Numa realização deste invento, a proteína pneumolisina é primeiro ligada a um espaçador e depois é conjugada com o polissacárido oxidado.

Constitui ainda um objectivo deste invento vacinas compreendendo estes conjugados. Estas vacinas são úteis para induzir uma resposta de anticorpos contra o polissacárido capsular de S. pneumoniae em animais de sangue quente.

Constitui ainda um outro objectivo deste invento que estas vacinas sejam usadas para imunizar contra doença causada por S. pneumoniae em animais de sangue quente, através da administração destas vacinas, numa quantidade imunogénica, por injecção intramuscular ou subcutânea.

Numa realização adicional deste invento, a vacina compreende uma mistura de pelo menos dois conjugados imunogénicos com polissacáridos oxidados derivados dos polissacáridos capsulares de diferentes tipos de S. pneumoniae.

Na preparação dos conjugados o polissacárido Tipo 18C de S. pneumoniae é tratado com ácido suave para despolimerizar parcialmente o polissacárido antes da oxidação, de modo a que a conjugação com pneumolisina recombinante ("rPL") seja realizada com êxito.

As vacinas de conjugado deste invento são altamente imunogénicas em animais de sangue quente. As vacinas induzem anticorpos contra o polissacárido e contra a proteína pneumolisina recombinante.

Os conjugados deste invento possuem vantagens distintas relativamente aos descritos anteriormente, pelo facto de a proteína veículo derivar da pneumolisina, a qual foi descrita como sendo um factor de virulência nas infecções por pneumococos (8). As vacinas de conjugado deste invento induzem anticorpos contra o polissacárido e contra a pneumolisina (ambos são factores de virulência), e conferem imunidade contra doenças causadas por S. pneumoniae. Os conjugados induzem anticorpos contra a pneumolisina que são -5- M h^rfr CL—v.( <ui capazes de neutralizar as actividades hemolítica e citotóxica da toxina, sem a necessidade de um espaçador ou agente de ligação descrito anteriormente (5, 6), se bem que tais espaçadores possam ser usados. A pneumolisina recombinante retem a sua conformação ao mesmo tempo que é tomada não tóxica.

Para além de permitir que as vacinas confiram imunidade em crianças com idade inferior a dois anos, a protéina veículo, rPL, pode ela própria conferir imunidade e não actuar apenas como veículo para o polissacárido oxidado. Finalmente, devido às vacinas de conjugado não incluírem a utilização da totalidade do organismo S. pneumoniae, a administração das vacinas não induzirá doença causada por S. pneumoniae.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 descreve um mapa físico dos clones com o gene da pneumolisina (ply) de S. pneumoniae Tipos 18C e 20. Os sítios de restrição são abreviados como se segue: Bs = BstYl, SI = Sall, Hd = Hindíll, EV - EcoKV. A Figura 2 descreve o esquema da subclonagem do gene ply de S. pneumoniae Tipo 18C num vector de expressão, pGEX-2T, para gerar pGEX-PL 18C-31. Os sítios de restrição estão abreviados como se segue: EI = EcoRl, Bs = BstYl, Hd = HindUl, EV = EcoRY, BH = BamHI. A Figura 3 descreve o método usado para purificar a rPL expressa por via recombinante. A Figura 4A descreve um SDS-PAGE (8-16% de acrilamida corado com azul Coomassie) das preparações de rPL em cada um dos passos de purificação. As faixas são como se segue: 1. células E. coli antes da indução com -6- IPTG, 2. células de E. coli após indução com IPTG durante 45 minutos, 3. células de E. coli após indução com IPTG durante 2 horas, 4. lisado de células totais de E. coli induzidas, 5. proteínas de E. coli não ligadas ao gel da coluna de afinidade (GST-rPL liga-se à coluna), 6. proteína de fusão purificada, GST-rPL, após eluição, 7. mistura de GST e rPL após digestão com trombina da proteína de fusão. 8. rPL purificada (sem GST e sem trombina), 9. marcadores moleculares (cada um deles em KD) como se segue: 97.4 - fosforilase B; 66-albumina sérica bovina; 45 - ovalbumina; 31 - anidrase carbónica; 21.5 - inibidor da tripsina; 14,5 - lisozima. A Figura 4B descreve uma imunotransferência de preparações de rPL em cada um dos passos de purificação. Na imunotransferência usaram-se anti-soros de coelho contra pneumolisina nativa. As faixas 1-8 correspondem às faixas 1-8 da Figura 4A.

Descrição Detalhada do Invento A pneumolisina, uma toxina hemolítica activada por sulfidrilo de 471 resíduos de comprimento, é produzida por todos os tipos de S. pneumoniae e é considerada um factor de virulência putativo nas infecções por pneumococos. Esta toxina tem um peso molecular de aproximadamente 53 000 daltons (53 KD). Os ratinhos e ratos injectados com pneumolisina inactivada apresentam uma maior sobrevivência quando posteriormente infectados com S. pneumoniae viva (9, 10). Assim, a pneumolisina é um potencial candidato a vacina e, como se mostra neste invento, é uma proteína veículo útil para a preparação de uma vacina de conjugado. Uma vez que a pneumolisina nativa é produzida num baixo nível em S. pneumoniae, foi efectuada a construção de uma E. coli recombinante a expressar níveis elevados de rPL. Os genes da pneumolisina já foram clonados, sequenciados e expressos em E. coli a partir de S. pneumoniae tipos 1 (11), 2(12) -7- i'o*-YH, ( ^ e 19F (13), assim como em Bacillus subtilis (13A). A pneumolisina não é secretada pela bactéria S. pneumoniae, aparentemente devido à ausência de uma sequência sinal (12).

Entre os aspectos deste invento exemplificados abaixo estão processos que incluem a clonagem do gene da pneumolisina de S. pneumoniae e a expressão da pneumolisina em E. coli, em níveis várias vezes superiores ao normal, como proteína de fusão usando o sistema de fusão da glutationa S-transferase (GST) e purificação da rPL de 53 kilodaltons (kD) usando cromatografia de afinidade com uma coluna de glutationa-agarose e clivagem da GST na proteína de fusão contendo GST-rPL usando a tromnbina como protease específica de sítio. Determinou-se a composição em aminoácidos, sequência de aminoácidos terminal e reactividades imunológicas de rPL. A rPL obtida desta forma é igual à proteína nativa, excepto após a remoção da GST da proteína de fusão, estarem presentes dois aminoácidos adicionais no extremo amina de rPL.

Conforme detalhado no Exemplo 1 abaixo, os vectores de expressão contendo o gene da pneumolisina do Tipo 18C ou um gene híbrido de pneumolisina, derivado de uma fusão de segmentos do gene do Tipo 18C e do Tipo 20, são preparados e inseridos em hospedeiros E. coli. Outros tipos de S. pneumoniae são igualmente fontes adequadas do gene da pneumolisina. Outras células hospedeiras convencionais são adequadas para a expressão de rPL.

Amostras de E. coli estirpe SCSI portadoras do plasmídeo recombinante pGEX-PL foram depositadas pelos Requerentes na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., e foi-lhes atribuido o número de acesso ATCC 69654.

Amostras de E. coli estirpe SCSI portadoras do plasmídeo -8-

recombinante pGEX-PL 18C/20 foram depositadas pelos requerentes na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., e foi-lhes dado o número de acesso ATCC 69655. O material depositado na ATCC pode ser igualmente usado, em conjunção com tecnologia de engenharia genética convencional, para gerar a proteína pneumolisina nativa, a qual não possui os resíduos adicionais de glicina e serina que permanecem após a clivagem com trombina no extremo N.

Os polissacáridos capsulares de vários tipos de pneumococos usados neste invento foram descritos nas Patentes U.S. Nos. 4 242 501 e 4 686 102 (1, 3). Os polissacáridos de pneumococos assim obtidos possuem um peso molecular relativamente elevado, com mais de 50% tendo um coeficiente de eluição (KaV) inferior a 0,3 numa coluna de Sepharose™ CL-4B (Phamacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Este valor corresponde a um peso molecular superior a 6 x 105 daltons.

Na sua forma nativa, os polissacáridos dos organismos pneumo-cócicos não contêm grupos redutores reactivos. De forma a criar polissacáridos reactivos contendo grupos redutores, o polissacárido foi parcialmente hidrolizado com quantidades controladas de periodato de sódio para produzir grupos redutores através da clivagem do grupo hidroxilo cis-proximal do polissacárido por oxidação com periodato, para gerar grupos aldeído seguindo o processo de Parikh, et al., (14). Os polissacáridos pneumocócicos purificados foram tratados, no escuro, com periodato de sódio 0,2-50 mM a 4°C ou à temperatura ambiente durante vários intervalos de tempo. Numa realização preferida, o polissacárido é tratado a pH 4,0-5,0. Prefere-se a utilização de periodato de sódio.

Num processo para a preparação dos polissacáridos de -9- pneumococos oxidados, tais como os Tipos 6B, 14 e 18C [O] 14 e [0]18C), são criados grupos reactivos do polissacárido por clivagem acídica fraca ou oxidativa usando periodato.

Após oxidação, o polissacárido oxidado ("[0]PS") é então extensivamente dialisado contra água apirogénica para remover materiais de baixo peso molecular. Como alternativa, pode ser usada uma coluna de filtração em gel como seja Sepharose™ CL-4B para a purificação de [0]PS. Quando se usa uma coluna de filtração em gel, as fracções são testadas quanto à presença de [O] PS pelo método calorimétrico de fenol-ácido sulfurico usando o polissacárido correspondente purificado como padrão (15). O produto purificado é então recuperado por concentração e liofilização. O [0]PS resultante possui uma cadeia com um comprimento de cerca de 15-800 unidades monoméricas.

Usou-se um novo método para criar os grupos reactivos no Tipo 18C: O polissacárido foi parcialmente despolimerizado, clivado para produzir uma molécula de tamanho intermédio e depois oxidado.

Se a oxidação for realizada na ausência de despolimerização parcial, obtem-se um material do tipo gel que não pode ser posteriormente usado. Para ultrapassar este problema, o polissacárido Tipo 18C é primeiro parcialmente despolimerizado por ácido suave, como seja tratamento com ácido acético, para reduzi-lo a um tamanho molecular de aproximadamente 10 000- 600 00 (KgV numa coluna de Sepharose CL-4B de 0,3-0,7). Só então o polissacárido Tipo 18C é sujeito à oxidação com periodato como descrito atrás para criar grupos redutores funcionais. Quando conjugado com rPL como descrito abaixo, o produto está na forma adequada a ser usado como vacina. O [OjPS é acoplado com a rPL como proteína veículo usando - 10- CL—<lUi conjugação directa ou indirecta. Para a conjugação directa, o [0]PS é conjugado com a rPL usando cianoboro-hidreto para aminação redutora por meios convencionais.

Os grupos aldeído funcionais no [0]PS reagem com rPL, a qual contem grupos amina (particularmente grupos lisina), para formar uma base de Schiff. Na presença de um agente redutor selectivo suave, como seja cianoboro-hidreto, forma-se um conjugado estável ligado covalentemente. A reacção é preferencialmente realizada a pH 5 a 9. A metodologia para a acoplagem de [0]PS a uma proteína usando cianoboro-hidreto foi descrita por Paik et al., (14) e Schwartz e Gray (16). O [0]PS pneumocócico do tipo 6B, 14 ou 18C (concentração 1-10 mg/ml) é misturado com rPL (concentração 1-10 mg/ml) em tampão fosfato de potássio ou tampão fosfato de sódio 0,2M (pH 6,0-8,0) à temperatura ambiente ou 37°C.

Após 30 minutos de incubação com agitação suave, adicionou-se 0,1-2,0 mM de cianoboro-hidreto de sódio. Esta mistura foi incubada a 25-37°C, com mistura suave durante 1-8 dias, para formar o conjugado [0]PS-rPL. O conjugado é purificado numa coluna de filtração em gel como seja Sepharose™ CL-4B. As fracções foram testadas quanto ao teor de proteína pelo método de Bradford com o reagente de ensaio de proteínas da Bio-Rad (17), usando albumina sérica bovina como padrão, e testado quanto ao teor em [0]PS como descrito previamente (15). As fracções que contêm o conjugado são reunidas, dialisadas e diafiltradas e/ou liofilizadas.

Como alternativa, a rPL é primeiro ligada a um espaçador antes da conjugação com o [OjPS. São exemplos de tais espaçadores a di-hidrazida de ácido adípico (ADH) e o ácido 6-aminocapróico. ADH é o espaçador preferido. - 11 -

Os conjugados processados de acordo com este invento são preferencialmente usados na preparação de vacinas para conferir protecção de animais de sangue quente contra doença causada por S. pneumoniae. A actividade hemolítica (toxicidade) da rPL é grandemente reduzida quando é conjugada com o [0]PS (sozinho ou com um espaçador), comparado com a pneumolisina administrada sozinha.

Os conjugados podem ser adicionados a diluentes ou veículos imunologicamente aceitáveis de forma convencional para preparar soluções líquidas ou suspensões injectáveis. Ainda, os conjugados podem ser ligados a hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio (alum) ou outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como QS-21 (18), monofosforil-lípido A e monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3DMPL).

Por exemplo, para preparar uma vacina de conjgado contendo [0]pS e rPL, ou uma vacina contendo uma mistura de vários conjugados, cada um deles contendo rPL e um tipo diferente de [0]PS, uma ou mais preparações de conjugado são ressuspensas em soro fisiológico tamponado com fosfato de sódio ("PBS") (pH 7,0-8,0) em concentrações de 1-1000 pg de polissacárido por ml.

As vacinas de conjugado deste invento são administradas de forma convencional, como seja por injecção subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular em animais de sangue quente para induzir uma resposta imune activa para protecção contra a infecção sistémica causada pelo patogénio S.pneumoniae. A dosagem a ser adinistrada por meios conhecidos dos familiarizados com a matéria. A protecção pode ser conferida por uma única dose de vacina ou pode necessitar de várias doses de reforço. - 12-

Deve-se notar que, se bem que rPL não seja por si só protectora, os ratinhos que receberam rPL sozinha vivem mais do que os ratinhos que receberam apenas o polissacárido [OJ18C. Assim, o efeito protector do conjuado parece ser devido a rPL que actua como veículo para o [0]PS, assim como uma função do próprio rPL.

Para que este invento possa ser melhor compreendido, são apresentados os exemplos que se seguem. Os exemplos têm fins ilustrativos apenas e não devem ser pensados como limitantes do âmbito do invento.

Exemplos Exemplo 1

Clonagem e expressão do gene rPL

Construção de um vector de expressão contendo um gene rPL híbrido tipo 18C/20

Construiu-se um gene ply de fusão a partir dos tipos 18C e 20, subclonou-se num vector de expressão adequado e uma rPL híbrida foi expressa. O extremo 3' do gene foi obtido a partir do tipo 20, enquanto o extreno 5' do gene foi obtido a partir do tipo 18C.

Para determinar os sítios de restrição adequados para a clonagem do gene ply Tipo 20, realizaram-se transferências Southern usando uma sonda oligonucleotídica marcada no extremo 3' (designada PL20), que hibrida com a região altamente conservada entre as hemolisinas activadas por sulfidrilo (nucleótidos 1484-1503; 12). A sonda é marcada com biotina ou digoxigenina. O - 13-fragmento Sall-EcoRV de 1,3 kb foi identificado como compreendendo a maior parte do gene ply, excepto no que respeita ao extremo 5' do gene. Este fragmento de 1,3 Kb é inserido nos sítios Sali e EcoRV em pBR322 (Boehringer Mannheim Co., Indianapolis, IN). Células competentes de E. coli estirpe SCSI (Stratagene, LaJolla, CA) foram usadas como hospedeiro. Os transformantes, resistentes à ampicilina e sensíveis à tetraciclina, foram despistados por hibridação de colónias usando a sonda PL20. Foram isolados três recombinantes idênticos, designados pSE-2, 3 e 28, (Figura 1). O fragmento Sall-EcoRV de pSE2 foi removido e inserido nos sítios Sal\ e Smal de pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA). Os transformantes resistentes à ampicilina, negativos para lactose (colónias incolores em X-gal [5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-galactopiranósido] quando induzidas pelo isopropil^-D-tiogalactopiranósido ("IPTG")) foram despistados por análise de restrição. Um dos recombinantes positivos foi designado pSE3-5.

Devido a não haver sítios de restrição adequados para a clonagem do extremo 5' do gene ply do Tipo 20, as transferências Southern foram realizadas com DNA genómico do Tipo 18C. Usou-se como sonda um fragmento Sall-EcoRV de 1,3 Kb derivado de pSE2-2, o qual foi marcado através de marcação com uma mistura de sequências iniciadoras. Um fragmento BstYl de 2,8 Kb foi identificado como contendo o gene ply completo, juntamente com as regiões flanqueantes 5' e 3'. este fragmento Bst YI foi digerido com Hindlll, e inserido nos sítios BamHl e Hindlll de um vector de selecção de promotores, pKK232-8 (19; Pharmacia). Usou-se como hospedeiro E. coli estirpe SCSI).

Para seleccionar os transformantes contendo o promotor do gene ply, os transformantes resistentes à ampicilina (100 μg/ml) e resistentes ao cloranfenicol (5 μg/ml) foram despistados por análise de restrição e transferência - 14-

Southem. Encontraram-se seis recombinantes idênticos, designados pBHl-32, 35, 36, 37, 38 e 39, que continham um fragmento BstYl-HindUl de 1 Kb abrangendo a região não codificadora 5' a montante e a região 5' codificadora do gene ply do Tipo 18C (Figura 1).

Em seguida, para produzir uma proteína recombinante funcional, os fragmentos de DNA pneumocócico clonados a partir dos Tipos 18C e 20 descritos atrás foram fundidos para construir um gene ply híbrido no plasmídeo pGEX-2T (Pharmacia) usando o sistema de proteína de fusão com a glutationa-S-transferase (20).

Realizou-se a Reacção em Cadeia com Polimerase (PCR) para facilitar a subclonagem do extremo 5' do gene. Sintetizaram-se duas sequências iniciadoras: uma sequência iniciadora de sentido directo no começo da sequência codificadora, com o sítio BamHl introduzido imediatamente a montante do codão de iniciação para facilitar a clonagem (nucleótidos 208-231; 12); e uma sequência iniciadora de sentido inverso, que hibrida com a área que cobre o único sítio EcoRI dentro do gene (nucleótidos 709-733; 12). O fragmento BstYl- EcoRI de 0,7 Kb derivado de pBHl-37 (Tipo 18C) serve como molde para ser amplificado pela DNA-Polimerase Vent™ (New England Biolbs, Beverly, MA), gerando assim fragmentos de 0,5 Kb. As experiências de PCR foram realizadas como se segue: o DNA foi desnaturado a 95°C durante 5 minutos antes da adição da DNA-polimerase Vent™, e realizados 30 ciclos de desnaturação (95°C durante 30 segundos), emparelhamento (50°C durante 30 segundos) e polimerização (72°C durante 1,5 minutos).

Os fragmentos de DNA amplificados foram digeridos com BamHl e EcoRI e depois inseridos nos sítios BamHl e EcoRI em pGEX-2T. Transformantes resistentes à ampicilina picados ao acaso foram testados quanto à - 15-presença do inserto pretendido por análise de restrição. Um recombinante designado pBEO.514 foi identificado como positivo (Figura 2). Em seguida, o fragmento EcoKl de 1,0 Kb (um sítio único dentro do gene) - EcoRI (derivado do vector pUC19, New England Biolabs) derivado de pSE3-5 (Tipo 20) foi inserido a jusante do DNA amplificado dentro de pBEO.514.

Os recombinantes positivos foram identificados com uma camada de eritrócitos de coelho (12), a qual foi aplicada como se segue. Os transformantes resistentes à ampicilina em placas de agar LB foram cobertos com 5 ml de eritrócitos de coelho a 2,5% (em 0,7% de agar fundido em PBS contendo IPTG 1 mM e DTT 1 mM) e incubados a 37°C durante três horas. As colónias portadoras dos plasmídeos recombinantes mostram zonas circulares de hemólise.

Quatro colónias individuais (pGEX-PL 18C/20-1, 2, 3 e 11) apresentaram zonas circulares de hemólise. As análises de restrição confirmam a presença do gene ply completo que está fundido com o extremo 3' do gene gst.

Construção de um vector de expressão contendo um gene rPL Tipol8C

Conforme descrito atrás, a digestão do fragmento BstYl de 2,8 Kb do DNA cromossómico do Tipo 18C com Hindlll produz um fragmento de 1 Kb abrangendo a região não codificadora 5' a montante e a região 5' do gene ply do Tipo 18C. A digestão também produz um fragmento de 1,8 Kb abrangendo a região 3' do gene ply e a região 3' não codificadora (Figura 1), conforme identificado por hibridação de colónias. O despiste dos transformantes resistentes à ampicilina e sensíveis ao cloranfenicol identificou três recombinantes idênticos designados pHB2-l, 26 e 32. A construção do gene ply completo a partir do Tipo 18C em pGEX- -16- 2Τ requereu a ligação de três fragmentos. Devido ao pequeno número de sítios de restrição a serem usados na subclonagem, realizou-se uma série de passos de clonagem.

Primeiro, pHB2-32 foi digerido com HindUl e EcoRl para produzir um fragmento de 0,7 Kb. Este fragmento foi inserido em pUC19 para gerar três recombinantes designados pHV3-2, 4 e 6. Segundo, pBHl-35 foi digerido com EcoRl para produzir um fragmento de 0,5 Kb que foi inserido em pUC 19 para gerar cinco recombinantes designados pII-3-1, 2, 3, 4 e 5. Terceiro, pII3-l e pHV-3-2 ou 6 foram digeridos com HindUl. Quarto, a clonagem do fragmento HindUl de 0,3 Kb derivado de pII3-l no sítio HindUl de pHV3-2 ou 6 foi realizada para gerar três recombinantes designados pHHV3-31, 54 e 55. Quinto, pHHV-3-31 e pBEO.514 foram digeridos com EcoRl. Finalmente, sexto, o fragmento EcoRl de 1,0 Kb derivado de pHHV3-31 foi inserido no sítio EcoRl de pBEO.514. Isolaram-se nove clones recombinantes, designados pGEX-PL 18C-31 a 39, com cobertura de eritrócitos de coelho.

Mais especificamente, o fragmento BstYl de 2,8 Kb de DNA cromossómico derivado de S. pneumoniae tipo 18C descrito atrás foi digerido com HindUl e ligado nos sítios BamYU e HindUl de pKK232-8 (19) como descrito (21) (a Figura 2 indica o sítio Hind III). Células competentes (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) de E. coli XLl-Blue (22) foram transformadas e e semeadas em placas de agar Luria-Bertani (LB) (21) contendo ampicilina (10 μ g/ml). Os transformantes resistentes à ampicilina foram despistados quanto à resistência ao cloranfenicol e hibridação de colónias (21) com uma sonda, fragmento EcoRI-EcoRV de 0,9 Kb, que deriva do gene ply do Tipo 20 (23). Entre os vários recombinantes identificados como contendo os fragmentos correctos, dois designados pBHl-35 e pHB2-32 foram seleccionados para serem usados na subclonagem. - 17-

O gene ply completo foi então construído em pGEX-2T (20; disponível na Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) na mesma grelha de leitura do extremo 3' do gene gst através de um método de clonagem convencional (21) e reacção em cadeia com polimerase usando DNA-polimerase Vent™ (New England Biolabs, Beverly, MA). Usaram-se células competentes (Stratagene) de E. coli SCSI (24). Os transformantes resistentes à ampicilina foram despistados com uma cobertura de eritrócitos de coelho (12): as colónias portadoras de plasmídeos recombinantes apresentam zonas crculares de hemólise. Um dos cinco isolados com características semelhantes, designados pGEX-PL 18C-31, foi seleccionado para posterior caracterização (Figura 2).

Expressão, purificação e caracterização de rPL O gene ply do Tipo 18C/20 ou 18C foi clonado e expresso em níveis elevados em E. coli como uma proteína de fusão com a glutationa-S-transferase (GST) (20). A proteína de fusão resultante é solúvel em soluções aquosas e é purificada a partir a partir de lisados bacterianos brutos em condições não desnaturantes. Estas condições preservam a antigenicidade do rPL pós purificação. A proteína de fusão GST-rPL pode ser purificada por meios simples, como seja cromatografia de afinidade.

Para purificar uma quantidade suficiente de rPL, realizou-se o processo de cromatografia de afinidade que se segue. Na Figura 3 está apresentado um fluxograma para a purificação de rPL. Uma cultura de E. coli SCSI, que cresceu durante a noite contendo pGEX-PL 18C ou pGEX-PL 18C/20 em 50 ml de Caldo Luria lx ou Caldo Terrific lx (25) contendo ampicilina (100 pg/ml), foi adicionada a um litro do mesmo meio. E. coli recombinante foi então crescida a 37°C, com agitação vigorosa, até se obter uma - 18- absorção de 1 a 600 nm. Adicionou-se IPTG à cultura (para uma concentração de 1 mM) como indutor, e as células de E. coli foram crescidas continuamente durante 2 horas. Se bem que seja produzida uma quantidade muito pequena de proteína de fusão GST-rPL antes da indução (ver faixa 1, Figura 4B), IPTG induz a expressão da proteína de fusão em grande quantidade dentro de um curto período de tempo (30 minutos a duas horas). A proteína de fusão, GST-rPL, é expressa em níveis elevados e constitui mais de 10% das proteínas totais bacterianas em SDS-PAGE corado com azul Coomassie (Figura 4).

As células foram centrifugadas a 10 OOOxg durante 5 ou 10 minutos a 4°C, lavadas uma vez com soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS: NaCl 150 mM, NaH2P04 16 mM, Na2HP04 4 mM, pH 7,3) e ressuspenso em 1/50 volume de PBS. Adicionou-se Triton X-100 para uma concentração final de 1% e as células foram lisadas por sonicação suave ou duas passagens através de uma Prensa Francesa (12 ooo libras). O lisado foi centrifugado a 10 000 xg durante 10 minutos a 4°C e os detritos celulares foram lavados uma vez com TPBS (1% Triton X-aoo em PBS). Os sobrenadantes foram reunidos e aplicou-se 200 ml de lisado celular clarificado numa coluna de 10 ou 50 ml de gel de glutationa-agarose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), equilibrada com TPBS. A coluna foi lavada com 5 volumes de TPBS, 2 volumes de PBS e 1 volume de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 para remover materiais indesejáveis. A proteína fusão, GST-rPL, foi eluida com glutationa 5 ou 10 mM/ Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. As fracções apresentando actividade hemolítica, conforme indicado por ensaios hemolíticos e de proteína, foram reunidas. As fracções foram identificadas como hemolíticas como se segue: um μΐ de cada uma das fracções foi adicionado a 50 μ 1 de DTT/PBS e depois misturado em placas de microtitulação com 25 μΐ de eritrócitos de coelho a 5% e incubadas à temperatura ambiente durante 15 minutos. A hemólise foi identificada a olho nu. - 19-

GST-rPL foi então digerida pela protease trombina, a qual possui um único sítio de reconhecimento (20) entre GST e rPL. A proteína de fusão foi misturada com trombina de plasma bovino (Sigma) (5 unidades/mg de proteína) e depois dialisado (peso molecular de exclusão: 12-14 000) contra tampão de clivagem da trombina (Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, NaCl 150 mM, CaCl2 2,5 mM) à temperatura ambiente durante a noite. A mistura de GST, rPL e alguma GST-rPL não digerida foi centrifugada a 3000 xg a 20°C usando uma Amicon Centriprep™-10 (Beverly, MA) (peso molecular de exclusão: 10 000) para concentrar e mudar o tampão para PBS e depois aplicada numa coluna de glutationa-agarose. Devido a GST e qualquer GST-rPL não clivada se ligarem especificamente à coluna, rPL passa livremente através da coluna e é colhida no eluato de PBS. As fracções hemolíticas contendo rPL foram reunidas. O tampão foi mudado para tampão fosfato de sódio 10 mM (pH 7,0) usando Centriprep™-10. A trombina foi removida da rPL (26) passando através de uma coluna de 1 ml de gel de heparina-Sepharose™ (Pharmacia) equilibrada com tampão de fosfato de sódio 10 mM (pH 7,0). A rPL purificada foi guardada a 4°C. O rendimento desta purificação foi de aproximadamente 6-10 mg/litro de cultura. A rPL purificada apresenta uma única banda num gel com um peso molecular de 53 000 dal tons conforme indicado por SDS/PAGE corado com azul Coomassie. Um varrimento densitométrico do gel revela que a pureza de rPL é superior a 95%.

Se bem que o método descrito atrás produza rPL de uma pureza superior a 95%, pode-se ainda obter uma maior pureza adicionando um passo final de cromatografia em hidroxilapaptite (HA). Este passo é realizado usando uma coluna de HA-Fast Flow 1,6 x 1,8 cm (Calbioche. Corp., LaJolla, CA). A coluna foi equilibrada com tampão fosfato de sódio (pH 6,8). Uma quantidade de 10 ml (aproximadamente 10 mg) de rPL foi adicionada à coluna de HA e a -20-proteína eluiu com um gradiente linear de tampão fosfato de sódio 10 mM a 200 mM (pH 6,8). O eluato da coluna foi colhido em fracções de 2 ml com um fluxo de aproximadamente 1,5 ml/min. As fracções foram testadas como descrito anteriormente (11). As fracções contendo rPL fora reunidas e analisadas relativamente à concentração de proteína, actividade hemolítica e pureza por SDS-PAGE. A rPL foi eluida como um único pico em tampão fosfato de aproximadamente 85-115 mM. A proteína eluida é quase homogénea como se mostra por SDS-PAGE e está virtualmente livre de lipopolissacárido contaminante (endotoxina). A massa molecular de rPL é de 53 000 daltons conforme determinado por SDS-PAGE e espectrometria de massa com absorção de laser auxiliada com UV/ ionização A rPL purificada tem uma actividade específica de 3 x 105 unidades hemolíticas/mg de proteína em eritrócitos de coelho (27), o que é comparável a aproximadamente 106 unidades hemolíticas/mg de PL nativa (9, 27). A actividade hemolítica específica foi determinada por uma ligeira modificação do método de Paton et al., (9). As amostras foram activadas com DTT 10 mM antes da mistura com 1,7% de eritrócitos de coelho. A absorvância dos sobrenadantes foi medida a 550 nm.

Na imunotransferência usando Lumi-Phos™530 (Boehringer Mannheim Co., Indianapolis, IN) para detecção por quimioluminescência, tanto a proteína de fusão GST-rPL como rPL reagem com anti-soros contendo os anticorpos contra PL nativa (Figura 4B). Aparentemente, a proteína de fusão de alto peso molecular foi transferida para a membrana Nytran (Schleicher & Schuell Inc., Keene, NH) com baixa eficiência comparado com rPL e com os produtos de degradação que podem ser assim reconhecidos pelos anticorpos. A -21 - h*.rfr imunodifusão de Ouchterlony revela que rPL reage identicamente com anticorpos anti-PL e anti-rPL. Isto sugere que rPL possui os mesmos determinantes antigénicos da PL nativa. A análise de aminoácidos e a determinação da sequência N-terminal (até 40 resíduos) foram realizadas com rPL purificada. A sequência N-terminal de rPL é idêntica à de PL nativa e à sequência prevista deduzida a partir da sequência nucleotídica do gene ply tipo 2 (11, 12), com excepção dos dois resíduos adicionais (glicina e serina), os quais permanecem na rPL após a clivagem com trombina no extreno N (20). A composição em aminoácidos de rPL está de acordo com a sequência deduzida a partir da sequência de nucleótidos do gene ply do tipo 2(12).

Exemplo 2

Preparação de polissacárido capsular de S. meumoniae

Os polissacáridos capsulares de vários tipos pneumocócicos usados neste invento foram descritos nas Patentes U.S. 4 242 501 (1) e 4 686 102 (3), as quais são aqui incluídas como referência. Os polissacáridos pneumocócicos purificados assim obtidos possuem um tamanho molecular relativamente alto, com mais de 50% tendo um valor de coeficiente de eluição (Κ^ν) inferior a 0,3 numa coluna de Sepharose™CL-4B (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Este valor corresponde a um peso molecular superior a 6 x 105 daltons.

Exemplo 3

Preparação de polissacárido tipo 14 oxidado reactivo contendo grupos redutores

Uma amostra de 100 mg de polissacárido pneumocócico Tipo 14 foi dissolvido e 20 ml de tampão acetatode sódio 0,1 M (pH 5,0). Uma porção de -22- 4 mg de periodato de sódio (para uma concentração final de 1 mM) foi adicionada no escuro e a mistura foi agitada suavemente, durante 10 minutos à temperatura ambiente, num frasco Erlenmeyer rolhado envolvido em folha de alumínio. O periodato de sódio em excesso foi destruído por reacção com 1 ml de etilenoglicol 0,5M durante 10 minutos à temperatura ambiente. A mistura reactiva, contendo o polissacárido Tipo 14 ("[O] 14") oxidado resultante, foi extensivamente diafiltrado e concentrado com um concentrador Amicon (Beverly, MA) com uma membrana de 3 500 daltons de exclusão à temperatura ambiente. O polissacárido diafiltrado [O] 14 foi liofilizado e guardado a -20°C até ser usado.

Exemplo 4

Preparação de polissacárido tipo 18C oxidado reactivo contendo grupos redutores O processo descrito no Exemplo 3, para a oxidação de polissacárido Tipo 14, foi repetido para o Tipo 18C, excepto que antes da oxidação com periodato, o polissacárido Tipo 18C foi parcialmente despolimerizado com ácido acético 1M para evitar a gelificação do polissacárido quando conjugado com rPL. Uma amostra de 500 mg do polissacárido Tipo 18C foi ressuspensa em 50 ml de ácido acético (pH final de 2,5) e incubada a 60°C durante 40 horas. Em seguida, adicionou-se 6 ml de acetato de sódio 2 M (pH final de 4,0). A mistura foi concentrada para aproximadamente 12 ml usando uma célula Amicon com agitação (YM10). O concentrado foi sujeito a cromatografia numa coluna de Sepharose™CL-4B e eluido com PBS 10 mM e 0,01% de NaN3. Colheram-se fracções de 4 ml e as de Kd 0,3 - 0,7 (10-60 KD) foram reunidas. As fracções foram dialisadas contra água com um peso molecular de exclusão de 12-14 KD, sendo a água mudada diariamente. O passo de oxidação com periodato foi então realizado para produzir o polissacárido Tipo 18C oxidado ("[O] 18CM).

Exemplo 5

Preparação do conjugado polissacárido r0114-rPL O polissacárido [O] 14 produzido no Exemplo 3 foi dissolvido em tampão fosfato de potássio 0,2 M (pH 8,0) a uma concentração de 6 mg/ml.O rPL produzido de acordo com o Exemplo 1 (expresso a partir de ATCC 69654 ou de ATCC 69655 em E. coli) foi também dissolvido num recipiente separado no mesmo tampão numa concentração de cerca de 2 mg/ml. A solução de polissacárido [O] 14 (0,5 ml) e a solução de rPL (0,5 ml) foram misturadas à temperatura ambiente. Após 30 minutos, adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (2,5 mg) e a mistura de reacção foi incubada à temperatura ambiente durante 5 dias. A mistura foi sujeita a cromatografia numa coluna de Sepharose™CL-4B, a qual foi primeiro equilibrada com PBS 10 mM (pH 7,0). O material conjugado foi eluido com o mesmo tampão sem um gradiente. As ffacções do pico contendo o conjugado foram testadas relativamente ao polissacárido e à proteína (15, 17). As fracções contendo o conjugado foram reunidas, caracterizadas e usadas para as preparações de vacinas. O conjugado polissacárido [0]14-rPL tem uma proporção p/p de açúcar/proteína de 7:1. A preparação de vacina de conjugado foi guardada a 4°C até ser usada.

Exemplo 6

Preparação de conjugado polissacárido ΓΟΙ-rPL com o espacador di-hidrazida de ácido adípico /ADH)

Preparação do derivado rPL-ADH

Três ml de rPL (9 mg) preparada de acordo com o Exemplo 1 (Tipo -24- 18C ou Tipo 18C/20) foram colocados em tampão fosfato de potássio 0,1M (pH 5,5). A rPL tamponada foi misturada com ADH (20 mg) e carbodiimida (20 mg) e incubada à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura de reacção foi mudada para pH 7,0, dialisando contra tampão fosfato de potássio 0,1M (pH 7,0) a 4°C numa manga de diálise Spectrapor com um tamanho de exclusão de 3 500 daltons. O material dialisado, contendo o derivado rPL-ADH, foi caracterizado por cromatografia numa coluna de Sepharose™CL-4B. O teor de proteína foi determinado pelo método de Bradford (17) e ADH foi medido por reacção com o ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico usando ADH como padrão (28). O derivado rPL-ADH (um líquido) foi guardado a 4°C até ser usado.

Preparação do conjugado polissacárido f0114-ADH-rPL O polissacárido [O] 14 preparado de acordo com o Exemplo 3 foi dissolvido em tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 8,0) numa concentração de 6 mg/ml e o derivado rPL-ADH foi igualmente dissolvido, num recipiente separado, no mesmo tampão numa concentração de 3 mg/ml. Uma amostra de 2,5 ml de polissacárido [O] 14 e uma amostra de 2,5 ml do derivado rPL-ADH foram misturados à temperatura ambiente. Após 2 horas, adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (12,5 mg) em água e a mistura de reacção foi incubada a 37°C, com agitação suave, durante 4 dias. A mistura foi cromatografada numa coluna de Sepharose™CL-4B que foi primeiro equilibrada com PBS 10 mM (pH 7,0). O material conjugado foi eluido com o mesmo tampão. As fracções do pico contendo o conjugado foram identificadas como descrito atrás, e depois foram reunidas, caracterizadas e usadas para as preparações de vacina. SDS-PAGE corado com prata mostra que o material de alto peso molecular está presente no conjugado. Um primeiro grupo de fracções reunidas, designado lote 1 de conjugado (da Sepharose ™CL-4B), possui um Κ-,ν de 0,08-0,20; enquanto um segundo grupo de fracções, designado lote 2, contem material com um KaV de -25- 0,21-0,34. A proporção de açúcar.-proteína para o lote 1 de conjugado é de 11:1; a proporção para o lote 2 de conjugado é de 13:1. As preparações de conjugado foram usadas para a preparação das vacinas. As preparações de conjugado foram guardadas a 4°C.

Exemplo 7

Preparação do conjugado polissacárido r0118C-rPL

Para preparar comprimentos intermédios deste polissacárido, adequados para usar em conjugados, usou-se uma pequena modificação do método do Exemplo 4. Uma porção de 500 mg do polissacárido tipo 18C foi dissolvida em 50 ml de ácido acético 1M (pH 2,3) e incubado a 60°C durante 40 horas. O polissacárido tratado foi ajustado a pH 4,5 com acetato de sódio 2M. O peso molecular da amostra foi determinado numa coluna de Sepharose™CL-4B. Reuniu-se o polissacárido que eluiu com um KgV de 0,3 a 0,7 (peso molecular de 15 000-600 000). As fracções reunidas foram extensivamente dialisadas contra água apirogénica a 4°C e depois liofilizadas. O material foi guardado a -20°C até ser usado para a preparação do polissacárido [O] 18C.

Uma porção de 50 mg do tamanho intermédio do polissacárido tipo 18C foi dissolvido em 10 ml de tampão acetato de sódio 0,1M (pH 5,0) e oxidado com 4 mg de periodato de sódio (concentração final de 2 mM) no escuro durante 10 minutos à temperatura ambiente. O excesso de periodato de sódio foi destruído por reacção com 50 μΐ de etilenoglicol 0,5M (concentração final de 25 mM) durante 10 minutos. A mistura de reacção contendo polissacárido [0]18C foi extensivamente dialisada e depois liofilizado. O material foi guardado a -20°C e usado na preparação do conjugado com rPL. -26- O polissacárido [0]18C foi dissolvido em tampão de fosfato de potássio 0,2M (pH 8,0) numa concentração de 6mg/ml. A rPL preparada de acordo com o Exemplo 1 (expressa a partir de ATCC 69654 ou ATCC 69655 em E. coli) foi também dissolvida num recipiente separado no mesmo tampão numa concentração de 3 mg/ml. Um ml de solução de polissacárido [0]18C e 0,5 ml de solução rPL foram misturados à temperatura ambiente. Após 1 hora, adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (3 mg) e a mistura de reacção foi incubada a 37°C durante 8 dias. A mistura foi cromatografada numa coluna de Sepharose™CL-4B, a qual foi primeiro equilibrada com PBS 10 mM (pH 7,0) e depois eluida com o mesmo tampão. As fracções do pico contendo o conjugado foram identificadas como descrito atrás, reunidas e caracterizadas. O conjugado de polissacárido [0]18C-rPL tem uma proporção de açúcar/proteína de aproximadamente 0,76:1. O SDS-PAGE corado com prata mostra a presença de material de alto peso molecular. O conjugado foi guardado a 4°C até ser usado para as preparações de vacinas.

Exemplo 8

Preparação do conjugado polissacárido fOU8C-rPL com um espacador ADH

Preparação de polissacárido IOU8C O polissacárido [0]18C foi preparado de acordo com o Exemplo 7, guardado a -20°C e usado na preparação do conjugado com o derivado rPL-ADH.

Preparação do derivado rPL-ADH

Uma porção de 10 ml de rPL (12 mg) preparado de acordo com o -27-

Exemplo 1 (Tipo 18C ou Tipo 18C/20) foi colocado em tampão de fosfato de potássio 0,1M (pH 5,4). A rPL tamponada foi misturada com 0,3 ml de ADH (30 mg) e 0,1 ml de carbodiimida (30 mg) e incubada com agitação suave à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura de reacção foi mudada para pH 7,0 através da diálise contra tampão fosfato de potássio 0,1M (pH 7,0), a 4°C durante dois dias, em manga de diálise Spectrapor com um tamanho de exclusão de 3 500 daltons. O material dialisado contendo o derivado rPL-ADH foi concentrado para cerca de 4 ml com uma Amicon Centriprep™ (10 000 daltons de exclusão) e cromatografado numa coluna de Sepharose™CL-4B. O teor de proteína e ADH foi avaliado como descrito anteriormente. O derivado rPL-ADH foi guardado a 4°C até ser usado.

Preparação do conjugado de polissacárido r0118C-ADH-rPL O polissacárido [0]18C foi dissolvido em tampão de fosfato de potássio 0,2M (pH 8,0) numa concentração de 6 mg/ml, e o derivado rPL-ADH foi também dissolvido no mesmo tampão, num recipiente separado, numa concentração de cerca de 2,7 mg/ml. Uma porção de 2,5 ml de polissacárido [0]18C e 2,5 ml do derivado rPL-ADH foram misturados à temperatura ambiente. Após 2 horas, adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (12,5 mg) em água e a mistura de reacção foi incubada a 37°C, com agitação suave, durante 4 dias. A mistura foi cromatografada numa coluna de Sepharose™CL-4B que foi primeiro equilibrada com PBS 10 mM (pH 7,0). O material conjugado foi eluido com o mesmo tampão. As fracções do pico contendo o conjugado foram identificadas como descrito atrás, reunidas, caracterizadas e usadas para as preparações de vacinas. SDS-PAGE corado com prata revelou a presença de materiais de alto peso molecular no conjugado. A proporção do polissacárido [0]18C para rPL no conjugado é de cerca de 1,8:1. O material conjugado foi guardado a 4°C. «-1 -28-

Exemplo 9

Resposta de anticorpos às vacinas de conjugado

Os conjugados preparados pelos processos dos Exemplos atrás passaram o teste de segurança geral em ratinhos e porquinhos da índia, pedidos pela United States Food and Drug Administration (21 C.F.R. § 610.11; 1 de Abril, 1993). Os conjugados foram então testados quanto à sua capacidade para induzir anticorpos em ratinhos. Os conjugados foram diluídos em PBS estéril (pH 7,0) contendo 0,01% de timerosal, de tal forma que uma dose de 0,2 ml contem 1 ou 5 pg do polissacárido. As vacinas de conjugado foram esterilizadas por filtração através de membranans Gelman de 0,2 μ. A vacina esterilizada foi guardada a 4°C até ser usada.

Ratinhos CD-I (Swiss) (8 semanas de idade) foram injectados intraperitonealmente com 0,2 ml da vacina (1-5 pg por dose), adsorvida a fosfato de alumínio(l mg/ml) como adjuvante. Com 2 semanas de intervalo, os ratinhos receberam duas injecções adicionais da vacina. Colheram-se amostras de sangue por venipunctura retro-orbital, duas semanas após cada uma das injecções. Testaram-se sete ratinhos por ELISA relativamente aos títulos de anticorpos contra o polissacárido e rPL. Os resultados do ensaio estão descritos na Tabela 1 (para o conjugado [O] 14/rPL) e Tabelas 2 e 3 (duas experiências separadas para o conjugado [O] 18C/rPL):

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Resposta de anticorpos a vacinas de conjugado [0]14/rPL em ratinho3

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Resposta de anticorpos a vacinas de conjugado [0]18C/rPL em ratinho 10 r— Os 00 as CM VO .-H CM CM >o OS r- OO O Os o Γ- Os oo l/o 'd' O io οο cO CM ^H vo CN τΓ V po 00 O cm O J % r- o CM CM OS Γ «s os as r- MD ΟΟ Os PO o vo o CM cd Γ ^H 10 Ό CM "d· po Oh ΟΟ ^H V Γ— ro CM (Λ O & cd C O Q cs rH OO PO • ε Γ- o o VO o r—- i/O tí (D o PO 1/0 VO CM PO cd C/3 <N CM CM V po Γ r— vo <L> *73 O &J5 * 3 * <υ as ΙΟ Os l/o η-1 GO O PO^ O P % Q IO 1 MD θ' PO po O o O Os PO Tt- CM O O O O Γ- O Γ- 1-H ^H OS ΡΟ o ΡΟ MD V V V PO I—1 oo CM u oo i-^ 1 C/3 O O o O Γ— Γ cd o o o o "Sf r— ΙΟ H 1-H i-H r-H 1-^ O o r—H Cd Oh "d· V V V V 'd" l <Z> O & <3 S O cd O o o o t— o o o ε o o o o CM o o *4H <L> T—4 i—( i-H 1-H ^H 1-H u C/3 CM V V V V l V l <U Ό /«-V <Λ O * u s 3 oo 1 <υ co o H C/3 Q 1 1 ό Ό ^H <o J Oh Ph l-l 1H ffi X hJ Q Q Oh (h % < < cd O ó ò Ò Ú c 00 oo 00 oo oo 1-^ ^H o J ,Ί |—| | | l cd > HH Ph hH Ph o O o O O u U 1—1 1- 1—1 1-1

Grupos de 5 ratinhos Swiss foram imunizados três vezes (2 semanas de intervalo) com as vacinas. * Soros reunidos em lotes analisados por ELISA. O título representa a diluição limite = 0,1. **Soro individual testado por ELISA.. GMT a representa diluição limite = 0,3.

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Tabela 3 <N cn ct O n cn 00 T-1 in l r- r- Ό CN SO so "d" CN N" ^r >n m o O cn 1 oo cn 1 Oh )-l cd cn >n o H oo Os CN CN Ή— ç* o O "t 'd" O Ό c o Os Ό cn SO cn cd o Os V SO cn ^H 03 r- O fc O & cd C hJ o o cd SO o E m o O CN 11 <U CN m <n ct <n CN O 00 cd <N f" V CN li cn SO o T3 o 03 O * OD 3. 1—1 3 * υ 00 Os cn o i-J co vo Tf- Ό cd H % O Q 1 cT cn O cn" bO O tí O m o O o sn Os O o (U Ό o o oo li CN O f-H iH ΙΤ3 cn o Tl- Ό V V Os I SO o Cd 00 c r-H ϋ ed > ob s o o CN Ό SO cd -4-J o o m O cn SO tí 1 N" CN 1 o O o V V CN CN 00 CN & o O 03 O & cd S o cd o o O O O c o g o o O O oo O cd +H f-H iH .—1 ,—1 SO H Q i-Q u (73 CN V V V V V cd <L> Ό /·—N C/3 1/3 O (aD O α u 03 00 (D <u 3 r”H co tf H c/b O G 1 >n »n m -1 J Pu Ph ti ti ffi ffi hJ hJ Q Q Pu t- % < < cd O Ó Ó Ó Ò c oo oo oo oo oo »^ 1—H 1—H f-H O r f | J“^ cd > HH Ph O O O O o u rupos de 5 ratinhos Swiss foram imunizados três vezes (2 semanas de intervalo) com as vacinas. Soros reunidos em lotes analisados por ELISA. O título representa a diluição limite = 0,1. *Soro individual testado por ELISA.. GMT representa a diluição limite = 0,3. -32

Exemplo 10

Ensaio hemolítico para anticorpos neutralizantes

Realizou-se um ensaio hemolítico para anticorpos neutralizantes como se segue (9, 12, 29): Numa placa de microtitulação de 96 cavidades (forma de U), diluições de soros dos animais (ratinhos e coelhos) contendo anticorpos contra rPL foram misturados com 1 pg de rPL. Após incubação durante 15 minutos a 37°C, adicionou-se ditiotreitol 10 mM. Após incubação durante 15 minutos a 37°C, adiciononou-se eritrócitos de coelho (concentração final 1,7%) e incubou-se durante mais 30 minutos da mesma forma. Após centrifugação a 150 xg durante 5 minutos, observou-se a presença ou ausência de sedimentos. A diluição que representa 50% de lise dos eritrócitos foi determinada a olho nu. Caso os anticorpos neutralizantes estejam presentes, observa-se um sedimento; caso não existam anticorpos neutralizantes, os eritrócitos são lisados. Os resultados dos dois ensaios hemolíticos estão descritos nas Tabelas 4 e 5: V <L> ti ω Ό 03 T3 g N » Ό r—H <N m 1 Ό 00 00 oo ‘> *c3 1 ** *—1 1 7—H 1 1—1 +-> O < £ 3 (D + + + + + + 3 te >-

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Inibição da actividade hemolítica por soros de ratinhos contendo anti-rPL

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Inibição da actividade hemolítica por soros de ratinhos contendo anti-rPL

** Soro individual. GMT representa a diluição limite = 0,3. *** Lote 1 Kd = 0,00-0,30; Lote 2 Kd = 0,30-0,60. -35-

Exemplo 11

Ensaio de citotoxicidade com células endoteliais

Realizou-se um ensaio de citotoxicidade com células endoteliais de acordo com o método de Rubins et al., (3). Removeu-se o meio às células intactas marcadas radioactivamente, após as células terem atingido a confluência, lavaram-se duas vezes com PBS, tripsinizaram-se, lavaram-se duas vezes com meio de cultura fresco, ressuspenderam-se em 200 μΐ de PBS e 300 μΐ de 51Cr (300 pCi) e incubaram-se a 37°C, 5% de C02 durante 90 minutos. As células foram lavadas duas vezes com PBS contendo 5% BSA e 2% de dextrose e ressuspensas em PBS contendo 0,5% de BSA e 0,2% de dextrose. As células foram ajustadas a 2xl05/ml. Numa placa de microtitulação de 96 alvéolos (em forma de U), diluições de soro de animais (ratinhos ou coelhos) contendo anticorpos contra rPL foram misturadas com 5 ng de rPL. Após incubação durante 15 minutos a 37°C, 5% de C02, adiciounou-se ditiotreitol 10 mM. Após incubação durante 30 minutos a 37°C, 5% de C02, adicionaram-se células (2 x 104) e incubaram-se durante mais duas horas da mesma forma. Após centrifugação a 150 x g durante 3 minutos, contou-se a radioactividade numa amostra do sobrenadante, por cintilação líquida, para determinar a percentagem de 51 Cr libertado. Para determinar o 51 Cr intracelular restante adicionou-se NaOH 1M, misturou-se a solução e mediu-se a radioactividade de uma alíquota. A percentagem de 51Cr libertada foi determinada como a percentagem de contagens totais por minuto no meio dividido pelas contagens totais por minuto no meio e monocamada celular. Os resultados do ensaio estão descritos na tabela 6, onde os valores se referem à média e desvio padrão de triplicados de alvéolos de culturas celulares marcadas com 51 Cr (24 000 cpm/200 μΐ), 2 x 104 células/alvéolo. As células foram incubadas na ausência ou presença de agentes como indicado, durante 2 horas a 37°C, na presença de ditiotreitol 10 mM. A % de 51Cr libertado = 100 x (2A/(A+B)); onde A = cpm em 100 μΐ do topo; B = cpm em 100 μΐ do fundo a que se adicionou 100 μΐ de NaOH.

Tabela 6

Percentagem de 51 Cr libertado

Condições experimentais

Contagens totais 97 ±2,3 Libertação espontânea 9 ±0,6 rPL (5 ng) 57 ±0,6 rPL + Soro anti-rPL (1:1000) 11 ±1,2 rPL + Soro anti-rPL (1:2000) 11 ±1,0 rPL +Soro anti-[0]18C (1:1000) 38 ±1,2 rPL + Soro anti-[0]18C (1:2000) 43 ± 1,5 rPL + Soro anti-[0]18C rPL (1:1000) 11 ±0,0 rPL + Soro anti-[0]18C rPL (1:2000) 11 ±0,6 rPL + Soro anti-[0]18C-ADH-rPL (1:1000) 11 ±0,0 rPL+ Soro anti-[0]18C-ADH-rPL (1:2000) 11 ±0,6

Exemplo 12

Proteccão contra a infecção experimental com S. pneumoniae viva em ratinhos vacinados com vacinas de rPL ou de conjugado

Ratinhos CD-I fêmea, de oito semanas de idade, em grupos de dez foram injectados com 0,2 ml das várias vacinas com intervalos de duas semanas. Estas vacinas incluíram rPL, [0]18C-rPL e [0]18C-ADH-rPL. A vacina testemunha, [0]18C, não induziu uma resposta de anticorpos nestes ratinhos. Cada um dos ratinhos foi injectado com uma dose de vacina contendo 1 pg de polissacárido, ou no caso de vacina contendo apenas rPL, 1 pg de proteína. Todas as vacinas continham também 1 mg/ml de fosfato de alumínio. Soros de ratinhos representativos foram colhidos antes da primeira vacinação e às 2 e 4 semanas -37-após a vacinação inicial. Os soros de todos os ratinhos foram colhidos 11 dias após a última vacinação. Os soros foram usados para determinar os anticorpos contra rPL e [0]18C. Duas semanas após a última vacinação, os ratinhos foram injectados com doses variáveis de S. pneumoniae, tipo 18C (ATCC 6318). As bactérias foram crescidas durante a noite em placas Trypticase™Soy Agar com 5% de sangue de carneiro (BBL, Cockeysville, MD; marca registada da Becton, Dickinson e Co.) durante a noite a 37°C, depois inoculadas em Trypticase™Soy Agar (BBL, Cockeysville, MD; marca registada da Becton, Dickinson e Co.) contendo 5% de sangue de carneiro desfibrinado e 1% de glucose e incubadas sem agitação a 37°C durante seis horas. O crescimento foi diluido adequadamente em TSB. O número de CFU/ml foi determinado por contagem de placas. As doses de bactérias injectadas intraperitonealmente foram calculadas como sendo de aproximadamente 0, 5, 25, 125 e 625 x LD50, onde LD50 é inferior ou igual a 3 CFU/dose. Assim, as doses de bactérias foram 0, 23, 115, 575 e 2875 CFU/dose. Os animais foram avaliados duas vezes por dia e registadas as mortes.

Os resultados estão apresentados na Tabela 7. Todos os ratinhos que serviram como testemunha negativa receberam TSB mas não bactérias, estão vivos e bem de saúde passados 14 dias. Todos os ratinhos vacinados com [0]18C, a testemunha positiva que não induz uma resposta de anticorpos, morrem dentro de quatro dias após infecção experimental com qualquer uma de quatro doses de S. pneumoniae. Os ratinhos receberam a vacina de rPL sozinha, a qual não induz respostas de anticorpos significativas contra rPL, sobrevivem durante mais tempo do que as testemunhas positivas. As vacinas de conjugados deste invento, contendo [O] 18C e rPL com ou sem um espaçador, quando administradas antes da infecção bacteriana são mais eficazes na protecção de ratinhos contra a infecção letal por pneumococos Tipo 18C, mesmo com a dose mais elevada de 2,9 x 103 CFU (625 x LD50). Estas vacinas de conjugados também induzem respostas de anticorpos significativas contra o polissacárido Tipo 18C e rPL (ver Tabelas 2 e 3). -38-Tabela 7 Efeito da vacinação com rPL e das vacinas de conjugados na sobrevivência de ratinhos infectados experimentalmente com S. pneumoniae o

O (X 60

Total o o T-H o o o O — <N m CS o o o — — ^H o 1 1 1 1 O o o o o o o o o o iH o T-H 1 1 1 o o o o o o o o o o CS o o 1 1 H o o o o o o o o o , o o 1 1 o o o r-r o o o o o o o O o o 1 1 o o o o o o o o o o o o\ o o 1 1 o o o o o o o o o o o 00 o o CS <N CS o o o o o o o o o o r- o o o 1—H o o o o o o o o o o o o o ^H CS o o o o o o o o o o 1—1 t—l o 1 o o o o o o o o o o CS (N o o o o - - o o o o o o m o m <S o o o ^H - o o o o o <N o o _ o T-H o o o o o o > '5 os o o o o o o o o o o o o o o o V w o ^—s ,,—s ^—N ^—S O s IO s, to H-*' b s—N IO >o t io LO Γ ,___v IO Γ m —1 Γ oo —N m 1-H Γ ΟΟ cn T-H ΟΟ o CS 1-H ΙΟ CS o CS 1-^ ιο CS o CS T-H LO CS w w w w w w w w w w w o X X X X X X Λ X o IO X IO IO X «o IO Q X X m CS CS X X o CS CS X X m CS CS o io CS Ό o >o CS ^H Ό o IO <N VO s ω |_1 4> w o % a> o <D T3 1 o H-l o 00 X Q 0 oo % < % ΰ o ò o wr\ oo l—' 00 1 OJJ bO bfi ZL i——1 zL 1—1 =1 &H o o 4 l-i > 1 1 1 's—y Número de ratinhos mortos (Total de ratinhos = 10/grupo)1 cd O O O O H o r“H o 1 1 1 1 m o 1 1 1 1 ΓΊ Y“H o 1 1 1 1 » 1 1—1 o 1 1 1 1 O 1—1 o 1 1 1 1 Os o 1 1 1 1 00 o 1 1 1 1 o 1 1 1 1 Ό o i 1 1 1 ^s cd • »-h cn o 1 1 1 1 Q *t o (N cn o CM (N ío m CM o r- iO CN cn , o o r-H <N o O ca O >

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Os ratinhos foram observados até aos 14 dias após a infecção experimental.

Exemplo 13

Resposta de anticorpos às vacinas de conjugados com diferentes adjuvantes O ensaio do Exemplo 9 foi repetido usando como adjuvante: (1) 200 pg (1 mg/ml) de fosfato de alumínio (A1P04); (2) 25 pg de 3DMPL; (3) 100 pg de 3DMPL; ou (4) uma combinação de 200 pg de A1P04 e 25 pg de 3DMPL. Os resultados do ensaio estão descritos na Tabela 8: C-

Efeito dos adjuvantes A1P04 e 3DMPL na resposta de anticorpos a vacinas de conjugados de [0]18C/rPL em ratinhos

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Efeito dos adjuvantes A1P04 e 3DMPL na resposta de anticorpos a vacinas de conjugados de [O] 18C/rPL em ratinhos

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Lisboa, 15 de Dezembro de 2000 ALBeRTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial

RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um conjugado imunogénico de polissacárido-proteína, compreendendo (a) um polissacárido oxidado derivado do polissacárido capsular de Streptococcal pneumoniae (S. pneumoniae), e (b) a proteína pneumolisina de S. pneumoniae que é expressa por via recombinante, em que a referida pneumolisina não foi tomada toxóide ou não foi produzida por mutagénese dirigida antes da conjugação com o referido polissacárido oxidado.
2. 2. O conjugado da Reivindicação 1, em que o polissacárido capsular de S. pneumoniae deriva do Tipo 14 ou Tipo 18C.
3. 3. O conjugado da Reivindicação 1, em que a pneumolisina que é expressa de forma recombinante é expressa em E. coli.
4. 4. O conjugado da Reivindicação 3, em que a pneumolisina que é expressa por via recombinante é expressa em E. coli estirpe designada SCSI, a qual é portadora de um plasmídeo seleccionado de entre o grupo constituído pelo plasmídeo designado pGEX-PL 18C (ATCC 69654) e o plasmídeo designado pGEX-PL 18C/20 (ATCC 69655).
5. 5. O conjugado da Reivindicação 1, em que a pneumolisina expressa por via recombinante é primeiro ligada a um espaçador antes da conjugação com o polissacárido oxidado derivado do polissacárido capsular de S. pneumoniae.
6. 6. O conjugado da Reivindicação 5, em que o espaçador é seleccionado a partir do grupo consistindo em hidrazida do ácido adípico (ADH) e ácido 6-aminocapróico. -2-
7. 7. Uma vacina compreendendo o conjugado imunogénico da Reivindicação 1.
8. 8. A vacina da Reivindicação 7 que compreende ainda um ou mais diluente, veículo ou adjuvante imunologicamente aceitável.
9. 9. A vacina da Reivindicação 7 que compreende uma mistura de pelo menos dois conjugados imunogénicos com polissacáridos oxidados derivados dos polissacáridos capsulares de diferentes tipos de S. pneumoniae.
10. 10. A vacina da Reivindicação 7 para usar na indução de uma resposta de anticorpos contra o polissacárido capsular de S. pneumoniae em animais de sangue quente.
11. 11. A vacina da Reivindicação 7 para usar na imunização contra doença provocada por S. pneumoniae em animais de sangue quente. Lisboa, 15 de Dezembro de 2000 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 14 1200 LISBOA