KR100385411B1 - 폐렴구균감염에대한면역용폐렴구균다당류-재조합뉴모리신결합체백신 - Google Patents

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Abstract

폐렴구균의 협막 다당류로부터 유도된 산화 다당류 및 재조합적으로 발현되는 폐렴구균의 뉴모리신 단백질로 이루어진 면역원성 다당류-단백질 결합체가 생성된다. 뉴모리신은 산화 다당류와 결합하기 전에는 변독소화 되지 않는다. 면역 원성 결합체는 폐렴구균의 협막 다당류 및 재조합 뉴모리신에 대한 항체 반응을 유도하고 폐렴구균-유발 질환에 대해 면역화시키기 위한 백신으로서 사용된다.

Description

폐렴구균 감염에 대한 면역용 폐렴구균 다당류-재조합 뉴모리신 결합체 백신
페렴구균은 세균성 폐렴의 가장 일반적인 발병 원인이고, 또한 중이염(중이감염), 수막염 및 균혈증의 주요 원인중의 하나이다. 각각의 협막 다당류의 상이한 화학 구조를 갖는 적어도 83개 유형의 폐렴구균 미생물이 있다. 협막 다당류는 폐렴구균의 주요 독력 인자이고 성인의 항체 반응을 유도한다. 현재, 23-다가 다당류 백신(
Figure pct00001
, American Cyanamid Company, Wayne, NJ)을 성인 및 2세 이상의 어린이에게 사용할 수 있다. 이러한 정제된 폐렴구균 다당류 백신의 제조방법이 미국 특허 제 4,242,501 호, 제 4,221,906 호 및 제 4,686,102호(참고문헌 1,2,3)에 기재되어 있다. 그러나, 2세 이하의 어린이는 이러한 유형의 백신에 대해 우수한 면역 반응을 유도하지 못한다.
2세 이하의 어린이에서 다당류의 면역학적 특징을 변형시키고 면역원성을 향상시키기 위해서, 다당류를 다당류-단백질 결합체를 형성하기 위해서 단백질 담체와 공유 결합시킨다. 결합체 다당류-단백질 결합체 백신의 제조 방법이 미국 특허 제 4,673,574 호(4)에 기재되어 있다. 그 특허는 환원 그룹(들)을 함유하는 폐렴구균 또는 헤모필루스 인플루엔제 유형 b의 협막 중합체로부터 유도된 다당류 단편 및 단백질 담체로서 세균 독소 또는 변독소, 특히 무독성 디프테리아 독소(예를 들면, CRM197)를 포함하는 면역원성 결합체의 제조 방법에 관한 것이다.
다당류의 면역원성을 향상시키기 위한 노력은 부위-특이 돌연변이생성이 독성 폐렴구균 단백질 뉴모리신의 비-독성 변독소를 생성하기 위해 사용됨을 보고한다. 결과의 돌연변이체 뉴모리신 변독소는 링커 또는 스페이서, 6-아미노카프로산을 사용하여 유형 19F 폐렴구균 협막 다당류와 결합시킨다. 그 결합체는 비결합된 다당류와 비교하여 유형 19F 다당류 잔기의 면역원성을 향상시켰다(5,6). 이에 뒤이은 연구에 의하여 변독소화되지 않은 천연 뉴모리신이 이의 독성때문에 백신에 포함되기에는 부적절한 것으로 나타냈다(7).
그러나, 이러한 노력 및 다른 노력에도 불구하고, 2세 이하의 어린이에 대한 폐렴구균에 대한 효과적인 백신은 없다. 따라서, 그러한 백신이 필요하다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 폐렴구균의 협막 다당류로부터 유도된 산화 다당류, 및 단백질 담체, 즉 재조합적으로 발현되고 산화 다당류와 결합하기전에 변독소화 되지않거나 부위-특이 돌연변이 생성에 의해 생성되지 않는 폐렴구균의 뉴모리신을 포함하는 면역원성 다당류-단백질 결합체를 제공하는 것이다. 뉴모리신은 변독소화되지 않으며; 그럼에도 불구하고 결과의 결합체는 현격히 감소된 독성을 지닌다.
본 발명의 하나의 양태에서, 산화 다당류는 뉴모리신 단백질에 직접 결합한다. 본 발명의 다른 양태에서, 뉴모리신 단백질은 우선 스페이서에 결합하고 이어서, 산화 다당류에 결합한다.
본 발명의 추가의 목적은 이러한 결합체를 백신으로서 사용하는 것이다. 이러한 백신은 온혈 동물에서 폐렴구균의 협막 다당류에 대한 항체 반응을 유도하기에 유용하다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 백신을 근육내 또는 피하 주사에 의해 면역원량으로 투여함으로써, 온혈 동물에서 폐렴구균-유발 질환에 대해 면역화하기 위해 이러한 백신을 사용하는 것이다.
본 발명의 추가 양태에서, 백신은 폐렴구균의 상이한 유형의 협막 다당류로부터 유도된 산화 다당류와의 적어도 2개의 면역원성 결합체의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 폐렴구균의 유형 18C 다당류를 산화전에 다당류를 부분적으로 해중합시키기 위해 약산으로 처리하여, 재조합 뉴모리신("rPL")과의 결합이 성공적으로 수행되게 할 수 있다.
본 발명의 결합체 백신은 온혈 동물에서 높은 면역원성을 나타낸다. 백신은 다당류 및 단백질, 즉 재조합 뉴모리신 모두에서 항체를 유도한다.
본 발명의 결합체는 단백질 담체가 폐렴구균 감염에서 독력 인자인 것으로보고되어온 뉴모리신으로부터 유도된다는 점에서 전술된 것 이상으로 명백한 이점이 있다(8). 본 발명의 결합체 백신은 다당류 및 뉴모리신 모두(모두 독력 인자)에 대한 항체를 유도하고, 폐렴구균에 의해 유발된 질환에 대한 면역성을 부여한다. 결합체는 스페이서가 사용될 수 있음에도, 전술된 스페이서 또는 링커의 요구없이 독소의 용혈성 및 세포독성 활성을 중화시킬 수 있는 뉴모리신에 대한 항체를 유발한다(5,6). 재조합 뉴모리신은 그의 형테를 유지하면서 무독성이 된다.
백신이 2세 이하의 어린이에게 면역성을 부여하도록 허용할뿐만 아니라, 담체 단백질, rPL 자체로 면역성을 부여할 수 있고 단지 산화된 다당류에 대한 담체로서만 작용하지는 않는다. 최종적으로, 결합체 백신이 전체 폐렴구균 미생물의 사용을 포함하지 않기때문에, 백신의 투여는 폐렴구균-유발 질환을 유도하지 않는다.
본 발명은 폐렴구균(Streptococcal pneumoniae)의 협막 다당류로부터 유도된 산화 다당류 및 재조합적으로 발현되는 폐렴구균의 뉴모리신 단백질을 포함하는 면역원성 다당류-단백질 결합체에 관한 것으로, 여기서 뉴모리신은 상기 산화 다당류와 접합하기 전에 변독소화 되지 않거나 또는 부위-특이 돌연변이생성에 의해 생성되지 않는다.
도 1은 폐렴구균 유형 18C 및 20으로부터 뉴모리신 유전자(ply)를 커버하는 클론의 물리적 지도를 나타낸다. 제한 부위를 다음과 같은 약어로 나타낸다: Bs=BstYI , S1=SaII, Hd=HindIII, EV=EcoRV.
도 2는 pGEX-PL 18C-31을 발생시키기 위해서 폐렴구균 유형 18C로부터의 ply 유전자를 발현 벡터, pGEX-2T중으로 서브클로닝시키기 위한 도식도이다. 제한 부위를 다음과 같은 약어로 나타낸다: EI=EcoRI, Bs=BstYI, Hd=HindIII, EV=EcoRV, BH=BamHI.
도 3은 재조합적으로 발현된 rPL을 정제하기 위해 사용된 방법을 나타낸다.
도 4A는 각 정제 단계에서 rPL 제제의 SDS-PAGE(Coomassie 블루로 염색된 8내지 16%의 아크릴아미드)를 나타낸다. 레인은 다음과 같다: 1 IPTG 유도전 이. 콜라이 세포, 2. 45분 동안의 IPTG 유도후의 이. 콜라이 세포, 3. 2시간 동안의 IPTG 유도후의 이. 콜라이 세포, 4. 유도된 이. 콜라이의 총 세포용해물, 5. 친화성 겔 컬럼에 의해 결합되지 않은 이. 콜라이 단백질(GST-rPL은 컬럼에 결합), 6. 용출후 정제된 융합 단백질, GST-rPL, 7. 융합 단백질의 트롬빈 분해후 GST와 rPL의 혼합물, 8. 정제된 rPL(GST 및 트롬빈 비함유), 9. 다음과 같은 분자량 마커(각각 KD): 97.4-포스포릴라제 B; 66-소 혈청 알부민; 45-난 알부민: 31-탄소 언히드라제; 21.5-트립신 억제제; 14.5-리소자임.
도 4B는 각 정제 단계에서 rPL 제제의 면역블롯을 나타낸다. 천연 뉴모리신에 대한 토끼 항혈청이 면역블롯팅에 사용된다. 레인 1 내지 8은 도 4A의 레인 1 내지 8에 상응한다.
길이가 471 잔기인 설프히드릴-활성화 용혈성 독소인 뉴모리신은 폐렴구균의 모든 유형에 의해 생성되고 폐렴구균 감염에서 추정적인 독력 인자인 것으로 사려된다. 이러한 독소는 대략 53,000 달톤(53 kD)의 분자량을 갖는다. 불활성화 뉴모리신으로 감염된 마우스 및 래트는 생 폐렴구균으로 자극될 때 향상된 생존율을 나타낸다(9,10). 따라서, 뉴모리신은 잠재적 백신 후보이고, 본 발명에서 보인 바와 같이, 결합체 백신의 제조를 위한 유용한 단백질 담체이다. 천연 뉴모리신이 폐렴구균에서 낮은 수준으로 생성되기 때문에, rPL을 과발현시키는 재조합 이. 콜라이의 작제가 착수된다. 뉴모리신 유전자는 폐렴구균 유형 1 (11), 2 (12) 및 19F(13), 및 바실러스 서브틸리스 (13A)로부터 이. 콜라이에서 이미 클로닝되고, 서열분석되며 발현되었다. 뉴모리신은 명백한 시그널 서열(12)의 결여로, 폐렴구균 세균에 의해 분비되지 않는다.
본 발명의 양태 가운데 폐렴구균으로부터 뉴모리신 유전자의 클로닝 글루타티온 S-전이효소(GST) 유전자 융합 시스템을 이용한 융합 단백질로서 이. 콜라이내 뉴모리신의 수배 과발현 및 글루타티온-아가로즈 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피와 부위-특이성 프로테아제인 트롬빈을 이용하여 GST-rPL을 함유하는 융합 단백질내 GST의 절단을 이용한 53 킬로달톤(kD) rPL의 정제를 포함하는 과정이 하기에 설명된다. rPL의 아미노산 조성, 말단 아미노산 서열 및 면역학적 반응성이 측정된다. 이러한 방식으로 수득된 rPL은 융합 단백질의 GST를 절단한 후, 두개의 추가 아미노산이 rPL의 아미노-말단에 존재하는 것을 제외하고는 천연 단백질과 동일하다.
하기 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 유형 18C로부터의 뉴모리신 유전자 또는 유형 18C 및 유형 20으로부터 유전자 부분의 융합으로부터의 하이브리드 뉴모리신 유전자를 함유하는 발현 벡터를 제조하고 이. 콜라이 숙주내로 삽입한다. 폐렴구균의 다른 유형 또한 뉴모리신 유전자의 적합한 공급원이다. 다른 통상적인 숙주 세포가 rPL의 발현에 적합하다.
재조합 플라스미드 pGEX-PL 18C를 운반하는 이. 콜라이 균주 SCS1의 샘플은 출원인에 의해 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A)에 기탁되고, ATCC 기탁 번호 69654를 부여 받았다.
재조합 플라스미드 pGEX-PL 18C/20을 운반하는 이. 콜라이 균주 SCS1의 샘플은 출원인에 의해 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A)에 기탁되고, ATCC 기탁 번호 69655를 부여 받았다.
ATCC에 기탁된 물질은 또한 N-말단에서 트롬빈 절단후에 남아있는 추가의 글리신 및 세린 잔기가 결여되어 있는 천연 뉴모리신 단백질을 재생성시키기 위해 통상적인 유전 공학 기술과 병행하여 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 다양한 폐렴구균 유형의 협막 다당류는 본원에 참고로 인용된 양도된 미국 특허 제 4,242,501 호 및 제 4,686,102 호(1, 3)에 기재되어 있다. 이렇게 하여 수득된 정제 폐렴구균 다당류는 50% 이상이 SepharoseTMCL-4B(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)의 컬럼상에서 0.3 이하의 용출 계수(Kav) 값을 갖는 비교적 높은 분자 크기를 갖는다. 이러한 값은 6×105달톤 이상의 분자량에 상응한다.
천연 형태에서는, 폐렴구균 미생물로부터의 다당류는 반응성 환원 그룹을 함유하지 않는다. 환원 그룹을 함유하는 각 반응성 다당류를 생성하기 위해서는, Parikh 일동의 방법에 따라 알데히드 작용기를 생성하기 위하여(14) 페리오데이트로 산화시킴으로써 다당류의 시스-근접 히드록실 그룹의 분해에 의해 다당류를 조절된 양의 나트륨 페리오데이트로 부분적으로 수소화시켜 환원 그룹을 생성시킨다. 정제된 폐렴구균 다당류를 다양한 길이의 시간 동안 4℃ 또는 실온에서 0.2 내지 50mM 나트륨 페리오데이트로 암실에서 처리한다. 바람직한 양태에서, 다당류를 pH4.0 내지 5.0에서 처리한다. 나트륨 페리오데이트의 사용이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태는 페리오데이트를 이용한 약산성 또는 산화 절단에 의한 다당류의 반응성 그룹을 생성하기 위한 유형 6B, 14 및 18C([O]6B, [O]14 및 [O]18C) 같은 산화된 폐렴구균 다당류를 제조하기 위한 방법이다.
산화후에, 이어 산화 다당류("[O]PS")를 발열물질-비함유수애 대해 광범위하게 투석시켜 작은 분자 크기 물질을 제거한다. 대안적으로, SepharoseTMCL-4B 같은 겔 여과 컬럼을 [O]PS의 정제를 위헤 사용할 수 있다. 겔 여과 컬럼이 사용될 때, 분획은 정제된 상응하는 다당류를 표준물로서 이용하여 페놀-황산 열량측정 방법에 의해 [O]PS의 존재에 대해 분석된다(15). 이어서, 정제된 생성물을 농축 및 동결-건조에 의해 회수한다. 결과의 [O]PS는 약 15 내지 800 단량체 단위의 쇄 길이를 갖는다.
유형 18C내 반응성 그룹을 생성하기 위해 신규한 방법이 사용된다: 다당류를 부분적으로 해중합하고, 중간 크기 분자를 생성하기 위해 절단한 다음 산화시킨다.
산화가 부분 해중합 없이 수행된다면, 불가능한 겔-유사 물질이 수득된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서, 유형 18C 다당류를 먼저 아세트산 처리 같은 약산에 의해 부분 해중합시켜, 약 10,000 내지 600,000 (SepharoseTMCL-4B 컬럼상에서 0.3 내지 0.7의 Kav)의 분자 크기로 감소시킨다. 이어서, 유형 18C 다당류만을 작용성 환원 그룹을 생성하기 위해서 전술된 바와 같은 페리오데이트 산화를 한다. 하기 기술된 바와 같이 rPL과 결합할 때, 생성물은 백신 용도에 적합한 형태이다.
[O]PS는 직접 또는 간접 결합을 이용하여 단백질 담체로서 rPL과 결합한다. 직접 결합에서, [O]PS는 통상적인 수단에 의한 환원성 아민화를 위한 시아노보로하이드라이드를 이용하여 rPL에 결합시킨다.
[O]PS내 작용성 알데히드 그룹을 Schiff 염기를 형성하기 위한 아미노 그룹(특히, 리신 그룹)을 함유하는 rPL과 반응시킨다. 시아노보로하이드라이드 같은 약한 선택적 환원제의 존재하에, 안정한 공유-결합 결합체가 형성된다. 반응은 바람직하게는 pH 5 내지 9에서 수행된다. [O]PS를 사용되는 단백질과 커플링하는 방법론이 Parikh 일동(14) 및 Schwartz와 Gray(16)에 의해 기재되어 있다.
폐렴구균 유형 6B, 14 또는 18C의 [O]PS(농도 1 내지 10mg/㎖)를 실온 또는 37℃에서 0.2M 인산칼륨 완충액 또는 인산 나트륨 완충액 (pH 6.0 내지 8.0)내 rPL(농도 1 내지 10mg/㎖)과 혼합시킨다.
온화한 혼합하에 배양 30분 후에, 0.1 내지 2.0mM의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 첨가한다. 이 혼합물을 온화한 혼합하에 1 내지 8일 동안 25 내지 37℃에서 배양시켜 [O]PS-rPL 결합체를 형성한다. 결합체를 SepharoseTMCL-4B 같은 겔 여과 컬럼상에서 정제한다. 분획은 소 혈청 알부민을 표준물로서 이용하여, Bio-Rad 단백질 분석제로 브래드포드 방법에 의해 단백질에 대해서 분석되고(17), 전술한 바와 같이 [0]PS에 대해 분석된다(15). 결합체를 함유하는 분획을 모으고, 투석시켜, 투석여과시키고/거나 동결건조시킨다.
대안적으로, rPL을 [O]PS와 결합전에 스페이서와 먼저 결합시킨다. 그러한스페이서의 예는 아디프산 디하이드라지드(ADH) 및 6-아미노카프로산이다. ADH가 바람직한 스페이서이다.
본 발명에 따라 가공된 결합체는 질병을 유발한 폐렴구균에 대해 온혈 동물을 보호하기 위한 백신의 제조에 바람직하게는 사용된다. rPL의 용혈 활성(독성)은 뉴모리신만을 단독 투여한 경우에 비교하여, [O]PS와 결합할 때(단독 또는 스페이서와 함께) 크게 감소된다.
결합체를 통상적인 방식으로 면역학적으로 허용되는 희석제 또는 담체에 첨가하여, 주사액 또는 현탁액을 제조한다. 또한, 결합체는 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄(alum) 또는 QS-21(18), 모노포스포릴 지질 A 및 3-O-탈아실화 모노포스포릴 지질 A(3DHPL) 같은 다른 약학적으로 허용되는 보조제와 결합될 수 있다.
예를 들면, [O]PS 및 rPL을 함유하는 결합체 백신, 또는 rPL 및 [O]PS의 상이한 유형을 각각 함유하는, 몇몇 결합체의 혼합물을 포함하는 백신을 제조하기 위해서, 결합체 제제를 1 내지 100㎍의 다당류/㎖의 농도로 인산 나트륨-완충 생리식염수("PBS")(pH 7.09 내지 8.0)중에 현탁시킨다.
본 발명의 결합체 백신을 피하, 복강내 또는 근육내 주사 같은, 통상적인 방식의 주사에 의해 온혈 동물내로 투여하여, 병원체 폐렴구균에 의해 발생된 전신 감염에 대해 보호하기 위한 능동 면역 반응을 유도한다. 투여되는 용량은 당해분야의 기술자에게 공지된 수단에 의해 결정된다. 보호는 백신의 단일 용량에 의해 제공될 수 있거나 수회 부스터 용량의 투여를 요구할 수 있다.
rPL이 자체로는 보호적이 아니지만, rPL만을 투여받는 마우스가 [O]18C 다당류만을 투여받는 마우스보다 더 오래 생존한다는 점이 주목할만 하다. 따라서, 결합체의 보호 효과는 [O]PS에 대한 담체로서 작용하는 rPL뿐만 아니라 rPL 자체의 기능 모두에 기인하는 듯하다.
본 발명을 더 잘 이해하기 위하여, 다음 실시예를 예로든다. 실시예는 단지 설명하기 위한 것에 불과하고 본 발명의 범위가 이로써 제한되지는 않는다.
실시예 1
rPL 유전자의 클로닝 및 발현
하이브리드형 18C/20 rPL 유전자를 함유하는 발현 벡터의 작제
융합 ply 유전자는 적당한 발현 벡터내로 서브클로닝된 유형 18C 및 20으로부터 작제되며, 하이브리드 rPL이 발현된다. 유전자의 3' 말단은 유형 20으로부터 수득되는 반면, 유전자의 5' 말단은 유형 18C로부터 수득된다.
유형 20 ply 유전자의 클로닝을 위한 적당한 제한 부위를 결정하기 위해서, 설프히드릴-활성화 헤모리신 가운데 고보존 영역(뉴클레오티드 1484-1503; 12)과 하이브리드화하는 3' 말단-표지된 올리고뉴클레오티드 탐침(PL20으로 명명)을 이용하여 서던 블롯을 수행한다. 탐침을 비오틴 또는 디곡시게닌으로 표지한다. 1.3kb SalI-EcoRV 단편은 유전자의 5' 말단을 제외하고는 ply 유전자의 대부분을 포함하는 것으로 동정된다. 이러한 1.3kb 단편을 pBR322내 SalI 및 EcoRV 부위내로 삽입시킨다(Boehringer Mannheim Co., Indianapolis, IN). 이. 콜라이 균주 SCS1(Stratagene, LaJolla, CA)의 컴피턴트 세포가 숙주로서 사용된다. 암피실린-내성 및 테트라시클린-감수성 형질전환체를 PL20 탐침을 이용하여 콜로니 하이브리드화에 의해 스크리닝한다. pSE2-2, 3 및 28로 명명된 세개의 동일 재조합체를 분리시킨다(도 1).
pSE2의 SalI-EcoRV 단편을 절단하여 pUC19(New England Biolabs, Beverly, MA)의 SalI 및 SmaI 부위내로 삽입시킨다. 암피실린-내성, 락토오즈-음성(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드("IPTG")에 의해 유도될 때, X-gal [5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노시드] 함유 평판상의 무색 콜로니) 형질전환체를 제한 분석에 의해 스크리닝한다. 양성 재조합체중의 하나를 pSE3-5로 명명한다.
유형 20으로부터의 ply 유전자의 5' 말단을 클로닝하기에 적합한 어떠한 제한 부위도 존재하지 않기때문에, 유형 18C로부터의 게놈 DNA로 서던 블롯을 수행한다. pSE2-2로부터의 1.3kb의 SalI-EcoRV 단편은, 혼합된 프라이머 표지에 의해 표지되며, 탐침으로서 사용한다. 2.8kb BstYI 단편은 5' 및 3' 플랭킹 영역과 함께 완전한 ply 유전자를 함유하는 것으로 동정된다. 이러한 BstYI 단편을 HindIII으로 분해하고, 프로모터-선별 벡터, pKK232-8(19: Pharmacia)의 BamHI 및 HindIII 부위내로 삽입시킨다. 이. 콜라이 균주 SCS1이 숙주로서 사용된다.
ply 유전자의 프로모터를 함유하는 형질전환체를 선별하기 위해서 암피실린-내성(100㎍/㎖) 및 클로람페니콜-내성(5㎍/㎖) 형질전환체를 제한 분석 및 서던 블롯팅에 의해 스크리닝한다. pBH1-32, 35, 36, 37, 38 및 39로 명명된 6개의 동일 재조합체는 5' 상부 비암호화 영역 및 유형 18C로부터의 ply 유전자의 5' 영역에 걸치는 1kb BstYI-HindIII 단편을 함유하는 것으로 밝혀졌다(도 1).
이어서, 작용성 재조합 단백질을 생성하기 위해서, 상술된 유형 18C 및 20으로부터 클로닝된 폐렴구균 DNA 단편을 글루타티온-S-전이효소 융합 단백질 시스템(20)을 이용하여, 융합시켜 플라스미드 pGEX -2T(Pharmacia)에서 하이브리드 ply 유전자를 작제한다(20).
중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 유전자의 5' 말단의 서브클로닝을 용이하게 한다. 두개의 프라이머가 합성된다: 암호화 서열의 개시부에 클로닝을 용이하게 하기 위해 개시 코돈의 바로 상부에 BamHI 부위가 도입된 센스 프라이머(뉴클레오티드 208-231; 12); 및 유전자내 고유한 EcoRI 부위를 커버하는 영역과 하이브리드화하는 안티센스 프라이머(뉴클레오티드 709-733; 12). pBH1-37(유형 18C)로부터의 0.7kb BstYI-EcoRI 단편이 VentTMDNA 중합효소(New England Biolabs, Beverly, MA)에 의해 증폭되는 주형으로 작용하며, 그로 인해 0.5kb 단편을 생성한다.
PCR 실험을 다음과 같이 수행한다: DNA를 VentTMDNA 중합효소의 첨가에 앞서 95℃에서 5분 동안 변성시켜, 변성을 30회 반복하고(95℃에서 30초 동안), 어닐링(50℃에서 30초 동안) 및 중합(72℃에서 1.5분 동안)을 수행한다.
증폭된 DNA 단편을 BamHI 및 EcoRI로 분해하여, pGEX-2T내 BamHI 및 EcoRI 부위내로 삽입한다. 무작위 선발된 암피실린-내성 형질전환체를 제한 분석에 의해 목적하는 삽입물의 존재에 대해 시험한다. pBEO.514로 명명된 재조합체가 양성으로서 동정된다(도 2). 다음에 pSE3-5(유형 20)로부터의 1.0kb EcoRI(유전자 내 고유 부위)-EcoRI(pUC19 벡터로 부터 유도, New England Biolabs) 단편을 pBEO.514내에서 증폭된 DNA의 하부에 삽입한다.
양성 재조합체는 다음과 같이 수행되는 토끼 적혈구 오버레이(12)에 의해 동정된다. LB 아가 평판상의 암피실린-내성 형질전환체를 5㎖의 2.5% 토끼 혈구(1mM IPTG 및 1mM DTT를 함유하는 PBS내 0.7% 용융 아가내)로 덮고 37℃에서 3시간 동안 배양시킨다. 제조한 플라스미드를 운반하는 콜로니는 용혈의 환상 영역을 보인다.
4개의 개별적 콜로니(pGEX-PL 18C/20-1, 2, 3 및 11)는 용혈의 환상 영역을 보인다. 제한 분석으로 gst 유전자의 3' 말단에 융합된 완전한 ply 유전자의 존재를 확인한다.
유형 18C rPL 유전자를 함유하는 발현 벡터의 작제
상술한 바와 같이, HindIII로 유형 18C 염색체 DNA의 2.8kb BstYI 단편을 분해함으로써 유형 18C로부터 5' 상부 비암호화 영역 및 ply 유전자의 5' 영역에 걸치는 1kb의 단편이 생성된다. 또한 분해에 의해 콜로니 하이브리드화에 의해 동정된 바와 같이, ply 유전자의 3' 영역 및 3' 비암호화 영역(도 1)에 걸치는 1.8kb의 단편이 생성된다. 암피실린-내성 및 클로람페니콜-감수성 형질전환체의 스크리닝으로 pHB2-1, 26 및 32로 명명된 세개의 동일 재조합체를 동정한다.
pGEX-2T내 유형 18C로부터의 완전한 ply 유전자의 작제에 세개 단편의 연결이 요구된다. 서브클로닝에 사용될 제한 부위의 부족때문에, 일련의 클로닝 단계가 수행된다.
우선, pHB2-32를 HindIII 및 EcoRV로 분해하여 0.7kb의 단편을 생성한다. 이 단편을 pUC19내로 삽입하여 pHV3-2, 4 및 6으로 명명된 세개의 재조합체를 생성시킨다. 두번째는, pBH1-35를 EcoRI로 분해하여 pII3-1, 2, 3, 4 및 5로 명명된 다섯개의 재조합체를 발생시키기 위해 pUC19내로 삽입되는 0.5kb의 단편을 생성한다. 세번째는, pII3-1 및 pHV3-2 또는 6을 HindIII으로 분해한다. 네번째는, pII3-1로부터의 0.3kb HindIII 단편의 pHV3-2 또는 6의 HindIII 부위로의 클로닝을 수행하여 pHHV3-31, 54 및 55로 명명된 세개의 제조합체를 생성한다. 다섯번째는, pHHV3-31 및 pBEO.514를 EcoRI로 분헤한다. 마지막으로, 여섯번째는 pHHV3-31로부터의 1.0kb EcoRI 단편을 pBEO.514의 EcoRI 부위내로 삽입한다. pGEX-PL 18C-31 내지 39로 명명된 아홉개의 동일 재조합체를 토끼 적혈구 오버레이에 의해 분리시킨다.
보다 구체적으로 밝혀서, 상술된 폐렴구균 유형 18C로부터 염색체 DNA의 2.8kb BstYI 단편을 HindIII으로 분해하고 기술된 바와 같이(21) pKK232-8의 BamHI 및 HindIII 부위(19)에 연결시킨다(도 2는 HindIII 부위를 표시한다). 이. 콜라이 XL1-Blue(22)의 컴피턴트 세포(Stratagene Cloning System, La Jolla, CA)를 형질전환시켜 클로람페니콜(10㎍/㎖)이 있거나 없이, 암피실린(50㎍/㎖)을 함유하는 루리아-베르타니(LB) 아가 평판(지)상에서 플레이팅된다. 암피실린 내성 형질전환체는 유형 20 ply 유전자(23)로부터 유도되는 탐침인 0.9kb EcoRI-EcoRV 단편을 사용하여 클로람페니콜 내성 및 콜로니 하이브리드화(21)에 의해 스크리닝된다. 정확한 단편을 함유하는 것으로 동정된 몇몇 재조합체 가운데서 pBH1-35 및 pHB2-32로 명명된 두개를 서브클로닝용으로 사용하기 위해 선택한다.
이어서, 완전한 ply 유전자는 통상적인 클로닝 방법(21) 및 VentTMDNA 중합효소(New England Biolabs, Beverly, MA)로 중합효소 연쇄 반응을 함으로써 gst 유전자의 3' 말단 프레임에서 pGEX-2T(20; Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ에서 시판)중에 작제된다. 이. 콜라이 SCS1(24)의 컴피턴트 세포(Stratagene)가 사용된다. 암피실린 내성 형질전환체는 토끼 적혈구 오버레이(12)에 의해 스크리닝된다: 재조합 플라스미드를 운반하는 콜로니는 용혈의 환상 영역을 보인다. 유사한 특성을 지닌 아홉개의 분리체중 하나를, pGEX-PL 18C-31로 명명하며, 추가의 성상확인을 위해 선택한다(도 2).
rPL의 발현, 정제 및 성상확인
유형 18C/20 또는 18C로부터의 ply 유전자를 글루타티온 S-전이효소(GST) 융합 단백질(20)로서 이. 콜라이에서 클로닝하고 과발현시킨다. 결과의 융합 단백질은 수용액중에서 가용성이고 비-변성 조건하에서 조 세균 용해물로부터 정제된다. 이러한 조건은 정제후에 rPL의 항원성을 보호한다. GST-rPL 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피 같은 간단한 수단에 의해 정제될 수 있다.
rPL의 충분한 양을 정제하기 위해서, 다음의 친화성 크로마토그래피 과정이 수행된다. rPL의 정제에 대한 흐름도를 도 3에서 나타냈다. 암피실린(100㎍/㎖)을 함유하는 50㎖의 1X 루리아 육즙 또는 1X 테리픽 육즙(25)내 pGEX-PL 18C 또는 pGEX-PL 18C/20을 함유하는 이. 콜라이 SCS1의 철야 배양액을 1ℓ의 동일한 배지에 첨가한다. 이어서, 600nm에서 흡광도 1에 도달할 때까지 재조합 이. 콜라이를 격렬한 진탕하에 37℃에서 성장시킨다. IPTG를 유도제로서 배양액에(농도 1mM이 되게) 첨가하고, 이. 콜라이 세포를 2시간 동안 계속해서 성장시킨다. 극소량의 GST-rPL융합 단백질이 유도전에 생성되는 반면(레인 1, 도 4B 참조), IPTG는 단시간(30분 내지 2시간)내에 다량으로 융합 단백질의 발현을 유도한다. 융합 단백질, GST-rPL은 과발현되고, Coomassie 블루로 염색된 SDS-PAGE상에서 총 세균 단백질의 10% 이상을 구성한다(도 4).
세포를 4℃에서 5 또는 10분 동안 10,000×g으로 원심분리시키고, 인산염 완충 생리식염수(PBS: 150mM NaCl, 16mM NaH2PO4, 4mM Na2HPO4, pH 7.3)로 1회 세척하여 1/50 부피의 PBS에서 재현탁시킨다. 트리톤 X-100을 1%의 최종 농도가 되게 첨가하고, 세포를 온화한 초음파 처리 또는 프렌치 프레스(12,000 lbs)를 통해 2회 통과시켜 용해시킨다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 10,000×g에서 원심분리시키고, 세포 잔재를 TPBS(PBS내 1% 트리톤 X-100)으로 1회 세척한다. 상등액을 모으고 200㎖의 투명한 세포 용해물을 TPBS로 평형시킨, 10 또는 50㎖ 글루타티온-아가로즈 겔(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)의 컬럼에 적용한다. 컬럼을 5 베드-부피의 TPBS, 2 베드-부피의 PBS, 및 1 베드-부피의 50mM 트리스-HCl, pH 8.0으로 세척하여 원하지 않는 물질을 제거한다. 융합 단백질, GST-rPL을 5 또는 10mM 글루타티온/50mM 트리스-HCl, pH 8.0으로 용출시킨다. 용혈 및 단백질 분석에 의해 지시된 바와 같이, 용혈 활성을 보이는 분획을 모은다. 분획은 다음과 같이 용혈성인 것으로 동정된다: 1㎕의 각 분획을 50㎕의 10mM DTT/PBS에 첨가한 다음 25㎕의 5% 토끼 적혈구와 미세역가 평판상에서 혼합시켜 실온에서 15분 동안 배양시킨다. 용혈을 눈으로 확인한다.
이어서, GST-rPL을 GST및 rPL사이에 고유한 인식 부위(20)를 갖는 프로테아제, 즉 트롬빈에 의해 분해한다. 융합 단백질을 소 혈장 트롬빈(Sigma)(5단위/mg 단백질)과 혼합시킨 다음, 트롬빈 절단 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 8.3, 150mM NaCl, 2.5mM CaCl2)에 대해 실온에서 밤새 투석시킨다(분자량 절단: 12-14,000). GST, rPL 및 일부 미분해 GST-rPL의 혼합물을 Amicon CentriprepTM-10(Beverly, MA)(분자량 절단: 10,000)을 이용하여 20℃에서 3,000×g으로 원심분리시켜 농축하고 PBS에 대한 완충액을 교환한 다음, 글루타티온-아가로즈 컬럼에 적용시킨다. GST 및 여타의 절단되지 않은 GST-rPL도 컬럼에 특이적으로 결합하기 때문에, rPL은 컬럼을 통하여 자유롭게 통과하고 PBS 용출물에 수집된다. rPL을 함유하는 용혈 분획을 모은다. 완충액을 CentriprepTM-10을 이용하여 10mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0)으로 교환한다. 트롬빈을 10mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0)으로 평형시킨 1㎖ 헤파린-SepharoseTM겔(Pharmacia)의 컬럼을 통하여 통과시킴으로써 rPL(26)로부터 제거한다. 정제된 rPL을 4℃에서 저장한다. 이러한 정제로부터의 수율은 약 6 내지 10mg/ℓ 배양액이다.
정제된 rPL은 SDS-PAGE/Coomassie 블루 균주에 의해 지시된 바와 같이 분자량 53,000 달톤으로 겔상에서 단일 밴드를 나타낸다. 겔의 밀도측정 스캔은 rPL의 순도가 95% 이상임을 나타낸다.
상술된 방법이 순도 95% 이상인 rPL을 생성하지만, 수산화인회석(HA) 크로마토그래피의 최종 단계를 첨가함으로써 더 높은 순도를 얻을 수 있다. 이러한 단계를 HA-고속 유동 1.6×8.0cm 컬럼(Calbiochem. Corp., LaJolla, CA)을 이용하여 수행한다. 컬럼을 10mM 인산 나트륨 완충액(pH 6.8)으로 평형에 이르게한다. rPL의 10㎖(약 10mg) 분량을 HA 컬럼에 첨가하고, 단백질을 10mM 내지 200mM 인산나트륨 완충액(pH 6.8)의 100㎖ 선형 농도 구배로 용출시킨다. 컬럼 용출물을 약 1.5㎖/분의 유속으로 2.0㎖ 분획에 수집한다. 분획을 전술한 바와 같이 분석한다(11). rPL을 함유하는 분획을 모아서 SDS-PAGE에 의해 단백질 농도, 용혈 활성 및 순도에 대해서 분석한다. rPL은 약 85 내지 115mM 인산염 완충액에서 단일 피크로 용출된다. 용출된 단백질은 SDS-PAGE에 의해 보인 바와 같이 거의 균질이고 지질다당류(내독소)를 거의 오염시키지 않는다.
rPL의 분자 질량은 SDS-PAGE 및 매트릭스 보조 UV-레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법에 의해 측정되며 53,000 달톤이다.
정제된 rPL은 토끼 적혈구상에서 3 x 105용혈 단위/mg 단백질의 특이 활성을 가지며(27), 이는 약 106용혈 단위/mg 천연 PL에 필적한다(9, 27). 특이적 용혈 활성은 Paton 일동의 방법을 약간 변형하여 측정된다(9). 샘플을 1.7% 토끼 적혈구로 혼합하기 전에, 10mM DTT로 활성화시킨다. 상등액의 흡광도를 550nm에서 측정한다.
화학발광 검출을 위한 Lumi-PhosTM530(Boehringer Mannheim Co., Indianapolis, IN)을 이용한 면역블롯팅에서, GST-rPL 융합 단백질 및 rPL 모두 천연 PL에 대한 항체를 함유하는 항혈청과 반응한다(도 4B). 분명하게, 고분자량 융합 단백질은 rPL에 비해 비효율적으로 Nytran 막(Schleicher & Schuell Inc., Keene, NH)으로 이송되고 항체에 의해 여전히 인식될 수 있는 생성물로 분해된다.
Ouchterlony 면역확산결과는 rPL이 항-PL 및 항-rPL 항체와 동일하게 반응함을 나타낸다. 이는 rPL이 천연 PL로서 동일한 항원 결정기를 가짐을 제안한다. N-말단 서열(40 잔기까지)의 아미노산 분석 및 결정은 정제된 rPL상에서 수행된다. rPL의 N-말단 서열은 천연 PL의 N-말단 서열, 및 N-말단에서 트롬빈 절단 후 rPL 상에 잔존하는 두개의 추가 잔기(글리신 및 세린)를 제외한 유형 2 ply유전자(11, 12)의 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 예상 서열과 동일하다. rPL의 아미노산 조성은 유형 2 ply 유전자(12)의 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 것과 일치한다.
실시예 2
폐렴구균 협막 다당류의 제조
본 발명에 사용된 다양한 폐렴구균의 협막 다당류가 본원에 참고로 인용되는 미국 특허 제 4,242,501호(1) 및 4,686,102호(3)에 기재되어 있다. 그렇게 수득된 정제된 폐렴구균 다당류는 SepharoseTMCL-4B(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)의 컬럼상에서 50% 이상이 0.3 이하의 용출상수(Kav)를 갖는 비교적 높은 분자 크기를 갖는다. 이러한 값은 6×105달톤 이상의 분자량에 상응한다.
실시예 3
환원 그룹을 함유하는 반응성 산화 유형 14 다당류의 제조
폐렴구균 유형 14 다당류의 100mg 샘플을 20㎖의 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0)에 용해시킨다. 나트륨 페리오데이트의 4mg 분량을(최종 농도 1 mM이 되게) 암실에서 첨가하고 혼합물을 실온에서 10분 동안 알루미늄 포일로 싸인 마개로 막은 엘렌마이어 플라스크에서 온화하게 교반시킨다. 과량의 나트륨 페리오데이트를 실온에서 10분 동안 1㎖의 0.5 M 에틸렌 글리콜과 반응시킴으로써 파괴시킨다. 결과의 산화 유형 14 ("[O]14") 다당류를 함유하는 반응 혼합물을 광범위하게 투석여과시키고 아미콘(Beverly, MA) 농축기로 실온에서 3,500 달톤 절단 막으로 농축시킨다. 투석여과된 [O]14 다당류를 동결건조시키고 사용될 때까지 -20℃에서 저장시킨다.
실시예 4
환원 그룹을 함유하는 반응성 산화된 유형 18C 다당류의 제조
유형 14 다당류를 산화시키기 위해서 실시예 3에 기술된 과정을 페리오데이트 산화전에, 유형 18C 다당류를 rPL과 결합할 때 다당류의 겔화를 막기 위해 1M 아세트산에 의해 부분적으로 해중합시키는 것을 제외하고는 유형 18C에 대해 반복한다. 유형 18C 다당류의 500mg 샘플을 50㎖ 아세트산(최종 pH 2.5)에 현탁시키고 60℃에서 40시간 동안 배양시킨다. 이어서, 6㎖의 2M 아세트산 나트륨을 첨가한다(최종 pH 4.0). 아미콘 교반 셀(YM10)을 이용하여 혼합물을 약 12㎖로 농축시킨다. 농축물을 SepharoseTMCL-4B 컬럼상에 두고 10mM PBS 및 0.01%의 NaN3로 용출시킴으로써 컬럼 크로마토그래피시킨다. 4㎖의 분획을 수집하고 Kd 0.3 내지 0.7(10 내지60 kD)의 것들을 모은다. 분획을 12 내지 14 kD분자량 절단으로 물에 대해서 매일 물을 교환해주면서 투석한다. 이어서, 페리오데이트 산화 단계 수행하여 산화 유형 18C("[O]18C") 다당류를 생성한다.
실시예 5
[O]14 다당류-rPL 결합체의 제조
실시예 3에서 제조된 [O]14 다당류를 6mg/㎖의 농도로 0.2 M 인산 칼륨 완충액 (pH 8.0)에 용해시킨다. 실시예 1에 따라 제조된 rPL(이. 콜라이내 ATCC 69654 또는 ATCC 69655로부터 발현) 또한 약 2mg/㎖의 농도로 동일 완충액중에 분리된 용기에서 용해시킨다. [O]14 다당류 용액(0.5㎖) 및 rPL 용액(0.5㎖)을 실온에서 혼합한다. 30분 후에, 나트륨 시아노보로하이드라이드(2.5mg)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 5일 동안 배양한다. 혼합물을 10 mM PBS (pH 7.0)로 먼저 평형시킨 SepharoseTMCL-4B 컬럼상에서 크로마토그레피시킨다. 결합 물질을 농도 구배없이 동일 완충액으로 용출시킨다. 결합체를 함유하는 피크 분획을 다당류 및 단백질에 대해서 분석한다(15, 17). 결합체를 함유하는 분획을 모으고, 성상확인하여 백신 제제용으로 사용한다. [O]14 다당류-rPL 결합체는 약 7:1의 탄수화물/단백질 w/w비를 갖는다. 결합체 백신 제제를 사용할 때까지 4℃에서 저장한다.
실시예 6
스페이서 아디프산 디히드라지드 (ADH)로 [O]14 다당류-rPL 결합체의 제조
rPL-ADH 유도체의 제조
실시예 1(유형 18C 또는 유형 18C/20)에 따라 제조된 3㎖의 rPL (9mg)을 0.1M 인산칼륨 완충액 (pH 5.5)에 넣는다. 완충된 rPL을 ADH (20mg) 및 카보디이미드(20mg)와 혼합하고, 실온에서 3시간 동안 배양시킨다. 반응 혼합물을 3,500 달톤 절단 막이 달린 스펙트라포 막 튜빙내 4℃에서 0.1 M 인산칼륨 완충액 (pH 7.0)에 대해 투석시킴으로써 pH 7.0으로 변화시킨다. rPL-ADH 유도체를 함유하는 투석된 물질을 SepharoseTMCL-4B 컬럼상에서의 크로마토그래피에 의해 성상확인한다. 단백질 함량을 브래드포드 방법에 의해 분석하고(17), ADH를 표준물로서 ADH와 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산의 반응에 의해 측정한다(28). rPL-ADH 유도체(액체)를 사용할 때까지 4℃에서 저장한다.
[O]14 다당류-ADH-rPL 결합체의 제조
실시예 3에 따라 제조된 [O]14 다당류를 6mg/㎖의 농도로 0.1 M 인산칼륨 완충액 (pH 8.0)에 용해시키고 또한 rPL-ADH 유도체를 3mg/㎖의 농도로 동일 완충액에 분리된 용기에서 용해시킨다. [O]14 다당류의 2.5㎖ 샘플 및 rPL-ADH 유도체 2.5㎖ 샘플을 실온에서 혼합한다. 2시간 후에, 물중의 나트륨 시아노보로하이드라이드 (12.5mg)를 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 4일 동안 온화한 혼합으로 배양시킨다. 혼합물을 10mM PBS (pH 7.0)로 먼저 평형시킨 SepharoseTMCL-4B 컬럼상에서 크로마토그래피시킨다. 결합 물질을 동일 완충액으로 용출시킨다. 결합체를 함유하는 피크 분획을 상술한 바와 같이 동정하고, 이어서 모은 다음, 성상확인하여 백신 제제용으로 사용한다. 은 염색 SDS-PAGE는 고분자량 물질이 결합체에 존재함을 보인다. 풀 1(SepharoseTMCL-4B으로부터)으로 명명된 모은 분획의 제 1 그룹은 0.08 내지 0.20의 Kav를 갖고; 반면에, 풀 2로 명명된 모은 분획의 제2 그룹은 0.21 내지 0.34의 Kav를 갖는 물질을 함유한다. 결합체 풀 1에 대한 탄수화물:단백질의 비는 11:1이고; 결합체 풀 2에 대한 비는 13:1이다. 결합체 제제는 백신의 제조를 위해 사용된다. 결합체 제제를 4℃에서 저장한다.
실시예 7
[O]18C 다당류-rPL 결합체의 제조
결합체 사용에 적합한 이러한 다당류의 중간 길이를 준비하기 위해서, 실시예 4의 방법을 약간 변형하여 사용한다. 유형 18C 다당류의 500mg 분량을 50㎖의 1M 아세트산 (pH 2.3)에 용해시키고 60℃에서 40시간 동안 배양시킨다. 처리된 다당류를 2M 아세트산 나트륨으로 pH 4.5로 조정한다. 샘플은 SepharoseTMCL-4B 컬럼상에서 크기별로 분류된 분자이다. 0.3 내지 0.7의 Kav에서 용출되는 다당류(분자량 15,000 내지 600,000)를 모은다. 모은 분획을 4℃에서 발열물질-비함유수에 대해 광범위하게 투석시킨 다음 동결건조시킨다. 물질을 [O]18C 다당류의 제조를 위해 사용될 때까지 -20℃에서 저장한다.
유형 18C 다당류의 중간 크기 50mg 분량을 10㎖의 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0)에 용해시키고 암실에서 실온으로 10분 동안 4mg의 나트륨 페리오데이트(최종 농도 2mM)로 산화시킨다. 과량의 나트륨 페리오데이트를 10분 동안 50㎕의0.5M 에틸렌 글리콜(최종 농도 25mM)과 반응시킴으로써 붕괴시킨다. [O]18C 다당류를 함유하는 반응 혼합물을 광범위하게 투석시킨 다음 동결건조한다. 물질을 -20℃에서 저장하고 rPL과의 결합체 제조를 위해 사용한다.
[O]18C 다당류를 6mg/㎖의 농도로 0.2M 인산칼륨 완충액 (pH 8.0)에 용해시킨다. 또한 실시예 1에 따라 제조된 rPL(이. 콜라이에서 ATCC 69654 또는 ATCC 69655로부터 발현)을 3mg/㎖의 농도 동일 완충액에 분리된 용기에서 용해시킨다. 1㎖의 [O]18C 다당류 용액 및 0.5㎖의 rPL 용액을 실온에서 혼합한다. 1시간 후에, 나트륨 시아노보로하이드라이드(3mg)를 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 8일 동안 배양시킨다. 혼합물을 10 mM PBS(pH 7.0)로 평형시킨 SepharoseTMCL-4B 컬럼상에서 크로마토그래피시킨 다음, 동일 완충액으로 용출시킨다. 결합체를 함유하는 피크 분획을 상술된 바와 같이 동정하고, 모아서 성상확인한다. [O]18C 다당류-rPL 결합체는 약 0.76:1의 탄수화물/단백질 비를 갖는다. 은 염색 SDS-PAGE는 고분자량 물질이 존재함을 보인다. 결합체를 백신 제제용으로 사용할 때까지 4℃에서 저장한다.
실시예 8
스페이서 ADH로 [O]18C 다당류-rPL 결합체의 제조
[O]18C 다당류의 제조
[O]18C 다당류를 실시예 7에 따라 제조하고, -20℃에서 저장하며 rPL-ADH 유도체와의 결합체를 제조하기 위해 사용한다.
rPL-ADH 유도체의 제조
실시예 1에 따라 제조된 rPL(12mg)(유형 18C 또는 유형 18C/20)의 10㎖ 분량을 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 5.4)에 둔다. 완충된 rPL을 0.3㎖의 ADH(30mg) 및 0.1㎖의 카보디이미드(30mg)와 혼합하고, 실온에서 3시간 동안 온화한 혼합하에 배양시킨다. 반응 혼합물을 3,500달톤 절단막으로 스펙트라포 막 튜빙에서 4℃로 2일 동안 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.0에 대해 투석함으로써 pH 7.0으로 변화시킨다. rPL-ADH 유도체를 함유하는 투석된 물질을 Amicon CentriprepTM(10,000 달톤 절단)으로 약 4㎖로 농축시키고 SepharoseTMCL-4B 컬럼상에서 크로마토그래피시킨다. 단백질 및 ADH의 함량을 전술된 바와 같이 분석한다. rPL-ADH 유도체를 사용할 때까지 4℃에서 저장한다.
[O]18C 다당류-ADH-rPL 결합체의 제조
[O]18C 다당류를 6mg/㎖ 농도로 0.2M 인산칼륨 완충액(pH 8.0)에 용해시키고, rPL-ADH 유도체를 또한 약 2.7mg/㎖의 농도로 동일 완충액에 분리된 용기에서 용해시킨다. [O]18C 다당류의 2.5㎖ 분량 및 2.5㎖의 rPL-ADH 유도체를 실온에서 혼합한다. 2시간 후에, 수중 나트륨 시아노보로하이드라이드(12.5mg)를 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 온화한 혼합하에 4일 동안 배양시킨다. 혼합물을 먼저 10 mM PBS(pH 7.0)로 평형시킨 SepharoseTMCL-4B 컬럼상에서 크로마토그레피시킨다. 결합체 물질을 동일 완충액으로 용출시킨다. 결합체를 함유하는 피크 분획을 상술된 바와 같이 동정하고, 모으며, 성상확인하여 백신 제제용으로 사용한다. 은 염색SDS-PAGE는 고분자량 물질이 결합체에 존재함을 나타낸다. 결합체내 [O]18C 다당류:rPL의 비는 약 1.8:1이다. 결합체 물질을 4℃에서 저장한다.
실시예 9
결합체 백신에 대한 항체 반응
상기 실시예의 과정에 의해 제조된 결합체는 미합중국 식품의약국(21 C.F.R. §610.11; 1993년 4월 1일)에 의해 요구된 마우스 및 기니아 피그에서의 총체적인 안전 시험을 통과한다. 이어서, 마우스에서 항체를 증가시키는 결합체의 능력을 시험한다. 결합체는 0.01% 티메로살을 함유하는 멸균 PBS (pH 7.0)로 희석되어, 0.2㎖의 투여량에 1 또는 5㎍의 다당류를 함유한다. 결합체 백신은 0.2μ의 겔만(Gelman) 필터를 통한 막 여과에 의해 멸균된다. 멸균 백신을 사용할 때까지 4℃에서 저장한다.
CD-1(스위스) 마우스 (8주령)에 보조제로서 인산 알루미늄(1mg/㎖)상에 흡수된 0.2㎖의 백신(1 내지 5㎍/투여량)을 복막내로 주사한다. 2주 간격으로, 마우스에 백신을 두번 추가 주사한다. 혈액 샘플을 각 주사 2주 후에 후안와 정맥천자에 의해 채혈한다. 7마리의 마우스를 다당류 및 rPL에 대한 항체 역가에 대해 ELISA로 분석한다. 분석 결과를 표 1([O]14/rPL 결합체에 대해) 및 표 2와 3([O]18C/rPL 결합체에 대해 두개의 분리된 실험)에 나타내었다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 10
중화 항체에 대한 용혈 분석
중화 항체에 대한 용혈 분석은 다음과 같이 수행된다(9, 12, 29): 96-웰(U-자형) 미세역가 평판에서, rPL에 대한 항체를 함유하는 동물(마우스 또는 토끼)로부터의 혈청 희석액을 1㎍의 rPL과 혼합한다. 37℃에서 15분 동안 배양시킨 후에, 10mM 디티오트레이톨을 첨가한다. 37℃에서 15분 동안 배양시킨 후에, 토끼 적혈구(1.7%의 최종 농도)를 첨가하고 동일한 방식으로 30분 동안 추가로 배양시킨다. 5분 동안 150 x g으로 원심분리시킨 후에, 펠릿의 존재 또는 부재를 기록한다. 적혈구의 50% 용해를 나타내는 희석액을 가시적으로 결정한다. 중화 항체가 존재할 때, 펠릿이 보인다; 항체가 존재하지 않는다면, 적혈구가 용해된다. 두개의 용혈 분석 결과를 표 4 및 5에 나타낸다:
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 11
내피 세포 세포독성 분석
내피 세포 세포독성 분석을 Rubins 일동의 방법에 따라 수행한다(30). 온전한 세포를 방사능표지하기 위해서, 세포가 유착점에 도달한 후 배지를 제거하고, PBS로 2회 세척하여, 트립신 처리하고, 새로운 배양 배지로 2회 세척하여, 200㎕의 PBS 및 300㎕51Cr(300μCi)에 재현탁시킨 다음, 37℃에서 5% CO2로 90분 동안 배양시킨다. 세포를 5% BSA와 2% 덱스트로즈를 함유하는 PBS에서 2회 세척하고 0.5% BSA와 0.2% 덱스트로즈를 함유하는 PBS에 재현탁시킨다. 세포를 2×105㎖로 조정한다. 96-웰(U-자형) 미세역가 평판에서, rPL에 대한 항체를 함유하는 동물(마우스 또는 토끼)로부터의 혈청 희석액을 5ng의 rPL과 혼합한다. 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 배양시킨 후에, 10mM의 디티오트레이톨을 첨가한다. 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 배양시킨 후에, 세포(2x104)를 첨가하여 동일한 방식으로 2시간 동안 추가로 배양시킨다. 3분 동안 150×g으로 원심분리시킨 후에, 상등액의 분취량에서의 방사능은 방출된51Cr(%)을 측정하기 위한 액체 섬광에 의해 계수된다. 남아있는 세포내51Cr을 측정하기 위해서, 1N NaOH를 첨가하여, 용액을 혼합하고 분취량에서의 방사선활성을 계수한다. 방출된51Cr(%)은 배지 및 세포층에서의 분당 총계수로 나눈 배지에서 분당 총 계수의 %로 측정한다. 분석의 결과를 표 6에 나타내었고, 여기서값들은 삼중51Cr-세포 배양 웰(24,000 cpm/200㎕), 2×104세포/웰로부터의 평균 및 표준 편차를 말한다. 세포를 10mM 디티오트레이톨의 존재하에 37℃에서 2시간 동안 지시된 바와 같이 시약의 부재 또는 존재하에 배양시킨다.
% 51Cr 방출 = 100×(2A/(A+B)); 여기서 A=상단 100㎕에서의 cpm; B=100㎕ NaOH가 첨가된 하단 100㎕에서의 cpm.
Figure pct00007
실시예 12
rPL 또는 결합된 백신으로 예방접종된 마우스내 생 폐렴구균의 공격에 대한 보호
10마리 그룹의 8주령 CD-1 마우스 암컷에 2주 간격으로 0.2㎖의 다양한 백신을 복막내 주사한다. 이러한 백신은 rPL, [O]18C-rPL 및 [O]18C-ADH-rPL을 포함한다. 대조군 백신 [O]18C는 이러한 마우스에서 항체 반응을 유도하지 않는다. 각 마우스에 1㎍의 다당류, 또는 rPL만을 포함하는 백신의 경우에는 1㎍의 단백질을 함유하는 백신의 투여량을 주사한다. 모든 백신은 또한 1mg/㎖ 인산 알루미늄을 함유한다. 대표적인 마우스로부터의 혈청을 초기 예방접종전에 그리고 초기 예방접종 2주 및 4주 후에 수집한다. 모든 마우스로부터의 혈청을 최종 예방접종 11일 후에 수집한다. 혈청을 rPL 및 [O]18C에 대한 항체를 결정하기 위해 사용한다. 최종 예방접종 2주 후에, 마우스에 폐렴구균, 유형 18C (ATCC 6318)의 투여량을 변화시키면서 주사한다. 세균을 37℃에서 밤새도록 5% 양 혈소판을 함유하는 TrypticaseTMSoy Agar(BBL, Cockeysville, MD; trademark of Becton, Dickinson and Co.)상에서 밤새 성장시킨 다음 5%의 섬유소 제거된 양 혈액 및 1%의 글루코즈를 함유하는 TrypticaseTMSoy Broth (TSB) (BBL; trademark of Becton, Dickinson and Co.)중에 접종하여 배양시키고 37℃에서 6시간 동안 진탕없이 배양시킨다. 성장을 TSB로 적절히 감쇄시킨다. CFU/㎖의 수를 평판 계수에 의해 측정한다. 복막내 주사된 세균의 투여량을 약 0, 5, 25, 125 및 625 X LD50이 되도록 계산하며, 여기서 LD50은 3 CFU/투여량 이하이다. 따라서, 세균 투여량은 0, 23, 115, 575 및 2875 CFU/투여량이다. 동물을 하루에 2번씩 확인하고 여타의 사망을 기록한다.
결과를 표 7에 나타냈다. TSB를 투여받지만 어떠한 세균도 투여받지 않는 음성 대조군으로서의 역할을 하는 모든 마우스는 14일후에도 잘 생존하였다. [O]18C로 예방접종된 모든 마우스, 즉 항체 반응을 유도하지 않는 양성 대조군은 폐렴구균의 4 용량으로 공격 후 4일 이내에 치사된다. rPL에 대한 뚜렷한 항체반응을 유도하는 rPL 백신만을 투여받는 마우스는 양성 대조군보다 더 오래 생존한다. 스페이서와 또는 스페이서없이 [O]18C 및 rPL을 함유하는 본 발명의 결합체 백신은 세균 공격전에 주어질 때, 2.9×103CFU (625×LD50)의 가장 높은 공격 투여량에서조차 유형 18C 폐렴구균에 의한 치명적인 감염에 대해 마우스를 보호하는 데 가장 효과적이다. 이러한 결합체 백신은 또한 유형 18C 다당류 및 rPL 모두에 뚜렷한 항체 반응을 유발한다(표 2 및 3 참조).
Figure pct00008
Figure pct00009
실시예 13
상이한 보조제와의 결합체 백신에 대한 항체 반응
실시예 9의 분석을 다음 보조제를 이용하여 반복한다: (1) 200㎍(1mg/㎖)의 인산 알루미늄(AlPO4); (2) 25㎍의 3DMPL; (3) 100㎍의 3DMPL; 또는 (4) 200㎍의 AlPO4및 25㎍의 3DMPL의 배합물. 분석의 결과를 표 8에 나타내었다:
Figure pct00010
Figure pct00011
참고 문헌
Figure pct00012
Figure pct00013

Claims (9)

  1. (a) 폐렴구균(Streptococcal. pneumoniae)의 협막 다당류로부터 유도된 산화 다당류, 및 (b) 재조합적으로 발현되고, 산화 다당류와 결합하기에 앞서 변독 소화되지 않거나 부위-특이성 돌연변이생성에 의해 생성되지 않는, 폐렴구균의 뉴모리신 단백질을 포함하는 면역원성 다당류-단백질 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 폐렴구균의 협막 다당류가 유형 14 또는 18C로부터 유도되는 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 재조합적으로 발현되는 뉴모리신이 이. 콜라이에서 발현되는 결합체.
  4. 제3항에 있어서, 재조합적으로 발현되는 뉴모리신이 pGEX-PL 18C로 명명된 플라스미드(ATCC 69654) 및 pGEX-PL 18C/20로 명명된 플라스미드(ATCC 69655)로 이루어진 그룹중에서 선택된 플라스미드를 포함하는 SCS1으로 명명된 이. 콜라이 균주에서 발현되는 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 재조합적으로 발현된 뉴모리신이 폐렴구균의 협막 다당류로부터 유도된 산화 다당류와 결합하기에 앞서 스페이서와 먼저 결합하는 결합체.
  6. 제5항에 있어서, 스페이서가 아디프산 디히드라지드 (ADH) 및 6-아미노카프로산으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 결합체.
  7. 제1항의 면역원성 결합체를 포함하는 백신.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 면역학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 보조제를 추가로 포함하는 백신.
  9. 제7항에 있어서, 두 개 이상의 면역원성 결합체와 폐렴구균의 상이한 유형의 협막 다당류로부터 유도된 산화 다당류와의 혼합물을 포함하는 백신.
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