FI120137B - Mutanttienterotoksiini, joka on tehokas ei-toksisena suun kautta annettavana adjuvanttina - Google Patents

Description

Mutanttienterotoksiini, joka on tehokas ei-toksisena suun kautta annettavana adju-vanttina - Mutantenterotoxin, som är effektiv som ieke-toxisk oral adjuvans 5 Yhdysvaltain merivoimat on tukenut osaksi tässä patenttijulkaisussa kuvattua tutkimusta, apurahan n:o N00014-83-K-0192. Valtiolla on määrättyjä oikeuksia tähän keksintöön.

1. Keksinnön ala 10 Esillä oleva keksintö koskee geneettisesti erilaista E. colin lämpölabiilin enterotok-siinin (LT) mutanttia ja sen käyttöä suun kautta annettavana adjuvanttina limakalvon ja seerumin vasta-aineiden indusoimiseksi. Erityisesti mutantti LT on muunnettu yhdellä aminohapposubstituutiolla, joka hävittää sen luontaisen toksisuuden, mutta jättää molekyylin adjuvanttiominaisuudet koskemattomiksi.

15 2. Keksinnön tausta

Mikrobipatogeenit voivat infektoida isännän monella eri mekanismilla. Ne voivat joutua isäntään trauman aiheuttaman rikkoutuneen ihon kautta, niitä voi kuljettaa Y jokin vektori tai ne voivat olla vuorovaikutuksessa limakalvon pinnan kanssa. Suurin 20 osa ihmisen patogeeneistä aiheuttaa sairauden viimeksi mainitulla mekanismilla, s.o.

; vuorovaikutuksella limakalvojen pinnan kanssa. Bakteeri- ja viruspatogeenit, jotka ’ vaikuttavat tällä mekanismilla, joutuvat ensiksi kosketukseen limakalvon pinnan kanssa, johon ne saattavat tarttua ja muodostaa sitten pesäkkeitä, tai niitä voi vat nielaista erikoistuneet imusolut (M-solut) epiteelissä, joka peittää Peyerin levyjä ja 25 muita imukeräsiä (Bockman ja Cooper, 1973, Am. J. Anat. 136:455-477; Owen et ai, 1986, J. Infect. Dis. 153:1108-1118). Imukudoksiin sisään menevät organismit saattavat kuolla helposti imukeräsissä synnyttäen tällöin mahdollisesti suojaavan immuunivasteen, koska antigeenejä joutuu immuunisoluihin imukerästen sisällä (esimerkiksi Vibrio cholerae). Vaihtoehtoisesti patogeenisiä organismeja, jotka sel-30 viävät paikallisista puolustusmekanismeista, voi levitä imukeräsistä ja aiheuttaa sitten paikallisen tai systeemisen taudin (esimerkiksi Salmonella spp., poliovirus, rotavirus isännissä, joiden immuunijärjestelmä on heikentynyt).

Sekretoriset IgA (slgA) -vasta-aineet infektoivien organismien spesifisiä viralenssi-35 determinantteja vastaan ovat tärkeitä tekijöitä koko limakalvojen immuniteetissa [Cebra et ai, 1986, julkaisussa Vaccine 86, Brown et ai (toim.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, ss. 129-133], Monissa tapauksissa limakalvon pintojen alkuperäinen infektio voidaan estää stimuloimalla limakalvon slgA-vasta-aineiden tuo- 2 tantoa infektoivan organismin relevantteja virulenssideterminantteja vastaan. Sekre-torinen IgA voi estää patogeenin alkuperäistä vuorovaikutusta limakalvon pinnan kanssa estämällä sen kiinnittymisen ja/tai pesäkkeiden muodostamisen, neutraloimalla pintaan vaikuttavia toksiineja tai estämällä isäntäsolujen invaasion. Vaikka solu-5 välitteisen immuniteetin ja seerumin vasta-aineiden roolin määrittämiseksi infek-toivilta aineilta suojaamisessa on tutkittu laajalti, vähemmän tiedetään slgAin säätelystä, induktiosta ja sekreetiosta. Parenteraalisesti annetut inaktivoidut kokosolu-ja kokovirusvalmisteet ovat tehokkaita tuomaan esiin suojaavaa seerumi-IgA:ta ja viivästynyttä tyyppiä olevia yliherkkyysreaktioita organismeja vastaan, joiden patoge-10 neesiin kuuluu merkittävä seerumi vaihe (s. o. Salmonella typhi, hepatiitti B). Paren-teraaliset rokotteet eivät kuitenkaan ole tehokkaita synnyttämään limakalvon slgA-vasteita ja ne ovat tehottomia sellaisia bakteereja vastaan, jotka ovat vuorovaikutuksessa limakalvon pintojen kanssa eivätkä mene sisään (esimerkiksi Vibrio cholerae). Äskettäin on kuitenkin saatu näyttöä siitä, että parenteraalisesti annetut rokotteet 15 saattavat olla tehokkaita ainakin yhtä virusta, rotavirusta, vastaan, joka on vuorovaikutuksessa ensisijaisesti limakalvon pintojen kanssa (Conner et ai., 1993, J. Virol. 67:6633-6641). Suojan arvioidaan johtuvan siitä, että antigeenille spesifinen IgG transsudoituu limakalvon pinnalle viruksen neutraloimiseksi. Sen vuoksi mekanismit, jotka stimuloivat sekä seerumin että limakalvon vasta-aineita, ovat tärkeitä te-20 hokkaiden rokotteiden kannalta.

Suun kautta tapahtuva immunisaatio voi olla tehokas spesifisten slgA-vasteiden synnyttämisen kannalta, mikäli antigeenejä tarjoutuu T-ja B-lymfosyyteille ja apusoluil-le, joita on Peyerin levyissä, joissa preferentiaalinen IgA B-solujen kehitys alkaa.

25 Peyerin levyt sisältävät auttaja-T-soluja (TH-soluja), jotka välittävät B-soluisotyyp-piä, joka vaihtaa suoraan IgM-soluista IgA-B-soluihin. Levyt sisältävät myös T-soluja, jotka initioivat terminaalisen B-solun erilaistumisen. Herkistetyt B-solut mi-gratoituvat sitten mesenteriaalisi in imusolmukkeisiin ja erilaistuvat, menevät rinta-tiehyeeseen, sitten yleiseen verenkiertoon ja sen jälkeen siementävät kaikki kehon 30 erityskudokset, suolen ja hengitystiealueen limakalvon tukikerros mukaanluettuna. Sitten kypsät plasmasolut tuottavat IgA:ta, se yhdistyy kalvoon sitoutuneeseen sekretoriseen komponenttiin ja kulkeutuu limakalvon pinnalle, jossa se on valmiina vuorovaikutukseen sisääntulevien patogeenien kanssa [Strober ja Jacobs, 1985, "Advances in host defense mechanisms", Voi. 4., Mucosal Immunity, Gallin ja Fauci 35 (toim.), Raven Press, New York. ss. 1-30; Tomasi ja Plaut, 1985, "Advances in host defense mechanisms", Vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin ja Fauci (toim.), Raven Press, New York, pp. 31-61]. Tämän yleisen limakalvojen immuunijärjestelmän olemassaolo selittää osaksi suun kautta annettavien elävien rokotteiden ja suun kautta -» tapahtuvan immunisaation mahdollisuuden suojata patogeenisiltä organismeilta, jotka aikaansaavat infektion olemalla aluksi vuorovaikutuksessa limakalvon pintojen kanssa.

5 Suun kautta tapahtuvaa immunisointia varten on kehitetty joukko strategioita, mukaanluettuna bakteerien (esimerkiksi Salmonella spp.) heikennettyjen mutanttien käyttö heterologisten antigeenien kantajina [Cardenas ja Clements, 1992, Clin. Microbiol. Rev. 5:328-342; Clements et ai., 1992, "Recombinant DNA Vaccines: Rationale and Strategy, Isaacson (toim.), Marcel Decker, New York, ss. 293-321; 10 Clements ja Cardenas, 1990, Res. Microbiol. 141:981-993; Clements ja El-Morshi-dy, 1984, Infect. Immun, 46:564-569], antigeenien kapselointi mikropallosiin, jotka muodostuvat poly-DL-laktidiglykolidista (PGL), proteiininkaltaisista polymeereistä -proteinoidesta [Sanitago et al., 1993, Pharmaceutical Research 10:1243-1247], ge-latiinikapseleista, erilaisista liposomiformulaatioista [Alving et al., 1986, Vaccine 15 4:166-172; Garcon ja Six, 1993, J. Immunol. 146:3697-3702; Gould-Fogerite ja

Mannino, 1993, "Liposome Technology" 2nd Edition. Vol. Ill, Gregoriadis (ed.)], adsorboiminen nanopartikkeleihin, lipofiilisten immuunivastetta stimuloivien kompleksien (ISCOMS) käyttö, [Mowat ja Donachie, 1991, Immunology Today 12: 383-*: ; 385] ja bakteerituotteiden, joilla on tunnettuja adjuvanttiominaisuuksia, lisääminen 20 [Clements et al., 1988, Vaccine 6:269-277; Elson, 1989, Immunology Today 146:29-33; Lycke ja Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308; Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281 ]. Kaksi bakteerituotetta, joilla on suurin mahdollisuus toimia suun kautta annettavina adjuvantteina, ovat koleratoksiini (CT), jota tuottavat eri V cholerae -kannat, ja lämpölabiili enterotoksiini (LT), jota tuottavat eräät Esche-25 richia colin enterotoksigeeniset kannat. Vaikka LT.lläja CT.llä on monia yhteisiä piirteitä, ne ovat selvästi erilaisia molekyylejä, joissa on biokemiallisia ja immunologisia eroavuuksia, jotka tekevät niistä ainutlaatuisia.

Koleran aiheuttama laajamittainen ripuli johtuu voimakkaasta ekso-enterotoksii-30 nista, joka aikaansaa adenylaattisyklaasin aktivoitumisen ja sen jälkeisen syklisen 3'-, 5'-adenosiinimonofosfaatin (cAMP) tasojen lisääntymisen solujen sisällä. Kole-ranenterotoksiini (CT) on 84 000 daltonin kokoinen polymeerinen proteiini, joka muodostuu kahdesta suuresta ei-kovalenttisesti toisiinsa liittyneestä, immunologisesti erillisestä alueesta tai domainista (kolera-A ja kolera-B) [Finkelstein ja LoSpalluto, 35 1969, J. Exp. Med. 130:185-202], Näistä 56 000 daltonin alue eli koleragenoidi ai heuttaa toksiinin sitoutumisen isäntäsolun kalvoreseptoriin GMi:teen (galaktosyyli-N-asetyyligalaktosaminyyli-(sialyyli)-galaktosyyliglukosyyliseramidi), jota esiintyy jokseenkin kaikkien eukaryoottisolujen pinnalla. Koleragenoidi muodostuu viidestä ei- 4 kovalenttisesti toisiinsa liittyneestä alayksiköstä, kun sen sijaan A-alue (27 000 dal-tonia) on vastuussa toksiinin erilaisista biologisista vaikutuksista.

CT:n kahden alayksikön suhteesta molekyylin immunologisiin ominaisuuksiin näh-5 den on väitelty kovasti. Toisaalta CT on erinomainen immunogeeni, joka provosoi sekä seerumin että limakalvojen vasta-ainereaktion kehittymisen toksiinia vastaan, kun sitä annetaan suun kautta. Tämä löytö ei ole uusi siinä mielessä, että kolerapoti-laissa on tiedetty kehittyvän antitoksiinivasta-aineiden tittereiden nousua kliinisestä kolerasta toipumisen aikana (Finkelstein, 1975, Curr. Top. Microbiol. Immunol.

10 69:137-196). Eräs tämän vasteen laatua tutkivien avainlöytö on ollut sen havaitsemi nen, että CT, päinvastoin kuin useimmat muut proteiiniantigeenit, ei aiheuta oraalista toleranssia itseään vastaan (Elson ja Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897; El-son ja Ealding, 1984, J. Immunol. 132:2736-2741). Tämän todettiin olevan myös totta, kun nimenomaan B-alayksikköä syötettiin hiirille, havainto, jonka ovat vahvis-15 taneet kolerarokotuksella Bangladeshissa tehdyt kenttäkokeet, joissa suun kautta ta pahtuva B-alayksiköllä, johon yhdistettiin tapettuja kokosoluja, immunisointi synnytti sekä limakalvo- että systeemisiä antitoksiinivasta-ainereaktioita (Svennerholm et ai., 1984, J, Infect. Dis. 149:884-893).

20 Sen lisäksi että CT on voimakas oraalinen immunogeeni, sillä on joukko muita raportoituja immunologisia ominaisuuksia. Kuten edellä mainittiin, Elson ja Ealding (Elson ja Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897) havaitsivat, että suun kautta annettu CT ei aikaansaa toleranssia itseään vastaan. Lisäksi kun suun kautta annetun CT:n kanssa annettiin samanaikaisesti erästä liukoista proteiiniantigeenia, avaimen-25 reikäkotilon hemosyaniinia (KLH), kehittyi sekretorisia IgA-vasteita sekä CT:tä että KLHita vastaan ja samalla kumoutui myös oraalisen toleranssin syntyminen KLH:ta vastaan. Nämä havainnot vahvistivat myöhemmin Lycke ja Holmgren, jotka laajensivat vielä niitä (Lycke ja Holmgren, 1986, Immunology 59:301 -308). Hämmennystä syntyy silloin, kun yritetään määritellä CT:n A- ja B-alayksikköjen roolia molekyylin 30 adjuvanttiominaisuuksien suhteen. Seuraavat havainnot, Elsonin kokoamina (Elson, 1989, Immunology Today 146:29-33), ovat perustana tälle hämmennykselle: - CT ei synnytä oraalista toleranssia itseään vastaan (Elson ja Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897).

- CT-B ei indusoi oraalista toleranssia itseään kohtaan (Elson ja Ealding, 1984, J.

35 Immunol. 133:2892-2897).

- CT voi estää toleranssin kehittymisen muita antigeenejä kohtaan, joita annetaan samanaikaisesti Ja se voi myös toimia adjuvanttina mainituille antigeeneille (Elson ja Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897); Lycke ja Holmgren, 1986, Immuno- 5 logy 59:301-308).

- CT voi toimia adjuvanttina CT-B:Ile (Elson ja Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897).

- Lämmön avulla aggregoitu CT on vain vähän myrkyllinen, mutta voimakas oraaii-5 nen immunogeeni (Pierce-et ai., 1983, Infect. Immun. 40:1112-1118).

- CT-B voi toimia immunologisena "kantajana" traditionaalisessa hapteeni-kantaja-konfiguraatiossa (Cebra et ai., 1986, julkaisussa Vaccines 86, Brown et ai., (toim.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, ss. 129-133; McKenzie ja Halsey, 1984, J. Immunol. 133:1818-1824).

10

Muutamat tutkijat ovat päätelleet näistä havainnoista, että B-alayksiköllä täytyy olla jokin inherentti adjuvanttiaktiivisuus. Cebran et ai, (Cebra et ai., 1986, julkaisussa Vaccines 86, Brown et ai., (toim.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, ss. 129-133), Lycken ja Holmgrenin (Lycke ja Holmgren, 1986, Immunology 59:301-15 308) ja Liangin et al. (Liang et al., 1988, J. Immunol. 141:1495-1501) havainnot näyttäisivät kiistävän tämän johtopäätöksen. Cebra et al. (Cebra et al., 1986, julkaisussa Vaccines 86, Brown et al., (toim.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, ss. 129-133) osoittivat, että puhdistettu CT-B nosti tehokkaasti spesifisten antikolera-toksiini-B-solujen tiheyttä Peyerin levyissä, kun sitä annettiin pohjukaissuoleen, f Γ: 20 mutta päinvastoin kuin CT:llä, sen tuloksena ei ollut merkittävää määrää IgA:ta tuottavia B-soluja. Lycke ja Holmgren (Lycke ja Holmgren, 1986, Immunology f ; 59:301 -308) vertasivat CT:n ja CT-B:n kykyä vahvistaa suolen limakalvon immuu nivastetta KLH:lle mittaamalla immunoglobuliinia erittävät solut suun kautta immunisoitujen hiirien lamina propriassa. He havaitsivat, että anti-KLH:ta tuottavat solut 25 eivät lisääntyneet vasteena mihin tahansa annokseen B-alayksikköä, joita testattiin heidän systeemissään. Lopuksi vielä Liang et al. (Liang et al., 1988, J. Immunol.

141:1495-1501) eivät todenneet minkäänlaista adjuvanttivaikutusta, kun CT-B:tä annettiin suun kautta yhdessä inaktivoidun Sendai-viruksen kanssa.

30 Kun eristetyssä B-alayksikössä on havaittu adjuvanttiaktiivisuutta, se on tapahtunut tyypillisesti toisesta tai toisesta kahdesta seuraavasta syystä. Ensiksikin eräs traditionaalinen menetelmä B-alayksikön valmistamiseksi on ollut suorittaa holotoksiinille erotuskromatografia geelisuodatuksella jonkin erotusaineen (s.o. guanidiini-HCLn tai muurahaishapon) läsnäollessa. Eristetyt alayksiköt kootaan sitten yhteen ja erotusai-35 ne poistetaan. Tällä menetelmällä valmistettu B-alayksikkö kontaminoidaan samalla tavoin A-alayksikön jäämillä siten, että renaturaation jälkeen pieni määrä holotok-siinia rekonstituoituu. Toinen syy liittyy immunologisen kantajan määrittämiseen. Kuten monet muut liukoiset proteiinit, B-alayksikkö voi toimia immunologisena ve- 6 hikkelinä, kun antigeenejä viedään immuunijärjestelmään. Jos nämä antigeenit ovat tarpeeksi pieniä ollakseen heikosti immunogeenisia, ne voidaan tehdä immunogee-nisiksi traditionaalisessa hapteeni-kantajakonfiguraatiossa. Samaten B-alayksikköön liittyy "teoreettinen" immuunivahvistus, erityisesti kun se annetaan suun kautta, siinä 5 mielessä, että B-alayksikkö sitoutuu epiteelisolujen pintaan ja saattaa immobilisoida siihen tarttuneen antigeenin Jolloin suoleen liittyvät imukudokset voivat prosessoida sitä. Kuitenkin potentiaalisen edun, joka tästä on antigeenin stabilisoitumismeka-nismille, saattaa mitätöidä antigeenin leviäminen ei-immunologisesti relevanttien kudosten läpi, toisin sanoen suolen epiteelisolujen pinnan läpi. Limakalvon immuu-10 nivasteen kannalta immunologisesti relevantteja kohtia ovat Peyerin levyt, erityisesti kun kysymys on antigeenispesifisestä T-soluista riippuvaisesta B-soluaktivaatiosta [Strober ja Jacobs, 1985, "Advances in host defense mechanisms." Voi. 4, Mucosal Immunity, Gallin ja Fauci (toim.), Raven Press, New York, ss. 1-30; Tomasi ja Plaut, 1985, "Advances in host defense mechanisms." Vol. 4, Mucosal Immunity, Gallin ja 15 Fauci (toim.), Raven Press, New York, ss. 31 -61; Brandtzaeg, 1989, Curr. Top.

Microbiol. Immunol. 146:13-25]. Tapahtumat isotyypin muuttumiseen IgM-soluista IgA B-soluihin tapahtuvat siis Peyerin levyissä. Antigeenit, jotka sijaitsevat epiteelisolujen pinnalla, voivat olla apuna antigeenin käynnistämässä B-solujen proliferaati-ossa siinä mielessä, että luokan II positiiviset nukkaiset epiteelisolut saattavat toimia 20 antigeeninä, joka taijoaa soluja T-soluaktivaatiolle sekretorisissa kohdissa, lisäten näin sytokiinituotantoa, terminaalista B-solujen erilaistumista, sekretorisen komponentin lisääntynyttä ilmentymistä ja antigeenispesifisen IgA:n ulkopuolista kulkeutumista [Tomasi, T.B. ja A.G. Plaut, 1985, "Advances in host defense mechanisms." Voi. 4, Mucosal Immunity, Gallin ja Fauci (toim.), Raven Press, New York, ss. 31-25 61]. Näiden tapahtumien suhteita ei ole selkeästi määritelty B-alayksikön osalta mui den antigeenien kantajana, ja termin "adjuvantti" käyttö näyttäisi epäasianmukaiselta sellaisesta vaikutuksesta käytettynä.

On selvää, että molekyylin adjuvanttiominaisuus sisältyy holotoksiiniin, jossa B-ala-30 yksikkö tarvitaan reseptorin tunnistamiseen ja helpottamaan A-alayksikön tunkeutumista soluun. A-alayksikkö vaaditaan myös adjuvanttiaktiivisuuteen, oletettavasti sen ADP-ribosyloivan entsyymiaktiivisuuden vuoksi ja sen kyvyn vuoksi lisätä cAMP:n solunsisäisiä tasoja (katso tuonnempana). B-alayksikkö yksinään voi toimia muiden antigeenien kantajana siinä mielessä, että kun se konjugoidaan näihin anti-35 geeneihin, ne voivat immobilisoitua suoleen liittyvien imukudosten käsiteltäviksi.

Vaikka LT:llä ja CT:llä on paljon yhteisiä piirteitä, ne ovat selvästi erilaisia molekyylejä biokemiallisine ja immunologisine eroavuuksineen, jotka tekevät ne ainutlaatui- 7 siksi, mukaanlukien 20 %:n eroavuus nukleotidi-ja aminohapposekvenssien homo-logiassa (Dallas ja Falkovv, 1980, Nature 288:499-501). Näillä kahdella toksiinilla on sama määrä alayksikköjä ja niiden sama järjestys, sama biologinen toimintamekanismi ja sama spesifinen aktiivisuus monissa in vitro -kokeissa (Clements ja Fin-5 kelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769; Clements et ai., 1980, Infect. Immun. 24:91-97).

Näiden molekyylien välillä on kuitenkin merkittäviä eroavuuksia, jotka vaikuttavat ei ainoastaan niiden enterotoksisiin ominaisuuksiin, vaan myös niiden kykyyn toimia 10 adjuvantteina. Ensiksikin toisin kuin V. choleraen tuottama CT, LT pysyy soluun liittyneenä ja irtoaa E. colista vain solun hajotessa (Clements ja Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769). CT erittyy vibriosta heti syntetisoiduttuaan ja se voidaan helposti tunnistaa ja puhdistaa viljelyn supematanteista. Sen seurauksena, toisin kuin CT, LT on biologisesti täysin aktiivinen vasta, kun se on eristetty solusta.

15 Yhdenmukaisesti bakteeritoksiinien A-B -mallin kanssa LT edellyttää proteolyysiä ja disulfidireaktiota ollakseen täysin aktiivinen. Ilman proteolyyttistä käsittelyä entsymaattisesti aktiivinen Αι-osa ei pysty dissosioitumaan A2-komponentista eikä se pysty saavuttamaan kohdesubstraattiaan (adenylaattisyklaasi) ohutsuolen epiteelisolun basolateraalisella pinnalla. Tämä pätee myös CT:hen, mutta viljelyn supematan-20 tissa olevat proteaasit, joille toksiini altistuu puhdistuksen aikana, suorittavat proteo-lyysin. Koska LT ei ole biologisesti täysin aktiivinen, sen identifioiminen on vaikeaa puhdistuksen aikana, jossa käytetään in vitro -kokeita kuten Y-l adrenaalisolukoetta tai permeabiliteettitekijäkoetta.

25 Tämä ero eristetyn materiaalin aktivoinnissa aikaansaa eroavuutta LT:n ja CT:n vastekynnyksissä biologisessa systeemissä. Esimerkiksi CT aiheuttaa havaittavaa selvää nesteen erittymistä hiiren ohutsuolessa annoksella 5 -10 gg. LT indusoi havaittavaa selvää nesteen erittymistä hiiren ohutsuolessa tasoilla, jotka ovat suurempia kuin 100 gg. Kaniinin ligatoidussa sykkyräsuolenmutkassa ero on dramaattinen ja 30 selvärajainen. Lisäksi on osoitettu, että kädellisissä LT ei aikaansaa nesteen eritystä millään testatulla annoksella 1 milligrammaan saakka. Tämä on 200 kertaa se määrä, jolla CT:n on raportoitu indusoivan varmaa nesteen liikettä ihmisissä. Kun LT altistetaan proteolyyttisille entsyymeille, joilla on trypsiininkaltaista spesifisyyttä, molekyyliä ei enää pystytä havaitsemaan CT:stä missään biologisessa koesysteemissä.

35 Tämän osoittivat selvästi Clements ja Finkelstein (Clement ja Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769.

Edellä raportoitujen eroavuuksien lisäksi LT:llä on epätavallinen affiniteetti hiilihyd- 8 raattia sisältäviin matriiseihin. Erityisesti LT, jonka moolimassa on 90 000, eluoituu Sephadex-kolonneista (glukoosi) näennäisellä moolimassalla 45 000 ja agaroosiko-lonneista (galaktoosi) näennäismoolimassalla 0. Toisin sanoen se sitoutuu galaktoo-sia sisältäviin matriiseihin ja voidaan eluoida sellaisista matriiseista puhtaassa muo-5 dossa käyttämällä galaktoosia. LT ei sitoudu ainoastaan agaroosiin puhdistuksessa käytetyissä kolonneissa, vaan, mikä on vielä tärkeämpää, muihin biologisiin mole-kyyleihin, jotka sisältävät galaktoosia, glykoproteiinit ja lipopolysakkaridit mukaanluettuina. Tämän LT:n lektiininkaltainen sitoutumisominaisuuden vuoksi LT:n reseptoreilla on laajempi jakautuma nisäkässoluissa kuin CT:llä, joka sitoutuu vain 10 GMLteen. Tähän saattavat olla osaksi syynä raportoidut eroavuudet näiden kahden molekyylin kyvyissä indusoida eri auttaja-T-lymfosyyttivasteita (McGhee et ai., 1994, Mucosal Immunology Update, kevät 1994, Raven Press, New York, s. 21).

Näissä McGheen et ai. (McGhee et ai., 1994, Mucosal Immunology Update, kevät 15 1994, Raven Press, New York, s. 21) raportoimissa tutkimuksissa osoitettiin, että hiirien immunisoiminen suun kautta sellaisilla rokotteilla kuten tetanustoksoidilla (TT) käyttäen CT:tä limakalvoadjuvanttina indusoi TH2-tyypin soluja Peyerin levyissä ja pernassa, minkä osoittavat TH-solut, jotka tuottavat IL-4:ä ja IL-5:ttä, mutta , : eivät IL-2:ta ja INF-gammaa. (Täydellisemmän katsauksen sytokiiniverkostosta saa- 20 daksesi katso Arai et ai., 1990, Ann. Rev. Biochem. 59:783-836). Tärkeää on. että kun CT:tä käytettiin limakalvoadjuvanttina. se vahvisti myös antigeenispesifistä IgE-vastetta IgA-vasteen lisäksi. Tällainen IgE-vasteiden voimistaminen heikentää vakavasti CT:n turvallisuutta limakalvoadjuvanttina, koska sen saatetaan odottaa synnyttävän välittömiä yliherkkyysreaktioita. Sitävastoin LT indusoi sekä ThI-ja TH2-25 soluja ja hallitsevasti antigeenispesifisiä IgA-vasteita ilman IgE-vasteita, kun sitä käytetään suun kautta annettuna limakalvoadjuvanttina.

Näillä kahdella molekyylillä on monia immunologisia eroavuuksia, kuten on osoitettu immunodifiuusiotutkimuksissa (Clements ja Finkelstein, 1978, Infect. Immun. y 30 21:1036-1039; Clements ja Finkelstein, 1978, Infect. Immun. 22:709-713), in vitro -neutralointitutkimuksissa ja osittaisella suojalla LT:hen liittyvää E. coli -ripulia vastaan vapaaehtoisissa koehenkilöissä, joille annettiin B-alayksikköperustaista ko-kosolukolerarokotetta (Clements et ai., 1988, J. Infect. Dis. 158:372-377).

35 Yhteen nivottuina nämä havainnot osoittavat, että LT ia CT ovat ainutlaatuisia molekyylejä huolimatta niiden näennäisistä samankaltaisuuksista ia että LT on käyttökelpoinen suun kautta annettava adiuvanttL kun sen sijaan CT ei ole.

9 LT:n adjuvanttiominaisuuksien osoittamiseen päädyttiin erään tämän keksinnön tekijän tutkiessa LT:n vaikutusta toleranssin kehittymiseen suun kautta annetuille antigeeneille. Ei ollut selvää, vaikuttaisiko LT myös oraalisen toleranssin syntymiseen tai olisiko sillä adj uvantti vaikutuksia Joita CT:llä oli osoitettu olevan, ottaen huomioon 5 näiden kahden molekyylin· välillä havaitut eroavuudet. Niinpä esillä olevan keksinnön tekijät tutkivat muutamia parametrejä, mukaanluettuina LT:n vaikutus oraaliseen toleranssiin OVA:ta kohtaan ja LT:n kahden alayksikön osuus todetussa vasteessa, LT:n annon ajoituksen ja antotavan vaihtelun vaikutus, vaikutus, joka etukäteen OVATle altistuksella on LT:n kykyyn vaikuttaa toleranssin kehittymiseen OVAille, 10 LT:n käyttö adjuvanttina kahden toisiinsa liittymättömän antigeenin kanssa ja im-munisointitavan vaikutus anti-OVA-reaktioihin. Näistä tutkimuksista (Clements et ai., 1988, Vaccine 6:269-277; Clements et ai., 1988, Abstract No. B91, 88th Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol.) saadut tulokset on koottu alle: 1. LT:n antamisen samanaikaisesti OVA:n kanssa osoitettiin ehkäisevän toleranssin 15 kehittymistä OVAdle ja lisäävän seerumin anti-OVA IgG -vastetta 30-90-kertaisesti verrattuna OVA:lla ja PBSdlä pohjustettuihin eläimiin, vastaavassa järjestyksessä. Tämän vaikutuksen määriteltiin johtuvan toksiinin entsymaattisesti aktiivisesta A-aiayksiköstä, koska B-alayksikkö ei yksinään pystynyt vaikuttamaan toleranssin syntyyn.

20 2. Eläimillä, joille annettiin LT:tä OVA:n kanssa aluksi annetun OVA-pohjustuksen jälkeen, kehittyi merkittävästi vähäisempi seerumin IgG-ja limakalvon IgA anti-OVA-vaste, kuin niillä, jotka saivat LT:tä OVA:n kanssa alkuperäisessä immunisoinnissa, mikä osoittaa, että ennalta tapahtuva altistus antigeenille vähentää LT:n tehoa toleranssi in vaikuttamisessa ja sen kykyä toimia adj uvanttina. LT ei kyennyt 25 kumoamaan toleranssia, kun se oli kerran kehittynyt. Tämän todettiin pätevän myös CT:hen, kun eläimiä esi-immunisoitiin OVAdla ennen ovalbumiinin plus CT:n antamista suun kautta, ja se tarjoaa selvän käsityksen siitä hyödyllisestä havainnosta, että vasta-ainereaktiot ei-kohteena oleviin ruokavalioon sisältyviin antigeeneihin eivät lisäänny, kun näitä adjuvantteja käytetään.

30 3. Seerumin IgG- ja limakalvon IgA-vasteet eläimissä, jotka saivat LT:tä vain yhden kerran ja tämä tapahtui ensimmäisen antigeenille altistuksen jälkeen, olivat samanlaisia kuin vasteet kolmen OVA/LT-pohjustuksen jälkeen, mikä osoitti, että sitoutuminen reaktiivisuuteen ilmenee varhain ja heti ensimmäisen antigeenille altistumisen jälkeen. Osoitettiin myös, että vasteen ohjaamista joko hallitsevasti seerumin 35 IgG:hen tai limakalvon IgA:han voidaan säädellä joko antamalla tai ei antamalla pa-rentaalista tehostusannosta.

4. Tuloksena LT:n antamisesta samanaikaisesti kahden liukoisen proteiiniantigee-nin kanssa on seerumin ja limakalvon vasta-aineiden kehittyminen molempia anti- 10 geenejä vastaan, jos eläimellä ei ole minkäänlaista aikaisempaa immunologista kokemusta kummastakaan. Tämä oli tärkeä havainto, koska limakalvon vasta-aineiden kehittymiselle kompleksiantigeeneja, kuten tapettuja bakteereja tai viruksia, vastaan riittäisi yksi mahdollinen LT:n käyttö adjuvanttina, jolloin kyky reagoida moniin an-5 tigeeneihin olisi tärkeää. ·

Tamuran et ai. (Tamura et ai., US-patentti n:o 5 182 109) osoitti, että LT ja/tai CT nenään annettuina nostivat vasta-ainetitteriä samanaikaisesti annettua antigeeniä vastaan. Tamuran et ai. tutkimuksessa ei kuitenkaan missään kohdassa sanota, että 10 nämä toksiinit voivat aikaansaada suojaavan immuunireaktion, kun ne annetaan suun kautta.

LT:llä on selvästikin merkittävä immuniteettia säätelevä potentiaali sekä aineena, jolla estetään toleranssin kehittymistä spesifisille antigeeneille että adjuvanttina käy-15 tettäväksi suun kautta annettavien antigeenien kanssa ja se tuo esiin sekä seerumin IgG- että limakalvon IgA-tuotannon antigeenejä, joiden kanssa se on annettu, vastaan. Tämä lisää mahdollisuutta saada aikaan tehokas erilaisia patogeenejä vastaan suunnattu immunisaatio-ohjelma, jossa annetaan suun kautta tapettuja tai heikennettyjä aineita tai spesifisten aineiden relevantteja virulenssideterminantteja. Kuitenkin 20 se tosiasia, että tämä "toksiini" voi stimuloida selvän luminaalisen eritysreaktion, kun se pilkkoutuu proteolyyttisesti, kuten esimerkiksi suolen proteaasien vaikutuksesta, tai kun sitä annetaan tarpeeksi suurina konsentraatioina suun kautta, saattaa estää sen mahdollisuuksien tutkimisen tai estää sen käytön sopivissa olosuhteissa. Tämä ongelma voitaisiin ratkaista, mikäli LT voitaisiin "detoksifioida" vähentämättä mole-25 kyylien adjuvanttiominaisuuksia. Sen arvioimiseksi, miten tämä voitaisiin toteuttaa, on välttämätöntä analysoida edelleen LT:n ja CT:n toimintamekanismia ja näiden molekyylien rakenteen ja toiminnan suhdetta. Kuten edellä mainittiin, sekä LT että CT syntetisoituu moniyksikkötoksiineina, joissa on A-komponentti ja B-komponent-ti. Kun toksiini on ensiksi ollut vuorovaikutuksessa isäntäsolun kalvoreseptorin 30 kanssa, B-alue helpottaa A-alayksikön tunkeutumista solukalvon läpi. Tiolipelkistyk-sessä tämä A-komponentti dissosioituu kahdeksi pienemmäksi polypeptidiketjuksi. Toinen näistä, Ai-palanen, katalysoi stimulatorisen GTP:hen sitoutuvan proteiinin (Gs) ADP-ribosylaation adenylaattisyklaasientsyymikompleksissa epiteelisolun baso-lateraalisella pinnalla ja tämän tuloksena cAMP .n solunsisäiset tasot nousevat. Tu-35 loksena oleva cAMP:n lisääntyminen aiheuttaa veden ja elektrolyyttien erittymistä ohutsuoleen vuorovaikutuksen kautta kahden cAMPdle herkän ioninkuljetusmeka-nismin kanssa, jossa tapahtuu 1) NaCkn kulkeutuminen samanaikaisesti nukkaisten epiteelisolujen harjareunusten poikki ja 2) elektrogeeninen Na+-riippuvaisen Cl:n 11 erittyminen imukerässoluista [Field, 1980, "Secretory diarrhea", Field et ai., (toim.), Waverly Press, Baltimore, s. 21-30], A-alayksikkö on myös tärkein osa, joka liittyy näiden toksiinien aikaansaamaan immuniteetin voimistumiseen. Tästä alayksiköstä tulee siten todennäköinen kohde manipulaatiolle, jolla pyritään molekyylien toksisten 5 ja immunologisten toimintojen erottamiseen. Lycken et ai. (Lycke et ai., 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281) äskettäin julkaistussa raportissa tehdään selväksi, että vaihtelut, jotka vaikuttavat toksiinin ADP-ribosyloivaan entsymaattiseen aktiivisuuteen ja muuttavat kykyä lisätä cAMP:n soslunsisäisiä tasoja, estävät myös molekyyliä toimimasta adjuvanttina. Sen vuoksi onkin tutkittava toista lähestymistapaa sen te-10 kemiseksi myrkyttömäksi.

3. Yhteenveto keksinnöstä

Esillä oleva keksintö perustuu yllättävään havaintoon, että LT:n mutanttimuoto, joka on menettänyt toksisen vaikutuksena ja jolta puuttuu ADP-ribosyylitransferaasi-15 aktiivisuus, säilyttää silti aktiivisuutensa immunologisena adjuvanttina. LT:n mutanttimuoto eroaa villityypistä yhden aminohapposubstituution, Arg^-Glyi^, osalta, joka muuttaa trypsiinille herkän kohdan ei-herkäksi. Proteolyyttisen kohdan menettäminen estää A-alayksikön proteolyyttisen prosessoitumisen sen toksiseksi muodoksi. Natiivi LT ei ole toksinen, kun se ensiksi eristetään bakteerista, mutta sillä on . 20 potentiaali olla täysin toksinen, kun se altistuu proteaaseille, kuten sellaisille, joita ; , esiintyy nisäkkäiden ohutsuolessa. LT:n mutanttimuodolla ei ole enää potentiaalia muuttua toksiseksi proteolyyttisen aktivoinnin vaikutuksesta. Tällä mutantti-LT:llä (tästedes mLT) säilyy kyky vahvistaa eläimen immuunivastetta (esimerkiksi IgG,

IgA) antigeenille, joka ei liity LT:hen eikä mLT:hen, ilman minkäänlaisia toksisia 25 sivuvaikutuksia. Kokeissa on saatu näyttöä siitä, että mLT:tä voidaan käyttää adjuvanttina antigeenien antamiseksi suun kautta; tällaisen annon tuloksena on seerumin IgG:n ja/tai limakalvon s!gA:n tuotanto antigeeniä, jonka kanssa mLT annetaan, vastaan. Esillä oleva keksintö koskee menetelmää seerumin ja/tai limakalvon immuunivasteen indusoimiseksi jossakin isännässä mille tahansa suun kautta annetulle 30 antigeenille ja tässä menetelmässä isännälle annetaan tehokas määrä mLT:tä yhdessä suun kautta annetun tehokkaan määrän kanssa antigeeniä. Antigeeni ja mLT annetaan edullisesti aluksi samanaikaisesti.

Keksinnön mukainen menetelmä ja seokset tuovat käyttöön paremman tavan immu-35 nisoida suun kautta seerumin ja limakalvon vasta-aineiden kehittämiseksi patogeenisiä mikro-organismeja vastaan. IgA-vasta-ainereaktioiden tuotanto patogeenisiä mikro-organismeja vastaan, jotka tunkeutuvat tai suorittavat invaasion limakalvon pinnan läpi, voidaan ohjata kysymyksessä olevaan pintaan, samalla kun voidaan 12 kehittää merkittävä seerumin vasta-ainereaktio patogeenisten mikro-organismien, joilta seerumin vasta-aine suojaa, aiheuttaman infektion estämiseksi. Esillä olevaa keksintöä voidaan käyttää mihin tahansa spesifiseen antigeeniin, jolloin spesifistä neutraloivaa vasta-ainevastetta voitaisiin käyttää kysymyksessä olevaan antigeeniin 5 liittyvän fysiologisen tai tautitilan poistamiseen.

Esillä oleva keksintö koskee myös koostumusta, jota voidaan käyttää komponenttina rokotteessa enterotoksisia bakteeri organismeja vastaan, jotka ilmentävät kolerankal-taisia enterotoksiineja, ja menetelmiä sen käyttämiseksi.

10

Keksintö koskee myös koostumusta, jota voidaan käyttää näissä menetelmissä. Koostumus käsittää tehokkaan määrän mLT:tä yhdistettynä tehokkaaseen määrään antigeeniä.

15 4, Lyhyt piirustusten kuvaus

Esillä oleva keksintö voidaan ymmärtää paremmin seuraavasta keksinnön yksityiskohtaisesta kuvauksesta, keksinnön erityissuoritusmuotoja koskevista esimerkeistä ja liitteenä olevista piirustuksista, joissa:

Kuvio 1: Kaavamainen esitys plasmidi pBD94:stä, joka koodaa sekä alayksikköä A 20 että alayksikköä B /nc-promoottorin säätelemänä. Plasmidi pBD94 sisältää alayksik-; Ί kö A:n aminohappotähteessä 192 yhden emässubstituution, joka koodaa Gly:tä eikä Γ Arg:tä ja joka säilyttää lukukehyksen, mutta eliminoi proteolyyttisen kohdan. Kuvi ossa on esitetty aminohapposekvenssi, joka vastaa trypsiiniherkkyysaluetta, ja ami-nohapposubstituution Arg]92-»Glyi92 paikka.

25 Kuvio 2: Käyrä, joka kuvaa ADP-ribosyyliagmatiinitasojen annoksesta riippuvaista nousua CT-määrän kasvun funktiona.

Kuvio 3: Nesteen kerääntymistä esiintyy, kun hiirille annetaan 125 pg natiivi-LT:tä, mutta ei esiinny, kun niille annetaan 125 pg mLT:tä. Suoli/tapettu eläin -suhde määritellään ohutsuolen painona jaettuna lopun ruhon painolla.

30 Kuvio 4: mLT:n kyky toimia immunologisena adjuvanttina. Kuvio 4A kuvaa mLT:n kykyä indusoida seerumin IgG-vaste OVA.lle. Kuvio 4B kuvaa mLT:n kykyä indusoida limakalvon slgA-vaste OVA:lle.

Kuvio 5: Koe, jossa osoitetaan, että mLT säilyttää kykynsä estää oraalisen toleranssin kehittymisen LT:ta kohtaan. Kuvio 5A: mLT:n kyky indusoida seerumin 35 IgG-vaste LT:lle. Kuvio 5B: mLT:n kyky indusoida limakalvon slgA-vaste LT:lle.

5. Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Esillä oleva keksintö koskee koostumusta ja menetelmiä tämän koostumuksen käyt- 13 tämiseksi limakalvon ja seerumin vasta-aineiden tuotannon edistämiseen antigeenejä vastaan, jotka annetaan samanaikaisesti suun kautta geneettisesti muunnetun bakteeritoksiinin kanssa. Muunnettu toksiini on E. colin lämpölabiilin enterotoksiinin (LT) eräs muoto, joka on geneettisen muokkauksen kautta menettänyt trypsiinille 5 herkän kohtansa, mikä tekee molekyylin ei-toksiseksi, mutta yllättävästi se kuitenkin säilyttää kykynsä toimia immunologisena adjuvanttina. Mutantti-LT:tä nimitetään tässä termillä "mLT". Keksintö perustuu siihen havaintoon, että mLT on yhtä tehokas kuin LT immunologisena adjuvanttina, mikä on odottamaton ja yllättävä tulos. mLT:llä ei ole enää entsymaattista ADP-ribosylaatioaktiivisuutta, koska A-alayksik-10 köä ei enää voida käsitellä proteolyyttisesti. Päinvastoin kuin Lycken ja työtovereiden tutkimuksissa, joissa tehtiin selväksi, että muutokset, jotka vaikuttavat LT:n ADP-ribosylaatioaktiivisuuteen, estävät molekyyliä myös toimimasta immunologisena adjuvanttina [Lycke et ai., 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281], tässä kuvattu mLT säilyttää aktiivisuutensa immunologisena adjuvanttina, vaikka, kuten esimer-15 keissä osoitetaan, sillä ei ole ADP-ribosylaatioaktiivisuutta.

Tässä kuvattu E. colin lämpölabiilin enterotoksiinin uusi mutanttimuoto, mLT, käyttäytyy kuten adjuvantti ja tuo esiin sekä seerumin IgG- että limakalvon slgA-tuotan-non antigeenejä, joiden kanssa sitä on annettu, vastaan. Hyöty tästä yllättävästä ha-20 vainnosta on, että adjuvanttina tehokasta määrää mLT:tä voidaan käyttää tehokkaassa erilaisia patogeenejä vastaan suunnatussa immunisointiohjelmassa, jossa annetaan tehokas määrä mLT-adjuvanttia sekoitettuna tapettuihin tai heikennettyihin patogee-neihin tai spesifisten patogeenien relevantteihin virulenssideterminantteihin tarvitsematta pelätä todellisia tai mahdollisia toksisia sivuvaikutuksia, joita liittyy suun 25 kautta annettuun CT:hen tai LT:hen.

Esillä oleva keksintö ylittää tunnetun tekniikan siinä, että esillä olevaa keksintöä voidaan käyttää erilaisissa immunologisissa sovelluksissa, joissa on saatettu käyttää CT:tä, LT:tä tai CT: n tai LT:n alayksikköjä, mutta joissa nyt mLT:ä käytettäessä ei : 30 esiinny todellisia tai mahdollisia sivuvaikutuksia, kuten ripulia, joita sen käyttöön saattaisi liittyä. Päinvastoin kuin LT, joka, vaikka onkin ei-toksinen ensiksi bakteerista eristettynä, saattaa muuttua täysin toksiseksi, kun se altistetaan proteaaseille, kuten esimerkiksi nisäkkäiden suolessa esiintyville proteaaseille, mLT:llä ei ole po-: tentiaalia muuttua toksiseksi proteolyyttisen aktivoitumisen johdosta.

35

Esillä olevan keksinnön eräs toinen toteutusmuoto koskee mLT:n käyttöä enterotok-sisia organismeja, jotka ilmentävät kolerankaltaisia toksiineja, vastaan suunnatun rokotteen komponenttina. Tämän keksinnön tekijät ovat osoittaneet, että mLT:lle ei 14 kehity suun kautta indusoitua immuunitoleranssia, kun sitä annetaan (katso alla), ja sen vuoksi mLT voi toimia ja on erittäin haluttu komponenttina sellaisissa rokotteissa, jotka ovat suunnatut enterotoksisia organismeja vastaan. Nykyisellä tekniikalla voidaan tuottaa käyttöön kolerankaltaista toksiinia ilmentäviä organismeja vastaan 5 suunnattua rokotteita, jotka sisältävät tapettuja kokosoluja ja toksiinin B-alayksikköä. Korvaamalla B-alayksikkö mLT:llä rokote saadaan paremmaksi kahdella eri tavalla. Ensiksikin mLT, jolla on sekä A- että B-alayksikkö, aikaansaa nyt immuunivasteen ei ainoastaan B-alayksikölle, vaan yhtä hyvin myös A-alayksikölle. Tällöin käytettävissä on enemmän epitooppeja tehokasta neutralisointia varten. Toiseksi mLT:n luon-10 täinen adjuvanttiaktiivisuus vahvistaa immuunivastetta rokotteen tapettujen kokoso-lujen muodostamaa komponenttia vastaan.

Lisäksi toiset tutkijat (Häse et ai., 1994, Infect. Immun. 62:3051-3057) ovat osoittaneet, että A-alayksikkö, joka on muunnettu siten, että se ei ole enää toksinen, muut-15 tamalla ADP-ribosyloivan entsymaattisen aktiivisuuden aktiivista kohtaa (vastakkainen proteolyyttiselle kohdalle, josta esillä olevassa keksinnössä on kysymys), voi indusoida immuunivasteen villityypin A-alayksikköä vastaan. Sillä tavalla muunnetulta A-alayksiköltä puuttuu nyt kuitenkin immunologinen adjuvanttiaktiivisuus ja se on sen vuoksi vähemmän suotava rokotekomponenttina kuin mLT.

.Y; 20

Lisäksi koska vasta-aineet mLT:tä vastaan reagoivat ristiin LT:n ja CT:n kanssa, mLT:tä voidaan käyttää rokotteissa, jotka on suunnattu monentyyppisiä enterotoksisia bakteeriorganismeja vastaan, jotka ilmentävät kolerankaltaisia toksiineja, kuten Escherichia spp. ja Vibrio spp.

'25 5.1 mLT:n tuottaminen

Villityypin LT-toksiini koodautuu luonnossa esiintyvällä plasmidilla, jota tavataan enterotoksigeenisissa E. coli -kannoissa, jotka kykenevät tuottamaan tätä toksiinia. Tämän keksinnön tekijät olivat aikaisemmin kloonanneet LT-geenin E. colin hu-30 maani-isolaatista, joka nimettiin H10407:ksi. Tämä alaklooni muodostuu 5,2 kilo-emäksen DNA-palasesta, joka on peräisin H10407:n enterotoksiiniplasmidista, joka on istutettu plasmidi pBR322:n Psd-kohtaan (Clements et ai., 1983, Infect. Immun. 40:653).Tämä rekombinaatiotekniikalla valmistettu plasmidi, nimeltään pDF82, on laajasti karakterisoituja se ilmentää LT:tä natiivi-LT-promoottorin ohjaamana. Seu-35 raava vaihe tässä prosessissa oli sijoittaa LT-geeni voimakkaan promoottorin, tässä tapauksessa /uc-promoottorin plasmidi pUC 18:11a, ohjaukseen. Tämä toteutettiin eristämällä geenit LT-A:lle ja LT-B.Ue erikseen ja yhdistämällä ne kasettiin vektori-plasmidissa. Tämä oli tärkeä vaihe, koska se antoi mahdollisuuden puhdistaa koh- 15 tuullisia määriä LT:tä ja siitä johdettuja mutantteja myöhempää tutkimusta varten. Tämä plasmidi, joka nimettiin pBD94:ksi, on esitetty kaavamaisesti kuviossa 1.

Sekä CT että LT syntetisoituvat siten, että niissä on trypsiiniherkkä peptidisidos, joka 5 yhdistää Aj-ja A2-kappaleet. Tämä peptidisidos pitää merkitä molekyylille "toksiseksi". Tämä pätee myös difteriatoksiiniin, A-B-toksiinin prototyyppiin, ja erilaisiin muihin bakteeritoksiineihin. Jos ArA2-sidosta ei poisteta joko bakteeriprote-aasien tai intestinaalisten proteaasien toimesta suolen lumenissa, Αι-kappale ei pääse kohteeseensa suolen epiteelisolun basolateraalisella pinnalla. Päinvastoin kuin CT, 10 LT ei ole biologisesti aktiivinen heti kun se on eristetty solusta. LT vaatii sekin pro-teolyysin ollakseen täysin aktiivinen ja proteolyyttinen aktivaatio ei tapahdu bakteerin sisällä. Sen vuoksi eräs keino muuttaa molekyylin toksisuutta vaikuttamatta ADP-ribosyloivaan entsymaattiseen aktiivisuuteen olisi poistaa geneettisesti käsittelemällä trypsiiniherkät aminohapot, jotka yhdistävät A-alayksikön Ar ja A2-komponentteja.

15 Jos molekyyli ei pääse pilkkoutumaan proteolyyttisesti, se ei ole toksinen. Alaan pe rehtynyt ajattelisi, että molekyyli säilyttäisi kuitenkin ADP-ribosyloivan entsymaatti-sen aktiivisuutensa ja siten adjuvanttifunktionsa.

Kuvio 1 esittää disulfidin koossa pitämän alueen Joka erottaa palaset Ai ja A2 toisis-20 taan, sekvenssiä. Tällä alueella on vain yksi arginiinitähde, jonka uskotaan olevan pilkkoutumiskohta, joka tarvitaan molekyylin toksisten ominaisuuksien aktivoimiseen. Tämä alue muutettiin suunnatulla mutageneesilla siten, että molekyylistä tuli ei-herkkä proteolyyttiselle digestiolle ja siten ei-toksinen.

25 Suunnattu mutageneesi suoritetaan hybridisoimalla yksisäikeiseen DNAihan jokin synteettinen oligonukleotidi, joka on komplementaarinen yksisäikeiselle templaatille lukuunottamatta keskustan lähellä olevaa ei-homogeenista aluetta. Juuri tämä alue sisältää halutun nukleotidimuutoksen tai -muutokset. Yksisäikeiseen kohde-DNA:han hybridisoimisen jälkeen oligonukleotidia jatketaan DNA-polymeraasilla 30 niin että syntyy kaksisäikeinen rakenne. Lovi suljetaan sitten DNA-ligaasilla ja kaksoisrakenne transformoidaan E. coli -isäntään. Mutanttien teoreettinen saanto tätä menetelmää käytettäessä on 50 % DNA-replikaation semikonservatiivisuuden vuoksi. Käytännössä saanto on paljon pienempi. On kuitenkin olemassa muutamia menetelmiä saannon parantamiseksi ja oligotidilla muunnettujen mutanttien seulomiseksi. 35 Käytetyssä systeemissä käytettiin toista mutageenisia oligonukleotidia muutettujen restriktiokohtien aikaansaamiseksi kaksoismutaatiostrategiassa.

Seuraavana vaiheena oli Arg:n korvaaminen jollakin toisella aminohapolla (s.o.

16 GGA = Gly korvaa AGA = Arg:n) säilyttäen siten lukukehyksen samalla kun proteo-lyyttinen kohta poistuu. mLT puhdistettiin sitten agaroosiaffmiteettikromatografialla yhdestä mutantista (pBD95),joka vahvistettiin sekvensoimalla. Alaan perehtyneet tuntevat vaihtoehtoisia puhdistusmenetelmiä. Tämä mutantti, jolle annettiin nimeksi 5 LT(R192G)5 tutkittiin sitten SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla trypsiiniherkän sidoksen muuntamisen osalta. Näytteitä tutkittiin altistamalla ja altistamatta trypsii-nille ja niitä verrattiin natiiviin (muuntamattomaan) LT:hen. mLT ei dissosioidu Ai±si ja A2:ksi, kun sitä inkuboidaan trypsiinin kanssa, mikä osoittaa, että herkkyys proteaasille on poistunut.

10 5.2 mLT: n ja siihen liittymättömien antigeenien antotapa

Esillä olevan keksinnön mukaan mLT voidaan antaa yhdistettynä mihin tahansa biologisesti relevanttiin antigeeniin ja/tai rokotteeseen, jolloin saadaan parempi immuunivaste mainitulle antigeenille ja/tai rokotteelle. Eräässä edullisessa toteutus-15 muodossa mLT ja antigeeni annetaan samanaikaisesti farmaseuttisena seoksena, joka käsittää tehokkaan määrän mLT:tä ja tehokkaan määrän antigeeniä. Antotapa on oraalinen. mLT:n ja antigeenin suhteelliset määrät vaihtelevat käytetyn antigeenin laadun ja immunisoitavan eläinlajin mukaan. Eräässä toteutusmuodossa mLT:n ja antigeenin ensimmäistä antoa seuraa kysymyksessä olevan antigeenin tehostusanto. 20 Eräässä toisessa toteutusmuodossa tehostetta ei anneta. Tehosteen ajoitus voi vaihdella riippuen antigeenistä ja hoidettavasta lajista. Muutokset annostuksessa ja tehosteen ajoituksessa mille tahansa kysymykseen tulevalle lajille ja antigeenille voidaan helposti määrittää rutiinikokein. Tehoste voi olla pelkästään antigeeniä tai antigeeniä yhdessä mLT.n kanssa. Tehosteen antotapa voi olla joko oraalinen, nasaalinen tai 25 parenteraalinen; jos tehosteessa käytetään mLT:tä, antotapa on mieluiten oraalinen.

Esillä olevan keksinnön mukaiset menetelmät ja seokset ovat tarkoitetut käytettäviksi sekä kehittymättömiin että kehittyneisiin selkärankaisiin, erityisesti lintuihin, nisäkkäisiin ja ihmiseen. Keksintöä rajoittamattomia esimerkkejä käyttökelpoisista anti-30 geeneistä olisivat antigeenit, jotka ovat peräisin bakteerien patogeenisistä kannoista (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vib-35 rio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia entero-colitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudo tuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Trepone- 17 ma pertenue, Treponema carateneum, Borrelia v mc eritti, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, 5 Chlamydia spp.); patogeenisistä sienistä (Coccidioides immitis, Aspergillus fumiga-tus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histo-plasma capsulatum)-, alkueläimistä (Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, 10 Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria) tai loismadoista (Enterobius vermicularis, Trichuris trichinra, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides sterco-ralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium ja koukkumadot) Jotka tulevat immuunijärjestelmään kokosolumuodossa tai osina, jot-15 ka on eristetty väliaineviljelmistä, jotka ovat tarkoitetut mainittujen organismien kasvattamiseen ja jotka ovat alalla hyvin tunnettuja, tai geneettisesti käsittelemällä tai kemiallisilla synteeseillä mainituista organismeista saadut suojaavat antigeenit.

Muita relevantteja antigeenejä olisivat patogeeniset virukset (keksintöä rajoittamat-20 tornina esimerkkeinä: Poxviridae, Herpesviridae, Herpes simplex -virus 1, Herpes simplex -virus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picomaviridae, Par-voviridae, Reoviridae, Retroviridae, influenssavirukset, parainfluenssavirukset, sikotautivirus, tuhkarokkovirus, RS-virus, vihurirokkovirus, Arboviridae, Rhabdoviri-dae, Arenaviridae, hepatiitti A -virus, hepatiitti B -virus, hepatiitti C -virus, hepatiitti 25 E -virus, ei-A/ei-B hepatiittivirus, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae ja HI-virus), jotka tulevat immuunijärjestelmään kokosolumuodossa tai viruksen osana, jotka on eristetty alalla hyvin tunnetuista väliaineviljelmistä, jotka ovat tarkoitetut sellaisten virusten kasvattamiseen, tai niistä peräisin olevat suojaavat antigeenit, jotka on saatu geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisilla synteeseillä.

30

Muita esimerkkejä relevanteista antigeeneistä ovat rokotteet, rajoittumatta kuitenkaan niihin. Esimerkkejä sellaisista rokotteista ovat, rajoittumatta kuitenkaan näihin, influenssarokote, hinkuyskärokote, kurkkumätä-ja jäykkäkouristustoksoidit yhdistettynä hinkuyskärokotteeseen, hepatiitti A -rokote, hepatiitti B -rokote, hepatiitti C -ro-35 kote, hepatiitti E -rokote, japaninenkefaliitti-rokote, herpesrokote, tuhkarokkorokote, vihurirokkorokote, sikotautirokote, tuhkarokko-, sikotauti-ja vihurirokkorokote, papilloomavirusrokote, parvovirusrokote, RSV-rokote, Lymen tauti -rokote, poliorokote, malariarokote, vesirokkorokote, gonorrearokote, HIV-rokote, bilhartsiarokote, 18 rotavirusrokote, mykoplasmarokote, pneumokokkirokote, menmgokokkirokote ja vastaavat. Niitä voidaan valmistaa tunnetuilla tavallisilla menetelmillä. Yleensä sellaiset rokotteet sisältävät joko koko organismin tai viruksen, joka on kasvatettuja eristetty alan ammattilaisten hyvin tuntemilla menetelmillä, tai ne käsittävät näiden 5 organismien tai virusten relevantteja antigeenejä, joita tuotetaan geenimuokkausme-netelmillä tai kemiallisilla synteeseillä. Niiden valmistusta kuvataan seuraavasti, rajoittumatta kuitenkaan tähän:

Influenssarokote: rokote, joka sisältää kokonaisia influenssaviruksia tai osia niistä, 10 hemagglutiniinia, neuraminidaasia, nukleoproteiinia ja matriisiproteiinia, saadaan puhdistamalla virus, jota kasvatetaan alkiollisissa kananmunissa joko eetterin ja de-tergentin kanssa, tai geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisella synteesillä.

Hinkuyskärokote: rokote, joka sisältää kokonaisia hinkuyskätoksiinibakteereita tai 15 osia siitä, hemagglutiniinia ja K-agglutiinia, ja niitä valmistetaan avirulentista toksiinista formaliinin kanssa ja uutetaan ulossuolaamalla tai sentrifiigoimalla Bordetel-lapertussis -viljelyliemestä tai bakteerisoluista, tai geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisen synteesin avulla.

20 Difteria- ja tetanustoksoidi yhdistettynä hinkuyskärokotteeseen: rokote, joka on hinkuyskärokotteen, difteria- ja tetanustoksoidin seos.

, Japaninenkefaliittirokote: rokote, joka sisältää kokonaisia antigeeniproteiineja tai osia niistä, jotka proteiinit saadaan viljelemällä virusta intraserebraalisesti hiirissä ja 25 puhdistamalla viruspartikkelit sentrifugoimalla tai etyylialkoholilla ja inakti voimalla ne, tai geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisen synteesin avulla.

B-hepatiittirokote: rokote, joka sisältää kokonaisen antigeeniproteiinin tai osia siitä, joka saadaan eristämällä ja puhdistamalla ulossuolauksella tai ultrasentrifugoimalla 30 HBs-antigeeni, joka on saatu hepatiittia kantavasta verestä, tai geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisen synteesin avulla.

Tuhkarokkorokote: rokote, joka sisältää kokonaisia viruksia tai osia viruksista, joita on kasvatettu kanan alkiosoluissa tai alkiollisissa munissa, tai suoja-antigeenia, joka 35 on saatu geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisen synteesin avulla.

Vihurirokkorokote: rokote, joka sisältää kokonaisia viruksia tai osia viruksista, joita on kasvatettu kanan alkiosoluissa tai alkiollisissa munissa, tai suoja-antigeenia, joka 19 on saatu geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisen synteesin avulla.

Sikotautirokote: rokote, joka sisältää kokonaisia viruksia tai osia viruksista, joita on kasvatettu kaniinin soluissa tai hedelmöittyneissä munissa, tai suoja-antigeenia, joka 5 on saatu geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisen synteesin avulla.

Tuhkarokko-, vihurirokko-ja sikotautirokote: rokote, joka on valmistettu sekoittamalla tuhkarokko-, vihurirokko-ja sikotautirokotetta.

10 Rotavirusrokote: rokote, joka sisältää kokonaisia viruksia tai osia viruksesta, jota on kasvatettu viljellyissä MA 104 -soluissa tai eristetty potilaan ulosteista, tai suoja-antigeenia, joka on saatu geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisen synteesin avulla.

15 Mykoplasmarokote: rokote, joka sisältää kokonaisia mykoplasmasoluja tai osia my-koplasmasoluista, joita on kasvatettu mykoplasman nestemäisessä kasvatusaineessa, tai suojaavaa antigeeniä, joka on saatu geenimuokkausmenetelmillä tai kemiallisen synteesin avulla.

20 Olosuhteet, joissa keksinnön mukaisella menetelmällä päästään tehokkaaseen ehkäisyyn, ovat itsestäänselviä alaan perehtyneille.

Esillä olevan keksinnön mukaiset rokotevalmisteseokset voidaan valmistaa sekoittamalla edellä kuvattuja antigeenejä ja/tai rokotteita mLT:n kanssa halutussa suhteessa. 25 Valmistaminen tulisi suorittaa äärimmäisen aseptisesti ja jokaisen komponentin tulisi myös olla aseptinen. Pyrogeenit tai allergeenit tulisi tietysti poistaa mahdollisimman täydellisesti. Esillä olevan keksinnön mukaista antigeenivalmistetta voidaan käyttää valmistamalla antigeeni per se ja mLT erikseen.

30 Lisäksi esillä oleva keksintö koskee varustepakkausta, joka sisältää tehokkaan määrän antigeeniä ja adjuvanttina tehokkaan määrän mLT:tä. Käytettäessä pakkauksen komponentit voidaan joko ensiksi sekoittaa toisiinsa ja sitten antaa suun kautta tai komponentit voidaan antaa erikseen suun kautta lyhyin aikavälein.

35 Esillä olevan keksinnön mukaiset rokotevalmistekoostumukset voidaan yhdistää joko nestemäiseen tai kiinteään farmaseuttiseen kantajaan, ja koostumukset voivat olla tablettien, kapselien, jauheiden, rakeiden, lietteiden tai liuoksien muodossa. Koostumukset voivat myös sisältää sopivia säilöntäaineita, väriaineita ja maunparannusai- 20 neita tai aineita, jotka aikaansaavat lääkeaineen hitaan vapautumisen. Mahdollisia kantajia, joita tämän keksinnön mukaisten farmaseuttisten koostumusten valmistuksessa voidaan käyttää, ovat, rajoittumatta kuitenkaan näihin, gelatiinikapselit, sokerit, selluloosajohdokset, kuten natriumkarboksimetyyliselluloosa, gelatiini, talkki, 5 magnesiumstearaatti, kasviöljy, kuten maapähkinäöljy jne., glyseriini, sorbitoli, agar-agar ja vesi. Kantajat voivat toimia myös sidonta-aineena, jotta koostumukset on helpompi tabletoida kätevää suun kautta antoa varten.

Tämän keksinnön mukainen rokotevalmistekoostumus voidaan säilyttää stabiilina 10 käyttövalmiina varastomuotona lyofilisoimalla tai millä tahansa muulla alan ammatti laisten tuntemalla tavalla. Suun kautta antoa varten rokote valmiste voidaan rekonsti-tuoida lietteeksi puskuroituun keittosuolaan, maitoon tai mihin tahansa muuhun fysiologisesti yhteensopivaan nestemäiseen väliaineeseen. Väliaine voidaan tehdä paremman makuiseksi lisäämällä siihen sopivia väri- ja makuaineita toivomusten mu-15 kaan.

Ennen rokotevalmistekoostumuksen antoa voidaan potilaalle antaa suun kautta tehokas määrä jotakin vatsahappoja neutraloivaa ainetta. Vaikka tähän tarkoitukseen voidaan käyttää monia yhdisteitä, natriumbikarbonaatti on edullisin. Vaihtoehtoisesti 20 rokotekoostumukset voidaan jaella enteropäällysteisissä kapseleissa (s.o. kapseleissa, jotka liukenevat vasta kuljettuaan mahalaukun läpi).

6. Esimerkit :,, Seuraavat esimerkit esitetään pelkästään keksinnön havainnollistamiseksi eikä niiden 25 tarkoituksena ole millään tavalla rajoittaa keksinnön suoja-alaa.

6.1. mLT:n rakentaminen

Villityypin LT-toksiini koodautuu luonnossa esiintyvällä plasmidilla, jota tavataan enterotoksigeenisen E. colin kannoissa, jotka pystyvät tuottamaan tätä toksiinia. Tä-30 män keksinnön tekijät ovat aikaisemmin kloonanneet LT-geenin E. coli humaani-isolaatista, jonka nimitys on H10407. Tämä alaklooni muodostuu 5,2 kb:n DNA-palasesta, joka on saatu H10407:n enterotoksiiniplasmidista, joka oli istutettu plas-midin pBR322 PM-kohtaan (Clements et ai., 1983, Infect. Immun. 40:653). Tämä yhdistelmäplasmidi, joka on nimetty pDF82:ksi, on laajalti karakterisoitu ja se ilmen-35 tää LT:tä natiivi LT-promoottorin säätelemänä. Seuraava vaihe tässä prosessissa oli sijoittaa LT-geeni jonkin voimakkaan promoottorin, tässä tapauksessa /ac-promoot-torin plasmidilla pUCl 8, säätelyyn. Tämä suoritettiin eristämällä geenit LT-A:ta ja LT-B:tä varten erikseen ja yhdistämällä ne kasetissa vektoriplasmidiin. Tämä oli tär- 21 keä vaihe, koska sen ansiosta pystyttiin puhdistamaan kohtuullisia määriä LT:tä ja siitä johdettuja mutantteja myöhempää analysointia varten. Tämä plasmidi, joka nimettiin pDF94:ksi, on esitetty kaavamaisesti kuviossa 1.

5 Sekä CT että LT syntetisoituvat niin, että niissä on trypsiinille herkkä peptidisidos, joka yhdistää Arja A2-palaset. Tämä peptidisidos tulee merkitä molekyylille "toksiseksi". Tämä pätee myös difteriatoksiiniin, joka on prototyyppi A-B -toksiinista, ja monenlaisiin muihin bakteeritoksiineihin. Jos Ai-A2-sidosta ei poisteta joko bakteeriproteaasien tai suoliproteaasien toimesta suolen lumenissa, s.o. proteolyytti-10 sellä käsittelyllä tai aktivoimalla, Arpalanen ei pääse kohteeseensa suolen epiteelisolun basolateraalisella pinnalla. Päinvastoin kuin CT, LT ei ole täysin biologisesti aktiivinen heti, kun se on eristetty solusta. LT vaatii myös proteolyysin ollakseen täysin aktiivinen ja proteolyyttistä aktivoitumista ei tapahdu bakteerin sisällä. Sen vuoksi eräs keino molekyylin toksisuuden muuttamiseksi vaikuttamatta ADP-ribosyloivaan 15 entsymaattiseen aktiivisuuteen olisi poistaa geneettisen muokkauksen avulla trypsii-niherkät aminohapot, jotka liittävät A-alayksikön Arja A2-komponentit toisiinsa. Mikäli molekyyliä ei pystytä proteolyyttisesti pilkkomaan, se ei ole toksinen. Alan ammattilainen ennustaisi, että molekyyli säilyttäisi kuitenkin ADP-ribosyloivan ent-symaattisen aktiivisuutensa ja sen seurauksena adjuvanttifunktionsa.

20

Kuviosssa 1 on esitetty disulfidin kohdalla olevan alueen, joka erottaa Ar ja A2-pala-set toisistaan, sekvenssi. Tällä alueella on yksi ainoa arginiinitähde, jonka uskotaan olevan pilkkoutumiskohta, joka tarvitaan molekyylin toksisten ominaisuuksien aktivoimiseen. Tämä alue muutettiin suunnatulla mutageneesilla siten, että molekyyli ei 25 enää ollut herkkä proteolyyttiselle digestiolle ja oli siis ei-toksinen.

Sunnattu mutageneesi suoritettiin hybridisoimalla yksisäikeiseen DNA:han synteettinen oligonukleotidi, joka on komplementaarinen yksisäikeiselle templaatille lukuunottamatta keskikohdan lähellä olevaa ei-homogeenista aluetta. Juuri tämä alue 30 sisältää halutun nukleotidimuutoksen tai -muutokset. Kun oligonukleotidi on hybri-disoitu yksisäikeiseen kohde-DNA:han, sitä jatketaan DNA-polymeraasilla kaksisäi-keisen rakenteen luomiseksi. Lovi suljetaan sitten DNA-ligaasilla ja kaksoisrakenne : siirretään E. coli -isäntään. Tätä menetelmää käytettäessä mutanttien teoreettinen saanto on 50 % johtuen DNA-replikaation semikonservatiivisuudesta. Käytännössä 35 saanto on paljon pienempi. On kuitenkin olemassa joukko menetelmiä saannon parantamiseksi ja oligonukleotidilla muunnettujen mutanttien seulomiseksi. Sovelletussa systeemissä käytettiin toista mutageenista oligonukleotidia muutettujen pilkkou-tumiskohtien luomiseksi kaksoismutaatiostrategialla.

22

Seuraava vaihe oli korvata Arg toisella aminohapolla (s.o. GGA = Gly korvaa AGA = Arg: in) Jolloin lukukehys säilyy samalla kun proteolyyttinen kohta häviää. Sitten mLT puhdistettiin agaroosiaffmiteettikromatografialla yhdestä mutantista (pBD95), 5 joka oli vahvistettu sekvensoimalla. Vaihtoehtoiset puhdistusmenetelmät ovat itsestään selviä alaan perehtyneille. Tämä mutantti-LTJoka nimettiin LT(Ri92G):ksi, tutkittiin sitten SDS-polyakryyliamidigeelilelektroforeesilla trypsiiniherkän sidoksen muuttamiseksi. Näytteitä tutkittiin sekä altistamalla ne trypsiinille että altistamatta niitä sillejä niitä verrattiin natiiviin (muuntamattomaan) LT:han. mLT ei jakaudu 10 Apksi ja A2:ksi, kun sitä inkuboidaan trypsiinin kanssa, mikä osoittaa, että herkkyys proteaasille on hävinnyt.

6.2. mLT: n vaikutus Y-l adrenaalisoluihin

Alan ammattilainen ennustaisi, että mLT ei olisi aktiivinen Y-l -adrenaalisoluko-15 keessa. Tämä ennakkoajatus perustuisi aikaisempiin havaintoihin (Clements ja Fin-kelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769), että ei-lovettu LT oli yli 1 000 kertaa vähemmän aktiivinen tässä koesysteemissä kuin CT ja että trypsiinikäsittely aktivoi LT:n biologisesti yhtä aktiiviseksi kuin CT:n tässä kokessa. Oletettiin, että tässä kokeessa todettu LT:n jäännösaktiivisuus ilman trypsiinillä aktivointia johtui jonkinlai-20 sesta jäännösproteaasiaktiivisuudesta, jota ei voitu ottaa lukuun. Trypsiiniä käytetään esimerkiksi Y-l adrenaalisolujen alaviljelyprosessissa. Sen vuoksi oletettiin, että LT, jota ei voitu loveta, olisi täysin epäaktiivinen Y-l adrenaalisolukokeessa. Tulokset on J esitetty taulukossa 1.

25 Taulukko 1

Toksiini Trypsiinillä aktivoitu Spesifinen aktiivisuus* : > Koleratoksiini - 15 LT - 60 LT ' " ' + 15 LT(ri92g> - 48 800 LT(r192G) + 48 800 *Minimiannos (pikogrammaa/kuoppa), joka tarvittiin aikaansaamaan (>50%) solun pyöristyminen.

Taulukko 1 osoittaa sen odottamattoman havainnon, että LT säilytti perustason aktiivisuuden Y-l adrenaalisolukokeessa, vaikka sitä ei voitu käsitellä proteolyyttisesti. 30 Kuten taulukossa 1 on osoitettu, CT:llä ja natiivi-LT:llä, jotka oli käsitelty trypsiinil- 23 la, oli samantasoinen aktiivisuus (15 pg) Y-l adrenaalisoluihin nähden. Sitävastoin mLT (48 000 pg) oli > 1 000 kertaa vähemmän aktiivinen kuin CT tai natiivi-LT eikä trypsiini kyennyt aktivoimaan sitä. Jäännösperusaktiivisuus epäilemättä heijastaa erilaista ja tähän asti tuntematonta adrenaalisoluaktivointitietä kuin se Joka vaatii 5 Ai-A2-sidoksen katkaisemisen.

6.3. mLT: n ADP-ribosyloiva entsy maallinen aktiivisuus

Koska mutaatio Jossa Arg192 korvataan Glyi92:lla, ei muuta At-osan entsymaattista kohtaa, alan ammattilainen olettaisi, että mLT säilyttäisi ADP-ribosyloivan entsy-10 maahisen aktiivisuutensa. Tämän ominaisuuden tutkimiseksi käytettiin NAD- agmatiini-ADP-ribosyylitransferaasi -koetta (Moss et ai, 1993, J. Biol. Chem. 268: 6383-6387). Kuten kuviossa 2 on osoitettu, CT aikaansaa annoksesta riippuvan nousun ADP-ribosyyliagmatiinitasoissa johtuen tämän molekyylin ADP-ribosyylitransfe-raasiaktiivisuudesta.

15

Taulukko 2 CT:n, natiivi-LT:n ja LT(R192g):i1 ADP-ribosyylitransferaasiaktiivisuus

Koe 12 3 4 KeskiarvolSEM

Ei toksiinia ET 9,12 5,63 14,17 9,64±2,48 __ _ _____ _____ _____ _________ _____ __ ______ _____ _____ _______ 100 pg CT 351,55 361,73 308,09 ET 340,46±16,45 _______ _____ _____ _____ — _______ 100 pgLT + 164,10 189,89 152,96 ET 168,98± 10,94 trypsiini 100 pgLT(R192G) 14,58 12,34 9,30 ET 12,07±1,53 100 pgLT(R192G) 14,73 8,90 10,47 ET 11,37±1,74 + trypsiini ET = Ei tehty tiedot ilmoitettu fmooleina min'1

Taulukko 2 osoittaa taulukon muodossa odottamattoman havainnon, että mLT:Itä 20 puuttui ilmaistavissa oleva ADP-ribosyloiva entsymaattinen aktiivisuus sekä tryp-siinillä aktivoituna tai ilman sitä, vaikka entsymaattista kohtaa ei ollut muutettuja Y-1 adrenaalisolukokeessa oli osoitettavissa perusaktiivisuustaso.

24 6.4. m LT: n enterotoksinen aktiivisuus

Odottamattoman havainnon, että mLT:llä ei ollut ilmaistavissa olevaa ADP-ribosy-loivaa entsymaattista aktiivisuutta sekä trypsiinillä aktivoituna tai ilman sitä, vaikka entsymaattista kohtaa ei ollut muutettuja sen lisähavainnon ja Y-l adrenaalisolu-5 kokeessa voitiin osoittaa perusaktiivisuustaso, vuoksi oli epäselvää, säilyttäisikö mLT enterotoksisen aktiivisuutensa. Ihanteellinen mLT-adjuvanttiformulaatio säilyttäisi kykynsä toimia immunologisena adjuvanttina, mutta siltä puuttuisivat todelliset tai mahdolliset sivuvaikutukset, kuten LT:n tai CT:n käyttöön liittyvä ripuli. Kuvio 3 osoittaa, että mLT ei indusoi selvää nesteen eritystä patenttihiirimallissa, edes 10 125 pg:n annoksella. Tämä annos on enemmän kuin viisi kertaa LT:n adjuvanttina tehokas määrä tässä mallissa. Tärkeää on, että natiivin LT:n mahdollinen toksisuus on nähtävissä tällä tasolla.

6.5. mLT: n adjuvanttiaktiivisuus 15 Alan ammattilainen ajattelisi, että koska mLT:llä ei ollut osoitettavissa olevaa ADP-ribosyylitransferaasiaktiivisuutta, siltä puuttuisi adjuvanttiaktiivisuus. Tämä ennak-koajatus perustuisi Lycken et ai. raporttiin (Lycke et ai., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2277-2281) Jossa selvitetään, että muutokset Jotka vaikuttavat toksiinin ADP-ribo-syloivaan entsymaattiseen aktiivisuuteen ja muuttavat sen kykyä lisätä cAMP.n so-20 lunsisäisiä tasoja, estävät myös molekyyliä toimimasta adjuvanttina. Kuten edellä osoitettiin, mLT:llä ei ole ADP-ribosyloivaa entsymaattista aktiivisuutta ja vain hieman epämääräistä perusaktiivisuutta Y-l adrenaalisoluissa eikä se indusoi selvää nesteen eritystä patenttihiirimallissa.

Γ 25 mLT:n adjuvanttiaktiivisuuden tutkimiseksi tehtiin seuraava koe. Kolme BALB/c-hiiren ryhmää immunisoitiin. Eläimet inokuloitiin vatsansisäisesti tylppäkärkisellä syöttöneulalla (Popper & Sons, Inc., New Hyde Park, New York). Päivänä 0 kukin ryhmä immunisoitiin suun kautta seuraavasti: ryhmä A sai 0,5 ml PBS.ä, joka sisälsi 5 mg OVA:ta, ryhmä B sai 0,5 ml PBS;ä,joka sisälsi 5 mg OVA:taja 25 pg natiivia 30 LT:tä, ja ryhmä C sai 0,5 ml PBS:ä, joka sisälsi 5 mg OVA:ta ja 25 pg mLT:tä. Sama ainevalio annettiin uudelleen päivinä 7 ja 14. Päivänä 21 kaikille eläimille annettiin tehosteeksi i.p. 1 pg OVA:ta 20% Maaloxissa. Viikon kuluttua i.p. inokulaatiosta eläimet tapettiin ja niistä tutkittiin seerumin IgG-vasta-aineet ja limakalvon IgA-vasta-aineet OVA:ta ja LT:tä vastaan ELISA-kokeella.

Reagenssit ja antiseerumit ELISA-koetta varten saatiin Sigma Chemical Co:lta. Näytteet ELISAA varten sarjalaimennettiin fosfaattipuskuroituun keittosuolaliuokseen (pH 7,2) - 0,05% Tween 20:een (PBS-TWEEN). Anti-LT-määrityksiä varten ..........""""" 35 25 mikrotitrauslevyt esipäällystettiin 1,5 pg: 11a per kuoppa sekagangliosideja (tyyppi III), sitten l pgilla per kuoppa puhdistettua LT itä. Anti-OVA määritettiin mikrotit-rauslevyiltä, jotka oli päällystetty 10 pgilla per kuoppa OVAita. Seerumin anti-LT ja anti-OVA määritettiin kaniinin antiseerumilla alkaliseen fosfataasiin konjugoitua 5 hiiren IgGitä vastaan. Limakalvon anti-LT-ja anti-OVA-IgA tutkittiin vuohen anti-seerumilla hiiren igA:ta (alfaketjuspesifinen) vastaan ja sen jälkeen kaniinin antiseerumilla alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen IgG:tä vastaan. Reaktiot pysäytettiin 3N NaOHilla. IgGin ja IgA:n arvot määritettiin standardikäyrästä puhdistetuilla hiiren myeloomaproteiineilla [MOPC 315, gA(IgA12); MOPC 21, gGl: Litton 10 Biogenetics, Inc., Charleston, SC], 6.5.1 Seerumin IgG OVA:ta vastaan

Kuten kuviossa 4A on esitetty, eläimissä, jotka pohjustettiin suun kautta OVAilla ja LT.llä ja jotka immunisoitiin sen jälkeen parenteraalisesti OVA :11a (4,058 pg/ml), 15 kehittyi merkittävästi voimakkaampi seerumin IgG anti-OVA -vaste kuin niillä, jotka saivat suun kautta pelkästään OVA:ta ja jotka sen jälkeen immunisoitiin parenteraalisesti OVAilla (ei todettavaa anti-OVA-vastetta) (Studentin t-testi p= 0,031). Merkittävää oli, että eläimillä, jotka saivat aluksi suun kautta OVA:ta ja mLTitä ja jotka sen jälkeen immunisoitiin parenteraalisesti OVAilla (1,338 pg/ml), kehittyi myös 20 merkittävästi voimakkaampi seerumin IgG anti-OVA-vaste kuin niillä, jotka pohjustettiin suun kautta pelkästään OVAilla ja sen jälkeen immunisoitiin parenteraalisesti OVAilla (ei havaittavaa anti-OVA-vastetta) (Studentin t-testi p= 0.0007).

6.5.2 Limakalvon slgA OVArta vastaan 25 Kuten kuviossa 4B on osoitettu, samanlaisia tuloksia saatiin, kun anti-OVA IgA-reaktioita verrattiin samoissa eläinryhmissä. Eläimet, jotka saivat aluksi suun kautta OVAita ja LTitä ja jotka immunisoitiin sen jälkeen parenteraalisesti OVAilla (869 ng/ml), kehittivät merkittävästi voimakkaamman limakalvon IgA anti-OVA-reaktion kuin ne, jotka pohjustettiin pelkästään OVAilla ja sitten immunisoitiin pa-30 renteraalisesti OVAilla (ei havaittavaa anti-OVA-vastetta) (Studentin t-testi p= 0.0131). Kuten edellä eläimillä, jotka pohjustettiin suun kautta OVAilla ja mLTillä ja jotka sen jälkeen immunisoitiin parenteraalisesti OVAilla (230 ng/ml), kehittyi myös merkittävästi voimakkaampi limakalvon IgA anti-OVA-vaste kuin niillä, jotka pohjustettiin pelkästään OVAilla ja sen jälkeen immunisoitiin parenteraalisesti OVAilla 35 (ei havaittavaa anti-OVA-vastetta) (Studentin t-testi p=Ö.Öl 89).

6.5.3 Seerumin IgG LT:tä vastaan Näissä samoissa eläimissä tutkittiin myös LT:n ja mLTin kykyä synnyttää anti-LT- 26 vasta-ainereaktio. Tämä oli tärkeää siinä mielessä, että se osoittaisi, kykenisikö mu-tantti-LT estämään toleranssin kehittymisen sille itselleen sen lisäksi, että se toimi adjuvanttina muille proteiineille. Kuten kuvio 5A osoittaa, eläimille, jotka pohjustettiin suun kautta OVAillaja LT:llä ja jotka sen jälkeen immunisoitiin parenteraali-5 sesti OVAilla (342 pg/ml), kehittyi merkittävästi voimakkaampi seerumin IgG anti-LT-reaktio kuin niillä, jotka pohjustettiin pelkästään OVA:lla ja sen jälkeen immunisoitiin parenteraalisesti OVA:lla (ei havaittavaa anti-LT-reaktiota) (Studentin t-testi p=0.0005). Eläimillä, jotka pohjustettiin suun kautta OVA:lla ja mLT:llä ja jotka immunisoitiin sitten parenteraalisesti OVA:lla (552 pg/ml), kehittyi myös merkittä-10 västi voimakkaampi seerumin IgG anti-LT -reaktio kuin niillä, jotka pohjustettiin pelkästään OVAilla (ei havaittavaa anti-LT-vastetta) (Studentin t-testi p=0.0026).

6.5.4 Limakalvon sIGA LT:tä vastaan

Kuten kuvio 5B osoittaa, samanlaisia tuloksia saatiin, kun anti-LT IgA-reaktioita 15 verrattiin näissä samoissa eläinryhmissä keskenään. Eläimille, jotka pohjustettiin suun kautta OVAillaja LT:llä ja jotka sen jälkeen immunisoitiin parenteraalisesti OVA:lla (4,328 ng/ml), kehittyi merkittävästi voimakkaampi limakalvon IgA anti-LT-reaktio kuin niillä, jotka pohjustettiin pelkästään OVA:lla ja sen jälkeen immunisoitiin parenteraalisesti OVA:lla (ei havaittavaa anti-LT-reaktiota) (Studentin t-testi 20 p=0.0047). Kuten edellä eläimillä, jotka pohjustettiin suun kautta OVAillaja mLT.llä ja jotka immunisoitiin sitten parenteraalisesti OVAilla (1,463 ng/ml), kehittyi myös merkittävästi voimakkaampi limakalvon IgA anti-LT -reaktio kuin niillä, j jotka pohjustettiin pelkästään OVAilla (ei havaittavaa anti-LT-vastetta) (Studentin t- / : testi p=0.0323).

25 7. Mikro-organismien tallennus

Seuraava plasmidi tallennettiin laitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, 18. elokuuta 1994 ja se sai alla mainitun tallennusnumeron: Plasmidi T allennusnumero 30 pBD95 E. coli LTR192G:ssä ATCC 69683 Tässä kuvattu ja patenttivaatimuksilla määritelty keksintö ei ole tarkoitettu rajoittumaan tässä selitettyihin erityistoteutusmuotoihin, koska näiden toteutusmuotojen tarkoituksena on kuvata keksinnön useita aspekteja. Kaikkien vastaavien toteutus-35 muotojen katsotaan sisältyvän tämän keksinnön suoja-alaan. Erilaiset keksinnön muunnelmat tässä esitettyjen ja kuvattujen lisäksi käyvät nimittäin alaan perehtyneille selviksi edellä esitetyn kuvauksen perusteella. Sellaiset muunnelmat katsotaan myös kuuluviksi liitteenä olevien patenttivaatimusten suoja-alaan.

5 27

On myös selvää, että kaikki emäsparien ja aminohappotähteiden lukumäärät ja koot, jotka on esitetty nukleotideille ja peptideille, ovat likimääräisiä ja niitä on käytetty kuvaamistarkoituksissa.

Tässä on mainittu joukko viitejulkaisuja, joiden koko sisältö liitetään tähän kokonaisuudessaan viitteenä.

28

International Application So: PCT

MICROORGANISMS

Oetional Sheet in connection with the microorganism referred to on oagai 32-33. lines 35-37 end ’--3 of the aescriotion A. IDENTIFICATION OF DEPOSIT '

Further deposits ere identified on an additional sheet

Name of depositary wsntunon American Type Culture Collection

Address of depositary institution (including postal code and country]

12301 Perfclawn Drive Rockville. MD 208S2 US

Date of deposit * August 18. 199A Accession Number * 69683

B. ADDITIONAL INDICATIONS fteaw bur* if aot ippicaäit). Thu sdanmix* a oonusued on i seperas j^set I

C. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE ‘ . «we _ D. SEPARATE FURNISHINO OF INDICATIONS · ftmw tot rf as.

The inacanona aateo eetow vna oa tuommed to me tmemstnnei lum later' ISoeofy me genera nature of the mmcatione 0.0..

‘Aceeeawn Nuneer of besoart*) E. □ This-sheet was received with the ImernaoonaJ application when filed (to be checked by the receiving Office)

Ehora Rh/«ra. Paratooai Spedsfet

Recelvsne OfBss - □ The date of receipt (from the applicant) by the imemsoonaJ Bureau ‘ was ^_________ (Authorized Officer)

Porm ^CT/Rö/iSa (January iSgTi-~

Claims (12)

29

1. Mutantti E. colin lämpölabiili enterotoksiiniholotoksiini, tunnettu siitä, että holotoksiinin A-alayksikön arginiini aminohappoasemassa 192 on korvattu glysii- 5 nillä, joka holotoksiini on Y-1 -adrenaalisolukokeella määritettynä oleellisesti vä hemmän toksinen kuin natiivi E. colin lämpölabiili enterotoksiiniholotoksiini ja jolla on immunologista adjuvanttiaktiivisuutta, mutta josta NAD-agmatiini-ribosyylitransferaasikokeella määritettynä puuttuu ADP-ribosyloiva entsyymiaktiivisuus. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mutantti holotoksiini, tunnettu siitä, että sitä koodaa plasmidi pBD95, joka on saatavissa E. coli LTR192G:stä, ATCC tallennusnumero 69683, joka ilmentää E. colin lämpölabiilin enterotoksiinin alayksikkö A:ta sekä alayksikkö B:tä. 15

3. Patenttivaatimuksen 1 mutantti enterotoksiiniholotoksiini käytettäväksi lääkkeessä.

4. Rokotevalmiste, tunnettu siitä että siinä on antigeeni yhdistettynä patenttivaa-20 timuksen 1 mutanttiin holotoksiiniin.

5. Patenttivaatimuksen 4 rokotevalmiste, tunnettu siitä että siinä on lisäksi sopiva kantaja, laimennin tai täyteaine.

6. Patenttivaatimuksen 4 rokotevalmiste, tunnettu siitä että antigeeni on valittu ryhmästä, jonka muodostavat influenssarokote, vesirokkorokote, difteriatoksoidi, tetanustoksoidi, hinkuyskärokote, japaninenkefaliittirokote, yhdistetty hinkuyskä-, kurkkumätä-ja jäykkäkouristusrokote, Lymen tauti -rokote, poliorokote, malariaro-kote, herpesrokote, papilloomavirusrokote, hepatiitti B -rokote, rotavirusrokote,

30 HIV-rokote, Campylobacter-rokote, kolerarokote, enteropatogeeninen E. coli -rokote, enterotoksinen E. coli -rokote, skistosomiaasirokote, tuhkarokkorokote, vi-hurirokkorokote, sikotautirokote, yhdistetty tuhkarokko-, vihurirokko-ja sikotauti-rokote, ja mykoplasmarokote.

7. Koostumus käytettäväksi suojaavan immuunireaktion tuottamiseen patogeenil le isännässä, tunnettu siitä, että se käsittää seoksen, jossa on tehokas määrä antigeeniä ja adjuvanttina tehokas määrä patenttivaatimuksen 1 mukaista koostumusta. 30

8. Varustepakkaus, jota voidaan käyttää suojaavan immuunivasteen tuottamiseen jotakin patogeeniä vastaan isännässä, tunnettu siitä, että se käsittää kaksi komponenttia: (a) tehokkaan määrän antigeeniä ja (b) adjuvanttina tehoavan määrän patenttivaati-5 muksen 1 mutanttia holotoksiinia, jolloin molemmat komponentit ovat suun kautta otettavaksi hyväksyttävässä kantajassa ja mainitut komponentit voidaan antaa joko sen jälkeen, kun ne on sekoitettu toisiinsa, tai erikseen lyhyen ajan kuluessa.

9. Patenttivaatimuksen 7 koostumus tai patenttivaatimuksen 8 varustepakkaus, 10 tunnettu siitä, että antigeeni on johdettu ryhmästä, jonka muodostavat bakteerit, virukset, alkueläimet, sienet, sisälmysmadot ja muut mikrobipatogeenit.

10. Patenttivaatimuksen 7 koostumus tai patenttivaatimuksen 8 varustepakkaus, tunnettu siitä, että antigeeni on johdettu enterotoksisesta bakteeriorganismista. 15

11. Patenttivaatimuksen 10 koostumus tai varustepakkaus, tunnettu siitä, että en-terotoksinen bakteeriorganismi on valittu ryhmästä, jonka muodostavat enterotoksi-set bakteeriorganismit, jotka ilmentävät kolerankaltaisia toksiineja.

12. Patenttivaatimuksen 11 koostumus tai varustepakkaus, tunnettu siitä, että en- terotoksinen bakteeriorganismi on E.coli tai Vibrio cholera. 31