NO317942B1 - Mutant varmelabilt E.coli-enterotoksin-holotoksin, samt vaksinepreparat, sammensetning og kitt inneholdende dette. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en genetisk distinkt mutant varmelabilt E. coli-enterotoksin-holotoksin (LT). Spesielt modifiseres det mutante LT med en enkelt aminosyresubstitusjon som opphever dens inneboende toksisitet, men lar molekylets adjuvansegenskaper forbli intakte. Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot et vaksinepreparat, en sammensetning og et kitt inneholdende det mutante holotoksinet.

Mikrobielle patogener kan infisere en vert ved hjelp av en eller flere mekanismer. De kan komme inn ved en skade i huden indusert av traume, de kan innføres ved vektortransmisjon eller de kan samvirke med en slimhinneoverflate. Hoveddelen av humane patogener starter sykdom ved hjelp av den siste mekanismen, dvs. etter samvirkning med slimhinneoverfJater. Bakterielle og virale patogener som virker ved hjelp av denne mekanismen, bringes først i kontakt med slimhinneoverflaten hvor de kan feste seg og så kolonisere, eller tas opp av spesialiserte absorptive celler (M-celler) i det epitel som ligger over Peyers plakk og andre lymfoide folHkler [Bockman og Cooper, 1973, Am. J. Anat. 136:455-477; Owen et al, 1986, J. Infect. Dis. 153:1108-1118]. Organismer som kommer inn i lymfevevet, kan lett drepes inne i lymfoidfolliklene, for derved å forårsake en potensielt beskyttende immunologisk respons når antigener avleveres til immune celler inne i folliklene (f.eks. Vibrio cholerae). Alternativt kan patogene organismer som kan overleve lokale forsvarsmekanismer, spre seg fra folliklene og deretter forårsake lokal eller systemisk sykdom (dvs. Salmonella spp., poliovirus, rotavirus hos immunkompromitterte verter).

Sekresjonsantistoffene IgA (slgA) rettet mot infiserende organismers spesielle virulensdeterminanter spiller en viktig rolle i den totale slimhinneimmuniteten [Cebra et al., 1986, i: Vaccines 86, Brown et al., utg. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, s. 129-133]. I mange tilfeller er det mulig å hindre den opprinnelige infeksjonen i slimhin-Tieoverflaten ved å stimulere produksjonen av slimhinnenssIgA-nivåer rettet mot relevante virulensdeterminanter hos en infiserende orga-nisme. Sekresjons-IgA kan hindre den første samvirkningen mellom patogenene og slimhinneoverflaten ved å blokkere fastgjøring og/eller kolonisering, nøytralisere overflatevirkende toksiner eller hindre invasjon av vertscellene. Mens det er utført utstrakt forskning på å bestemme rollen til celle-formidlet immunitet og serumantistoff ved beskyttelse mot infiserende midler, er det kjent mindre om reguleringen, induksjonen og utskillelsen av slgA. Parenteralt administrerte, inaktiverte helcelle- og helviruspreparater er effektive i å frembringe beskyttende serum-IgG og hyper- følsomme reaksjoner av forsinket type mot organismer som har en signifikant serumfase i deres patogenese (dvs. Salmonella typhi, hepatitt B). Parenterale vaksiner er imidlertid ikke effektive i å frembringe slgA-responser i slimhinnen og er ineffektive mot bakterier som samvirker med slimhinneover-flater og invaderer ikke (f.eks. Vibrio cholerae). Det erimidlertid nylig vist at parenteralt administrerte vaksiner kan være effektive mot minst ett virus, rotavirus, som primært samvirker med slimhinneoverflater [Conner et al., 1993, J. Virol. 67:6633-6641]. Beskyttelsen antas å oppstå fra transudasjon av antigenspesifikk IgG til slimhinneoverflater for virusnøytralisasjon. Mekanismer som stimulerer både serum- og slimhinneantistoffer er derfor viktige for effektive vaksiner.

Oral immunisering kan være effektiv for induksjon av spesifikke slgA-responser dersom antigenene presenteres for T- og B-lymfocyttene og de hjelpercellene som inneholdes i Peyers-plakk, hvor preferanseutvikling av IgA-B-celler initieres. Peyer-plakk inneholder hjelper-T(TH)-celler som formidler at B-celleisotyper forandres direkte fra IgM-celler til IgA.B-celler. Plakkene inneholder også T-celler som initierer terminal B-celledifferensiering. De preparerte B-cellene migrerer så til de mesenteriale lymfeknutene og underkastes differensiering, kommer inn i den store lymfegangen og så til den generelle sirkulasjonen og påvirker deretter alle kroppens sekresjonsvev, inkludert lamina propria i tarmen og luftveiene. IgA produseres så av de modne plasmacellene, kompleksdannes med membranbundet sekresjonskomponent og transporteres til slimhinneoverflaten der den er tilgjengelig til å samvirke med invaderende patogener [Strober og Jacobs, 1985, i: Advances in host defense mechanisms, vol. 4, Mucosal Immunity, Gallin og Fauci, utg. Raven Press, New York, s. 1-30; Tomasi og Plaut, 1985, i: Advances in host defense mechanisms, vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin og Fauci, utg. Raven Press, New York, s. 31-61]. Eksistensen av dette vanlige slimhinneimmunsystemet forklarer delvis potensialet til levende orale vaksiner og oral immunisering for beskyttelse mot patogene organismer som initierer infeksjon ved først å samvirke med slimhinneoverflater.

En rekke strategier er utviklet for oral immunisering, inkludert bruken av fortynnede mutanter av bakterier (dvs. Salmo-nella spp.), som bærere for heterologe antigener [Cårdenas og Clements, 1992, Clin. Microbiol. Rev. 5:328-342; Clements et al, 1992, i: Recombinant DNA Vaccines: Rationale and Strategy, Isaacson, utg. Marcel Decker, New York, s. 293-321; Clements og Cérdenas, 1990, Res. Microbiol. 141:981-993; Clements og El-Morshidy, 1984, Infect. Immun. 46:564-569], innkapsling av antigener i mikrokuler bestående av poly-DL-laktid-glykolid (PGL), proteinlignende polymerer - proteino-ider [Sanitago et al., 1993, Pharmaceutical Research 10:1243-1247], gelatinkapsler, forskjellige utforminger av liposomer Alving et al., 1986, Vaccine 4:166-172; Garcon og Six, 1993, J. Immunol. 146:3697-3702; Gould-Fogerite og Mannino, 1993, i: Liposome Technology, 2. utg., vol. HI, Gregoriadis (utg.)], adsorpsjon på nanopartikler, anvendelse av lipofile, immune stimuleringskomplekser (ISCOMS) [Mowat og Donachie, 1991, Immunology Today 12:383-385J, og tilsetning av bakterielle produkter med kjente adjuvansegenskaper [Clements et al., 1988, Vaccine 6:269-277; Elson, 1989, Immunology Today 146:29-33; Lycke og Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308; Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281]. De to bakterielle produktene med det største potensialet for å fungere som orale adjuvanser er koleratoksin (CT), fremstilt av forskjellige stammer av V. cholerae, og det varmelabile enterotoksinet (LT), fremstilt fra noen enterotoksigene stammer av Escherichia coli. Selv om LT og CT har mange trekk felles, er disse klart distinkte molekyler med biokjemiske og immunologiske forskjeller som gjør dem unike.

Den omfattende diaré forårsaket av kolera er resultatet av et kraftig eksoenterotoksin som forårsaker aktivering av adenylatsyklase og en etterfølgende økning i intracellulære nivåer av syklisk 3-,5-adenosinmonofosfat (cAMP). Koleraenterotoksinet (CT) er et polymert protein på 84 000 dalton bestående av to immuno-logisk distinkte, ikke-assosierte hovedområder eller domener ("kolera-A" og "kolera-B") [Finkelstein og LoSpalluto, 1969, J. Exp. Med. 130:185-202], Av disse er 56 000 daltonområdet, eller koleragenoidet, ansvarlig for bindingen av toksinet til vertscellemembranreseptoren, GViMI (galaktosyl-N-acetylgalak-tosaminyl-(sialyl)-galaktosyl-glukosyl-ceramid), som finnes på overflaten av i det vesentlige alle eukaryote celler. Koleragenoid består av fem ikke-kovalent forbundne under-enheter, mens A-området (27 000 dalton) er ansvarlig for toksinets forskjellige biologiske effekter.

Forholdet mellom de to underenheter av CT når det gjelder molekylets immunologiske egenskaper har vært kilde til stor debatt. På den ene siden er CT et utmerket immunogen som for-årsaker utvikling av antistoffresponser både hos serum- og slimhinneantitoksin når det gis oralt. Dette funn er ikke nytt ved det at det er kjent at kolerapasienter utvikler økning i titere av antitoksinantistoffer under rekonvalesens fra klinisk kolera

[Finkelstein, 1975, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 69:137-196]. Et nøkkelfunn for dem som undersøkte egenskapene ved denne respons var den observasjon at CT, til forskjell fra de fleste andre proteinantigenene, ikke induserer oral toleranse mot seg selv [Elson og Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897; Elson og Ealding, 1984, J. Immunol. 132:2736-2741]. Dette ble også funnet å være viktig når bare B-underenheten ble tilført mus, en observasjon som ble understøttet av feltforsøkene med koleravaksine i Bangladesh, i hvilke oral immunisering med B-underenhet kombinert med drepte hele

celler forårsaket antitoksin antistoffresponser i både slimhinne så vel som systemisk [Svennerholm et al., 1984, J. Infect. Dis. 149:884-893].

I tillegg til å være et kraftig oralt immunogen har CT en rekke andre rapporterte immunologiske egenskaper. Som angitt ovenfor, observerte Elson og Ealding [Elson og Ealding, 1984,

J. Immunol. 133:2892-2897] at oralt administrert CT ikke induserer toleranse mot seg selv. Samtidig oral administra-sjon av CT med et løselig proteinantigen, nøkkelskjellhemo-cyanin (KLH), resulterte dessuten i utviklingen av sekresjons-IgA-responser mot både CT og KLH og opphevet også induksjonen av oral toleranse mot KLH. Disse funn ble der-etter bekreftet og utvidet av Lycke og Holmgren [Lycke og Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308]. Forvirringen oppstår når det gjøres forsøk på å definere rollen til A- og B-underenhetene av CT når det gjelder molekylets adjuvansegenskaper. De følgende observasjonene, som oppsummert av Elson [Elson, 1989, Immunology Today 146:29-33], er basis for denne for-virringen: CT induserer ikke oral toleranse mot seg selv [Elson og Ealding, 1984, J.

Immunol. 133:2892-2897].

CT-B induserer ikke oral toleranse mot seg selv [Elson og Ealding, 1984, J.

Immunol. 133:2892-2897].

CT kan hindre induksjon av toleranse mot andre anti-gener som det gis samtidig med, og tjener også som et adjuvans for disse antigenene [Elson og Ealding, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897; Lycke og Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308].

CT kan virke som et adjuvans for CT-B [Elson og Ealding 1984, J. Immunol.

133:2892-2897].

Varmeaggregert CT har liten toksisitet, men er et

kraftig oralt immunogen [Pierce et al., 1983, Infect.

Immun. 40:1112-1118].

CT-B kan tjene som en immunologisk "bæ rer" i en tradisjonell haptenbærerutforming [Cebra et al., 1986, i:

Vaccines 86, Brown et al., utg. Cold Spring Harbor

Laboratory, New York, s. 129-133; McKenzie og Halsey,

1984, J. Immunol. 133:1818-1824].

En rekke forskere har fra disse funnene konkludert med at B-underenheten må ha en viss innebygget adjuvansaktivitet. Funnene til Cebra et al. [Cebra et al., 1986, i: Vaccines 86, rown et al., utg. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, s. 129-133], Lycke og Holmgren [Lycke og Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308], og Liang et al. [Liang et al., 1988, J. Immunol. 141:1495-1501] ville argumentere mot denne konklusjonen. Cebra et al. [Cebra et al., 1986, i: Vaccines 86, Brown et al., utg. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, s. 129-133] viste at renset CT-B var effektivt i å øke frekvensen av spesifikke antikoleratoksin-B-celler i Peyers-

plakk når det gis intraduodenalt, men resulterte i motsetning til CT ikke i signifikante antall IgA-engasjerte B-celler. Lycke og Holmgren [Lycke og Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308] sammenlignet CT og CT-B og evnen til å øke immunresponsen i tarmslimhinnen til KLH ved å måle celler som utskilte immunglobulin i lam ina propria hos oralt immuniserte mus. De fant ingen økning i anti-KLH-produserende celler som respons på noen dose av B-underenhet som ble testet i deres system. Endelig fant Liang et al. [Liang et al., 1988, J. Immunol. 141:1495-1501] ingen adjuvanseffekt når CT-B ble administrert oralt i forbindelse med inaktivert Sendaivirus.

Når adjuvansaktivitet er observert for isolert B-underenhet, er det typisk på grunn av en av to grunner. For det første har en tradisjonell fremgangsmåte for fremstilling av B-underenhet vært å underkaste ho lo toksin for dissosiasjonskromatografi med gelfiltrering i nærvær av et dissosieringsmiddel (f.eks. guanidin-HCl eller maursyre). De isolerte underenhetene samles så, og dissosieringsmidlet fjernes. Den B-underenhet som fremstilles ved hjelp av denne teknikken, er alltid forurenset med spormengder av A-underenhet, slik at ved renaturering rekonstitueres en liten mengde holotoksin. Den andre grunnen har å gjøre med definisjonen av en immunologisk bærer. På samme måte som mange andre løselige proteiner kan B-underenhet tjene som en immunologisk bæ rer for presentasjon av antigener til immunsystemet. Dersom disse antigenene er tilstrekkelig små til å være dårlig immunogene, kan de gjøres immunogene i en tradisjonell haptenbærerutforming. Det er likeledes en "teoretisk" immunøkning forbundet med B-underenhet, spesielt for oral presentasjon, ved det at B-underenhet bindes til overflaten av epitelceller og kan immobilisere et festet antigen for prosessering av tarmassosiert lymfoid vev. En hvilken som helst ulempe med denne mekanisme for antigenstabilisering kan imidlertid fjernes ved fordelingen av antigenet over ikke-immunologisk relevante vev, dvs. overflaten av epitelceller i tarmene. I sammenheng med slimhinnemottakeligheten er de immunologisk relevante stillingene Peyers plakk, spesielt for antigenspesifikk, T-celleavhengjg B-celleaktivering [Strober og Jacobs, 1985, i: Advances in host defense mechanisms, vol. 4, Mucosal Immunity, Gallin og Fauci, utg. Raven Press, New York, s. 1-30; Tomasi og Plaut, 1985, i: Advances in host defense mechanisms, vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin og Fauci, utg. Raven Press, New York, s. 31-61; Brandtzaeg, 1989, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146:13-25]. Således foregår hendelsene frem til overgang av isotype fra IgM-celler til IgA-B-celler i Peyers plakk. Antigener som er lokalisert på epitelcelleoverflaten, "kan medvirke til antigenindusert B-cellevekst ved det at de positive lodne epitelcellene av klasse II kan virke som antigenpresenterende celler for T-celleaktivering på sekresjonsstedet, og derved øke cytokinproduksjonen, terminal B-celledifferensiering, økt ekspresjon av sekresjonskomponent og økt ekstern transport av antigenspesifikt IgA [Tomasi, T.B. og Plaut, A.G., 1985, i: Advances in host defense mechanisms, vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin og Fauci, utg. Raven Press, New York, s. 31-61]. Forholdet mellom disse begivenhetene er ikke klart definert for B-underenheten som en bæ rer for andreantigener, og bruk av uttrykket "adjuvans" ville synes upassende for en slik effekt.

Det er klart at molekylets adjuvansegenskap ligger i holotoksinet, i hvilket B-underenheten kreves for reseptorgjenkjennelse og for å lette inntrengning av A-underenheten i cellen. A-underenheten kreves også for adj uvansaktivitet, antakelig som en funksjon av dens ADP-ribosylerende enzymatiske aktivitet og evnen til å øke intracellulæren ivåer av cAMP (se nedenfor). B-underenheten alene kan virke som en bærer for andre antigener ved at den når den konjugeres til disse antigenene, kan de immobiliseres ved prosessering av tarmassosiert lymfoid vev.

Selv om LT og CT har mange trekk felles, er disse klart distinkte molekyler med biokjemiske og immunologiske for-skjeller som gjør dem enestående, inkludert en 20 % forskjell i nukleotid- og aminosyresekvenshomologi [Dallas og Falkow, 1980, Nature 288:499-501]. De to toksinene har samme underenhetsantall og -arrangement, samme biologiske virkningsmekanisme og den samme spesifikke aktivitet i mange in vitro-forsøk [Clements og Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769; Clements et al., 1980, Infect. Immun. 24:91-97].

Det er imidlertid signifikante forskjeller mellom disse molekylene som innvirker ikke bare på deres enterotoksiske egenskaper, men også deres evne til å fungere som adjuvanser. Til å begynne med blir LT til forskjell fra CT produsert av V. cholerae, celleassosiert og frigjøres bare fra E. colt under cellelyse [Clements og Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769]. CT utskilles fra vibrio så snart det er syntetisert og kan lett identifiseres i og renses fra dyrkningssupernatanter. I motsetning til CT er således LT ikke fullt biologisk aktivt når det først er isolert fra cellen. Overensstemmende med A-B-modellen for bakterielle toksiner krever LT proteolyse og disulfidreduksjon for å bli helt aktivt. I fravær av proteolytisk behandling er den enzymatisk aktive A]-delen ikke i stand til å dissosiere fra A2-komponenten og kan ikke nå dens målsubstrat (adenylatsyklase) på tarmepitelcellens basolaterale overflate. Dette gjelder også for CT, men proteaser i dyrkningssupernatanten, som toksinet eksponeres for under rensing, utfører proteolysen. Siden LT ikke er fullstendig biologisk aktivt, er det vanskelig å identifisere under rensing ved bruk av biologiske forsøk in vitro, som f.eks. Y-l-adrenalcelleforsøket eller permeabilitetsfaktorforsøket.

Denne forskjell i aktivering av det isolerte materialet resulterer i forskjeller i responsterskler for LT og CT i biologiske systemer. CT induserer f.eks. påvisbar nettofluidsekresjon i musetarm ved en dose på 5-10 ug. LT induserer påvisbar nettosekresjon i musetarm på nivåer over 100 ug. den underbundne ileumslyngen hos kanin er forskjellen dramatisk og klar. Hos primater er det dessuten vist at LT ikke induserer fluidsekresjon ved noen dose som er testet opptil 1 mg. Dette er 200 ganger mengden av CT som er rapportert å indusere positiv fluidbevegelse hos mennesker. Når LT eksponeres for proteolytiske enzymer med trypsinlignende spesifisitet, kan molekylet ikke skilles fra CT i noe biologisk forsøkssystem. Dette blir klart påvist av Clements og Finkelstein [Clements og Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769],

I tillegg til de ovenfor rapporterte forskjellene har LT en uvanlig affinitet for karbohydratholdige matrikser. LT med en molekylvekt på 90 000 elueres spesielt fra Sephadex-kolonner (glukose) med en tilsynelatende molekylvekt på 45 000 og fra Agarose-kolonner (galaktose) med en tilsynelatende molekyl-vekt på 0. Det vil si at det bindes til galaktoseholdige matrikser og kan elueres fra disse matrikser i ren form ved anvendelse av galaktose. LT bindes ikke bare til agarose i kolonner som anvendes for rensing, men, noe som er viktigere, til andre biologiske molekyler inneholdende galaktose, inkludert glykoproteiner og lipopolysakkarider. Denne lektinlignende bindingsegenskap for LT resulterer i en bredere reseptorfordeling på pattedyrceller for LT enn for CT, som bindes bare til Gmi. Dette kan delvis forklare de rapporterte forskjeller i evnene hos disse to molekylene til å indusere forskjellige hjelper-T-lymfocyttresponser [McGhee et al., 1994, Mucosal Immunology Update, Spring 1994, Raven Press,New York, s. 21].

I disse undersøkelsene som er rapportert av McGhee et al. [McGhee et al., 1994, Mucosal Immunology Update, Spring 1994, Raven Press, New York, s. 21], ble det vist at oral immuni-sering av mus med vaksiner som f.eks. tetanustoksoid (TT) med CT som et slimhinneadjuvans selektivt induserer celler av T2-typen i Peyers plakk og milt, slik det manifesteres av TH-celler som produserer IL-4 og IL-5, men ikke IL-2 eller INF-gamma. [For en mer fullstendig oversikt over cytokinnettverket se Arai et al., 1990, Ann. Rev. Biochem. 59:783-836.] Det er viktig at når CT ble anvendt som et slimhinneadjuvans. øker det også antigenspesifikke IgE- responser i tillegg til IgA-responsen. Slik økning av IgE-responser setter sikkerheten ved CT somlet slimhinneadjuvans i alvorlig fare på grunn av prospektet ved å indusere hypersensitivitetsreaksjoner av den umiddelbare typen. I motsetning til dette induserer LT både TH1- og TH2-celler og overveiende antigenspesifikke IgA-responser uten IgE-responser når det anvendes som et oralt administrert slimhinneadjuvans.

De to molekylene har også mange immunologiske forskjeller, som vist i immundiffusjonsundersøkelser [Clements og Finkelstein, 1978, Infect. Immun. 21:1036-1039; Clements og Finkelstein, 1978, Infect Immun. 22:709-713], in vitro-nøytralisasjonsundersøkelser og den partielle beskyttelsen mot LT-assosiert E. coli-diaré, i frivillige som mottar B-underenhetshelcellekoleravaksine [Clements et al., 1988, J. Infect. Dis. 158:372-377]. Totalt sett viser disse funn at LT oe CT er unike molekyler, på tross av deres tilsynelatende likheter, og at LT er et praktisk oralt adjuvans mens CT ikke er det.

Demonstrasjonen av LTs adjuvansegenskaper kom frem ved en undersøkelse av påvirkningen av LT på utvikling av toleranse mot oralt administrerte antigener av en av foreliggende oppfinnere. Det var ikke klart om LT også ville influere på induksjonen av oral toleranse eller ikke, eller oppvise adjuvanseffektene som er vist for CT, tatt i betraktning de observerte forskjeller mellom de to molekylene. Foreliggende oppfinnere undersøkte derfor en rekke parametere, inkludert effekten av LT og oral toleranse overfor OVA og rollen til de to underenhetene av LT i den observerte respons, effekten av å variere tidspunkt og administrasjonsmåte for LT, effekten av tidligere eksponering for OVA og LTs evne til å influere toleranse mot OVA, anvendelsen av LT som et adjuvans med to ubeslektede antigener og effekten av immuniseirngsmåten på anti-OVA-responser. De resultater som er oppnådd ved disse undersøkelsene [Clements et al., 1988, Vaccine 6:269-277; Clements et al., 1988, abstrakt nr. B91, 88th Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol.], er oppsummert nedenfor: 1 Samtidig administrasjon av LT med OVA ble vist å hindre induksjon av toleranse mot OVA og å øke serumanti-OVA-IgG-respons 30-90 ganger sammenlignet med henholdsvis OVA-preparerte og PBS-preparerte dyr. Denne effekt ble bestemt å være en funksjon av den enzymatisk aktive A-underenheten av toksinet, siden B-underenheten alene ikke var i stand til å påvise toleranseinduksjon. 2 Dyr tilført LT med OVA etter en opprinnelig OVA-preparering utviklet et signifikant lavere serum-IgG og anti-OVA-respons i slimhinne-IgA enn de som fikk tilført LT med OVA i den opprinnelige immuniseringen, hvilket indikerer at tidligere eksponering for antigenet reduserer effektiviteten av LT til å påvirke toleranse, og dets evne til å virke som et adjuvans. LT var ikke i stand til å hemme toleranse så snart det var etablert. Dette ble også funnet å være tilfellet for CT år dyr ble preimmunisert med OVA før oralt ovalbumin pluss CT, og gir en viss innsikt i den nyttige observasjonen at antistoffresponser til diettantigener

som ikke er målt, ikke økes når disse adjuvanser anvendes.

3 Serum-IgG- og slimhinne-IgA-responser hos dyr som mottar LT i bare ett enkelt tilfelle, som er etter den første eksponeringen til antigen, var ekvivalente med responser etter tre OVA/LT-prepareringer, hvilket indikerer at tilbøyelighet til mottakelighet forekommer tidlig og ved

første eksponering for antigen. Det ble også vist at retningen av responsen til enten i hovedsak serum-IgG eller slimhinne-IgA kan

reguleres ved enten å administrere en parenteral forsterkerdose eller ikke. 4 Samtidig administrasjon av LT med to løselige proteinantigener resulterer i utvikling av serum- og slimhinneantistoffer mot begge antigener dersom dyret ikke har noen tidligere immunologisk erfaring med noen av dem. Dette var et viktig funn, siden en mulig anvendelse av LT som et adjuvans ville være for utviklingen av slimhinneantistoffer mot komplekse antigener, slik som f.eks. drepte bakterier eller virus, hvor evnen til å svare på multiple antigener ville være viktig.

Undersøkelser av Tamura et al. [Tamura et al., US-patent nr. S 182 109] viste at LT og/eller CT administrert intranasalt økte antistofftiteren mot et samadministrert antigen. Det 1 res imidlertid ikke noe sted i nevnte patent at disse toksiner kan indusere en beskyttende immunrespons når de administreres oralt.

LT har tidligere vist signifikant immunregulerende potensial, både som et middel for å hindre induksjon av toleranse for spesifikke antigener og som et adjuvans for oralt administrerte antigener, og det fremkaller produksjon av både serum-IgG og slimhinne-IgA mot antigener som det leveres med. Dette åpner muligheten for et effektivt immuniseringsprogram mot en rekke patogener innbefattende den orale administrasjonav drepte eller fortynnede midler eller relevante virulens-determinanter av spesifikke midler. Det faktum at dette "toksin" kan stimulere en netto luminal sekresjonsrespons når det spaltes proteolytisk, som f.eks. av tarmproteaser, eller når det administreres i høye nok konsentrasjoner oralt, kan imidlertid hindre undersøkelse av dets potensial eller hindre dets bruk under passende betingelser. Dette problemet kunne løses dersom LT kunne "detoksifiseres" uten å minske mole-kylenes adjuvansegenskaper. For å forstå hvordan dette kan gjennomføres, er det nødvendig ytterligere å analysere virkningsmekanismen til LT og CT og det strukturelle og funksjonelle slektskapet mellom disse molekylene. Som angitt tidligere, syntetiseres både LT og CT som multiunderenhetstoksiner med A- og B-komponenter. Etter den opprinnelige sam-virkningen av toksinet med vertscellemembranreseptoren letter B-området inntrengningen av A-underenheten gjennom celle-membranen. Ved tiolreduksjon dissosieres denne A-komponenten i to mindre polypeptidkjeder. Den ene av disse, Ai-delen, katalyserer ADP-ribosyleringen av det stimulerende GTP-bindende proteinet (Gs) i adenylatsyklaseenzymkomplekset og den basolaterale overflaten av epitelcellen, og dette resulterer i økende intracellulære nivåer av cAMP. Den resulterende økning av cAMP forårsaker sekresjon av vann og elektrolytter til tynntarmen ved samvirkning av to cAMP-følsomme ionetransportmekanismer omfattende 1) NaCl-kotransport over de lodne epitelcellenes børstegrense, og 2) elektrogen Na<+->avhengig Cl"-sekresjon av kryptceller [Field, 1980, i: Secretory diarrhea, Field et al., utg. Waverly Press, Baltimore, s. 21-30]. A-underenheten er også den hoveddel som er forbundet med immunøkning av disse toksiner. Denne underenheten blir så et sannsynlig mål for manipulering for å dissosiere molekylenes toksiske og immunologiske funksjoner. En nylig rapport fra Lycke et al. [Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281] gjør det klart at forandringer som påvirker toksinets ADP-ribosylerende, enzymatiske aktivitet og forandrer evnen til å øke intracellulære nivåer av cAMP, også hindrer molekylet fra å fungere som et adjuvans. Derfor må en annen fremgangsmåte for detoksifisering undersøkes.

Domenighini et al (WO 93/13202) beskriver et mutant varmelabilt E. cø/i-entrotoksin med en substitusjon av arginin ved aminosyren 192 i A-subenheten med aminosyren asparagin ("R192N"). I motsetning til foreliggende oppfinnelse som angår et nytt mutant "R192G" varmelabilt E. cø/i-enterotoksin som har vesentlig redusert toksisitet samtidig som adjuvansaktiviteten er bibeholdt, har det mutante toksinet ifølge Domenighini et al den samme toksisiteten som det varmelabile villtype toksinet.

Burnette et al. beskriver koleratoksiner og ikke mutante varmelabile E. coli-enterotoksiner. Burnette et al. beskriver mutagenese i aminosyrerestene i posisjon arginin-7, histidin-44, histidin-70, glutaminsyre-112, tyrosin-6, asparginsyre-9, prolin-185, cystin-187, arginin-146 og tryptofan-179 i koleratoksinet. Burnette et al. beskriver således mutante cholera toksiner som antigener.

Loosmore et al., Infection & Immunity, 1990, vol. 58(11) side 3653-3662 beskriver et detoskifisert kikhostetoksin, til forskjell fra det mutante varmelabile E. coli-enterotoksinet ifølge foreliggende oppfinnelse som har adjuvansaktivitet, har kikhostetoksinanalogen, på lik linje med villtype kikhostetoksinet ingen adjuvansaktivitet.

Tamura et al., (GB 2 217 600) beskriver villtype ADP-ribosylerte toksiner og angår ikke mutante toksiner med redusert toksisitet.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende observasjon at en mutant form av LT, som har tapt sin toksiske effekt og er uten ADP-ribosyltransferaseaktivitet, fortsatt beholder sin aktivitet som et immunologisk adjuvans. Den mutante formen av LT skiller seg fra den ville typen ved en enkelt aminosyreerstatning, Argi92-Glyi92, hvilket gjør en trypsinsensitiv stilling insensitiv. Tapet av den proteo-lytiske stillingen hindrer den proteolytiske behandlingen av A-underenheten til dens toksiske form. Nativt LT er ikke toksisk når det først isoleres fra bakterien, men har poten-sial til å bli helt toksisk når det eksponeres for protease, som f.eks. de som finnes i pattedyrtarmen. Den mutante formen av LT har ikke lenger potensial til å bli toksisk på grunn avproteolytisk aktivering. Dette mutante LT kalt mutant varmelabilt E. coli-enterotoksin-holotoksin, heretter forkortet mLT bibeholder evnen til å øke et dyrs immunrespons (f.eks. IgG, IgA) på et antigen som ikke er i slekt med LT eller mLT, uten toksiske bivirkninger. Eksperimentelle data viser at mLT er nyttig som et adjuvans for oralt administrerte antigener. En slik administrasjon resulterer i produksjonen av serum-IgG og/eller slimhinne-sIgA mot det antigen med hvilket mLT er levert.

Foreliggende oppfinnelse angår således et mutant varmelabilt E. co/z-enterotoksin-holotoksin, kjennetegnet ved at et arginin ved aminosyreposisjonen 192 i A-subenheten av holotoksinet er erstattet med glysin, der det mutante varmelabile E. co/i-enterotoksin-holotoksin er mer enn 1000 ganger mindre toksisk enn det native varmelabile E. coli-enterotoksin-holotoksinet slik det måles i Y-l-binyrecelleanalysen og som har immunologisk adjuvansaktivitet men mangler ADP-ribosylerende enzymaktivitet slik det måles ved NAD-Agmatin ADP-ribosyltransferaseanalysen.

En foretrukken utførelsesform angår et mutant holotoksin kjennetegnet ved at det mutante varmelabile E. cc/i-enterotoksin-colotoksin kodes av plasmid pDB95 som oppnås fra/T. coli LT RI92 G med ATCC aksesjonsnr. 69683, som uttrykker både subenhet A og subenhet B av det varmelabile E. cø/i-enterotoksinet.

Foreliggende oppfinnelse kan forstås mer fullstendig ved å henvise til den følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen, eksempler på spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen og de medfølgende figurene, hvor: Figur 1 viser et skjematisk diagram av plasmidet pBD94, som koder for underenhetene A og B under kontroll av /ac-promotoren. Plasmid pBD9S inneholder den enkle baseerstatningen ved aminosyrerest 192 i underenhet A, som koder for Gly heller enn Arg, som beskytter leserammen, men eliminerer den proteolytiske stillingen. Aminosyresekvensen tilsvarende om-rådet av trypsinsensitivitet og stillingen for aminosyreerstatningen Argi92-Glyi92 vises.

Figur 2 viser grafisk den doseavhengige økningen i nivåer av

ADP-ribosylagmatin som en funksjon av økende mengder av CT.

Figur 3 viser fluidakkumulering etter mating av 125 fig av nativt LT, men ikke etter mating av 125 ug mLT til mus. Tarmkroppsforholdet defineres som tarmvekten dividert med den gjenværende kroppsvekten. Figur 4 viser mLTs evne til å virke som et immunologisk adjuvans. Figur 4A viser mLTs evne til å indusere en serum-IgG-respons til OVA. Figur 4B viser mLTs evne til å indusere en slimhinne-sIgA-respons til OVA. Figur 5 er en forsøksdemonstrasjon på at mLT bibeholder evnen til å hindre induksjon av oral toleranse til LT. Figur 5 A viser mLTs evne til å indusere en serum-IgG-respons til LT. Figur 5B viser mLTs evne til å indusere en slimhinne-sIgA-respons til LT.

Det modifiserte toksinet er en form av det varmelabile enterotoksinet (LT) i E. coli som ved genetisk bearbeidelse har tapt sin trypsinsensitive stilling for å gjøre molekylet ikke-toksisk, men allikevel uventet bibehol-der sin evne til å virke som et immunologisk adjuvans. Dette mutante LT kalles heretter "mLT". Oppfinnelsen er basert på den oppdagelse at mLT er like effektivt som LT som et immunologisk adjuvans, et uventet og overraskende resultat. mLT har ikke lenger den enzymatiske aktiviteten for ADP-ribosylering fordi A-underenheten ikke lenger kan behandles proteolytisk. I motsetning til publiserte undersøkelser av Lycke og kolleger, som gjør det klart at forandringer som påvirker LTs ADP-ribosylerende aktivitet også hindrer molekylet fra å fungere som et immunologisk adjuvans [Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281], bibeholder det her beskrevne mLT aktivitet som et immunologisk adjuvans, selv om det, som vist i eksemplene, ikke har ADP-ribosylerende aktivitet.

Den nye mutante formen av det varmelabile enterotoksinet i E. coli, mLT, som er beskrevet her, oppfører seg som et adjuvans og fremmer produksjonen av både serum-IgG og slimhinne-sIgA mot antigener med hvilke det er levert. Nytten av denne overraskende oppdagelsen er at en adjuvanseffektiv mengde mLT kan anvendes i et effektivt immuniseringsprogram mot en rekke patogener, omfattende den orale administrasjonen av en effek-tiv mengde mLT-adjuvans i blanding med drepte eller fortynnede patogener eller relevante virulensdeterminanter av spesifikke patogener, uten fare for de reelle eller potensielle, toksiske bivirkninger som er forbundet med oral administrasjon av CT eller LT.

Foreliggende oppfinnelse erstatter teknikkens stand ved at foreliggende oppfinnelse har en rekke immunologiske anvendel-ser hvor CT, LT eller underenheter av CT eller LT kan ha vært anvendt, men hvor det med mLT ikke er noen reelle eller potensielle bivirkninger, slik som diaré, forbundet med anvendelsen. I motsetning til LT, som selv om det ikke er toksisk når det først isoleres fra bakterien har potensial til å bli helt toksisk når det eksponeres for proteaser, som f.eks. de som finnes i pattedyrtarmen, har mLT ikke potensial til å bli toksisk på grunn av proteolytisk aktivering.

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er som en komponent i en vaksine mot enterotoksiske organismer som uttrykker koleralignende toksiner. Foreliggende oppfinnere har vist at mLT ikke er gjenstand for oralt indusert immuntoleranse når det administreres (se nedenfor), mLT kan derfor fungere og er svært ønsket som en komponent i vaksiner som er rettet mot enterotoksiske organismer. Aktuell teknologi til-veiebringer vaksiner mot koleralignende toksin som uttrykker organismer inneholdende drepte hele celler og B-underenheten av toksinet. Ved å erstatte B-underenheten med mLT i vaksinen forbedres vaksinen på to forskjellige måter. For det første vil mLT, som har både A- og B-underenheter, nå indusere en immunrespons ikke bare til B-underenheten, men til A-underenheten også. Dette tilveiebringer flere epitoper for effek-tiv nøytralisering. For det andre vil adj uvansakti vi teten som er innebygget i mLT, øke immunresponsen mot den drepte helcellekomponenten i vaksinen.

Andre forskere [Hase et al, 1994, Infect. Immun. 62:3051-3057] har videre vist at A-underenheten, som er modifisert slik at det ikke lenger er toksisk ved å forandre den aktive stillingen i den ADP-ribosylerende enzymatiske aktiviteten (i motsetning til den proteolytiske stillingen som er gjenstand for foreliggende oppfinnelse), kan indusere en immunrespons mot A-underenheten av vill type. Den A-underenheten som er modifisert slik, mangler imidlertid immunologisk adjuvansaktivitet og er derfor mindre ønskelig som en vaksinekomponent enn mLT.

Siden antistoffer mot mLT kryssreagerer med LT og CT, kan imidlertid mLT anvendes

i vaksiner rettet mot mange typer av enterotoksiske, bakterielle organismer som uttrykker koleralignende toksiner, som f.eks. Escherichia spp. og Vibrio spp.

LT-toksin av vill type kodes på et naturlig forekommende plasmid funnet i stammer av enterotoksigent E. coli som er i stand til å produsere dette toksinet. Foreliggende oppfinnere hadde tidligere klonet LT-genet fra et humant isolat av E. coli betegnet H10407. Denne subklon består av et 5,2 kb DNA-fragment fra enterotoksinplasmidet av Hl0407 innført i Pstl-stillingen i plasmid pBR322 [Clements et al., 1983, Infect. Immun. 40:653]. Dette rekombinante plasmid, betegnet pDF82, er karakterisert i stor utstrekning og uttrykker LT under kontroll av den native LT-promotor. Det neste trinnet i denne prosessen var å plassere LT-genet under kontroll av en sterk promotor, i dette tilfellet lac-promotoren, på plasmid pUC18. Dette ble gjennomført ved å isolere genene for LT-A og LT-B separat og rekombinere dem i en kassett i vektorplasmidet. Dette var et viktig trinn fordi det tillot rensing av rimelige mengder LT og oppnådde mutanter for etterfølgende analyse. Dette plasmidet, betegnet pBD94, vises diagrammatisk i figur 1.

Både CT og LT syntetiseres med en trypsinsensitiv peptidbinding som forener Ai- og A2-delene. Denne peptidbindingen må være knekket for at molekylet skal være "toksisk". Dette gjelder også for difteritoksinet, det prototypiske A-B-toksinet, og for en rekke andre bakterielle toksiner. Dersom Ai-A2-bindingen ikke fjernes, enten ved hjelp av bakterielle proteaser eller tarmproteaser i tarmens hulrom, kan ikke Al-delen nå sitt mål og den basolaterale overflaten av tarmens epitelcelle. I motsetning til CT er ikke LT helt biologisk aktivt når det først er isolert fra cellen. LT krever også proteolyse for å være helt aktivt, og den proteolytiske aktiveringen foregår ikke inne i bakterien. Derfor ville en måte å forandre molekylets toksisitet uten å påvirke den ADP-ribosylerende, enzymatiske aktiviteten være å fjerne de trypsinsensitive aminosyrene som forener Aj-og A2-komponentene i A-underenheten ved genetisk manipulering. Dersom molekylet ikke kan spaltes proteolytisk, vil det ikke være toksisk. Fagmannen ville forutse at molekylet imidlertid skulle bibeholde dets ADP-ribosylerende, enzymatiske aktivitet og som følge derav dets adjuvansfunksjon.

Figur 1 viser sekvensen av det området som er motsatt disulfidet og som skiller Ar og A2-delene. Inne i dette området er det en enkelt argininrest som antas å være den spaltningsstilling som er nødvendig for å aktivere molekylets toksiske egenskaper. Dette området ble endret ved stillingsrettet mutagenese på en slik måte at molekylet gjøres innsensitivt for proteolytisk fordøyelse og derfor ikke-toksisk.

Stillingsrettet mutagenese gjennomføres ved hybridisering til enkeltstrenget DNA et syntetisk oligonukleotid som er komplementært til det enkeltstrengede templatet, bortsett fra et område med mistilpasning nær senteret. Det er dette området som inneholder den ønskede nukleotidforandring eller de ønskede nukleotidforandringene. Etter hybridisering med den enkeltstrengede mål-DNA forlenges oligonukleotidet med DNA-polymerase for å danne en dobbeltstrenget struktur. Merket forsegles så med DNA-ligase, og dupleksstrukturen trans-formeres til en E. co/i-vert. Det teoretiske utbyttet av mutanter ved bruk av denne fremgangsmåten er 50 % på grunn av den semikonservative DNA-replikasjonsmåten. I praksis er utbyttet meget lavere. Det er imidlertid en rekke fremgangs-måter tilgjengelige for å forbedre utbyttet og velge oligonukleotidrettede mutanter. Det anvendte systemet utnyttet et andre mutagent oligonukleotid for å skape endrede restrik-sjonsstillinger i en dobbel mutasjonsstrategi.

Det neste trinnet var å innføre en annen aminosyre istedenfor Arg (dvs. GGA = Gly erstatter AGA = Arg), for således å be-vare leserammen mens den proteolytiske

stillingen elimineres. mLT ble så renset ved agaroseaffinitetskromatografi for en mutant (pBD95) som var bekreftet med sekvensering. Altema-tive fremgangsmåter for rensing vil være selvsagte for fagmannen. Dette mutant-LT, betegnet LT(Ri92g), ble så undersøkt ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese for modifikasjon av den trypsinsensitive bindingen. Prøver ble undersøkt med og uten eksponering for trypsin og sammenlignet med nativt (umodiflsert) LT. mLT dissosierer ikke til Ai og A2 når det inkuberes med trypsin, og indikerer derved at sensitivi-teten for protease er fjernet.

Overensstemmende med foreliggende oppfinnelse kan mLT administreres i forbindelse med et hvilket som helst biologisk relevant antigen og/eller en vaksine, slik at økt immunrespons for nevnte antigen og/eller vaksine oppnås. I en foretrukket utførelsesform administreres mLT og antigen samtidig i et farmasøytisk preparat omfattende en effektiv mengde mLT og en effektiv mengde antigen. Administrasjonsmåten er oral. De respektive mengder av mLT og antigen vil variere, avhengig av identiteten til det antigen som anvendes og de arter av dyr som skal immuniseres. I en utførelsesform følges den første administrasjonen avjnLT og antigen av en forsterkning med det relevante antigenet. I en annen utførelsesform gis ingen forsterker. Tidspunktene for forsterkning kan variere, avhengig av antigenet og de arter som behandles. Modifikasjonene i doseringsområdet og tidspunkter for for-sterkning for en hvilken som helst gitt art og hvilket som helst gitt antigen kan lett bestemmes ved rutineforsøk. Forsterkeren kan bestå av antigen alene eller i kombinasjon med mLT. Administrasjonsmåten for forsterkningen kan være enten oral, nasal eller parenteral. Dersom mLT anvendes i forsterkeren, er administrasjonen imidlertid fortrinnsvis oral.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre vaksinepreparat kjennetegnet ved at det omfatter et antigen i kombinasjon med det mutante holotoksin og eventuelt en egnet bærer, fortynningsmiddel eller eksipiens.

Vaksinepreparatet ifølge foreliggende oppfinnelse er ment for bruk både hos umodne og modne virveldyr, spesielt fugler, pattedyr og mennesker. Foretrukne utførelsesformer er vaksinepreparater som omfatter antigener valgt fira gruppene patogene stammer av bakterier { Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisserian meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinwn, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemo- philus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylo- bacter ( Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei. Salmonella typhimurium, Treponema

pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borreli avincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.) ; patogene sopper ( Coccidioides immitis, Aspergillus jumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum) ; protozoer ( Entomoeba histolytica, Trichomonas tenås, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria) ; eller

innvollsorm ( Enterobius vermicularis. Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella mspiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium og hakeormer), enten presentert for immunsystemet i helcelleform eller delvis isolert fra mediekulturer beregnet på å dyrke nevnte organismer som er vel kjente på fagområdet, eller beskyttende antigener fra nevnte organismer oppnådd ved genetiske behandlingsteknikker eller ved kjemisk syntese.

Andre eksempler på relevante antigener ville være patogene virus som poxvirus herpesvirus, herpes simplexvirus 1, herpes simplexvirus 2, adenovirus, papovavirus, enterovirus, picomavirus, parvovims, reovirus, retrovirus, influensavirus, parainfluensavirus, kusma, meslinger, respiratorisk syncytialvirus, røde hunder, arbovirus, rhabdovirus, arenavirus, hepatitt A-virus, hepatitt B-virus, hepatitt C-virus, hepatitt E-virus, non-A/non-B-hepatittvirus, rhinovirus, koronavirus og rotavirus og enten presentert for immunsystemet i sin helhet eller delvis isolert fra mediekulturer beregnet på å dyrke slike virus som er vel kjente på fagområdet, eller beskyttende antigener derfrå oppnådd ved genetiske behandlingsteknikker eller ved hjelp av kjemisk syntese.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en sammensetning omfattende en vaksine og det mutante holotoksin ifølge oppfinnelsen. Foretrukne utførelsesformer er sammensetninger der relevante antigener omfatter vaksiner. Eksempler på slike vaksiner omfatter influensavaksine, kikhostevaksine, difteri- og tetanustoksoid kombinert med kikhostevaksine, hepatitt A-vaksine, hepatitt B-vaksine, hepatitt C-vaksine, hepatitt E-vaksine, japansk encefalittvaksine, herpesvaksine, meslingvaksine, røde hunder-vaksine, kusmavaksine, blandingsvaksine mot meslinger, kusma, kikhoste og røde hunder, papillomvirusvaksine, parvovirusvaksine, respiratorisk-syncytialvirusvaksine, Lyme-sykdomsvaksine, poliovaksine, malariavaksine, vannkoppevaksine, gonorévaksine, HIV-vaksine, schistosomiasisvaksine eller bilharziavaksine, rotavaksine, mykoplasmavaksine, pneumokokkvaksine, meningokokkvaksine og andre. Disse kan fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Generelt omfatter slike vaksiner enten hele organismen eller virus dyrket og isolert ved hjelp av teknikker som er velkjente for fagmannen, eller omfatter relevante antigener av disse organismer eller virus som er fremstilt ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese. Produksjonen av dem illustreres ved, men er ikke begrenset til, som følger: Influensavaksine: en vaksine omfattende det hele eller en del av hemagglutinin, neuraminidase, nukleoprotein og matriks-protein som kan oppnås ved å rense et virus som er dyrket i embryonerte egg med eter og detergent, eller ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese.

Kikhostevaksine: en vaksine omfattende det hele eller en del av kikhostetoksin, hemagglutinin og K-agglutin som er oppnådd fra avirulent toksin med formalin som er ekstrahert ved utsalting eller ultrasentrifugering fra kulturvæsken eller bakterieceller av Bordetella pertussis, eller ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese.

Difteri- og tetanustoksoid kombinert med kikhostevaksine: en vaksine blandet med kikhostevaksine, difteri- og tetanustoksoid.

Japansk encefalittsvaksine: en vaksine omfattende det hele eller en del av et antigent protein som er oppnådd ved dyrkning av et virus intracerebralt i mus og rensing av viruspartiklene ved sentrifugering eller etylalkohol og inaktivering av den samme, eller ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese.

Hepatitt B-vaksine: en vaksine omfattende det hele eller en del av et antigent protein som oppnås ved isolering og rensing av HBs-antigen ved utsalting eller ultrasentrifugering, oppnådd fra hepatittbærende blod eller ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese.

Meslingevaksine: en vaksine omfattende det hele eller en del av et virus som er vokst i dyrkede kyllingembryoceller eller embryonerte egg, eller et beskyttende antigen oppnådd ved genetisk behandling eller kjemisk syntese.

Røde hunder-vaksine: en vaksine omfattende det hele eller en del av et virus som er vokst i dyrkede kyllingembryoceller eller embryonerte egg, eller et beskyttende antigen oppnådd ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese.

Kusmavaksine: en vaksine omfattende det hele eller en del av et virus som er vokst i dyrkede kaninceller eller embryonerte egg, eller et beskyttende antigen oppnådd ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese.

Blandingsvaksine av meslinger, røde hunder, kikhoste og kusma: en vaksine fremstilt ved blanding av mesling-, røde hunder-, kikhoste- og kusmavaksiner. Rotavirusvaksine: en vaksine omfattende det hele eller en del av et virus i dyrkede MA 104-celler eller isolert fra pasientens feces, eller et beskyttende antigen oppnådd ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese. r,

Mykoplasmavaksine: en vaksine omfattende det hele eller en

del av mykoplasmaceller som har vokst i et flytende dyrk-ningsmedium for mykoplasma, eller et beskyttende antigen oppnådd ved genetiske behandlingsteknikker eller kjemisk syntese.

De betingelser for hvilke effektiv prevensjon kan oppnås ved hjelp av foreliggende metode, vil være selvsagte for fagmannen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en sammensetning for anvendelse til frembringelse av en immunrespons mot et patogen kjennetegnet ved at det omfatter en blanding av en effektiv mengde av et antigen og en adjuvanseffektiv mengde av det mutante holotoksin.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å blande de ovenfor illustrerte antigener og/eller vaksiner med mLT i ønsket forhold. Fremstillingen skal gjennomføres strengt aseptisk, og hver komponent skal også være aseptisk. Pyrogener eller allergener skal naturlig-vis fjernes så fullstendig som mulig. Antigenpreparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved å fremstille antigenet per se og mLT separat.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et kitt nyttig for å frembringe en beskyttende immunrespons hos en vert mot et patogen kjennetegnet ved at det omfatter to komponenter: (a) en effektiv mengde av et beskyttende antigen fra en bakterie, sopp, protozo, innvollsorm eller viruspatogen, og (b) en adjuvanseffektiv mengde av det mutante holotoksin. I bruk kan settets komponenter enten først blandes sammen og så administreres oralt eller komponentene kan administreres oralt skilt fra hverandre i løpet av en kort tid.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan kombineres med enten en flytende eller fast farmasøytisk bærer, og blandingene kan foreligge i form av tabletter, kapsler, pulvere, granuler, suspensjoner eller løsninger. Blandingene kan også inneholde egnede konserveringsmidler, fargestoffer og smaksstoffer, eller midler som gir langsom frigjøring. Potensielle bærere som kan anvendes ved fremstillingen av de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen, omfatter, men er ikke begrenset til, gelatinkapsler, sukkere, cellulosederivater, som f.eks. natriumkarboksymetylcellulose, gelatin, talk, magnesiumstearat, vegetabilsk olje, som f.eks. jordnøttolje osv., glyserol, sorbitol, agar og vann. Bærere kan også tjene som et bindemiddel for å lette tablettering av blandingene for hensiktsmessig oral administrasjon.

Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan bibeholdes i en stabil lagringsform for lett bruk ved lyofilisering eller ved andre midler som er kjent for fagmannen. For oral administrasjon kan vaksineblandingen rekonstitueres som en suspensjon i bufret saltløsning, melk eller et hvilket som helst annet fysiologisk forenlig flytende medium. Mediet kan fremstilles mer smakelig ved tilsetning av egnede farge- og smaksstoffer etter ønske.

Administrasjon av vaksinepreparatblandingene kan foregå etter en oral dosering av en effektiv mengde av et magesyrenøytraliserende middel. Mens mange forbindelser kan anvendes for dette formål, foretrekkes natriumbikarbonat. Alternativt kan vaksineblandingene avleveres i enterisk belagte kapsler (dvs. kapsler som oppløses først etter å ha passert gjennom magen).

EKSEMPLER

De følgende eksemplene gis bare for illustrasjon og er ikke ment å begrense oppfinnelsens område på noen måte.

Konstruksjon av mLT

LT-toksin av vill type kodes på et naturlig forekommende plasmid som er funnet i stammer av enterotoksigent E. coli, som kan produsere dette toksinet. Foreliggende oppfinnere hadde tidligere klonet LT-genet fra et humant isolat av E. coli, betegnet Hl0407. Denne subklon består av et 5,2 kb DNA-fragment fra enterotoksinplasmidet av Hl0407 innført i Pstl-stillingen i plasmid pBR322 [Clements et al., 19S3, Infect. Immun. 40:653]. Dette rekombinante plasmid, betegnet pDF82, er uttømmende karakterisert og uttrykker LT under kontroll av den native LT-promotor. Det neste trinnet i denne prosessen var å plassere LT-genet under kontroll av en sterk promotor, i dette tilfellet lac-promotoren, på plasmid pUC18. Dette ble gjennomført ved å isolere genene for LT-A og LT-B separat og rekombinere dem i en kassett i vektorplasmidet. Dette var et viktig trinn fordi det tillot rensing av betydelige mengder LT og oppnådde mutanter for etterfølgende analyse. Dette plasmidet, betegnet pDF94, er vist i diagrammet i figur 1. Både CT og LT syntetiseres med en trypsinsensitiv peptid-binding som forbinder Ar og A2-delene. Denne peptidbindingen må merkes for at molekylet skal være "toksisk". Dette gjelder også for difteritoksin, prototyp A-B-toksin, og for en rekke andre bakterielle toksiner. Dersom Ai-A2-bindingen ikke fjernes, enten ved hjelp av bakterielle proteaser eller tarmproteaser i tarmhulrommet, dvs. proteolytisk behandling eller aktivering, kan Ai-delen ikke nå sitt mål og den basolaterale overflaten av tarmepitelcellen. I motsetning til CT er ikke LT helt biologisk aktivt når det først isoleres fra cellen. LT krever også proteolyse for å bli helt aktivt, og den proteolytiske aktiveringen foregår ikke inne i bakterien. Derfor ville ett middel for å forandre molekylets toksisitet uten å påvirke den ADP-ribosylerende, enzymatiske aktiviteten være å fjerne de trypsinsensitive aminosyrene som forener Ai- og A2-komponentene i A-underenheten ved genetisk manipuler-ing. Dersom molekylet ikke kan spaltes proteolytisk, vil det ikke være toksisk. Fagmannen ville forutse at molekylet imidlertid skulle bibeholde dets ADP-ribosylerende, enzymatiske aktivitet og som følge av dette dets adjuvansfunksjon.

Figur 1 viser sekvensen av det området som er motsatt disulfidet og som skiller Ai- og A2-delene. Innenfor dette området er det en enkelt argininrest som antas å være den spaltnings-stilling som er nødvendig for å aktivere molekylets toksiske egenskaper. Dette området ble forandret ved stillingsrettet mutagenese på en slik måte at molekylet gjøres innsensitivt for proteolytisk fordøyelse og derfor ikke-toksisk.

Stillingsrettet mutagenese gjennomføres ved å hybridisere til enkeltstrenget DNA et syntetisk oligonukleotid som er komplementært til det enkeltstrengede templatet, bortsett fra et område med mistilpasning nær senteret. Det er dette området som inneholder den ønskede nukleotidforandring eller de ønskede nukleotidforandringene. Etter hybridisering med den enkeltstrengede mål-DNA forlenges oligonukleotidet med DNA«polymerase for å danne en dobbeltstrenget struktur. Merket forsegles så med DNA-ligase, og dupleksstrukturen transformeres til en E. coli-vert. Det teoretiske utbyttet av mutanter ved bruk av denne fremgangsmåten er 50 % på grunn av den semikonservative metoden for DNA-replikasjon. I praksis er utbyttet meget lavere. Det er imidlertid en rekke metoder tilgjengelige for å forbedre utbyttet og velge oligonukleotidrettede mutanter. Det anvendte systemet utnyttet et andre mutagent oligonukleotid for å danne endrede restriksjonsstillinger i en dobbel mutasjonsstrategi. Det neste trinnet var å innføre en annen aminosyre istedenfor Arg (dvs. GGA = Gly erstatter AGA = Arg), for således å be-vare leserammen mens den proteolytiske stillingen elimineres. mLT ble så renset ved agaroseaffinitetskromatografi for én mutant (pBD95) som var bekreftet med sekvensering. Alterna-tive rensemetoder vil være selvsagte for fagmannen. Dette mutant-LT, betegnet LTCRi92G)lble så undersøkt ved hjelp av SDS-polyakrylamidgelelektroforese for modifikasjon av den trypsinsensitive bindingen. Prøver ble undersøkt med og uten eksponering for trypsin og sammenlignet med nativt (umodifisert) LT. mLT dissosierer ikke til Aiog A2 når det inkuberes med trypsin, derved indikeres at sensitiviteten for protease er fjernet.

Effekt av mLT på Y- l- adrenalceller

Fagmannen ville forutse at mLT ikke ville være aktivt i Y-l-adrenalcelleforsøket. Denne forutsigelse ville være basert på tidligere funn [Clements og Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769] at umerket LT var mer enn 1000 ganger mindre aktivt i dette forsøkssystemet enn CT, og at trypsinbehandling aktiverte LT til det samme nivå av biologisk aktivitet som CT i dette forsøket. Det ble antatt at den observerte restaktiviteten av LT i dette forsøket i fravær av trypsinaktivering var en funksjon av noe gjenværende proteaseakti-vitet som det ikke kunne gjøres rede for. Trypsin anvendes f.eks. i fremgangsmåten for subdyrkning av Y-l-adrenalceller. Det ble derfor antatt at LT som ikke kunne merkes, ville være fullstendig inaktivt i Y-l-adrenalcelleforsøket. Resultatene fremgår av tabell I.

Tabell I viser det uventede funn at mLT bibeholdt et basal-nivå av aktivitet i Y-l-adrenalcelleforsøket, selv om det ikke kunne behandles proteolytisk. Som vist i tabell I, har CT og nativt LT behandlet med trypsin samme aktivitetsnivå (15 pg) på Y-l-adrenalceller. I motsetning til dette var mLT (48 000 pg) > 1000 ganger mindre aktivt enn CT eller nativt LT og kunne ikke aktiveres med trypsin. Den gjenværende basalaktivitet reflekterer utvilsomt en forskjellig og hittil ukjent vei for adrenalcelleaktivering enn den som krever separering av Ai-A2-bindingen.

ADP- ribosvlerende. enz<y>matisk aktivitet av mLT

Fordi den mutasjon som erstatter Arg]92 med Gly 192 ikke for-andrer den enzymatiske stillingen for Ai-delen, ville en fag-mann forutse at mLT ville bibeholde dets ADP-ribosylerende,enzymatiske aktivitet. For å undersøke denne egenskapen ble NAD-agmatin-ADP-ribosyltransferaseforsøket anvendt [Moss et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:6383-6387]. Som vist i figur 2, produserer CT en doseavhengig økning i nivåer av ADP-ribosylagmatin, en funksjon av dette molekyls ADP-ribosyltransferaseakti vitet

Tabell II viser i tabellform det uventede funn at mLT manglet enhver påvisbar ADP-ribosylerende, enzymatisk aktivitet, med eller uten trypsinaktivering, selv om den enzymatiske stillingen ikke var endret og det var et demonstrerbart basalnivå av aktivitet i Y-l-adrenalcelleforsøket.

Enterotoksisk aktivitet av mLT

På grunn av det uventede funn at mLT manglet enhver påvisbar ADP-ribosylerende, enzymatisk aktivitet, med eller uten trypsinaktivering, selv om den enzymatiske stillingen ikke var endret og det ytterligere funn at det er et basalakti-vitetsnivå i Y-l-adrenalcelleforsøket, var det uklart om mLT ville bibeholde noen av dets enterotoksiske egenskaper. En ideell adjuvansblanding av mLT ville bibeholde dets evne til å virke som et immunologisk adjuvans, men vil mangle de virkelige eller potensielle bivirkninger, som f.eks. diaré forbundet med bruken av LT eller CT. Figur 3 viser at mLT ikke induserer netto fluidsekresjon i patentmusmodellen, selv ved doser på 125 ug. Denne dosen er mer enn fem ganger den adjuvanseffektive dosen for LT i denne modellen. Det er viktig at den potensielle toksisitet til nativt LT kan ses på dette nivå.

Adjuvansaktivitet av mLT

Fagmannen ville forutse at siden mLT ikke hadde noen påvisbar ADP-ribosyltransferaseaktivitet og ikke er enterotoksisk, ville det mangle adjuvansaktivitet. Denne forutsigelse ville være basert på rapporten til Lycke et al. [Lycke et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281], hvor det gjøres klart at forandringer som påvirker toksinets ADP-ribosylerende, enzymatiske aktivitet og forandrer evnen til å øke intracellulæ re nivåer av cAMP, også hindrer molekylet i å fungere som et adjuvans. Som vist ovenfor, har mLT ingen ADP-ribosylerende, enzymatisk aktivitet og bare litt udefinert basal-aktivitet i Y-l-adrenalceller, og induserer ikke noen netto fluidsekresjon i patentmusmodellen.

For å undersøke mLTs adjuvansaktivitet ble følgende forsøk utført. Tre grupper av BALB/c-mus ble immunisert. Dyrene ble inokulert intragastrisk med en matenål med sløv tupp (Popper & Sons, Inc., New Hyde Park, New York). På dag 0 ble hver gruppe immunisert oralt som følger: Gruppe A fikk 0,5 ml PBS inneholdende 5 mg OVA, gruppe B fikk 0,5 ml PBS inneholdende 5 mg OVA og 25 ug nativt LT, og gruppe C fikk 0,5 ml PBS inneholdende 5 mg OVA og 25 ug mLT. Hvert regime ble admini-strert igjen på 7. og 14. dag. På dag 21 ble alle dyrene forsterket i.p. med 1 ug OVA i 20 % Maalox. én uke etter i.p.-inokuleringen ble dyrene drept og undersøkt på serum-IgG- og slimhinne-IgA-antistoffer rettet mot OVA og LT ved hjelp av

ELISA.

Reagenser og antisera for ELISA ble oppnådd fra Sigma Chemi-cal Co. Prøver for ELISA ble seriefortynnet i fosfatbufret saltløsning (pH 7,2), 0,05 % Tween 20 (PBS-TWEEN). For bestemmelser av anti-LT ble mikrotiterplater forhåndsbelagt med 1,5 ug pr. brønn av blandede gangliosider (type III), så med 1 ug pr. brønn av renset LT. Anti-OVA ble bestemt på mikrotiterplater forhåndsbelagt med 10 ug pr. brønn av OVA. Serumanti-LT og -anti-OVA ble bestemt med kaninantiserum mot muse-IgG konjugert til alkalisk fosfatase. Slimhinneanti-LT og -anti-OVA-IgA ble bestemt med geiteantiserum mot muse-IgA [a-kjedespesifikt], fulgt av kaninantiserum mot geite-IgG konjugert til alkalisk fosfatase. Reaksjonene ble stanset med 3 N NaOH. Verdier for IgG og IgA ble bestemt fra en standard-kurve med rensede musemyelomproteiner (MOPC 315, gA(IgA12);MOPC 21; gGl: Litton Bionetics, Inc., Charleston, SC).

Serum- IgG- anti- OVA

Som vist i figur 4A, utviklet dyr som ble preparert oralt med OVA og LT en signifikant høyere serum-IgG-anti-OVA-respons etter etterfølgende parenteral immunisering med OVA (4,058 ug/ml) enn de som ble preparert med OVA alene og deretter immunisert parenteralt med OVA (ingen påvisbar anti-OVA-respons) (Students t-test, p = 0,031). Dyr som var prepa-rert oralt med OVA og mLT, utviklet også en signifikant høyere serum-IgG-anti-OVA-respons etter etterfølgende parenteral immunisering med OVA (1,338 ug/ml) enn de som ble preparert med OVA alene og deretter immunisert parenteralt med OVA (ingen påvisbar anti-OVA-respons) (Students t-test, p = 0,0007).

Mukosal slgA-anti-OVA

Som vist i figur 4B, ble lignende resultater oppnådd når anti-OVA-IgA-responser ble sammenlignet innenfor disse samme grupper av dyr. Dyr som var preparert oralt med OVA og LT, utviklet en signifikant høyere slimhinne-IgA-anti-OVA-respons etter etterfølgende parenteral immunisering med OVA (869 ng/ml) enn de som ble preparert med OVA alene og deretter immunisert parenteralt med OVA (ingen påvisbar anti-OVA-respons) (Students t-test, p = 0,0131). Som ovenfor utviklet dyr som var preparert oralt med OVA og mLT, også en signifikant høyere slimhinne-IgA-anti-OVA-respons etter etterfølgende parenteral immunisering med OVA (230 ng/ml) enn de som var preparert med OVA alene og deretter immunisert parenteralt med OVA (ingen påvisbar anti-OVA-respons) (Students t-test, p = 0,0189).

Serum- IeG- anti- LT

Evnen hos LT og mLT til å utvikle en anti-LT-antistoffrespons hos disse samme dyrene ble også undersøkt. Dette var viktig ved det at det ville tilveiebringe en indikasjon på om mutant-LT var i stand til å hindre induksjon av toleranse mot seg selv i tillegg til å fungere som et adjuvans for andre proteiner. Som vist i figur 5A, utviklet dyr som var preparert oralt med OVA og LT en signifikant høyere serum-IgG<s>anti-LT-respons etter etterfølgende parenteral immunisering med OVA (342 ug/ml) enn de som var preparert med OVA alene og deretter immunisert parenteralt med OVA (ingen påvisbar anti-LT-respons) (Students t-test, p = 0,0005). Dyr som ble prepa-rert oralt med OVA og mLT, utviklet også en signifikant høyere serum-IgG-anti-LT-respons etter etterfølgende

parente-ral immunisering med OVA (552 ug/ml) enn de som ble preparert med OVA alene og deretter immunisert parenteralt med OVA (ingen påvisbar anti-LT-respons)

(Students t-test, p = 0,0026).

Mukosal slgA- anti- LT

Som vist i figur 5B, ble lignende resultater oppnådd når anti-LT-IgA-responser ble sammenlignet med disse samme grupper av dyr. Dyr som var preparert oralt med OVA og LT, utviklet en signifikant høyere slimhinne-IgA-anti-LT-respons etter etterfølgende parenteral immunisering med OVA (4,328 ng/ml) enn de som ble preparert med OVA alene og der-etter immunisert parenteralt med OVA (ingen påvisbar anti-LT-respons)

(Students t-test, p = 0,0047). Som ovenfor utviklet dyr som ble preparert oralt med OVA og mLT, også en signifikant høyere slimhinne-IgA-anti-LT-respons etter etterfølgende parenteral immunisering med OVA (1,463 ng/ml) enn de som ble preparert med OVA alene og deretter immunisert parenteralt med OVA (ingen påvisbar anti-LT-respons) (Students t-test, p = 0,0323).

Deponering av mikroorganismer

Det følgende plasmid ble deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, 18. august 1994, og er til-delt det angitte aksesjonsnummer:

Den oppfinnelse som er beskrevet og krevd her, skal ikke begrenses i omfang av de spesielle utførelsesformer som er beskrevet her, siden disse utførelsesformene er ment som illustrasjon av flere aspekter av oppfinnelsen. Hvilke som helst ekvivalente utførelsesformer er ment å ligge innenfor oppfinnelsens område. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til dem som er vist og beskrevet her, vil være selvsagte for fagmannen på området fra den foranstående beskrivelse. Slike modifikasjoner menes også å ligge innenfor området av de medfølgende krav.

Det skal også forstås at alle basepar og aminosyrerestnumre og -størrelser som er gitt for nukleotider og peptider, er omtrentlige og er anvendt for beskrivelsesformål.

En rekke referanser er sitert her, hvis hele beskrivelser inntas her i sin helhet som referanse.

Claims (14)

1. Mutant varmelabilt E. co/z-enterotoksin-holotoksin, karakterisert ved at et arginin ved aminosyreposisjonen 192 i A-subenheten av holotoksinet er erstattet med glysin, der det mutante varmelabile E. co/i-enterotoksin-holotoksin er mer enn 1000 ganger mindre toksisk enn det native varmelabile E. cø/j-enterotoksin-holotoksinet slik det måles i Y-l-binyrecelleanalysen og som har immunologisk adjuvansaktivitet men mangler ADP-ribosylerende enzymaktivitet slik det måles ved NAD-Agmatin ADP-ribosyltransferaseanalysen.

2. Mutant holotoksin ifølge krav 1,karakterisert ved at det mutante varmelabile E. cøft-enterotoksin-holotoksin kodes av plasmid pDB95 som oppnås fra£. coli LT RI92 G med ATCC aksesjonsnr. 69683, som uttrykker både subenhet A og subenhet B av det varmelabile E. cø/z-enterotoksinet.

3. Vaksinepreparat, karakterisert ved at det omfatter et antigen i kombinasjon med det mutante holotoksin ifølge krav 1, og eventuelt en egnet bærer, fortynningsmiddel eller eksipiens.

4. Vaksinepreparat ifølge krav 3, karakterisert ved at antigenet er et antigen fra en bakterie utvalgt fra gruppen bestående av Streptococcus pyrogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium per/ ringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromatis, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter ( Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella lfexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincent», Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugamushi og Chlamydia spp.

5. Vaksinepreparat ifølge krav 3,karakterisert ved at antigenet er et angtigen fra en sopp utvalgt fra gruppen bestående av Coccidioides immitis, Aspergi{ lus jumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans og Histoplasma capsulatum.

6. Vaksinepreparat ifølge krav 3, karakterisert ved at antigenet er et antigen fra en protozo utvalgt fra gruppen bestående av Entomoeba histolytica, Trichomonas tenås, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishamania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum og Plasmodium malaria.

7. Vaksinepreparat ifølge krav 3, karakterisert ved at antigenet er et antigen fra en innvollsorm utvalgt fra gruppen bestående av Enterobius vermicularis, Trichuris trichirura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spir alis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium og hakeorm.

8. Vaksinepreparat ifølge krav 3, karakterisert ved at antigenet er et antigen fra et virus utvalgt fra gruppen bestående av Poxiviridae, Herpesviridae, Herpes Simplex virus 1, Herpes Simplex virus 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, influensa virus, parainfluensa virus, kusma, meslinger, respiratorisk-syncytialvirus, røde hunder, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, hepatitt A-virus, hepatitt B-virus, hepatitt C-virus, hepatitt E-virus, ikke-A/ikke-B hepatitt virus, Rhinoviridae, Coronaviridae og Rotaviridae.

9. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter (a) en vaksine utvalgt fra gruppen bestående av influensavaksine, kikhostevaksine, difteri- og tetanustoksoid kombinert med kikhostevaksine, hepatitt A-vaksine, hepatitt B-vaksine, hepatitt C-vaksine, hepatitt E-vaksine, japansk encefalittvaksine, herpesvaksine, meslingevaksine, røde hunder-vaksine, kusmavaksine, blandingsvaksine mot meslinger, kusma, kikhoste og røde hunder, papillomavirusvaksine, parvovirusvaksine, respiratorisk syncytialvirusvaksine, Lyme-sykdomsvaksine, poliovaksine, malariavaksine, vannkoppevaksine, gonorévaksine, schistosomiasisvaksine, rotavaksine, Campylobacter- vaksme, koleravaksine, enteropatogen E. co/i'-vaksine, enterotoksisk E. cø/i-vaksine, mykoplasmavaksine, pneumokokkvaksine og meningokokkvaksine, og (b) det mutante holotoksin ifølge krav 1.

10. Kitt nyttig for å frembringe en beskyttende immunrespons hos en vert mot et patogen, karakterisert ved at det omfatter to komponenter: (a) en effektiv mengde av et beskyttende antigen fra en bakterie, sopp, protozo, innvollsorm eller viruspatogen, og (b) en adjuvanseffektiv mengde av det mutante holotoksin ifølge krav 1.

11. Sammensetning for anvendelse til frembringelse av en immunrespons mot et patogen, k arakterisert ved at det omfatter en blanding av en effektiv mengde av et antigen og en adjuvanseffektiv mengde av det mutante holotoksin ifølge krav 1.

12. Sammensetning ifølge krav 11 eller kitt ifølge krav 10, karakterisert ved at antigenet er avledet fra en enterotoksisk bakterieorganisme.

13. Sammensetning eller kitt ifølge krav 12, karakterisert ved at den enterotoksiske bakterieorganismen er en enterotoksisk bakterieorganisme som uttrykker et coleraliknende toksin.

14. Sammensetning eller kitt ifølge krav 12, karakterisert ved at den enterotoksiske bakterieorganismen er Escherichia I spp. eller Vibrio cholera.