JP2005538954A - 分子の経上皮輸送用組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は米国予備特許出願番号第60/384949号、2002年5月31日出願に対する合衆国法典第35巻第119条(e)に基づく優先権を主張し、それらの内容をここで資料として使用する。
連邦政府による援助研究又は開発に関する記載
この研究の一部は米国政府資金により支援された(国立衛生研究所認可番号第GM057342号)。
BoNTは約150キロドルトンの分子量を有する単鎖不活性プロポリペプチドとして合成される。不活性プロ−BoNTは内因性又は外因性蛋白質分解酵素により、プロ−BoNTの蛋白質分解開裂により活性化される。不活性BoNTプロペプチドの開裂(ニッキング)は2個のポリペプチド鎖(重鎖(HC)及び軽鎖(LC))を産出する。HC及びLCは通常、動物細胞の内部に存在するような還元条件下で切断されることのできるジスルフィド結合により結合している。
いくつかの種類のクロストリジウムが現在BoNT毒素を生産することが知られており、例えば、ボツリヌス菌、F型毒素産生菌(Cl.baratii)、E型毒素産生菌(酪酸菌、Cl. butyricum)が挙げられる。
BoNTは、消化管、肺、及び他の上皮膜を通り抜けて、血流に進入出来ることが知られている。血流中で、BoNTは神経筋接合部のニューロンへ入り込むことができ、そこで毒素はその特徴的作用を発現できる。
一部又は全てのLCが上皮膜を通過するために削除され変形されるBoNT分子の能力は文献に記載されている(例えば、米国特許第6051239号)。しかし、これら分子は、種々の理由で実用的でないことが明らかな(変形を受けていない)完全な形のHCの産出又は単離を必要とした。BoNTのフラグメントを使用してボツリヌス中毒を予防するための注射可能なワクチンの製造も試みられた。しかし、上皮を通過するトランスサイトーシス可能な、ボツリヌス中毒を予防できるワクチンは未だ報告されていない。
特に、本発明は、動物の非角質上皮を通過してエンティティをトランスロケーションするための組成物を提供する。上記組成物は、BoNTのHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含有する。上記エンティティのサイズは、好ましくは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない。本発明の組成物で使用される任意のエンティティは、実際には免疫原性、治療用、及び/又は診断用でもよい。
例えば、本発明はBoNTのHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合した抗原を含むワクチンでもよく、上記抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、上記抗原は脊椎動物の病原体に対して感染防御免疫を発現する。例えば、上記ワクチンはBoNTのHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合した抗原を含有してもよく、上記抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、抗原は脊椎動物のボツリヌス菌神経毒に対して感染防御免疫を発現する。
同様に本発明で提供されるのは、脊椎動物中のエンティティに対する免疫反応を発現する方法である。この場合、上記方法は下記ステップを含む;
a)エンティティをBoNTのHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合するステップ、但しエンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない;及び
b)フラグメント結合したエンティティを上皮と接触させるステップ。
BoNTのHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含有する医薬組成物も又、本発明の方法及び/又は組成物で使用できる食品及びトランスロケーション用ポリペプチドと同様に、本発明としてここで記載される。
カルボキシ末端HCフラグメントへ結合したエンティティの性質は、フラグメントの細胞通過能に大きく影響を及ぼさない。実質的にはどの種類のエンティティでもこの方法で輸送でき、この方法は上皮小胞のサイズ収容能力及び、エンティティをHCフラグメントへ結合する実施者の能力にのみ限定される。
一方、好ましくは、カルボキシ末端HCフラグメントは、BoNTの完全長HCのアミノ酸配列の(分子量で)2%以上であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、上記フラグメントはアミノ末端で開始される完全長HCの目的としない部分の(即ち、図1のセロタイプA中の残基468で開始される)切除/削除により得られる。更に好ましくは、カルボキシ末端HCフラグメントは、BoNTの完全長HCのアミノ酸配列の、(分子量で)約5%以上、約30%以上、約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、及び約90%以上を含有する部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明に使用されるカルボキシ末端HCフラグメントは、公知のいずれかのBoNTセロタイプ(例えば、A、B、C、D、E、F、及びGのいずれか)のHC又は次に発見されるいずれかのBoNTセロタイプから誘導できる。好ましくは、カルボキシ末端HCフラグメントは、組成物が投与される動物として同種の動物で病原性であることが公知であるセロタイプ(例えば、ヒトに対するセロタイプA、B、及びE)から誘導できる。しかし、選択されたフラグメントが、その動物中に細胞通過能を保有するために所定の動物においては通常は病原性を示すセロタイプから得られなければならない必要はない。
結合されたエンティティは、多数のより小さな治療用又は免疫原性試薬を封入又は取り込むようなより大きなエンティティであることが好ましい。例えば、多数のより小さい治療用、診断用又は免疫原性試薬を輸送するために使用できるエンティティとして、リポソーム、再封入したRBC、ミセル、ミクロスフィア、及び微粒子が挙げられる。
エンティティは、フラグメントの細胞通過能が非常に損なわれない限り、どの位置のカルボキシ末端HCフラグメントへ結合してもよい。例えば、エンティティはフラグメントのカルボキシ末端またはその近傍へ結合してもよい。好ましくはエンティティは、フラグメントのアミノ末端又はその近傍へ結合される。
又、リンカーは介在分子でもよく、その介在分子はその結合機能と共に化学的、治療用又は診断用機能を有しても有さなくても良い。リンカーとして使用できる介在分子の例として、ビオチン、アビジン、又は抗体物質が挙げられる。この種のリンカーは、エンティティ及びフラグメントの間に介在できる。
エンティティは又、エンティティそれ自身の中へフラグメントを組み込むことにより結合されてもよい。例えば、エンティティがリポソームの場合、フラグメントは、フラグメントの細胞通過機能部位が損なわれない状態でフラグメントの部分がリポソームの構造内に貫通し留まることが可能な特定のドメインを含む。
エンティティ及びフラグメントは分離して調製されてから結合されてもよく、同時に調製されてもよい。
又、本発明のワクチンは動物中で実質的に粘膜性免疫性のみを発現するように調製でき、ワクチンはその動物へ、本発明の組成物中に粘膜性免疫反応を促進し、及び/又は全身性免疫反応を抑制するシグナル分子を含有させて投与される。これらシグナル分子として、インターロイキン又はトランスフォーミング増殖因子が挙げられる。シグナル分子は、フラグメント結合した抗原へ強く又は弱く結合しても、フラグメント自体でもよく、又、本発明の組成物と一緒に動物へ共投与してもよい。
エンティティ結合したカルボキシ末端HCフラグメントにより通過される上皮は、好ましくは非角質であるか非角質化されたものである。皮膚以外の多くの上皮は通常非角質である。しかし、皮膚組織の脱角質化又は部分可溶化は、本発明の組成物及び方法の経皮使用を可能とする。一般的に適切な上皮の例として、消化器系(例えば、口、食道、胃、回腸、十二指腸、空腸、結腸、及び肛門)、鼻、肺、膣、及び眼性上皮が挙げられる。本発明の組成物の腹膜投与により(組成物が)到達する上皮も又、適切である。
本発明の組成物及び方法が対象とする動物の種類の1種はヒトである。ヒト用には、A、B、及びEセロタイプの完全長HCに由来するカルボキシ末端HCフラグメントの使用が好ましい。更に、全てのBoNTセロタイプからの多くのフラグメントが家庭愛玩動物及び農場家畜等の通常の動物で使用できる。従って、本発明の医薬的用途に類似する獣医学的使用も本発明の範囲内である。
ここで使用される用語「生理学的に許容できる」エステル又は塩は、医薬組成物の他の成分のいずれとも親和性があり、組成物が投与される被検体に有毒でない活性成分のエステル又は塩形状を意味する。
本発明の医薬組成物はバルクで、単回服用量、複数の単回服用量として製造され、包装され、又は販売できる。ここで使用される「服用量」とは、活性成分の所定量を含有する医薬組成物の別々の量である。活性成分量は、一般的には被検体へ投与される活性成分の投薬量、又は例えばその投薬量の二分の一又は三分の一の投薬量等の便利な分割部分と同じである。
本発明の医薬組成物の制御−又は徐放性配合物は、従来技術を使用して製造できる。
ここで使用される「油状」液体とは、炭素含有液体分子を含有し、水より低い極性を示すものである。
活性成分を含有するソフトゼラチンカプセルは、ゼラチン等の生理学的分解性組成物を使用して製造できる。これらソフトカプセルは活性成分を含有し、それは、水又は;落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油等の油媒体;と混合されてもよい。
本発明の医薬組成物は、直腸投与に適切な配合物として製造され、包装され、又は販売されてもよい。これら組成物は、例えば、坐剤、停滞用浣腸医薬品、及び直腸又は結腸の洗浄用溶液の形状でもよい。
化学的組成物による材料の含浸又は被膜方法は、当分野で公知であり、本発明を制限するものではないが、化学的組成物を表面上へ付着又は結合する方法、化学的組成物を材料の構造中へ材料(即ち、生理学的分解性材料等)の合成中に組み込む方法、及び水性若しくは油性溶液又は懸濁液を吸収性材料中に吸収させ、次に乾燥してもしなくてもよい方法、が挙げられる。
ここで記載された肺デリバリーに使用できる配合物は又、本発明の医薬組成物の鼻内デリバリーにも使用できる。
鼻投与に適切な配合物として、例えば活性成分を約0.1%(w/w)の少量から100%(w/w)の多量まで含有してもよく、更に1以上の上記追加的成分を含有してもよい。
他の使用できる眼科的投与可能配合物として、微晶質性形状又はリポソーム調剤での活性成分が挙げられる。
BoNT=ボツリヌス菌神経毒(ホロトキシン);
nBoNT=切れ目のある(nicked)BoNT、即ち、HC及びLCに開裂し、ジスルフィド結合により結合されているBoNT前駆体ポリペプチド;
uBoNT=切れ目のない(un-nicked)BoNT、即ち、開裂されずにいるBoNT前駆体ポリペプチド(150kDa);
HC=ボツリヌス菌神経毒の重鎖;
88kHC=88キロドルトンHCカルボキシ末端フラグメント(図2参照);
66kHC=66キロドルトンHCカルボキシ末端フラグメント(図2参照);
50kHC=50キロドルトンHCカルボキシ末端フラグメント(図2参照);
48kHC=2キロドルトンのカルボキシ末端が切除された50kHCフラグメント(図2参照);
AF=商標「ALEXAFLUOR」568蛍光染料;
bt=ビオチン;
GFP=緑色蛍光蛋白質;
GST=グルタチオン−S−トランスフェラーゼ;
Stag=商標「S-TAG」システム(15aaS-TAGペプチド及びリボヌクレアーゼS−蛋白質、Novagen社製、Madison、Wisconsin、米国);
6×his=ヘキサヒスチジン標識;並びに
CTBS=コレラ毒素Bサブユニット。
B細胞種は下記の通り:
T−84=T-84ヒト消化管上皮細胞;
MDCK=Madin-Darbyイヌ腎臓上皮細胞;
Caco−2=Caco−2ヒト消化管上皮細胞;
Calu−3=Calu−3ヒト肺上皮細胞;
RAEC=ラット肺胞上皮細胞;並びに
mRT=ネズミ気道細胞(in vivo)。
CA=細胞の頂端面、及び、B=細胞の基底面。
D率は平均±平均の標準誤差を上皮表面のフェムトモル/hr/cm2で表した。
天然及び組み換え型蛋白質、天然毒素及び天然鎖。
ボツリヌス菌神経毒(BoNT)並びにHC及び軽鎖(LC)構成要素を資料に記載されている標準技術(「DasGupta and Sathyamoorthy」1984;Simpsonら、1988)を使用して単離した。
DNAフラグメント単離用標準技術、DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメントによる張り出し末端の修復、及びT4DNAリガーゼによるライゲーションを使用した。全てのクローン化ステップ及び発現は、pREP4リプレッサープラスミドを含有するE.coliM−15(Qiagen社製、Chatsworth、CA、米国)中で行なった。BoNTLC(rL鎖)をコードするDNAフラグメントは、下記配列を有するプライマーを使用してプラスミドpCL8から増幅した:forward、CCCAATAACA ATTAACAACT TTAAT(SEQ ID NO:8);及びreverse、TTTctgcagC TATTTATTAT ATAATGATCT ACCATC(SEQ ID NO:9)、但し、PstI制限酵素切断部位は、下付(小)文字で表す。1個のシトシンをforwardプライマーの5’末端へ添加し、BamHI制限酵素切断部位の再構築を行い、又、翻訳メチオニンのpQE−30開始フレーム中の軽鎖DNAのクローン化を行った。reverseプライマー中で、PstI制限酵素切断部位を終止コドンのすぐ下流に導入した。増幅した生成物を精製し、T4ポリメラーゼで処理し、PstIで切断し、発現ベクターpQE−30のKlenow−充填BamHI及びPstI制限酵素切断部位との間に挿入し、プラスミドpQE−LC1を生成した。pQE−LC1の構造はDNAシークエンシングで確認した。
(商標「GENBANK」登録番号X73423で記載されているヌクレオチド配列SEQ ID NO:10、を有する。)構造遺伝子は、BoNTセロタイプA(BoNT A)のHCの88キロドルトン(88K)、66キロドルトン(66K)、又は50キロドルトン(50K)フラグメントをエンコードしており、PCRにより産出した。これらHCフラグメントはここで表される「88kHC」「66kHC」及び「50kHC」である。
緑色蛍光蛋白質(GFP)の配列コードをPCRにより産出した。26キロドルトン(26K)GFP蛋白質をエンコードするDNAフラグメントを、下記ヌクレオチド配列を有するプライマーを使用して増幅した:forwardプライマーACATgcatgc ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTCA(SEQ ID NO:18)、reverseプライマーCCggtaccCC AGGCCCATTT GTAGAGCTCA TC(SEQ ID NO:19)、ただしforwardプライマー配列中のSphI制限酵素切断部位及びreverseプライマー配列中のKpnI制限酵素切断部位は、下付(小)文字で表す。GFP遺伝子を含有する増幅したフラグメントはSphI及びKpnIと共に処理され、プラスミドpQE−66kHC中の、SphI及びKpnI制限酵素切断部位の間に挿入される。得られたプラスミドpQE−GFP−66kHCは、ATGコドン、6×his標識及び66kHC遺伝子フレーム中にGFP遺伝子を含有する。
Lennoxブロス中37℃で振とうして、600nm(A600)での吸収値が0.6〜0.8となるまでインキュベートを行った。イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を1.0ミリモル濃度(最終濃度)となるよう添加し、インキュベートを更に5時間続けた。1リットルの誘発培養物からの細菌を4℃で遠心分離して回収し、50ミリモル濃度リン酸ナトリウムの緩衝剤(pH.7.4)20ml中で300ミリモル濃度NaClと再懸濁した。細胞懸濁液を、1分2回のパルスでそれぞれ75%出力で、モデルl60 sonic dismembrator(Fisher Scientific社製、Malvern、PA、米国)により音波粉砕により氷上に溶解した。溶解産物を20000×g、30分4℃で遠心分離した。清澄化した浮遊物を2mlの充填されたニトリル三酢酸樹脂と共に混合し、1時間4℃で回転装置上でインキュベートし、最終的に25mlカラム中へ注いだ。
ボツリヌス菌毒素は比較的不活性な単鎖分子として表される。完全に活性とするために、毒素は蛋白質分解プロセシング(ニッキング)」を受けてその二鎖形状を産出しなければならない。実験室的には、これは通常トリプシンにより達成される。
次に続く毒素のニッキング酵素からの分離を容易にするために、TPCK(L−1−トシルアミド−2−フェニルエチルクロロメチルケトン)を4%ビーズ化アガロースへ架橋(固定化)したトリプシン(固定化トリプシン;PIERCE社製、Rockford、IL、米国)処理したものを使用した。トリプシンスラリーを反応緩衝剤(10ミリモル濃度リン酸ナトリウム緩衝剤、pH7.5)で3回洗浄した。毒素を酵素へ添加し、室温で(23℃)1時間、毒素に対するトリプシン比1:10でインキュベートした。インキュベート後、反応混合物を毎分10000回転で5分間、Eppendorf 卓上型遠心分離機中で遠心分離した。「切れ目のある(nicked)」毒素を含有する浮遊物を収集し、−20℃で貯蔵した。又、「切れ目のある」毒素は、0.2ミクロン遠心分離フィルター(Schleicher&Schuell Centrexミクロフィルターユニット)を通して、清浄無菌管へろ過して、ビーズ化トリプシンから分離しても良い。材料サンプルは電気泳動によりニッキングを確認するために試験した。
二鎖毒素は、ジスルフィド結合により結合されたLC(酵素部分)及びHC(結合及びトランスロケーション部分)から構成される。この結合はその酵素活性、神経伝達物質放出を引き起こす蛋白質の開裂、を発揮するために、(ジスルフィド結合が)還元(破壊)され軽鎖とされる必要がある。in vitro開裂試験を行うために、天然毒素は還元させなければならなかった。
ボツリヌス菌毒素は、生理学的pH(pH7.2〜7.4)でのリン酸緩衝剤中又はリン酸緩衝食塩水(PBS)中で、ジチオトレイトール(DTT;クリランド試薬)でインキュベートされ、還元された。通常使用されるDTTの濃度は、試験に応じて5ミリモル濃度〜20ミリモル濃度である。DTT及び毒素反応混合物を、室温で(23℃)1時間インキュベートした。毒素還元は、非還元性ゲル上での電気泳動により確認した。
ボルトンハンター試薬は、Perkin Elmer Life Sciences社(Boston、Massachusetts、米国)から市販されている。この分子へ、蛋白質(例えば、リシン残基)の第1級アミンと反応する、反応性サクシンイミジルエステル成分を供給した。毒素、HC又はそのフラグメントを(125I)−ボルトンハンター試薬を本質的に製造者の指示に従い使用してヨウ素化した。得られる生成物の生物活性の損失を減少させるため、反応時間を少くした。蛋白質を標識化して、500キュリー/ミリモル以下の平均特定活性とした。
商標「ALEXAFLUOR」568は、577nmで吸収(励起)最大値、603nmで発光最大値を有する染料分子である。この染料は、Molecular Probes社(Eugene、OR、米国)から市販されており、製造者の指示に従い使用した。この分子を、蛋白質(例えば、リシン残基)の第1級アミンと反応する反応性サクシンイミジルエステル成分へ供給した。精製BoNT Aの1.0mg/mlPBS溶液0.50mlへ50μlの1.0モル濃度重炭酸ナトリウムを供給し、続いて混合物を染料へ添加した。反応を1時間室温で攪拌して連続した。ヒドロキシルアミン溶液(17μl)を添加し、インキュベートを更に30分間室温で続けてから反応を停止した。完全な反応体積を次にPBSで平衡化してPBSで溶離するゲルろ過カラムを通してろ過した。最初にカラムから溶離した染色帯(標識化毒素)を収集し、3℃で貯蔵した。標識化の量は、製造者の指示に従い、商標「ALEXAFLUOR」染料及び毒素の吸光度係数を使用して計算した。トランスサイトーシス実験で使用した毒素は3〜7モル/モル毒素の染料で標識化した。
単層の極性化した上皮細胞を、0.4μm孔径のポリカーボネート膜、商標「TRANSWELL」(Corning-Costar社製、Cambridge、Massachusetts、米国)多孔質ボトムインサート上に成長させた。商標「TRANSWELL」装置は、上皮細胞培養物の頂端面の又は基底面のいずれかの上に生成物を封じ込め可能である。上皮細胞層を通過する生成物のトランスサイトーシスのない場合、実質的には全ての生成物が装置により上皮の一方の側の上に保持される。従って、商標「TRANSWELL」装置は、生成物の上皮通過性トランスサイトーシスの評価に有用である。
発現した蛋白質の有毒性を、マウス横隔膜神経片側横隔膜調製物上でバイオアッセイした。組織を切除し、95%O2、5%CO2で通気した生理学的緩衝剤中で懸濁し、35℃で維持した。生理学的溶液は下記組成物であった:137ミリモル濃度NaCl;5ミリモル濃度KCl;1.8ミリモル濃度CaCl2;1.0ミリモル濃度MgSO4;24ミリモル濃度NaHCO3;1.0ミリモル濃度NaH2PO4;11ミリモル濃度D−グルコース;及び0.01%(w/v)ゼラチン。横隔膜神経を連続的に刺激し(1.0Hertz;0.1〜0.3ミリ秒持続)、筋肉痙攣を記録した。毒素誘発された麻痺の測定結果は、神経性刺激への筋肉痙攣応答の50%減少であった。
発現した蛋白質の有毒性を、蛋白質を実験マウスへ投与して試験した。ヒスチジン親和性樹脂又はGST親和性樹脂からの溶離により精製蛋白質を、lmg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで希釈し、マウスへ腹膜内(i.p.)注射した。組み換え型蛋白質を、濃度1〜100μg/動物(平均重量約25グラム)で、PBS−BSA100μl分取物へ投与した。時間の長さを変化させて監視して、動物への非特定の有毒性を検知した。
スイス・ウェブスターマウス(メス、それぞれ25グラム)を、Ace Animals社(Boyertown、PA、米国)から購入し、食物及び水を無制限に与えた。
手術前プロトコルでは、手術前に動物を18時間固定したが、水は自由に与えた。又、手術前操作では、腹部を剃毛し、ゲンタマイシンサルフェート(6mg/kg体重(FujusawaUSA社製、Deerfield、IL、米国)の予防用の皮下投与量を投薬した。手術当日に、動物を獣医学手術室へ移し、次に続く全てのステップは、無菌外科環境内で行った。
外科操作は1動物当り約15分間続き、麻酔薬の懸濁液は10〜15分間内の完全回復を示した。次に動物を実験室に移し、それらをアッセイ終点まで監視した。死亡時間を記録し、注入時間から死亡時間までの合計所用時間(分)を計算した。
結合保持能力並びに消化管及び気道上皮細胞の通過保持能力を示す毒素変種の、下記経口及び/又は鼻内投与で免疫性を発現するそれらの能力を試験した。更に評価されるためには、経口又は吸入可能なワクチンは、1000MLD50以上の親毒素に対する免疫防御を引き起こす必要がある。特定の病原体フリーのスイス・ウェブスターマウス(メス)をこの実施に使用した。
皮下(s.c.)免疫用に、動物へ0.1mlのPBS中の1〜20μg蛋白質を投与した。4回投薬を14日間隔で与えた。第2回、第3回及び第4回の免疫後、マウスを7日間飼育し、毒素変種への免疫反応性用免疫ブロット法により分析した。マウスに腹膜内(i.p.)経路を経由して1×103MLD50以上の親毒素の負荷をかけた。注入前に、毒素を1%(w/v)ゼラチン含有PBSで希釈した。マウスに14日間負荷をかけ、次にそれらに最終ワクチン接種した。又、未処理のマウスをコントロールとして使用した。
スイス・ウェブスターマウス(メス、それぞれ20−25グラム)を、Ace Animals社(Boyertown、PA、米国)から購入し、食物及び水を無制限に与えた。マウスを経口で(p.o.)免疫化した。p.o.投与用に、それぞれの動物へ、0.2ml溶離緩衝剤中に懸濁した4μgの蛋白質を胃内栄養(補給)針を経由して投与した。マウスを0日に免疫化し、ブースター(追加抗原)を14、28、及び42日に与えた。同一に免疫化したマウスからの血清サンプルを、21、35、及び49日に採取して貯留した.血清採取用に、イソフルラン麻酔下のマウスの眼窩後部叢(retro-orbital plexus)からキャピラリー管により血液を抜き取った。
一次インキュベートを一晩(18時間)室温で1:1000希釈血清で行った。次にホースラディッシュペルオキシダーゼ−標識化抗マウスIgGを、1:10000希釈で1時間室温で使用した。充分な洗浄後、膜を強化型化学発光試薬(商標「ECL」、Amersham Biosciences社製、Piscataway、NJ、米国)を使用して処理した。
ELISAを、微小な変更を行った以外はSiegelの記載した方法で行った。高度に精製(>95%)BoNT Aを、リン酸緩衝食塩水(pH7.4)濃度5μg/mlとなるように希釈し、次にミクロタイタープレート(100μl/ウェル)へ添加し、4℃で一晩密封容器中でインキュベートした。
1%BSAの0.1%(v/v)商標「TWEEN」20を有するTBS溶液を、不特定の結合をブロックするために使用した。血清サンプルを最初に1:30に希釈し、続いて4倍希釈して合計7個の希釈液(1:30〜1:122、880)とした。希釈血清を毒素被覆したウェル正副2個へ添加した(100μl/ウェル)。第2の抗体は1:1000に希釈したアルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗ヒト又は抗マウスIgA又はIgGであった。第1及び第2抗体を60分間37℃でインキュベートした。p−ニトロフェニルリン酸(100μl/ウェル)を基質として添加した。プレートを室温で30分間インキュベートし、吸収を405nmでミクロプレートリーダーで測定した。上記より、ELISAタイターを、吸収0.2(吸収ユニット)を与える最も高い血清希釈の逆数として定義した。
ミクロタイタープレートを、1:1000希釈したウサギ抗ボツリヌス菌トキソイドAを含有する被膜緩衝剤(0.1モル濃度Na2CO3、pH9.6)溶液で、100μl/ウェルで、一晩4℃で被覆した。次に吸着残存部位を、洗浄緩衝剤(20ミリモル濃度TBS、0.1%(v/v)商標「TWEEN」20、pH7.6)中の1%(w/v)BSAを添加して1時間37℃でブロックした。次にプレートを洗浄緩衝剤で4回洗浄した。適切な体積のアッセイ緩衝剤(20ミリモル濃度TBS、pH7.6)又は適切なマウス血清で抗原を希釈して標準カーブを作成した。標準及び血清のサンプル(100μl/ウェル)を、1時間37℃でインキュベートし、プレートを上記の様に洗浄した。1:500希釈したマウス抗BoNT AHCを添加し、1時間37℃でインキュベートした。プレートを緩衝剤で3回洗浄し、洗浄緩衝剤で希釈(1:5000)したアルカリホスファターゼ−標識化ヤギ抗マウスIgG結合体100μlを添加し、1時間37℃でインキュベートした。プレートを洗浄後、100μlの基質(p−ニトロフェニルリン酸)のグリシン緩衝剤、pH10.4(0.1モル濃度グリシン、1ミリモル濃度MgCl2、及び1ミリモル濃度ZnCl2)溶液をそれぞれのウェルへ添加した。室温で30分間インキュベート後、反応を停止し、405nmの吸収を測定した。
この試験は、天然BoNT A及びヒト消化管上皮細胞(T-84細胞)を使用して行った。トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを、1×10-8モル濃度の天然、精製BoNT Aを装置の上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の、装置の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
ウェスタンブロットは、トランスサイトーシス前のコントロール(BoNT A)及びT-84細胞を通してトランスサイトーシスされた(即ち、底部室から集めた)BoNT Aは、ほとんど同一のサイズを有することを示した。従って、BoNT Aが効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量も変化せず、トランスサイトーシスが行われる機構はBoNTの変性を生じないことを示した。
この試験は、BoNT A及びMadin-Darbyイヌ腎臓細胞(MDCK細胞)を使用して行った。トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMDCK細胞培養物を分析した。アッセイを、1×10-8モル濃度の天然、精製BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
ウェスタンブロットは、天然BoNT AはMDCK細胞により、弱く結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出されたことを示した。結論は、BoNT Aは、細胞の基底面から採取した媒体中には検知されず、BoNT Aは効率良くMDCK細胞を通過しないことを示した。
リシン残基で125Iへ結合したBoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮細胞(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、125Itへ結合したBoNT Aは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。それは、トランスサイトーシス率11.29±0.30フェムトモル/hr/cm2で効率良くT-84細胞を通過した。
実験結果から3つの主要な結論が得られた。第1に、精製ボツリヌス菌神経毒は、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、125Iの結合によるリシン残基の改質は、これら性質を示すホロトキシンの能力を変化させない。第3に、BoNT Aはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125I−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
リシン残基で125Iへ結合したBoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Aを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、125Iへ結合したBoNT Aが細胞の基底面から頂端面へ輸送されたことを示した。それは効率良くT-84細胞を通過し、トランスサイトーシス率は8.98±0.20フェムトモル/hr/cm2と定量された。
リシン残基で125Iへ結合したBoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCaco−2細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量を標識化毒素の特定の活性に基づいて計算した。
実験結果から4つの主要な結論が得られた。第1に、精製ボツリヌス菌神経毒は、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、リシン残基の修飾はこれらの性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第3に、BoNT Aはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125I−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第4に、HCはヒト消化管上皮細胞通過時に1を超える分子(LC及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
リシン残基で125Iへ結合したBoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。精製神経毒は効率良くMDCK細胞を通過しなかったことが、トランスサイトーシス率の0.05±0.01フェムトモル/hr/cm2で示された。
BoNT Aは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
リシン残基で125Iへ結合した切れ目のないボツリヌス菌神経毒のトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−uBoNT Bを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化uBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、uBoNTは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。それは9.01±0.44フェムトモル/hr/cm2の割合で効率良くT-84細胞を通過した。
リシン残基で125Iへ結合した切れ目のないボツリヌス菌神経毒のトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイはlx10-8モル濃度(125I)−ボツリヌス菌毒素タイプBを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量を標識化毒素の特定の活性に基づいて計算した。
結果は、uBoNT Bは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。それは効率良くMDCK細胞(0.05±0.00フェムトモル/hr/cm2)を通過しなかった。uBoNTセロタイプBは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
リシン残基で125Iへ結合した切れ目のないボツリヌス菌神経毒のトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−uBoNT Bを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に上部(頂端面)室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化uBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、uBoNTは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。uBoNTは4.48±0.00フェムトモル/hr/cm2の割合で、効率良くT-84細胞を通過した。
リシン残基で125Iへ結合した切れ目のないボツリヌス菌神経毒のトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−uBoNTを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、上部(頂端面)室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化uBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、精製uBoNTは細胞の基底面から頂端面へあまり輸送されなかったことを示した。精製uBoNTは効率良くMDCK細胞(0.05±0.00フェムトモル/hr/cm2)を通過しなかった。
精製uBoNT Bは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
リシン残基で125Iへ結合した切れ目のあるBoNT Bのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してT-84細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−nBoNT Bを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化nBoNT Bの特定の活性を基礎にして計算した。
上記よりいくつかの結論が得られた。第1に、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、精製nBoNT Bは、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第3に、nBoNT Bはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125I−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第4に、nBoNT BのHCはヒト消化管上皮細胞通過時に1を超える分子(LC及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
リシン残基で125Iへ結合したnBoNT Bのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−nBoNT Bを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化nBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
精製nBoNT Bは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
リシン残基で125Iへ結合したnBoNT Bのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイは1x10-8モル濃度(125I)−nBoNT Bを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に上部(頂端面)室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化nBoNT Bの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、nBoNTは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。精製nBoNTは、5.54±0.00フェムトモル/hr/cm2の割合で効率良くT-84細胞を通過した。
リシン残基で125Iへ結合したnBoNT Bのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Bを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、上部(頂端面)室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化nBoNTの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、精製nBoNT Bは細胞の基底面から頂端面へあまり輸送されなかったことを示した。精製nBoNT Bは効率良くMDCK細胞(0.05±0.00フェムトモル/hr/cm2)を通過しなかった。精製nBoNT Bは、極性化したMDCK上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
HC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度HCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスした分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
実験結果から2つの主要な結論が得られた。第1に、ボツリヌス菌神経毒のHCは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、トランスサイトーシス後、基底面上へ放出される天然HCの分子サイズは変化していなかった。そのことからトランスサイトーシスのプロセスはHCの物理的構造を変えないという結論が導かれる。
HC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度HCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部(基底面)室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスした分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、HCは細胞の基底面から採取した媒体中には検知されなかったことを示した。従って、HCは効率良くMDCK細胞を通過しなかった。ボツリヌス菌神経毒のHCは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
リシン残基で125Iへ結合したHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)HCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化HCの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、HCは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。HCが効率良くT-84細胞を通過しただけでなく、得られたトランスサイトーシス率(7.10±0.00フェムトモル/hr/cm2)は精製BoNT Aのトランスサイトーシス率(11.34フェムトモル/hr/cm2)に匹敵した。
3つの主要な結論が得られた。第1に、HC、セロタイプAは、分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すHCの能力を変化させない。第3に、HCはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ125I−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
リシン残基で125Iへ結合したHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−HCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化HCの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、HCは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。HCは効率良くMDCK細胞を通過しなかったことが、トランスサイトーシス率の0.06±0.00フェムトモル/hr/cm2で示された。HC、セロタイプAは、極性化した腎臓上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
66kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度66kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
これら結果から3つの主要な結論が下記の通り得られた。第1に、66kHCは分化し、極性化したヒト消化管上皮細胞により、結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、トランスサイトーシス後、基底面に放出された66kHCの分子サイズは、変化していなかった。第3に、66kHCはヒト消化管上皮細胞の頂端面から基底面へ6×−ヒスチジン標識を輸送可能である。
66kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度66kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、66kHCは細胞の基底面から採取した媒体中には検知されなかったことを示した。従って、66kHCは効率良くMDCK細胞を通過しなかった。66kHCは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
50kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度50kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、50kHCフラグメントは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。50kHCは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量は変化しなかった。
50kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度50kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、50kHCは細胞の基底面から採取した媒体中には検知されなかったことを示した。従って、50kHCは効率良くMDCK細胞を通過しなかった。従って、50kボツリヌス菌神経毒のHCは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
リシン残基で125Iへ結合した50kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−50kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化50kHCの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、50kHCは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。50kHCは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、トランスサイトーシス率(13.97±0.00フェムトモル/hr/cm2)は精製BoNT Aのトランスサイトーシス率(11.34フェムトモル/hr/cm2)に匹敵した。
リシン残基で125Iへ結合した50kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−50kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化50kHCの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、50kHCは細胞の頂端面から基底面へあまり輸送されなかったことを示した。50kHCが効率良くMDCK細胞を通過しなかったことが、トランスサイトーシス率の0.06±0.00フェムトモル/hr/cm2で示された。従って、ボツリヌス菌神経毒の50kHCフラグメントは、極性化したMDCK上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
リシン残基で125Iへ結合した商標「ALEXAFLUOR」568BoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度商標「ALEXAFLUOR」568−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、蛍光分光法で分析した。関連するトランスサイトーシスの量は商標「ALEXAFLUOR」568BoNT A結合体の発光ピークに基づいて示した。
結果は、精製BoNT Aは小分子を細胞の頂端面から基底面輸送したことを示した。精製BoNT Aは効率良くT-84細胞を通過し、小分子が共輸送された。
リシン残基で125Iへ結合した商標「ALEXAFLUOR」568BoNT Aのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度商標「ALEXAFLUOR」568−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に底部室の内容物を集め、蛍光分光法で分析した。関連するトランスサイトーシスの量は商標「ALEXAFLUOR」568−標識化BoNT A結合体の発光ピークに基づいて示した。
結果は、精製BoNT Aは細胞の頂端面から基底面へ効率良く小分子を輸送しなかったことを示した。精製BoNT Aは効率良くMDCK細胞培養物中の小分子を共輸送しなかった。精製BoNT Aは、分化し、極性化したイヌ腎臓上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされたため、これら細胞を通して小分子を輸送できなかった。
ビオチン−50kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-7モル濃度ビオチン−50kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットをアビジン−HRPでプローブすることにより確認した。
結果は、ビオチン−50kHCは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。ビオチン−50kHCは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量及び受容体結合性は変化しなかった。
ビオチン−50kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-7モル濃度ビオチン−50kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットをアビジン−HRPでプローブすることにより確認した。
結果は、ビオチン−50kHCは細胞の頂端面から基底面へ効率良く輸送されなかったことを確認した。精製50kHCはMDCK培養物中の244ドルトン−ビオチン分子を効率良く共輸送しなかった。
実験結果から2つの主要な結論が得られた。第1に、ビオチン−50kHCは、分化し、極性化したイヌ腎臓上皮細胞により結合されず、内在化せず、トランスサイトーシスせず、放出されなかった。第2に、50kHCはイヌ腎臓上皮細胞のの頂端面から基底面へビオチンを輸送しなかった。
緑色蛍光蛋白質66kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度GFP−66kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、蛍光分光法で分析した。関連するトランスサイトーシスの量はGFP−66kHC結合体の発光ピークを基礎に示した。
結果は、66kHCは細胞の頂端面から基底面へ緑色蛍光蛋白質66kHCを輸送したことを示した。精製フラグメントは効率良くT-84細胞を通過し、緑色蛍光蛋白質66kHCが共輸送された。
緑色蛍光蛋白質66kHCのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度GFP−66kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、底部室の内容物を集め、蛍光分光法で分析した。関連するトランスサイトーシスの量はGFP−66kHC結合体の発光ピークを基礎に示した。
結果は、66kHCはGFP細胞の頂端面から基底面へは効率良く輸送しなかったことを示した。精製66kHCフラグメントはMDCK細胞培養物中のGFPを効率良く輸送しなかった。66kHCは、分化し、極性化したイヌ腎臓上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
商標「S-TAG」50kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度商標「S-TAG」−50kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、商標「S-TAG」−50kHCは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。商標「S-TAG」−50kHCは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量は変化しなかった。
商標「S-TAG」−50kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMadin-Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度商標「S-TAG」−50kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法により確認した。
結果は、商標「S-TAG」−50kHCは、細胞の基底面から採取した媒体中には検知されなかったことを示した。従って、商標「S-TAG」−50kHCは効率良くMDCK細胞を通過しなかった。商標「S-TAG」−50kHCは、極性化したMDCK細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
GST−88kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度GST−88kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットを抗GST抗体でプローブすることによりにより確認した。
結果は、GST−88kHCは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。GST−88kHCは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量は変化しなかった。
GST−88kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMDCK細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度GST−88kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットを抗GST抗体でプローブすることにより確認した。結果は細胞の頂端面から基底面へGST−88kHCを効率良く輸送しなかったことを示した。
GST−66kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してヒト消化管上皮(T-84)細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度GST−66kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットを抗GST抗体でプローブすることによりにより確認した。
結果は、GST−66kHCは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを確認した。GST−66kHCは効率良くT-84細胞を通過するだけではなく、分子の分子量は変化しなかった。
GST−66kHC、セロタイプAのトランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してMDCK細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度GST−66kHCを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの試験の最後に、1条件当り3個の底部室の内容物を集め、商標「CENTRICON」ミクロ濃縮機中で濃縮した。得られた溶液を7.5%(w/v)SDS-PAGE上に流し、続いてニトロセルロース膜へ移した。トランスサイトーシスされた分子の実体及び分子量は、抗HC抗体を使用したウェスタンブロット法及びコピーしたブロットを抗GST抗体でプローブすることにより確認した。
結果は、GST−66kHCは細胞の頂端面から基底面へ効率良く輸送されなかったことを示した。精製GST−66kHCは効率良くMDCK培養物を通過しなかった。GST−66kHCは、極性化したイヌ腎臓上皮細胞による、結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出は不充分になされた。
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCalu−3細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量を標識化毒素の特定の活性に基づいて計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は効率良くCalu−3細胞を通過した。トランスサイトーシス率は0.423±0.076フェムトモル/hr/cm2と定量された。
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCalu−3細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Aを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は効率良くCalu−3細胞を通過した。又、トランスサイトーシス率は0.206±0.037フェムトモル/hr/cm2と定量された。
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCalu−3細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−HC(セロタイプA)を上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化HCの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、HCは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。HCが効率良くCalu−3細胞を通過しただけでなく、得られたトランスサイトーシス率(0.198±0.007フェムトモル/hr/cm2)は精製ホロトキシンのトランスサイトーシス率(0.423フェムトモル/hr/cm2)に匹敵した。
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してCalu−3細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−HC(セロタイプA)を底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化HCの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、HCは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。HCが効率良くCalu−3細胞を通過しただけでなく、得られたトランスサイトーシス率(0.112±0.033フェムトモル/hr/cm2)は精製ホロトキシンのトランスサイトーシス率(0.206フェムトモル/hr/cm2)に匹敵した。
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してラット肺胞上皮細胞(RAEC)をインキュベートして分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Aを上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は効率良くラット肺胞上皮細胞を通過し、トランスサイトーシス率は0.376±0.014フェムトモル/hr/cm2と定量された。
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してラット肺胞上皮細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−BoNT Aを底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化BoNT Aの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、BoNT Aは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。精製神経毒は効率良くラット肺胞上皮細胞を通過し、トランスサイトーシス率は0.159±0.027フェムトモル/hr/cm2と定量された。
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してラット肺胞上皮細胞(RAEC)をインキュベートして分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−HC(セロタイプA)を上部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の底部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化HCの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、HCは細胞の頂端面から基底面へ輸送されたことを示した。HCは効率良くラット肺胞上皮細胞を通過するだけではなく、トランスサイトーシス率(0.140±0.050フェムトモル/hr/cm2)はボツリヌス菌神経毒タイプAのトランスサイトーシス率(0.376フェムトモル/hr/cm2)に匹敵した。
トランスサイトーシスを商標「TRANSWELL」装置アッセイシステムを使用してラット肺胞上皮細胞培養物を分析した。アッセイを1×10-8モル濃度(125I)−HC(セロタイプA)を底部室へ添加して開始した。続いて培養物を18時間、37℃でインキュベートした。それぞれの段階で実験の上部室の内容物を集め、ゲルろ過した。空隙容量フラクションを放射能アッセイし、毒素ピークを合計して合計数を決定した。トランスサイトーシスの量は、標識化HCの特定の活性を基礎にして計算した。
結果は、HCは細胞の基底面から頂端面への側面へ輸送されたことを示した。HCは効率良くラット肺胞上皮細胞を通過するだけではなく、トランスサイトーシス率(0.132±0.026フェムトモル/hr/cm2)はボツリヌス菌神経毒タイプAのトランスサイトーシス率(0.159フェムトモル/hr/cm2)に匹敵した。
この実施例は、ボツリヌス菌毒素は、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。これら実験は均一なBoNT及びスイス・ウェブスターメスマウス(25〜30グラム体重)を使用して行った。
BoNT Aを鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した後、36.4μg/kg体重(125I)−BoNT Aを20μl溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。個々の集団はそれぞれ1、2、又は3時間後にCO2ガスで犠牲にされ、心臓穿刺により血液を採取した。血漿を10分間の3000×gで遠心分離して血液から分離し、アッセイするまで−20℃で貯蔵した。続いて血漿サンプル(100μl)をPBS(400μl)と混合し、商標「SEPHADEX」G−25カラムを通してろ過した。フラクション(0.5ml)を集め、ガンマカウンターでフラクション中の放射性量を測定した。空隙容量で溶離した標識化BoNT A、及び空隙容量フラクション中に含有された放射能を、存在する蛋白質の合計量を決定するために合計した。
実験結果から5つの主要な結論が得られた。第1に、精製ボツリヌス菌神経毒はin vivoの気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、リシン残基の修飾はこれら性質を示すホロトキシンの能力を変えない。第3に、ホロトキシンはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ125I−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。第4に、HCはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へLCを輸送可能である。第5に、HCはin vivoのマウス気道上皮細胞を通過する時に1を超える分子(LC及びボルトンハンター試薬)を輸送可能である。
この実施例は、HC(セロタイプA)は、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。これら実験は均一に単離したBoNTのHC及びスイス・ウェブスターメスマウス(25〜30グラム体重)を使用して行った。
HCを鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した後、24.4μg/kg体重(125I)−HCを20μl溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。個々の集団はそれぞれ1、2、4又は6時間後にCO2ガスで犠牲にされ、心臓穿刺により血液を採取した。血漿を10分間の3000×gで遠心分離して血液から分離し、アッセイするまで−20℃で貯蔵した。続いて血漿サンプル(100μl)をPBS(400μl)と混合し、商標「SEPHADEX」G−25カラムを通してろ過した。フラクション(0.5ml)を集め、ガンマカウンターでフラクション中の放射性量を測定した。空隙容量で溶離した標識化HC、及び空隙容量フラクション中に含有された放射能を存在するHCの合計量を決定するために合計した。
3つの主要な結論が得られた。第1に、ボツリヌス菌神経毒のHCフラグメントはin vivoの気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、リシン残基の修飾は、これら性質を示すHCの能力を変化させない。第3に、HCはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ125I−ボルトンハンター試薬を輸送可能である。
この実施例は、50kHCは、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。これら実験は精製6×his標識融合型組み換え型50kHC及びスイス・ウェブスターメスマウス(それぞれ25〜30グラム体重)を使用して行った。
50kHCを鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した後、0.4mg/kg体重の蛋白質を20μl溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。個々の集団はそれぞれ0.5、1、2、又は4時間後にCO2ガスで犠牲にされ、心臓穿刺により血液を採取した。血漿を10分間の3000×gで遠心分離して血液から分離し、アッセイするまで−20℃で貯蔵した。HCフラグメントの血漿中濃度を捕獲ELISAにより決定した。
実験結果から2つの主要な結論が得られた。第1に、ボツリヌス菌神経毒の50kHCフラグメントはin vivoのマウス気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ6×−ヒスチジン標識を輸送可能である。
この実施例は、50kHCは、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。更に、50kHCは上皮細胞を通過してGSTを輸送できる。これら実験は精製組み換え型GST−50kHC及びスイス・ウェブスターメスマウス(それぞれ25〜30グラム体重)を使用して行った。
GST−50kHC融合蛋白質を鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した後、0.6μg/kg体重の蛋白質を20μl溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。個々の集団はそれぞれ1,2,4又は6時間後にCO2ガスで犠牲にされ、心臓穿刺により血液を採取した。血漿を10分間の3000×gで遠心分離して血液から分離し、アッセイするまで−20℃で貯蔵した。GST−50kHCの血漿中濃度を捕獲ELISAにより決定した。
実験結果から4つの主要な結論が得られた。第1に、GST−50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へGSTを輸送可能である。第3に、50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ6×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第4に、50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞を通過する時に1を超える分子(GST及び6×−ヒスチジン標識)を輸送可能である。
この実施例は、50kHCは、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。更に、50kHCは免疫反応を発現するために適切な構造の異種の分子を輸送できる。これら実験は精製組み換え型GST−50kHC及びスイス・ウェブスターメスマウス(それぞれ25−30グラム体重)を使用して行った。
鼻内免疫のために、マウスへ0.6mg/kg体重のGST−50kHCを20μlのPBS溶液で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した。蛋白質を20μl溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。5回投薬を7日間隔で投与した。第5回の免疫後、マウスを10日間飼育し、試験体を、GST、50kHC、及びGST−50kHCへの免疫反応性用免疫ブロット法で分析した。
実験結果から5つの主要な結論が得られた。第1に、GST−50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞により結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、放出される。第2に、50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へGSTを輸送可能である。第3に、50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞の頂端面から基底面へ6×−ヒスチジン標識を輸送可能である。第4に、50kHCはin vivoのマウス気道上皮細胞を通過する時に1を超える分子(GST及び6×−ヒスチジン標識)を輸送可能である。第5に、トランスサイトーシスしたGST−50kHCはin vivoでGST及び50kHCに対する特定の免疫反応を発現することが可能である。
この実施例はHCカルボキシ末端の2キロドルトンセグメントは、生きている動物の上皮細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な情報を含有することを示した。これを示すため、HCの48キロドルトン部分を、トリプシン消化で50kHCのカルボキシ末端の2キロドルトンフラグメントを削除して生成した。
この試験は、精製組み換え型48kHC及びスイス・ウェブスターメスマウス(25〜30グラム体重)を使用して行った。
すべての動物は、ボツリヌス菌毒素の致死量負荷後24時間以内に死亡した(即ち、保護効果はほとんど無かった。)。更に、抗原に対する血清IgGの濃度はほんの僅かだった。これらの結果は切除したHCのカルボキシ末端の2キロドルトンフラグメントはin vivoのマウス気道上皮細胞による結合、内在化、トランスサイトーシス、及び放出に関する重要な作用を有することを示した。
この実施例は、鼻内経路により50kHCを共投与した時、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)はBoNTに対する全身性免疫反応及び粘膜性免疫反応を発現することを示した。これら実験は精製組み換え型50kHC、コレラ毒素Bサブユニット(sigma)及びスイス・ウェブスターメスマウス(それぞれ25〜30グラム体重)を使用して行った。
マウスへ0.1mg/kg体重のCTBを含む10μlのPBS溶液、40μg/kg体重の50kHCを含む10μlのPBS溶液、又は50kHC及びCTBを含む10μlのPBS溶液を鼻内経路で投与した。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で軽く麻酔した。蛋白質を10μl溶液の外鼻孔への単回投与で投与した。動物の頭部は後部咽頭中へのドレナージを最小化するために垂直位置で保持した。3回投薬を2週間隔で投与した。第3回の免疫後、マウスを7日間飼育し、試験体をELISAでボツリヌス菌毒素Aへの免疫反応性を分析した。又、マウスは第3免疫10日後、致死量のボツリヌス菌毒素A(1μg/マウス)の負荷をかけ、生存率を2週間観察した。
これらの結果は、50kHCの鼻内投与は、0.4mg/kg(体重)の高い投薬量でさえ、BoNT Aの致死量負荷に対する、中程度のレベルの血清Ig応答及び僅か40%の動物の保護を発現するが粘膜性免疫反応を引き起こさないことを示した。しかし、粘膜性IgG応答はCTBの共投与により誘発されることができ、毒素の複合的致死量(multilethal dose;1μg/マウス)に対する保護を達成した。
この実施例は、100kDaHCは、生きている動物の、腸内細胞の頂端面上に受容体が結合され、内在化され、トランスサイトーシスされ、及び上皮細胞の基底面に放出されるために必要な全ての情報を含有することを示した。これら実験は天然ボツリヌス菌神経毒セロタイプAから精製HCを使用して、スイス・ウェブスターメスマウス(体重25−30グラム)へ(栄養)補給管を経由して投与して行った。
経口免疫のために、マウス当り10μgの100kDaHCを200μlのPBS溶液でマウスへ投与した。HCを含む200μlのPBS溶液をそれぞれのマウスへ栄養(補給)針を使用して投与した。最初の投薬の次に3個のブースターを2週間隔で与えた。マウスをイソフルラン(商標「ISO-THESIA」、Abbott Laboratories North社製、シカゴ、IL、米国)で麻酔し、それぞれのブースターの7日後、眼窩後部洞(sinus)から血液を採取した。抗体の生成はELISAによりアッセイされ、タイターを計算した。
この実施例はボツリヌス菌毒素のHC及びHCのフラグメントは、上皮細胞を通過して分子を広い範囲で輸送できることを示した。
これは輸送分子(即ち、HC又はHCのフラグメント)は、上皮細胞の表面へ結合されてエンドサイトーシス及びトランスサイトーシスを受けることで、豊富な積載分子(リガンド、酵素、抗原等)を全身循環系中へ運搬し、次に血液及びリンパ液中へ放出できることを意味する。
In vitro実験及びin vivo実験は実施例1〜52で記載したとおり行った。これら実験の結果は、HC又はそのフラグメントは、広く異なる分子量(下記表2に示すように)及び広く異なる機能(下記表2に示すように)を有する分子を輸送し、上皮細胞を通過可能なことを示した。
Claims (85)
- 動物の非角質上皮を通過してエンティティをトランスロケーションするための組成物であり、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)の重鎖(HC)のカルボキシ末端フラグメントへ結合しているエンティティを含有し、上記エンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない組成物。
- 上記BoNTはセロタイプA、B、及びEのBoNTの群から選ばれる請求項1の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約2%以上を含有する請求項1の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約5%以上を含有する請求項1の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約30%以上を含有する請求項1の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約50%以上を含有する請求項1の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCの約20〜約50(アミノ酸)残基を含有する請求項1の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCの約35以上のアミノ酸残基を含有する請求項1の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒のHCの約60以上のアミノ酸残基を含有する請求項1の組成物。
- 上記フラグメントはβ−三葉型ドメイン及びレクチン結合ドメインから選ばれるドメインを含有する請求項1の組成物。
- 上記フラグメントは介在分子によりエンティティへ結合している請求項1の組成物。
- 上記介在分子はアビジン、抗体物質、及びビオチンの群から選ばれる請求項11の組成物。
- 上記エンティティはペプチド結合によりフラグメントへ結合している請求項1の組成物。
- 上記エンティティはフラグメントのアミノ末端近くに結合している請求項1の組成物。
- 上記エンティティはフラグメントのアミノ末端へ結合している請求項1の組成物。
- 上記エンティティは超分子複合体である請求項1の組成物。
- 上記超分子複合体はマルチサブユニット蛋白質、フラグメントへ結合している蛋白質の1以上のサブユニット、である請求項16の組成物。
- 上記エンティティはポリペプチドである請求項1の組成物。
- 上記ポリペプチドは、動物の病原体に関連する蛋白質の免疫原性部分である請求項18の組成物。
- 上記病原体は、炭素菌、百日咳菌、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、ウェルチ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、Q熱リケッチア、クリミア−コンゴ出血熱ウィルス、野兎病菌、偽鼻疽菌、リシン、リフトバレー熱ウィルス、急性呼吸(窮迫)症候群(SARS)の原因物質であるコロナウィルス、サキシトキシン、ブドウ球菌エンテロトキシンB、トリコセシンマイコトキシン、大痘瘡ベネズエラウマ脳炎ウィルス、及びコレラ菌の群から選ばれた請求項19の組成物。
- 上記動物はヒトであり、上記病原体はボツリヌス菌神経毒である請求項19の組成物。
- 上記エンティティは抗体物質である請求項1の組成物。
- 上記抗体物質はテトラサブユニット免疫グロブリン及び単鎖抗体の群から選ばれた請求項22の組成物。
- 更に複数のエンティティを含有する請求項1の組成物。
- 上記動物は哺乳類である請求項1の組成物。
- 上記上皮は、肛門上皮、胃腸上皮、鼻上皮、眼性上皮、肺上皮、及び膣性上皮の群から選ばれる請求項1の組成物。
- 上記エンティティの分子量は約1000ドルトン以下である請求項1の組成物。
- 上記エンティティの分子量は約300ドルトン〜約550ドルトンである請求項1の組成物。
- 更にSEQ ID No:20〜168及び170〜188のポリペプチドの群から選ばれる補体成分蛋白質を含む請求項1の組成物。
- 脊椎動物中で抗原に対する免疫反応を発現する組成物であり、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合している抗原のエピトープの1以上を含有し、上記エピトープのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない組成物。
- 上記免疫反応は全身性免疫反応である請求項30の組成物。
- 上記免疫反応は粘膜性免疫反応である請求項30の組成物。
- 上記抗原は、炭素菌、百日咳菌、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、ウェルチ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、Q熱リケッチア、クリミア−コンゴ出血熱ウィルス、野兎病菌、偽鼻疽菌、リシン、リフトバレー熱ウィルス、急性呼吸(窮迫)症候群(SARS)の原因物質であるコロナウィルス、サキシトキシン、天然痘ウィルス、ブドウ球菌エンテロトキシンB、トリコセシンマイコトキシン、大痘瘡ベネズエラウマ脳炎ウィルス、及びコレラ菌、の抗原から選ばれる請求項30の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約2%以上を含有する請求項30の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約5%以上を含有する請求項30の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約30%以上を含有する請求項30の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約50%以上を含有する請求項30の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCの約20〜約50(アミノ酸)残基を含有する請求項30の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCの約35以上のアミノ酸残基を含有する請求項30の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒のHCの約60以上のアミノ酸残基を含有する請求項30の組成物。
- 脊椎動物中でボツリヌス菌神経毒に対して免疫反応を発現する組成物であり、ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントを含有する組成物。
- 上記免疫反応は全身性免疫反応である請求項41の組成物。
- 上記免疫反応粘膜性免疫反応である請求項41の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約2%以上を含有する請求項41の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約5%以上を含有する請求項41の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約30%以上を含有する請求項41の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約50%以上を含有する請求項41の組成物。
- ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合した抗原を含有するワクチンであり、上記抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、上記抗原は脊椎動物中の病原体に対して感染防御免疫を発現するワクチン。
- 肛門、鼻、肺、眼、口及び膣経路の群から選ばれた経路によりヒトへ投与するために処方された請求項48のワクチン。
- 複数の病原体への免疫性を発現する複数の抗原を含有し、それぞれの抗原はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのフラグメントへ結合している請求項48のワクチン。
- ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合している抗原を含有するワクチンであり、上記抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、上記抗原は脊椎動物中でボツリヌス菌神経毒に対して感染防御免疫を発現するワクチン。
- 抗原が脊椎動物の非角質上皮へ接触する時に抗原に対する免疫反応を発現する組成物であり、ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合している抗原のエピトープの1以上を含有する組成物。
- 動物の非角質上皮を通してエンティティをトランスロケーションする方法であり、エンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えず、上皮を、ボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合しているエンティティを含有する組成物と接触させることを含む方法。
- 上記BoNTはセロタイプA、B、及びEのBoNTの群から選ばれる請求項53の方法。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約2%以上を含有する請求項53の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約5%以上を含有する請求項53の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約30%以上を含有する請求項53の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHC分子量の約50%以上を含有する請求項53の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCの約20〜約50(アミノ酸)残基を含有する請求項53の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCの約35以上のアミノ酸残基を含有する請求項53の組成物。
- 上記フラグメントはボツリヌス菌神経毒のHCの約60以上のアミノ酸残基を含有する請求項53の組成物。
- 上記フラグメントは介在分子によりエンティティへ結合している請求項53の方法。
- 上記介在分子はアビジン、抗体物質、及びビオチンの群から選ばれる請求項61の方法。
- 上記エンティティはペプチド結合によりフラグメントへ結合している請求項53の方法。
- 上記エンティティはフラグメントのアミノ末端近くに結合している請求項53の方法。
- 上記エンティティはフラグメントのアミノ末端へ結合している請求項53の方法。
- 上記エンティティは超分子複合体である請求項53の方法。
- 上記超分子複合体はマルチサブユニット蛋白質、フラグメントへ結合している蛋白質の1以上のサブユニット、である請求項53の組成物。
- 上記エンティティはポリペプチドである請求項53の方法。
- 上記ポリペプチドは、動物の病原体に関連する蛋白質の免疫原性部分である請求項69の方法。
- 上記病原体は、炭素菌、百日咳菌、ウシ流産菌、イヌ流産菌、マルタ熱菌、ブタ流産菌、ウェルチ菌、破傷風菌、ジフテリア菌、Q熱リケッチア、クリミア−コンゴ出血熱ウィルス、野兎病菌、偽鼻疽菌、リシン、リフトバレー熱ウィルス、急性呼吸(窮迫)症候群(SARS)の原因物質であるコロナウィルス、サキシトキシン、天然痘ウィルス、ブドウ球菌エンテロトキシンB、トリコセシンマイコトキシン、大痘瘡、ベネズエラウマ脳炎ウィルス、及びコレラ菌の群から選ばれた請求項69の方法。
- 上記動物はヒトであり、病原体はボツリヌス菌神経毒である請求項69の方法。
- 上記エンティティは抗体物質である請求項53の方法。
- 上記抗体物質はテトラサブユニット免疫グロブリン及び単鎖抗体の群から選ばれた請求項53の方法。
- 更に複数のエンティティを含有する請求項53の方法。
- 上記動物は哺乳類である請求項53の方法。
- 上記組成物は更にSEQ ID No:20〜168及び170〜188のポリペプチドの群から選ばれる補体成分蛋白質を含む請求項54の方法。
- 脊椎動物中のエンティティに対する免疫反応を発現する方法であり、下記ステップを含む方法;
a)エンティティをボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合するステップ、但しエンティティのサイズは上皮細胞の小胞の管腔容量を超えない;及び
b)フラグメント結合したエンティティを上皮と接触させるステップ。 - 上記脊椎動物はヒトである請求項78の方法。
- 上記エンティティはヒト病原体の抗原である請求項79の方法。
- 脊椎動物中でクロストリジウム神経毒(BoNT)に対する免疫反応を発現する方法であり、上記方法は組成物の脊椎動物の上皮への接触を含み、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含み、上記エンティティは抗原が脊椎動物の循環系ヘデリバリーされた時に、脊椎動物中のボツリヌス菌神経毒に対して感染防御免疫を発現する抗原である方法。
- 脊椎動物の血流へエンティティを急速にデリバリーするための医薬組成物であり、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含み、肺投与用に配合されている組成物。
- 脊椎動物の血流へエンティティを急速にデリバリーするための医薬組成物であり、上記組成物はボツリヌス菌神経毒(BoNT)のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合したエンティティを含み、経口投与用に配合されている組成物。
- その食品成分のゲノムはボツリヌス菌神経毒のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合した、治療用又は免疫原性ポリペプチドを含有する蛋白質を発現的にエンコードするポリヌクレオチドを含有する食品。
- ボツリヌス菌神経毒のHCのカルボキシ末端フラグメントへ結合した免疫原性ポリペプチドを含有するトランスロケーション用ポリペプチド。
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