PL182667B1 - Mutant nietrwałej termicznie enterotoksyny holotoksyny z E.coli - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja przydatna jako składnik szczepionki przeciw enterotoksycznym organizmom bakteryjnym, w których następuje ekspresja choleropodobnych enterotoksyn, oraz sposoby jej stosowania.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja przydatna w tych sposobach. Kompozycja zawiera skuteczną ilość mLT w kombinacji ze skuteczną ilością antygenu.

Krótki opis rysunków

Wynalazek można dokładniej zrozumieć po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem wynalazku, przykładami konkretnych rozwiązań według wynalazku, oraz załączonymi rysunkami, przy czym:

Figura 1. Schematyczny diagram plazmidu pBD94, który koduje podjednostki A i B pod kontrolą promotora lac. Plazmid pBD95 zawiera pojedyncze podstawienie zasady przy reszcie aminokwasu 192 podjednostki A i koduje Gly zamiast Arg, co zachowuje ramkę odczytu, ale eliminuje miejsce proteolityczne. Pokazano sekwencję aminokwasów odpowiadającą obszarowi wrażliwości na trypsynę oraz miejsce podstawienia aminokwasu Argi92-Glyi92.

Figura 2. Graficzne przedstawienie zależnego od dawki wzrostu poziomu ADP-rybozyloagmatyny w funkcji wzrostu ilości CT.

Figura 3. Nagromadzanie się płynu po podaniu myszom 125 pg natywnego LT, ale nie po podaniu 125 pg mLT. Stosunek jelito/tusza określa się jako wagę jelita podzieloną przez wagę reszty tuszy.

Figura 4. Zdolność mLT do działania jako adjuwant immunologiczny. Fig. 4A - zdolność mLT do indukowania surowiczej reakcji IgG na OVA. Fig. 4B - zdolność mLT do indukowania śluzówkowej reakcji slgA na OVA.

Figura 5. Doświadczalne potwierdzenie, że mLT zachowuje zdolność do zapobiegania indukcji doustnej tolerancji na LT. Fig. 5A - zdolność mLT do indukowania surowiczej reakcji IgG na LT. Fig. 5B - zdolność mLT do indukowania śluzówkowej reakcji slgA na LT.

Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja i sposób jej stosowania w celu przyspieszenia wytwarzania śluzówkowych i surowiczych przeciwciał przeciw antygenom, które są równocześnie podawane doustnie wraz z genetycznie zmodyfikowaną bakteryjną toksyną. Zmodyfikowaną toksyna jest w postaci nietrwałej termicznie enterotoksyny (LT) E. coli, która poprzez modyfikację metodą inżynierii genetycznej utraciła swe miejsce wrażliwe na trypsynę, tak że cząsteczka stała się nietoksyczna, ale zachowała zdolność do działania jako immunologiczny adjuwant. Mutant LT jest w opisie określany jako mLT. Wynalazek oparty jest na odkryciu, że mLT jest równie skuteczny jak LT jako immunologiczny adjuwant, co jest nieoczekiwane i zaskakujące. mLT nie wykazuje już aktywności enzymatycznej w rybozylowaniu ADP, gdyż podjednostka A nie może już być poddana obróbce proteolitycznej. W przeciwieństwie do opublikowanych badań Lycke'a i współpracowników, którzy wykazali, że zmiany, które wpływają na aktywność LT w rybozylowaniu ATP uniemożliwiają również działanie cząsteczki jako adjuwanta [Lycke i inni, 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281], obecnie opisany mLT zachowuje aktywność jako adjuwant immunologiczny, mimo iż, jak to przedstawiono w przykładach, nie wykazuje aktywności w rybozylowaniu ADP.

Nowa forma mutantowa nietrwałej termicznie enterotoksyny E. coli, mLT, przedstawiona w opisie, zachowuje się jako adjuwant i wywołuje wytwarzanie zarówno surowiczego

182 667

IgG jak i śluzówkowego IgA przeciw antygenom, z którymi jest podawany. Przydatność tego nieoczekiwanego odkrycia polega na tym, że skutecznie działającą jako adjuwant ilość mLT można wykorzystać w skutecznym programie immunizacji przeciw wielu zarazkom poprzez doustne podawanie skutecznej ilości adjuwanta mLT w mieszaninie z uśmierconymi lub osłabionymi zarazkami lub odpowiednimi determinantami wirulencji określonych zarazków bez obawy o wystąpienie rzeczywistych lub potencjalnych toksycznych efektów ubocznych związanych z doustnym podawaniem CT lub LT.

Wynalazek zmienia stan wiedzy, gdyż można go wykorzystać w wielu zastosowaniach immunologicznych, w których można było zastosować CT, LT lub podjednostki CT albo LT, z tym że obecnie mLT nie wywołuje rzeczywistych lub potencjalnych efektów ubocznych takich jak biegunka, związanych z jego stosowaniem. W przeciwieństwie do LT, który jakkolwiek nie jest toksyczny bezpośrednio po wydzieleniu z bakterii, ale może stać się całkowicie toksyczny, gdy poddany zostanie działaniu proteaz, np. takich, które występują w jelicie ssaków, mLT nie może stać się toksyczny w wyniku uaktywniania proteolitycznego.

W innym wykonaniu przedmiotem wynalazku jest składnik szczepionki przeciw organizmom enterotoksycznym, w których następuje ekspresja toksyn cholero-podobnych. Stwierdzono, że mLT przy podawaniu doustnym nie wywołuje tolerancji odpornościowej, tak że może działać i jest wysoce pożądany jako składnik szczepionek skierowanych przeciw organizmom enterotoksycznym. Współczesna technologia dostarcza szczepionek przeciw organizmom, w których następuje ekspresja toksyn cholero-podobnych, zawierających uśmiercone całe komórki i podjednostkę B toksyny. Zastępując w szczepionce podjednostkę A przez mLT poprawia się szczepionkę na dwa różne sposoby. Po pierwsze mLT, który zawiera zarówno podjednostkę A jak i B, wywołuje reakcję odpornościową nie tylko w stosunku do podjednostki B, ale również w stosunku do podjednostki A. Zapewnia to więcej epitopów do skutecznej neutralizacji. Po drugie aktywność adjuwantowa właściwa dla mLT będzie wzmacniać reakcję odpornościową przeciw uśmierconym całym komórkom stanowiącym składnik szczepionki.

Inni badacze [Hase i inni, 1994, Infect. Immun. 62:3051-3057] wykazali, że podjednostka A zmodyfikowana tak, że nie jest już toksyczna w wyniku zmiany aktywnego miejsca enzymatycznej aktywności a rybozylowaniu ADP (w przeciwieństwie do miejsca proteolitycznego, które jest przedmiotem wynalazku) może wywołać reakcję odpornościową przeciw podjednostce A dzikiego typu. Jednakże tak zmodyfikowana podjednostka A nie wykazuje aktywności adjuwanta immunologicznego i z tego względu jest mniej pożądana jako składnik szczepionki niż mLT.

Ponadto, w związku z tym, że przeciwciała przeciw mLT reagują krzyżowo z LT i CT, mLT można wykorzystać także w szczepionkach skierowanych przeciw wielu typom enterotoksycznych organizmów bakteryjnych, w których zachodzi ekspresja toksyn choleropodobnych, takich jak Escherichia spp. i Vibrio spp.

Wytwarzanie mLT

Toksyna LT dzikiego typu jest kodowana w naturalnym plazmidzie występującym w szczepach enterotoksygenicznych E. coli zdolnych do wytwarzania tej toksyny. Twórcy sklonowali uprzednio gen LT z ludzkiego izolatu E. coli oznaczonego jako HI 0407. Ten subklon zawiera fragment DNA o 5,2 kD z enterotoksynowego plazmidu HI0407 wstawiony do miejsca Pstl plazmidu pBR322 [Clements i inni, 1983, Infect. Immun. 40:653]. Taki zrekombinowany plazmid, oznaczony jako pDF82, został dokładnie scharakteryzowany, a ponadto wywołuje on ekspresję LT pod kontrolą natywnego promotora LT. W następnym etapie tego procesu umieszczono gen LT pod kontrolą silnego promotora, w danym przypadku promotora lac, w plazmidzie pUC18. Przeprowadzono to wydzielając osobno geny LT-A i LT-B, oraz rekombinując je w kasecie w plazmidzie wektorowym. Był to bardzo ważny etap, gdyż umożliwił oczyszczenie znaczących ilości LT i pochodnych mutantów do wykonania następnie analizy. Plazmid oznaczony jako pBD94 przedstawiono schematycznie na fig. 1.

Zarówno CT jak i LT syntetyzowane są z wiązaniem peptydowym wrażliwym na trypsynę, które łączy części A| i Az. Takie wiązanie peptydowe musi zostać rozerwane, aby cząsteczka stała się toksyczna. Odnosi się to również do toksyny kokluszowej, prototypo

182 667 wej toksyny A-B, a także do szeregu innych toksyn bakteryjnych. Jeśli wiązanie A1-A2 nie zostanie usunięte przez proteazy bakteryjne lub przez proteazy jelitowe w świetle jelita, Ai nie może osiągnąć celu na boczno-podstawnej powierzchni jelitowej komórki nabłonkowej. W przeciwieństwie do CT LT nie jest w pełni aktywny biologicznie bezpośrednio po wydzieleniu z komórki. LT również wymaga proteolizy, aby być w pełni aktywny, z tym że aktywacja proteolityczna nie zachodzi we wnętrzu bakterii. Z tego względu jednym ze środków zmiany toksyczności cząsteczki bez wpływania na aktywność enzymatyczną w rybozylowaniu ADP mogłoby być usunięcie na drodze manipulacji genetycznej aminokwasów wrażliwych na trypsynę, które łączą składniki Ai i A2 podjednostki A. Jeśli cząsteczka nie będzie mogła być rozszczepiona proteolitycznie, nie będzie toksyczna. Specjalista może przewidzieć, że cząsteczka powinna jednak zachować aktywność enzymatyczną w rybozylowaniu ADP i w związku z tym działać jako adjuwant.

Na fig. 1 pokazano sekwencję złączonego poprzez disulfid obszaru, który rozdziela części Ai i A2. W obszarze tym znajduje się jedna reszta argininy, która, jak się uważa, stanowi miejsce rozszczepiania niezbędne do uaktywnienia toksycznych właściwości cząsteczki. Obszar ten zmieniono na drodze miejscowo ukierunkowanej mutagenezy w taki sposób, aby nadać cząsteczce niewrażliwość na trawienie proteolityczne, a w konsekwencji nietoksyczność.

Miejscowo ukierunkowaną mutagenezę przeprowadza się przez hybrydyzację z jednoniciowym DNA syntetycznego oligonukleotydu, który jest komplementarny z jednoniciową matrycą z wyjątkiem obszaru niedopasowanej znajdującego się bliżej niż w środku. To właśnie ten obszar zawiera pożądaną jedną lub więcej zmian nukleotydów. Po hybrydyzacji z jednoniciowym docelowym DNA oligonukleotyd wydłuża się polimerazą DNA uzyskując strukturę dwuniciową. Następnie przerwę uszczelnia się ligazą DNA i strukturę dupleksową transformuje się w E. coli jako gospodarzu. Teoretyczna wydajność mutantów przy wykorzystaniu takiej procedury wynosi 50% z uwagi na półzachowawczy charakter replikacji DNA. W praktyce wydajność jest o wiele niższa. Istnieje jednak szereg metod umożliwiających zwiększenie wydajności i selekcję mutantów ukierunkowaną na oligonukleotyd. W stosowanym układzie wykorzystano drugi mutageniczny oligonukleotyd w celu stworzenia zmienionych miejsc restrykcyjnych zgodnie ze strategią podwójnej mutacji.

Następny etap stanowiło zastąpienie innym aminokwasem Arg (np. GGA = Gly zastępuje AGA = Arg) , dzięki czemu zachowuje się ramkę odczytu, ale eliminuje się miejsce proteolityczne. mLT oczyszczano następnie metodą chromatografii powinowactwa na agarozie z jednego mutanta (pBD95), którego budowę potwierdzono przez sekwencjonowanie. Specjalistom znane są inne sposoby oczyszczania. Uzyskany mutant LT oznaczony jako LT(Ri92G) zbadano następnie metodą elektroforezy na SDS-żelu poliakrylamidowym w aspekcie modyfikacji wiązania wrażliwego na trypsynę. Próbki badano przed i po ekspozycji na trypsynę, porównując je z natywnym (niemodyfikowanym) LT. mLT nie dysocjuje na A| i A2 przy inkubowaniu z trypsyną, co oznacza, że wrażliwość na proteazę została usunięta.

Sposób podawania mLT i nie spokrewnionych antygenów

Według wynalazku mLT można podawać w połączeniu z dowolnym biologicznie znaczącym antygenem lub szczepionką, dzięki czemu uzyskuje się wzrost reakcji odpornościowej na ten antygen i/lub szczepionkę. W korzystnym wykonaniu mLT i antygen podaje się równocześnie w postaci kompozycji farmaceutycznej zawierającej skuteczną ilość mLT i skuteczną ilość antygenu. Kompozycję podaje się doustnie. Odpowiednie ilości mLT i antygenu będą zmieniać się w zależności od rodzaju stosowanego antygenu oraz gatunków immunizowanych zwierząt. W jednym wykonaniu po wstępnym podaniu mLT i antygenu stosuje się wspomagające odpowiedni antygen. W innym wykonaniu wspomagania nie stosuje się. Moment wspomagania może zmieniać się w zależności od antygenu i immunizowanych gatunków. Modyfikacje zakresu dawki i momentu wspomagania dla danych gatunków i antygenu można łatwo ustalić na podstawie rutynowych doświadczeń. Dopełnienie może zawierać sam antygen lub kombinacja z LT. Dopełnienie można podawać doustnie, donosowo lub pozajelitowe; jednakże jeśli mLT stosuje się w dopełnieniu, podawanie jest korzystnie doustne.

Sposoby i kompozycje według wynalazku przeznaczone są do wykorzystania w odniesieniu do niedojrzałych i dojrzałych kręgowców, zwłaszcza ptaków, ssaków i ludzi. Do uży

182 667 tecznych antygenów, podanych przykładowo i nie stanowiących ograniczeń, należą antygeny z patogenicznych szczepów bakterii (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococcus aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.); patogenicznych grzybów (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capssulatum); pierwotniaków (Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); albo Helminiths (Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium i tęgoryjec dwunastnicy), obecne w układzie odpornościowym w postaci całych komórek lub części wydzielonych z hodowli, w których hoduje się te organizmy w znany sposób, bądź też chronionych antygenów z tych organizmów uzyskanych technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Do innych odpowiednich antygenów należą patogeniczne wirusy (przykładowo, ale bez ograniczeń, wymienić można Poxviridae, Herpesviridae, wirus Herpes Simplex 1, wirus Herpes Simplex 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picomaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, wirusy grypy, wirusy parainfluency, świnki, odry, wirus oskrzelowy, wirus różyczki, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, wirus Hepatitis A, wirus Hepatitis B, wirus Hepatitis C, wirus Hepatitis E, wirus nie-A/nie-B Hepatitis, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae oraz wirus HIV) obecne w układzie odpornościowym w postaci całych komórek lub części wydzielonych z hodowli, w których hoduje się te wirusy w znany sposób, bądź też chronionych antygenów z tych wirusów uzyskanych technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Do kolejnych przykładów odpowiednich antygenów należą, ale nie wyłącznie, szczepionki. Do takich szczepionek należą przykładowo, ale nie wyłącznie, szczepionka przeciw grypie, szczepionka przeciw kokluszowi, szczepionka przeciw zapaleniu wątroby A, szczepionka przeciw zapaleniu wątroby B, szczepionka przeciw zapaleniu wątroby C, szczepionka przeciw zapaleniu wątroby E, szczepionka przeciw japońskiemu zapaleniu mózgu, szczepionka przeciw opryszczce, szczepionka przeciw odrze, szczepionka przeciw różyczce, szczepionka przeciw śwince, mieszana szczepionka przeciw odrze, śwince i różyczce, szczepionka przeciw papillomawirusowi, szczepionka przeciw parwowirusowi, szczepionka przeciw wirusowi oskrzelowemu, szczepionka przeciw chorobie Lime'a, szczepionka polio, szczepionka przeciw malarii, szczepionka przeciw ospie wietrznej, szczepionka przeciw rzeżączce, szczepionka przeciw HIV, szczepionka przeciw schistosomatozie, szczepionka przeciw rotawirusom, szczepionka przeciw mikoplazmie, szczepionka przeciw pneumokokom, szczepionka przeciw meningokokom itp. Można je wytwarzać powszechnie znanymi sposobami. Zazwyczaj szczepionki takie zawierają albo całe organizmy lub wirusy wyhodowane i wydzielone technikami dobrze znanymi specjalistom, albo też zawierają stosowne antygeny z tych organizmów lub wirusów wytworzone technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej. Ich wytwarzanie ilustrują następujące, ale nie jedyne, przykłady:

Szczepionka przeciw grypie: szczepionka zawierająca całość lub część hemaglutyniny, neuraminidazy, nukleoproteiny i białka matrycowego, uzyskiwanych przez oczyszczanie wi

182 667 rusa hodowanego w zapłodnionych jajkach, z eterem i detergentem, albo technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Szczepionka przeciw kokluszowi: szczepionka zawierająca całość lub część toksyny kokluszu, hemaglutyniny i K-aglutyny, uzyskiwana z niezjadliwej toksyny z formaliną którą ekstrahuje się przez wysalanie lub oddzielanie w ultrawirówce z bulionów lub komórek bakteryjnych Bordetella pertussis, albo technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Toksyna błonicowa i tężcowa w połączeniu ze szczepionką przeciw kokluszowi: szczepionka wymieszana ze szczepionki przeciw kokluszowi oraz toksyny błonicowej i tężcowej.

Szczepionka przeciw japońskiemu zapaleniu mózgu: szczepionka zawierająca całość lub część białka antygenowego, uzyskiwanego przez hodowlę wirusa w mózgach myszy, a następnie oczyszczanie cząstek wirusa w ultrawirówce lub za pomocą alkoholu etylowego, oraz ich dezaktywację, albo technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Szczepionka przeciw zapaleniu wątroby typu B: szczepionka zawierająca całość lub część białka antygenowego, uzyskiwanego przez wydzielenie i oczyszczanie antygenu HBs na drodze wysalania lub w ultrawirówce, otrzymanego z krwi przenoszącej zapalenie wątroby, albo technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Szczepionka przeciw odrze: szczepionka zawierająca całość lub część wirusa hodowanego w komórkach embrionalnych kurczaka lub w zapłodnionych jajach, albo chroniony antygen otrzymany technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Szczepionka przeciw różyczce: szczepionka zawierająca całość lub część wirusa hodowanego w komórkach embrionalnych kurczaka lub w zapłodnionych jajach, albo chroniony antygen otrzymany technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Szczepionka przeciw śwince: szczepionka zawierająca całość lub część wirusa hodowanego w komórkach królika lub w zapłodnionych jajach, albo chroniony antygen otrzymany technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Mieszana szczepionka przeciw odrze, śwince i różyczce: szczepionka uzyskana przez zmieszanie szczepionek przeciw odrze, śwince i różyczce.

Szczepionka Rota: szczepionka zawierająca całość lub część wirusa hodowanego w komórkach MA 104, albo wydzielonego z kału pacjentów, bądź też chroniony antygen otrzymany technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Szczepionka przeciw mikoplazmie: szczepionka zawierająca całość lub część komórek mikoplazmy hodowanych w ciekłej pożywce dla mikoplazmy, albo chroniony antygen otrzymany technikami inżynierii genetycznej lub na drodze syntezy chemicznej.

Stany, których skuteczne zapobieganie można osiągnąć sposobem według wynalazku, są znane specjalistom.

Kompozycje w postaci preparatów szczepionkowych według wynalazku otrzymać można przez zmieszanie powyższych przykładowych antygenów i/lub szczepionek z mLT w pożądanym stosunku. Produkcję należy prowadzić w warunkach absolutnie aseptycznych, a każdy składnik powinien być również aseptyczny. Pirogeny lub alergeny powinny być zbadane jak najpełniej. Preparat antygenowy według wynalazku można także stosować przygotowując osobno sam antygen i mLT.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw zawierający skuteczną ilość antygenu oraz adjuwantowo skuteczną ilość mLT. Przy stosowaniu składniki zestawu najpierw miesza się i podaje doustnie, albo też składniki można podawać doustnie osobno, w krótkim odstępie czasu.

Kompozycje w postaci preparatów szczepionkowych według wynalazku można łączyć z ciekłym lub stałym farmaceutycznym nośnikiem, przy czym kompozycje mogą być w postaci tabletek, kapsułek, proszków, granulatu, zawiesin lub roztworów. Kompozycje mogą także zawierać odpowiednie środki konserwujące, barwiące i smakowo-zapachowe, albo środki zapewniające powolne uwalnianie. Do potencjalnych nośników, które można zastosować przy wytwarzaniu kompozycji farmaceutycznych według wynalazku należą, ale nie wyłącznie, kapsułki żelatynowe, cukry, pochodne celulozy takie jak sól sodowa karboksymetylocelulozy, żelatyna, talk, stearynian magnezu, oleje roślinne takie jak olej arachidowy itp.,

182 667 gliceryna, sorbitol, agar i woda. Nośniki mogą także służyć jako środek wiążący ułatwiający tabletkowanie kompozycji do wygodnego podawania doustnego.

Kompozycje w postaci preparatów szczepionkowych według wynalazku mogą być utrzymywane w postaci zapewniającej trwałość przy przechowywaniu, gotowej do użycia, poprzez liofilizację lub wykorzystanie innych technik znanych specjalistom. Do podawania doustnego preparat szczepionkowy można odtworzyć jako zawiesinę w buforowanym roztworze soli, w mleku lub w innym fizjologicznie tolerowanym ciekłym ośrodku. Ośrodkowi można nadać przyjemniejszy wygląd i smak dodając w razie potrzeby odpowiednie środki barwiące i smakowo-zapachowe.

Podawanie kompozycji w postaci preparatów szczepionkowych można poprzedzić doustną dawką skutecznej ilości środka zobojętniającego kwas żołądkowy. Jakkolwiek można w tym celu zastosować wiele związków, to korzystny jest wodorowęglan sodowy. Kompozycje szczepionkowe można również podawać w postaci kapsułek z powłoką dojelitową (czyli kapsułek, które rozpuszczają się dopiero po przejściu przez żołądek).

Przykłady

Poniższe przykłady podano jedynie w celu zilustrowania wynalazku, tak że nie ograniczają one jego zakresu.

Konstrukcja mLT

Toksyna LT dzikiego typu jest kodowana w naturalnym plazmidzie występującym w szczepach enterotoksygenicznych E. coli zdolnych do wytwarzania tej toksyny. Twórcy sklonowali uprzednio gen LT z ludzkiego izolatu E. coli oznaczonego jako HI0407. Ten subklon zawiera fragment DNA o 5,2 kD z enterotoksynowego plazmidu HI0407 wstawiony do miejsca Pstl plazmidu pBR322 [Clements i inni, 1983, Infect. Immun. 40:653]. Taki zrekombinowany plazmid, oznaczony jako pDF82, został dokładnie scharakteryzowany, a ponadto wywołuje on ekspresję LT pod kontrolą natywnego promotora LT. W następnym etapie tego procesu umieszczono gen LT pod kontrolą silnego promotora, w danym przypadku promotora lac, w plazmidzie pUC18. Przeprowadzono to wydzielając osobno geny LT-A i LT-B, oraz rekombinując je w kasecie w plazmidzie wektorowym. Był to bardzo ważny etap, gdyż umożliwił oczyszczenie znaczących ilości LT i pochodnych mutantów do wykonania następnie analizy. Plazmid oznaczony jako pBD94 przedstawiono schematycznie na fig. 1.

Zarówno CT jak i LT syntetyzowane są z wiązaniem peptydowym wrażliwym na trypsynę, które łączy części Ai i Aj. Takie wiązanie peptydowe musi zostać rozerwane, aby cząsteczka stała się toksyczna. Odnosi się to również do toksyny kokluszowej, prototypowej toksyny A-B, a także do szeregu innych toksyn bakteryjnych. Jeśli wiązanie Ai-Aj nie zostanie usunięte przez proteazy bakteryjne lub przez proteazy jelitowe w świetle jelita, np. na drodze obróbki lub aktywowania proteolitycznego, Ai nie może osiągnąć celu na bocznopodstawnej powierzchni jelitowej komórki nabłonkowej. W przeciwieństwie do CT LT nie jest w pełni aktywny biologicznie bezpośrednio po wydzieleniu z komórki. LT również wymaga proteolizy, aby być w pełni aktywny, z tym że aktywacja proteolityczna nie zachodzi we wnętrzu bakterii. Z tego względu jednym ze środków zmiany toksyczności cząsteczki bez wpływania na aktywność enzymatyczną w rybozylowaniu ADP mogłoby być usunięcie na drodze manipulacji genetycznej aminokwasów wrażliwych na trypsynę, które łączą składniki Ai i Aj podjednostki A. Jeśli cząsteczka nie będzie mogła być rozszczepiona proteolitycznie, nie będzie toksyczna. Specjalista może przewidzieć, że cząsteczka powinna jednak zachować aktywność enzymatyczną w rybozylowaniu ADP i w związku z tym działać jako adjuwant.

Na fig. 1 pokazano sekwencję złączonego przez disulfid obszaru, który rozdziela części A| i Aj W obszarze tym znajduje się jedna reszta argininy, która, jak się uważa, stanowi miejsce rozszczepiania niezbędne do uaktywnienia toksycznych właściwości cząsteczki. Obszar ten zmieniono na drodze miejscowo ukierunkowanej mutagenezy w taki sposób, aby nadać cząsteczce niewrażliwość na trawienie proteolityczne, a w konsekwencji nietoksyczność.

Miejscowo ukierunkowaną mutagenezę przeprowadza się przez hybrydyzację z jednoniciowym DNA syntetycznego oligonukleotydu, który jest komplementarny z jednoniciową matrycą z wyjątkiem obszaru niedopasowanej znajdującego się bliżej niż w środku. To właśnie ten obszar zawiera pożądaną jedną lub więcej zmian nukleotydów. Po hybrydyzacji

182 667 z jednoniciowym docelowym DNA oligonukleotyd wydłuża się polimerazą DNA uzyskując strukturę dwuniciową. Następnie przerwę uszczelnia się ligazą DNA i strukturę dupleksową transformuje się w E. coli jako gospodarzu. Teoretyczna wydajność mutantów przy wykorzystaniu takiej procedury wynosi 50% z uwagi na półzachowawczy charakter replikacji DNA. W praktyce wydajność jest o wiele niższa. Istnieje jednak szereg metod umożliwiających zwiększenie wydajności i selekcję mutantów ukierunkowaną na oligonukleotyd. W stosowanym układzie wykorzystano drugi mutageniczny oligonukleotyd w celu stworzenia zmienionych miejsc restrykcyjnych zgodnie ze strategią podwójnej mutacji.

Następny etap stanowiło zastąpienie innym aminokwasem Arg (np. GGA = Gly zastępuje AGA = Arg), dzięki czemu zachowuje się ramkę odczytu, ale eliminuje się miejsce proteolityczne. mLT oczyszczano następnie metodą chromatografii powinowactwa na agarozie z jednego mutanta (pBD95), którego budowę potwierdzono przez sekwencjonowanie. Specjalistom znane są inne sposoby oczyszczania. Uzyskany mutant LT oznaczony jako LT(ri92G) zbadano następnie metodą elektroforezy na SDS-żelu poliakrylamidowym w aspekcie modyfikacji wiązania wrażliwego na trypsynę. Próbki badano przed i po ekspozycji na trypsynę, porównując je z natywnym (niemodyfikowanym) LT. mLT nie dysocjuje na Ai i A₂ przy inkubowaniu z trypsyną, co oznacza, że wrażliwość na proteazę została usunięta.

Wpływ mLT na komórki nadnercza Y-l

Specjalista mógłby przewidywać, że mLT powinien nie wykazywać aktywności w teście z komórkami nadnercza Y-l. Przewidywania te mogłyby być oparte na wcześniejszych ustaleniach [Clements i Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769], że nie nacięty LT jest ponad 1 000 razy mniej aktywny w tym teście niż CT, oraz że obróbka trypsyną uaktywnia LT do takiego samego poziomu aktywności biologicznej jak CT w tym teście. Zakładano, że resztkowa aktywność LT obserwowana w tym teście bez aktywowania trypsyną związana jest z pewną resztkową aktywnością proteazową która mogła nie zostać uwzględniona. Tak np. trypsyną stosowana jest w procesie hodowli komórek nadnercza Y-L W związku z tym zakładano, że LT, który nie może zostać nadcięty, powinien być całkowicie nieaktywny w teście z komórkami nadnercza Y-l. Wyniki podano w tabeli I.

Tabela I

Toksyna	Uaktywnianie trypsyną	Aktywność właściwa*
Toksyna cholery	-	15
LT	-	60
LT	4-	15
LT (R192G)	-	48 800
LT (RJ92G)	4-	48 800
* Minimalna dawka (pg/studzienkę) niezbędna do spowodowania w ponad 50% zaokrąglenia komórek

Z tabeli I nieoczekiwanie wynika, że mLT zachowuje podstawowy poziom aktywności w teście z komórkami nadnercza Y-l, nawet jeśli nie może ulegać obróbce proteolitycznej. Jak to pokazano w tabeli I, CT oraz natywny LT poddany obróbce trypsyną wykazują ten sam poziom aktywności (15 pg) w stosunku do komórek nadnercza Y-l. Natomiast mLT (48 000 pg) był ponad 1 000 razy mniej aktywny niż CT lub natywny LT, a ponadto nie można go było uaktywnić trypsyną. Resztkowa podstawowa aktywność bez wątpienia odzwierciedla odmienną i jak dotychczas nieznaną drogę uaktywniania komórek nadnercza, nie wymagającą rozdzielania połączenia Ai-A₂.

Aktywność enzymatyczna mLT w rybozylowaniu ADP

W związku z tym, że mutacyjne zastąpienie Argi9₂ przez Gly19₂ nie zmienia miejsca enzymatycznego w grupie Aj, specjalista mógłby przewidywać, że mLT powinien zachować swoją aktywność enzymatyczna mLT w rybozylowaniu ADP. W celu zbadania tej właściwo

182 667 ści wykonano test ADP-rybozylotransferazy NAD-agmatyny [Moss i inni, 1993, J. BioL Chem. 268:6383-6387], Jak to pokazano na fig. 2, CT powoduje zależny od dawki wzrost poziomów ADP-rybozyloagmatyny, funkcji aktywności ADP-rybozylotransferazowej tej cząsteczki.

Tabela II

Aktywność ADP-rybozylotransferazowa CT, natywnej LT i LT(ri92G)
Doświadczenie	1	2	3	4	Średnia±SEM
Bez toksyny	NO	9,12	5,63	14,17	9,64±2,48
ląg CT	ND	17,81	17,60	25,75	20,39^2,68
lOągCT	ND	107,32	111,28	104,04	107,55±2,09
100 pg CT	351,55	361,73	308,09	ND	340,46± 16,45
100 μg LT	17,32	14,48	13,86	ND	15,22±l,07
100 g LT + trypsyną	164,10	189,89	152,96	ND	168,98±10,94
100 pg LT(R|92G)	14,58	12,34	9,30	ND	12,07^1,53
100 pg LT(R192G) + trypsyną	14,73	8, 90	10,47	ND	11,37±1,74
ND = nie wykonywano wyniki podane w fmolach min’1

W tabeli II przedstawiono w formie tabelarycznej nieoczekiwanie stwierdzenie, że mLT nie wykazuje jakiejkolwiek wykrywalnej aktywności enzymatycznej w rybozylowaniu ADP, zarówno bez aktywowania jak i z aktywowaniem trypsyną, nawet jeśli miejsce enzymatyczne nie zostało zmienione, tak że uzyskuje się poziom podstawowy aktywności w teście z komórkami nadnercza Y-l.

Aktywność enterotoksyczna mLT

Z uwagi na nieoczekiwane stwierdzenie, że mLT nie wykazuje jakiejkolwiek wykrywalnej aktywności enzymatycznej w rybozylowaniu ADP, zarówno bez aktywowania jak i z aktywowaniem trypsyną, nawet jeśli miejsce enzymatyczne nie zostało zmienione, oraz dodatkowe stwierdzenie, że istnieje poziom podstawowy aktywności w teście z komórkami nadnercza Y-l, nie było jasne, czy mLT może zachować jakąkolwiek z jego właściwości endotoksycznych. Idealny preparat adjuwantowy mLT powinien zachowywać jego zdolność do działania jako adjuwant immunologiczny, ale powinien być pozbawiony rzeczywistych lub potencjalnych skutków ubocznych, takich jak powodowanie biegunki związane ze stosowaniem LT lub CT. Na fig. 3 pokazano, że mLT nie wywołuje wydzielania netto płynu w przypadku modelowych myszy, nawet w dawce 125 pg. Jest to dawka ponad pięciokrotnie większa od skutecznej dawki adjuwanta dla LT w takim modelu. Należy podkreślić, że przy takim poziomie zaobserwować można potencjalną toksyczność natywnego LT.

Działanie mLT jako adjuwanta

Specjalista mógłby przewidywać, że z uwagi na to, iż mLT nie wykazuje wykrywalnej aktywności ADP-rybozylotransferazowej oraz nie jest enterotoksyczny, nie powinien on wykazywać aktywności adjuwanta. Przewidywania takie mogłyby być oparte na doniesieniu Lycke'a i innych [Lycke i inni, 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281], w którym wykazano wyraźnie, że zmiany, które wpływają na enzymatyczną aktywność toksyny w rybozylowaniu ADP lub wpływają na zdolność do zwiększania wewnątrzkomórkowych poziomów cAMP powodują, że cząsteczka przestaje również działać jako adjuwant. Jak to przedstawiono powyżej, mLT nie wykazuje aktywności enzymatycznej w rybozylowaniu ADP oraz wykazują jedynie pewną, nie dającą się określić aktywność podstawową w komórkach nadnercza Y-l, a także nie wywołują wydzielania netto płynu w przypadku modelowych myszy.

182 667

W celu sprawdzenia działania mLT jako adjuwanta przeprowadzono następujące doświadczenie. 3 grupy myszy BALB/c poddano immunizowaniu. Zwierzęta zaszczepiono dożołądkowo za pomocą tępo zakończonej igły do karmienia (Pommer & Sons, Inc., New Hyde Park, New York). W dniu 0 każdą grupę immunizowano doustnie w następujący sposób: grupa A otrzymała 0,5 ml PBS zawierającego 5 mg OVA, grupa B otrzymała 0,5 ml PBS zawierającego 5 mg OVA i 25 pg natywnego LT, a grupa C otrzymała 0,5 ml PBS zawierającego 5 mg OVA i 25 pg mLT. Immunizację dla każdej grupy powtórzono w dniach 7 i 14. W dniu 21 u wszystkich zwierząt zastosowano wspomaganie dootrzewnowe podając 1 pg OVA w 20% Maalox'ie. Po tygodniu od szczepienia dootrzewnowego zwierzęta uśmiercono i oceniono w nich przeciwciała surowicze IgG i śluzówkowe IgA skierowane przeciw OVA i LT metodą ELISA.

Odczynniki i przeciwsurowice do testu ELISA uzyskano z Sigma Chemical Co. Próbki do testu ELISA rozcieńczano seryjnie roztworem soli buforowanym fosforanem (pH 7,2) - 20% Tween (PBS-TWEEN). Do oznaczeń przeciw-LT płytki microtiter wstępnie pokryto mieszanymi gangliozydami (Typ III) w ilości 1,5 pg/studzienkę, a następnie oczyszczonym LT w ilości 1 pg/studzienkę. Przeciw-OVA oznaczano na płytkach microtiter wstępnie powleczonych OVA w ilości 10 pg/studzienkę. Surowiczy przeciw-LT i przeciw-OVA oznaczano stosując przeciwsurowicę królika przeciw mysiemu IgG skoniugowanemu z alkaliczną fosfatazą. Śluzówkowe przeciw-LT i przeciw-OVA oznaczano stosując przeciwsurowicę kozią przeciw mysiemu IgA [specyficznemu względem łańcucha a], a następnie przeciwsurowicę królika przeciw koziemu IgG skoniugowanemu z alkaliczną fosfatazą. Reakcje przerywano 3N NaOH. Wielkości dla IgG i IgA wyznaczano ze standardowej krzywej dla oczyszczonych białek mysiego szpiczaka (MOPC 315, gA(IgA12); MOPC 21 gGl: Litton Bionetics, Inc., Charleston, SC).

Surowicze IgG przeciw-OVA

Jak to pokazano na fig. 4A, u zwierząt immunizowanych doustnie OVA i LT rozwinęła· się znacząco wyższa surowicza reakcja IgG przeciw-OVA po wykonanej następnie pozajelitowej immunizacji OVA (4 058 pg/ml) niż u zwierząt immunizowanych doustnie samym OVA, a następnie immunizowanych pozajelitowe OVA (brak wykrywalnej reakcji przeciwOVA) (test t Studenta p = 0,031). Należy zaznaczyć, że u zwierząt immunizowanych doustnie OVA i mLT również pojawiła się znacząco wyższa surowicza reakcja IgG przeciw-OVA po wykonanej następnie pozajelitowej immunizacji OVA (1 338 pg/ml), niż u zwierząt immunizowanych doustnie samym OVA, a następnie immunizowanych pozajelitowe OVA (brak wykrywalnej reakcji przeciw-OVA) (test t Studenta p = 0,0007).

Śluzówkowe slgA przeciw-OVA

Jak to pokazano na fig. 4B, podobne wyniki uzyskano, gdy reakcje IgA przeciw-OVA porównano dla tych samych grup zwierząt. U zwierząt immunizowanych doustnie OVA i LT rozwinęła się znacząco wyższa śluzówkowa reakcja IgA przeciw-θνλ po wykonanej następnie pozajelitowej immunizacji OVA (869 ng/ml) niż u zwierząt immunizowanych doustnie samym OVA, a następnie immunizowanych pozajelitowe OVA (brak wykrywalnej reakcji przeciw-OVA) (test t Studenta p = 0,0131). Podobnie jak powyżej, u zwierząt immunizowanych doustnie OVA i mLT również pojawiła się znacząco wyższa śluzówkowa reakcja IgA przeciw-OVA po wykonanej następnie pozajelitowej immunizacji OVA (230 ng/ml), niż u zwierząt immunizowanych doustnie samym OVA, a następnie immunizowanych pozajelitowo OVA (brak wykrywalnej reakcji przeciw-OVA) (test t Studenta p = 0,0189).

Surowicza IgG przeciw-LT

Zbadano również zdolność LT i mLT do wywoływania reakcji przeciwciała przeciw-LT na tych samych zwierzętach. Bardzo ważne było sprawdzenie, czy mutantowy LT jest zdolny do zapobiegania powstawaniu tolerancji na samego siebie oprócz działania jako adjuwant dla innych białek. Jak to pokazano na fig. 5A, u zwierząt immunizowanych doustnie OVA i LT rozwinęła się znacząco wyższa surowicza reakcja IgG przeciw-LT po wykonanej następnie pozajelitowej immunizacji OVA (342 pg/ml) niż u zwierząt immunizowanych doustnie samym OVA, a następnie immunizowanych pozajelitowo OVA (brak wykrywalnej reakcji przeciw-LT) (test t Studenta p = 0,0005). U zwierząt immunizowanych doustnie OVA i mLT również pojawiła się znacząco wyższa surowicza reakcja IgG przeciw-LT po wykonanej na

182 667 stępnie pozajelitowej immunizacji OVA (552 pg/ml), niż u zwierząt immunizowanych doustnie samym OVA, a następnie immunizowanych pozajelitowo OVA (brak wykrywalnej reakcji przeciw-LT) (test t Studenta p = 0,0026).

Sluzówkowe slgA przeciw-LT

Jak to pokazano na fig. 5B, podobne wyniki uzyskano, gdy reakcje IgA przeciw-OVA porównano dla tych samych grup zwierząt. U zwierząt immunizowanych doustnie OVA i LT rozwinęła się znacząco wyższa śluzowkowa reakcja IgA przeciw-LT po wykonanej następnie pozajelitowej immunizacji OVA (4 328 ng/ml) niż u zwierząt immunizowanych doustnie samym OVA, a następnie immunizowanych pozajelitowo OVA (brak wykrywalnej reakcji przeciw-LT) (test t Studenta p = 0,0047). Podobnie jak powyżej, u zwierząt immunizowanych doustnie OVA i mLT również pojawiła się znacząco wyższa śluzowkowa reakcja IgA przeciw-LT po wykonanej następnie pozajelitowej immunizacji OVA (1 463 ng/ml), niż u zwierząt immunizowanych doustnie samym OVA, a następnie immunizowanych pozajelitowo OVA (brak wykrywalnej reakcji przeciw-LT) (test t Studenta p = 0,0323).

Depozyt drobnoustrojów

Następujący plazmid został zdeponowany w American Type Culture Collection (ATCC) - Rockville, MD, dnia 18 sierpnia 1994 roku, gdzie nadano mu następujący numer Plazmid Numer pBD95 w E. coli LTR192G ATCC 69683

Opisany i zastrzeżony wynalazek nie jest ograniczony w zakresie konkretnymi ujawnionymi rozwiązaniami, gdyż celem tych rozwiązań jest zilustrowanie szeregu aspektów wynalazku. Dowolne równoważne rozwiązania uważa się za objęte zakresem wynalazku. W rzeczywistości różne modyfikacje wynalazku oprócz pokazanych i opisanych powyżej staną się oczywiste dla specjalistów po zapoznaniu się z powyższym opisem. Uważa się również, że modyfikacje takie wchodzą w zakres załączonych zastrzeżeń.

Należy ponadto zdawać sobie sprawę, że wszystkie liczby i wielkości dotyczące par zasad i reszt aminokwasów podane dla nukleotydów i peptydów są przybliżone i są użyte w celach opisowych.

W opisie cytowanych jest szereg odnośników, których całość ujawnienia wprowadza się jako źródła literaturowe.

182 667

Promotor Lac

_onAJ GGT TGT GGA GAT TCA TCA AGA ACA ATT ACA GGT GAT ACT TGT AAT BD94

Gly Cys Gly Asp Ser Ser Arg Thr Ile Thr Gly Asp Thr Cys Asn

TCA TCA GGA ACA ATT ACA MUTATOR OUGO θθτ TGT GGA GAT TCA TCA GGA ACA ATT ACA GGT GAT ACT TGT AAT BD95

Gly Cys Gly Asp Ser Ser Gly Thr Ile Thr Gly Asp Thr Cys Asn

I-----------------------------------------------------1----------------------------------------------------------------------------1

Pętla disulfidowa

Zmieniony peptyd wrażliwy na trypsynę

FIG.1

182 667

Stosunek jelito/tusza

godziny

FIG.3

182 667

6,000 ϊ 5,000 σ»

ρ.ο. 0VA 0VA/LT 0VA/LT(R192G)

3Χ 3Χ 3Χ i .p. 0VA 0VA 0VA

FIG.4A

3X 3X 3X

i.p. 0VA 0VA 0VA

FIG.4B

182 667

3Χ OVA

3Χ OVA

3Χ OVA

6,000 _τ

5,000

4,000 3,000

2,000 1,000 FIG.5A

ρ.ο.

ί.ρ.

OVA 3Χ OVA

OVA/LT 3Χ OVA

0VA/LT(R192G) 3Χ OVA

FIG.5B

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Mutant nietrwałej termicznie enterotoksyny holotoksyny z E. coli, w którym arginina w pozycji aminokwasowej 192 podjednostki A holotoksyny została zastąpiona glicyną, przy czym holotoksyna posiada zasadniczo mniejszą toksyczność niż natywna nietrwała termicznie enterotoksyna holotoksyna mierzoną w teście z komórką nadnercza Y-l, i posiada immunologiczną aktywność adjuwantową bez enzymatycznej aktywności rybozylacji ADP mierzonej w teście ADP-rybozylotransferazy NAD-agmatyny.
2. 2. Mutant holotoksyny według zastrz. 1, znamienny tym, że jest kodowany przez plazmid pBD95 zawarty w E. coli LTR192G o numerze dostępu ATCC 69683, który pozwala na ekspresję zarówno podjednostki A jak i podjednostki B nietrwałej termicznie enterotoksyny E. coli.
3. 3. Kompozycja do szczepień, znamienna tym, że zawiera antygen i mutanta holotoksyny, przy czym mutantem holotoksyny jest mutant nietrwałej termicznie enterotoksyny holotoksyny z E. coli, w którym arginina w pozycji aminokwasowej 192 podjednostki A holotoksyny została zastąpiona glicyną, przy czym holotoksyna zawiera mniejszą toksyczność niż natywna nietrwała termicznie enterotoksyna holotoksyna mierzoną w teście z komórką nadnercza Y-l, i posiada immunologiczną aktywność adjuwantową bez enzymatycznej aktywności rybozylacji ADP mierzonej w teście ADP-rybozylotransferazy NAD-agmatyny.
4. 4. Preparat do szczepień według zastrz. 3, znamienny tym, że zawiera dodatkowo odpowiedni nośnik, rozcieńczalnik lub zaróbkę.
5. 5. Preparat do szczepień według zastrz. 3, znamienny tym, że antygen został wybrany z grupy zawierającej: szczepionkę przeciw grypie, szczepionkę przeciw ospie wietrznej, toksoid błonicowy, toksoid tężca, szczepionkę przeciw krztuścowi, szczepionkę przeciw japońskiemu zapaleniu mózgu, mieszaną szczepionkę przeciw krztuścowi, błonicy i toksoidowi tężca, szczepionkę przeciw chorobie Lyme'ą szczepionkę polio, szczepionkę przeciw opryszczce, szczepionkę przeciw papillomawirusowi, szczepionkę przeciw zapaleniu wątroby typu B, szczepionkę przeciw rotawirusowi, HIV, szczepionkę przeciw Campylobacter, szczepionkę przeciw cholerze, szczepionkę przeciw enteropatogennej E. coli, szczepionkę przeciw enterotoksycznej E. coli, szczepionkę przeciw schistosomatozie, szczepionkę przeciw malarii, szczepionkę przeciw odrze, szczepionkę przeciw różyczce, szczepionkę przeciw śwince, mieszaną szczepionkę przeciw odrze, śwince i różyczce oraz szczepionkę przeciw mykoplazmie.
6. 6. Środek farmaceutyczny do otrzymywania odpowiedzi immunologicznej gospodarza wobec patogenu, znamienny tym, że zawiera mieszaninę skutecznej ilości antygenu i skutecznej ilości adjuwanta będącego mutantem nietrwałej termicznie enterotoksyny holotoksyny z E. coli, w którym arginina w pozycji aminokwasowej 192 podjednostki A holotoksyny została zastąpiona glicyną przy czym holotoksyna zawiera mniejszą toksyczność niż natywna nietrwała termicznie enterotoksyna holotoksyna mierzoną w teście z komórką nadnercza Y-l, i posiada immunologiczną aktywność adjuwantową bez enzymatycznej aktywności rybozylacji ADP mierzonej w teście ADP-rybozylotransferazy NAD-agmatyny.
7. 7. Środek farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że antygen wybrany jest z grupy obejmującej bakterie, wirusy, pierwotniaki, grzyby, robaki i inne zarazki drobnoustrojowe.
8. 8. Środek farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że antygen pochodzi z enterotoksycznego organizmu bakteryjnego.
9. 9. Środek farmaceutyczny według zastrz. 8, znamienny tym, że enterotoksyczny organizm bakteryjny jest wybrany z grupy enterotoksycznych organizmów bakteryjnych, w których następuje ekspresja toksyn cholero-podobnych.
10. 10. Środek farmaceutyczny według zastrz. 9, znamienny tym, że enterotoksyczne organizmy bakteryjne wybrane są z grupy obejmującej Escherichia spp. i Vibrio spp.

    182 667
11. 11. Zestaw do otrzymywania u gospodarza reakcji odpornościowej na patogen, znamienny tym, że zawiera 2 składniki: (a) skuteczną ilość antygenu oraz (b) adjuwantowo skuteczną ilość mutanta nietrwałej termicznie enterotoksyny holotoksyny z E. coli, w którym arginina w pozycji aminokwasowej 192 podjednostki A holotoksyny została zastąpiona glicyną przy czym holotoksyna zawiera niniejszą toksyczność niż natywna nietrwała termicznie enterotoksyna holotoksyna mierzoną w teście z komórką nadnercza Y-l, i posiada immunologiczną aktywność adjuwantową bez enzymatycznej aktywności rybozylacji ADP mierzonej w teście ADP-rybozylotransferazy NAD-agmatyny, przy czym obydwa składniki są zawarte w doustnie dopuszczalnym nośniku i mogą być podawane w postaci zmieszanej lub osobno w krótkim odstępie czasu.
12. 12. Zestaw według zastrz. 11, znamienny tym, że antygen pochodzi z enterotoksycznego organizmu bakteryjnego.
13. 13. Zestaw według zastrz. 12, znamienny tym, że enterotoksyczny organizm bakteryjny jest wybrany z grupy enterotoksycznych organizmów bakteryjnych, w których następuje ekspresja toksyn cholero-podobnych.
14. 14. Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że enterotoksyczne organizmy bakteryjne wybrane są z grupy obejmującej Escherichia spp. i Yibrio spp.

    * * *

    Zakres wynalazku

    Wynalazek dotyczy odmiennego genetycznie mutanta nietrwałej termicznie enterotoksyny (LT) E. coli, oraz jego zastosowania jako doustnego adjuwanta do indukowania przeciwciał w śluzówce i surowicy. W szczególności mutant LT zmodyfikowany jest przez podstawienie jednego aminokwasu, co eliminuje jego wrodzoną toksyczność, ale pozostawia nienaruszone właściwości cząsteczki jako adjuwanta.

    Stan techniki wynalazku

    Drobnoustrojowe zarazki mogą infekować gospodarza według jednego z szeregu mechanizmów. Mogą one przedostawać się przez przerwę w powłoce ciała, mogą być wprowadzone w wyniku transmisji wektora, albo też mogą oddziaływać z powierzchnią błony śluzowej. Większość ludzkich zarazków inicjuje chorobę według tego ostatniego mechanizmu, to znaczy po oddziaływaniu z powierzchniami błon śluzowych. Bakteryjne i wirusowe zarazki działające według tego mechanizmu najpierw stykają się z powierzchnią błony śluzowej, do której mogą się przyłączać tworząc następnie kolonie, albo też mogą być wchłonięte przez wyspecjalizowane komórki absorpcyjne (komórki M) w nabłonku, który przykrywa kępki Peyera lub inne grudki chłonne [Bockman i Cooper, 1973, Am. J. Anat. 136:455-477; Owen i inni, 1986, J. Infect. Dis. 153:1108-1118]. Organizmy, które wchodzą do tkanek limfatycznych, mogą być łatwo uśmiercone w grudkach chłonnych prowokując w ten sposób potencjalną ochronną reakcję immunologiczną jako antygeny, które dostarczane są do komórek odpornościowych wewnątrz grudek chłonnych (np. Vibrio cholerae). Zarazki, które przetrwają miejscowe mechanizmy ochronne, mogą rozprzestrzenić się z grudek chłonnych, a następnie spowodować chorobę miejscową lub ustrojową (np. Salmonella spp., wirus polio, rotawirus u gospodarzy mających obniżoną odporność).

    Wydzielnicze przeciwciała IgA (slgA) ukierunkowane przeciw określonym determinantom wirulencji infekujących organizmów odgrywają istotną rolę w ogólnej odporności śluzówki [Cebra i inni, 1986, w: Yaccines 86, Brown i inni (red.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, str. 129-133]. W wielu przypadkach zapobiec można początkowej infekcji powierzchni błony śluzowej przez pobudzanie wytwarzania śluzówkowych slgA ukierunkowanych przeciw odpowiednim determinantom wirulencji infekcyjnych organizmów. Wydzielnicze IgA mogą zapobiec początkowemu oddziaływaniu zarazka z powierzchnią błony śluzowej poprzez blokowanie przyłączania się i/lub kolonizacji, neutralizowanie toksyn działających na powierzchnię albo zapobieganie zaatakowaniu komórek gospodarza. Jakkolwiek obszerne badania wykonano w celu ustalenia roli odporności z udziałem komórek oraz prze

    182 667 ciwciała surowiczego w ochronie przed czynnikami infekcyjnymi, wiedza odnośnie regulowania, indukowania i wydzielania slgA jest znacznie mniejsza. Podawane pozajelitowo preparaty z inaktywowanych pełnych komórek lub pełnych wirusów są skuteczne w ujawnianiu ochronnych IgG surowicy i opóźnionego typu reakcji nadwrażliwości przeciw organizmom, w przypadku których występuje znacząca faza surowicza w ich patogenezie (np. Salmonella typhi, Hepatitis B). Szczepionki pozajelitowe nie sąjednak skuteczne w ujawnianiu śluzówko wy ch odpowiedzi slgA, oraz nie są skuteczne przeciw bakteriom, które oddziaływują z powierzchniami błon śluzowych i nie dokonują inwazji (np. Vibrio cholerae). Ostatnio potwierdzono jednak, że pozajelitowo podawane szczepionki mogą być skuteczne przeciw co najmniej jednemu wirusowi, rotawirusowi, który oddziaływuje przede wszystkim z powierzchniami błon śluzowych [Conner i inni, 1993, J. Virol. 67:6633-6641], Zakłada się, że ochrona wynika z przesiąkania IgG specyficznego względem antygenu na powierzchnie błon śluzowych w celu zneutralizowania wirusa. W związku z tym mechanizmy, które pobudzają zarówno śluzówkowe jak i surowicze przeciwciała, są bardzo ważne dla zapewnienia skuteczności szczepionek.

    Doustna immunizacja może być skuteczna do wywołania specyficznych odpowiedzi slgA, jeśli antygeny znajdują się w limfocytach T i B oraz w komórkach przejmujących znajdujących się w kępkach Peyera, w których inicjowany jest wybiórczy rozwój IgA komórek B. Kępki Peyera zawierają komórki pomocniki T (TH), które uczestniczą w bezpośrednim przełączaniu izotypu komórek B z komórek IgM do komórek B IgA. Kępki zawierają także komórki T, które inicjują końcowe różnicowanie komórek B. Uzbrojone komórki B migrują następnie do krezkowych węzłów chłonnych i ulegają różnicowaniu, wchodzą do przewodu piersiowego, a następnie do ogólnego krążenia, po czym zasiedlają wszystkie tkanki wydzielnicze w organizmie, w tym blaszkę właściwą jelita oraz przewód oddechowy. Następnie przez dojrzałe komórki osocza wytwarzane jest IgA, które zostaje skompleksowane ze składnikiem wydzielniczym związanym z błoną i przeniesione na powierzchnię błony śluzowej, gdzie może oddziaływać z inwazyjnymi zarazkami [Strober i Jacobs, 1985, w: Advances in host defence mechanisms. Vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin i Fauci (red.), Raven Press, New York, str. 1-30; Tomasi i Plaut, 1985, w: Advances in host defence mechanisms. Vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin i Fauci (red.), Raven Press, New York, str. 31-61]. Istnienie tego wspólnego śluzowkowego układu odpornościowego wyjaśnia w części skuteczność żywych doustnych szczepionek lub doustnej immunizacji w ochronie przed zarazkami, które inicjują infekcję oddziaływując najpierw z powierzchniami błon śluzowych.

    Opracowano szereg strategii doustnej immunizacji, w tym zastosowanie osłabionych mutantów bakterii (np. Salmonella spp.) jako nośników heterologicznych antygenów [Cardenas i Clements, 1992, Clin. Microbiol. Rev. 5:328-342; Clements i inni, 1992, w: Recombinant DNA Vaccines: Rationale and Strategy, Isaacson (red.), Marcel Decker, New York, str. 293-321; Clements i Cardenas, 1990, Res. Microbiol. 141:981-993; Clements i ElMorshidy, 1984, Infect. Immun. 46:564-569], kapsułkowanie antygenów w mikrokulkach wykonanych z poli-DL-laktydu-glikolidu (PGL), białko-podobnych polimerów - proteinoidów [Sanitago i inni, 1993, Pharmaceutical Research 10:1243-1247], w kapsułkach żelatynowych, w różnych preparatach liposomowych [Alving i inni, 1986, Vaccine 4:166-172; Garcon i Six, 1993, J. Immunol. 146:3697-3702; Gould-Fogerite i Mannino, 1993, w: Liposome Technology, 2 wyd., Vol. III, Gregoriadis (red.)], adsorpcję na nanocząstkach, zastosowanie lipofilowych kompleksów pobudzających odporność (ISCOMS) [Mowat i Donachie, 1991, Immunology Today 12:383-385] oraz dodawanie produktów bakteryjnych o znanych właściwościach wspomagających [Clements i inni, 1988, Vaccine 6:269-277; Elson, 1989, Immunology Today 146:29-33; Lycke i Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308; Lycke i inni, 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281]. Do dwóch produktów bakteryjnych o największej skuteczności w działaniu jako doustne adjuwanty, należy toksyna cholery (CT) produkowana przez różne szczepy V. cholerae, oraz nietrwała termicznie enterotoksyna (LT) produkowana przez pewne enterotoksygeniczne szczepy Escherichia coli. Jakkolwiek LT i CT wykazują wiele wspólnych cech, stanowią wyraźnie różne cząsteczki, których różnice biochemiczne i immunologiczne powodują że są one unikatowe.

    182 667

    Intensywna biegunka choleryczna wywoływana jest przez silną egzo-enterotoksynę, którą powoduje uaktywnienie cyklazy adenylowej, a następnie wzrost wewnątrzkomórkowych poziomów cyklicznego monofosforanu 3',5'-adenozyny (cAMP). Enterotoksyna cholery (CT) stanowi polimeryczne białko o 84 000 daltonach złożone z dwóch głównych, niekowalencyjnie zasocjowanych, immunologicznie różnych obszarów lub domen (cholera-A i cholera-B) [Finkelstein i LoSpatullo, 1969, J. Exp. Med. 130:185-202], Obszar o 56 000 daltonach, czyli choleragenoid, odpowiedzialny jest za wiązanie się toksyny z receptorem błony komórkowej gospodarza, Gmi (galaktozylo-N-acetylogalaktozaminylo-(sialilo)-galaktozyloglukozyloceramid), który występuje na powierzchni zasadniczo wszystkich komórek eukariotycznych. Choleragenoid składa się z 5 niekowalencyjnie zasocjowanych podjednostek, natomiast obszar A (27 000 daltonów) odpowiedzialny jest za odmienne działanie biologiczne toksyny.

    Zależność między dwoma podjednostkami CT w aspekcie właściwości immunologicznych cząsteczki stała się przedmiotem obszernej dyskusji. Z jednej strony CT jest doskonałym immunogenem, który prowokuje rozwój odpowiednich przeciwciał przeciw toksynie zarówno w surowicy jak i w śluzówce, gdy podawany jest doustnie. Nie jest to nowe odkrycie, gdyż wiadomo, że u osób chorych na cholerę występuje wzrost mian przeciwciał przeciw toksynie podczas rekonwalescencji po przebytej cholerze [Finkelstein, 1975, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 69:137-196], Jednym z kluczowych odkryć tych badań nad charakterem tej reakcji była obserwacja, że CT w przeciwieństwie do większości innych antygenów białkowych nie indukuje doustnej tolerancji przeciw sobie [Elson i Eadling, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897; Elson i Eadling, 1984, J. Immunol. 132:2736-2741], Zostało to również stwierdzone, gdy samą podjednostkę B wprowadzano do myszy, oraz potwierdzone w próbach polowych ze szczepionką przeciw cholerze w Bangladeszu, w których doustna immunizacja podjednostką B w kombinacji z uśmierconymi całymi komórkami wywołała wzrost śluzówkowych, a także ustrojowych reakcji przeciwciał przeciw toksynie [Svennerholm i inni, 1984, J. Infect. Dis. 149:884-893].

    Będąc silnym doustnym immunogenem CT wykazuje również szereg innych właściwości immunologicznych. Jak to zaznaczono powyżej, Elson i Eadling [Elson i Eadling, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897] zaobserwowali, że podawany doustnie CT nie wywołuje tolerancji przeciw sobie. Ponadto przy równoczesnym doustnym podawaniu CT wraz z rozpuszczalnym antygenem białkowym, hemocyjaniną pijawki (KLH) uzyskuje się rozwinięcie reakcji wydzielniczego IgA przeciw zarówno CT jak i KLH, a także zniesienie indukcji doustnej tolerancji przeciw KLH. Odkrycia te zostały następnie potwierdzone i rozszerzone przez Lycke'a i Holmgrena [Lycke i Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308]. Zamieszanie powstaje, gdy pragnie się zdefiniować rolę podjednostek A i B w CT w odniesieniu do właściwości cząsteczki jako adjuwanta. Podstawę do tego zamieszania stanowią następujące obserwacje zestawione przez Elsona [Elson, 1989, Immunology Today, 146:29-33]:

    - CT nie indukuje doustnej tolerancji przeciw sobie [Elson i Eadling, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897].

    - CT-B nie indukuje doustnej tolerancji przeciw sobie [Elson i Eadling, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897],

    - CT może zapobiegać powstawaniu tolerancji przeciw innym antygenom, z którymi jest równocześnie podawany, a także służy jako adjuwant dla tych antygenów [Elson i Eadling, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897; Lycke i Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308].

    - CT może działać jako adjuwant dla CT-B [Elson i Eadling, 1984, J. Immunol. 133:2892-2897],

    - Agregowany na ciepło CT wykazuje niewielką toksyczność, ale jest silnym doustnym immunogenem [Pierce i inni, 1983, Infect. Immun. 40:1112-1118],

    CT-B może służyć jako immunologiczny nośnik w tradycyjnej konfiguracji hapten-nośnik [Cebra i inni, 1986, w: Vaccines 86, Brown i inni (red.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, str. 129-133; McKenzie i Halsey, 1984, J. Immunol. 133:1818-1824].

    Na podstawie tych ustaleń szereg badaczy doszło do wniosku, że podjednostką B musi wykazywać pewną właściwą aktywność adjuwanta. Ustalenia, których dokonali Cebra i inni

    182 667

    [Cebra i inni, 1986, w: Vaccines 86, Brown i inni (red.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, str. 129-133], Lycke i Holmgren [Lycke i Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308] oraz Liang i inni [Liang i inni, 1988, J. Immunol. 141:1495-1501] kłócą się z tym wnioskiem. Cebra i inni [Cebra i inni, 1986, w: Vaccines 86, Brown i inni (red.), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, str. 129-133] wykazali, że oczyszczony CT-B skutecznie zwiększa częstość komórek B specyficznych przeciw cholerze w kępkach Peyera, gdy podawany jest dodwunastniczo, ale w przeciwieństwie do CT nie powoduje powstania w znaczącej ilości komórek B związanych z CT. Lycke i Holmgren [Lycke i Holmgren, 1986, Immunology 59:301-308] porównali CT i CT-B pod względem zdolności do wzmacniania reakcji odpornościowej śluzówki jelita na KLH mierząc wydzielające immunoglobulinę komórki w blaszce właściwej doustnie immunizowanych myszy. Nie stwierdzili oni wzrostu ilości komórek wytwarzających przeciw-KLH w reakcji na jakąkolwiek dawkę podjednostki B badanej w swoich układach. Ponadto Liang i inni [Liang i inni, 1988, J. Immunol. 141:1495-1501] nie stwierdzili działania adjuwanta, gdy CT-B podawano doustnie w połączeniu z inaktywowanym wirusem Sendai.

    Gdy zaobserwowano aktywność adjuwanta dla wydzielonej podjednostki B, zazwyczaj wynikało to z jednego z dwóch powodów. Po pierwsze tradycyjny sposób preparowania podjednostki B obejmuje poddawanie holotoksyny chromatografii dysocjacyjnej na drodze filtracji żelowej w obecności środka dysocjującego (np. chlorowodorku guanidyny lub kwasu mrówkowego). Wydzielone podjednostki zbiera się, po czym usuwa się środek dysocjujący. Podjednostka B preparowana taką techniką jest bez wątpienia zanieczyszczona śladowymi ilościami podjednostki A, tak że przy renaturacji odtwarza się niewielką ilość holotoksyny. Drugi powód związany jest z definicją nośnika immunologicznego. Podobnie jak wiele innych rozpuszczalnych białek, podjednostka B może służyć jako nośnik immunologiczny do wystawiania antygenów na działanie układu odpornościowego. Gdy takie antygeny są na tyle małe, aby ich immunogeniczność była niewielka, mogą one stać się immunogeniczne w tradycyjnej konfiguracji hapten-nośnik. Podobnie występuje teoretyczne wzmocnienie odporności związane z podjednostkąB, zwłaszcza w odniesieniu do prezentacji doustnej, związane z tym, że podjednostka B wiąże się z powierzchnią komórek nabłonkowych i może unieruchomić przyłączony antygen, tak że zostanie on poddany obróbce przez tkanki limfatyczne związane z jelitem. Jednakże jakakolwiek zaleta takiego mechanizmu stabilizowania antygenu może odbić się na rozkładzie antygenu w nie związanych immunologicznie tkankach, np. na powierzchni jelitowych komórek nabłonkowych. W związku z reaktywnością śluzówki immunologicznie związane miejsca stanowią kępki Peyera, zwłaszcza w odniesieniu do uaktywniania specyficznych względem antygenu komórek B zależnych od komórek T [Strober i Jacobs, 1985, w: Advances in host defence mechanisms. Vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin i Fauci (red.), Raven Press, New York, str. 1-30; Tomasi i Plaut, 1985, w: Advances in host defence mechanisms. Vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin i Fauci (red.), Raven Press, New York, str. 31-61; Brandtzaeg, 1989, Curr, Top. Microbiol. Immunol. 146:13-25]. I tak zjawiska aż do przełączania izotypu z komórek IgM do komórek B IgA zachodzą w kępkach Peyera. Antygeny zlokalizowane na powierzchni komórki nabłonkowej mogą uczestniczyć w indukowanej przez antygen proliferacji komórek B, gdyż kosmkowe komórki nabłonkowe klasy II dodatniej mogą działać jako komórki prezentujące antygen w uaktywnianiu komórek T w miejscu wydzielania, dzięki czemu zwiększa się wytwarzanie cytokiny, końcowe różnicowanie komórek B, zwiększa się ekspresja składnika wydzielniczego oraz zwiększa się zewnętrzny transport IgA specyficznego względem antygenu [Tomasi i Plaut, 1985, w: Advances in host defence mechanisms. Vol. 4. Mucosal Immunity, Gallin i Fauci (red.), Raven Press, New York, str. 31-61]. Zależności występujące w tych zjawiskach nie zostały wyraźnie zdefiniowane dla podjednostki B jako nośnika innych antygenów, w związku z czym użycie określenia adjuwant nie wydaje się odpowiednie dla takiego zjawiska.

    Wyraźnie właściwość cząsteczki jako adjuwanta związana jest z holotoksyną gdyż podjednostka B wymagana jest do rozpoznania receptora i ułatwienia penetracji podjednostki A do komórki. Podjednostka A jest również niezbędna do ujawnienia się aktywności adjuwanta, prawdopodobnie w związku z działaniem jej ADP-rybozylującej aktywności enzymatycznej

    182 667 oraz ze zdolnością do zwiększania wewnątrzkomórkowych poziomów cAMP (patrz poniżej). Sama podjednostka B może działać jako nośnik innych antygenów, gdyż po skoniugowaniu z tymi antygenami mogą one zostać unieruchomione tak, że zostaną poddane obróbce przez tkanki limfatyczne związane z jelitem.

    Jakkolwiek LT i CT mają wiele wspólnych cech, stanowią wyraźnie różne cząsteczki, których różnice biochemiczne i immunologiczne powodują, że są one unikatowe; należy do nich 20% różnica w homologii sekwencji nukleotydów i aminokwasów [Dallas i Falków, 1980, Naturę 288:499-501], Obydwie toksyny wykazują taką samą liczbę i uszeregowanie podjednostek, taki sam mechanizm działania biologicznego oraz taką samą aktywność właściwą w wielu testach in vitro [Clements i Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769; Clements i inni, 1980, Infect. Immun. 24:91-97],

    Istnieją jednak znaczące różnice między tymi cząsteczkami, które wpływają nie tylko na ich właściwości enterotoksyczne, ale także na ich zdolność do działania jako adjuwantów. Przede wszystkim w przeciwieństwie do CT wytwarzanego przez V. cholerae LT pozostaje związany z komórką i uwalniany jest z E. coli jedynie podczas lizy komórek [Clements i Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769]. CT wydzielany jest przez przecinkowca wkrótce po zsyntetyzowaniu i może być łatwo zidentyfikowany w supematantach z hodowli, z których można go oczyszczać. Natomiast LT, w przeciwieństwie do CT, nie jest od razu w pełni biologicznie czynny, gdy zostanie wydzielony z komórki. Zgodnie z modelem A-B dla toksyn bakteryjnych LT wymaga proteolizy i redukcji disulfidu, aby być w pełni aktywny. Przy braku obróbki proteolitycznej enzymatycznie aktywna część A] nie jest zdolna do odłączenia się od składnika A 2 i nie może osiągnąć docelowego substratu (cyklazy adenylowej) na bocznopodstawnej powierzchni jelitowej komórki nabłonkowej. Jest tak również w przypadku CT, z tym że proteazy w supematancie hodowli, których działaniu poddana jest toksyna podczas oczyszczania, ulegają proteolizie. W związku z tym, że CT nie jest w pełni biologicznie czynny, trudno jest zidentyfikować go w czasie oczyszczania za pomocą testów biologicznych in vitro, takich jak test z komórką nadnercza Y-l lub test czynnika przepuszczalności.

    Ta różnica w uaktywnianiu wydzielonego materiału powoduje różnice w progu reakcji dla LT i CT w układach biologicznych. Tak np. CT indukuje wykrywalne netto wydzielane płyny w mysim jelicie w dawce 5-10 pg. LT indukuje wykrywalne netto wydzielane płyny w mysim jelicie w dawkach powyżej 100 pg. W przypadku podwiązanej pętli krętnej królika różnica jest zdecydowana i wyraźna. Ponadto wykazano, że w przypadku naczelnych LT nie wywołuje wydalania płynu przy żadnej badanej dawce aż do 1 mg. Jest to wielkość 200 razy większa od podanej dawki CT, która wywołuje dodatni ruch płynu u ludzi. Gdy LT zostanie poddany działaniu enzymów proteolitycznych o specyficzności trypsyno-podobnej, cząsteczka nie daje się odróżnić od CT w żadnym układzie testów biologicznych. Wykazali to wyraźnie Clements i Finkelstein [Clements i Finkelstein, 1979, Infect. Immun. 24:760-769],

    Oprócz wyżej wymienionych różnic LT wykazuje niezwykłe powinowactwo względem matryc zawierających węglowodany. W szczególności LT o ciężarze cząsteczkowym 90 000 eluuje się z kolumn Sephadex (glukoza) z pozornym ciężarem cząsteczkowym 45 000, a z kolumn Agarose (galaktoza) z pozornym ciężarem cząsteczkowym 0. Oznacza to, że wiąże się on z matrycami zawierającymi galaktozę i może być eluowany z tych matryc w czystej formie po zastosowaniu galaktozy. LT wiąże się nie tylko z agarozą w kolumnach stosowanych do oczyszczania, ale, co jest jeszcze ważniejsze, z innymi cząsteczkami biologicznymi zawierającymi galaktozę, w tym z glikoproteinami i lipopolisacharydami. Ta lektyno-podobna zdolność wiązania LT powoduje, że rozkład receptorów na komórkach ssaków dla LT jest szerszy niż dla CT, które wiążą się tylko z Gmi· Może to być w części odpowiedzialne za opublikowane różnice w zdolnościach tych dwóch cząsteczek do indukowania różnych odpowiedzi limfocytu pomocnika T [McGhee i inni, 1994, Mucosal Immunology Update, Spring 1994, Raven Press, New York, str. 21],

    W badaniach opublikowanych przez McGhee i innych [McGhee i inni, 1994, Mucosal Immunology Update, Spring 1994, Raven Press, New York, str. 21] podano, że doustna immunizacja myszy szczepionkami takimi jak toksoid tężca (TT) z CT jako śluzowkowym adjuwantem indukuje selektywnie komórki typu Th2 w kępkach Peyera i w śledzionach, o czym świadczą komórki TH, które wytwarzają IL-4 i IL-5, ale nie IL-2 lub INF-γ. [Pełniej

    182 667 szy przegląd siatki cytokiny - patrz Arai i inni, 1990, Ann. Rev. Biochem. 59:783-836], Należy podkreślić, że jeśli CT zastosuje się jako adjuwant śluzówkowy, wzmacnia on również odpowiedzi IgE specyficzne względem antygenu oprócz odpowiedzi IgA. Takie wzmocnienie odpowiedzi IgE poważnie osłabia bezpieczeństwo stosowania CT jako adjuwanta śluzówkowego z uwagi na perspektywę wywoływania reakcji nadwrażliwości typu natychmiastowego. Natomiast LT indukuje zarówno komórki ThI jak i Th2 oraz przede wszystkim odpowiedzi IgA specyficzne względem antygenu bez odpowiedzi IgE, gdy stosowany jest jako podawany doustnie adjuwant śluzówkowy.

    Dwie cząsteczki mogą także wykazywać wiele różnic immunologicznych, co wykazały badania immunodyfuzji [Clements i Finkelstein, 1978, Infect. Immun. 21:1036-1039; Clements i Finkelstein, 1978, Infect. Immun. 22:709-713], badania neutralizacji in vitro, oraz częściowa ochrona przed związaną z LT biegunką E. coli u ochotników, którym podano szczepionkę z podjednostki B i pełnych komórek cholery [Clements i inni, 1988, J. Infect. Dis. 158:372-377],

    Wszystkie te ustalenia wykazują że LT i CT stanowią unikatowe cząsteczki pomimo ich pozornych podobieństw, oraz że LT jest praktycznym doustnym adjuwantem, którym nie jest CT.

    Wykazanie działania LT jako adjuwanta zaowocowało badaniami jednego z twórców nad wpływem LT na pojawienie się tolerancji na doustnie podawane antygeny. Nie było jasne, czy LT może, czy też nie może wpływać na pojawienie się doustnej tolerancji lub wykazywać działanie adjuwanta wykazywane przez CT, w świetle zaobserwowanych różnic pomiędzy dwoma cząsteczkami. W związku z tym zbadano szereg parametrów obejmujących wpływ LT na doustną tolerancję na OVA oraz rolę dwóch podjednostek LT w obserwowanych reakcjach, wpływ zmiany czasu i sposobu podawania LT, wpływ wcześniejszej ekspozycji na OVA na zdolność LT do pojawienie się tolerancji na OVA, zastosowanie LT jako adjuwanta z dwoma nie spokrewnionymi antygenami, oraz wpływ sposobu immunizacji na reakcje anty-OVA. Wyniki uzyskane w tych badaniach [Clements i inni, 1988, Vaccine 6:269-277; Clements i inni, 1988, Abstract No. B91, 88 Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol.] zestawiono poniżej:

    1. Okazało się, że równoczesne podawanie LT i OVA zapobiega indukcji tolerancji na OVA oraz zwiększa przeciw-OVA reakcję surowiczego IgG 30-90 razy w porównaniu ze zwierzętami immunizowanymi OVA i immunizowanymi PBS. Stwierdzono, że działanie to jest zależne od enzymatycznie aktywnej podjednostki A w toksynie, gdyż sama podjednostka B nie była zdolna do wpływania na indukowanie tolerancji.

    2. U zwierząt, którym podano LT z OVA po wstępnej immunizacji OVA wystąpiła znacznie niższa surowicza IgG i śluzowkowa IgA reakcja przeciw-OVA, niż u tych, którym podano LT z OVA we wstępnej immunizacji, co wskazuje iż wcześniejsza ekspozycja na działanie antygenu zmniejsza skuteczność LT we wpływaniu na tolerancję oraz jego zdolność do działania jako adjuwant. LT nie był zdolny do zniesienia tolerancji, która już ustaliła się. Działanie takie stwierdzono również w przypadku CT, gdy zwierzęta wstępnie immunizowano OVA przed doustnym podaniem albuminy jaja kurzego z CT, co w pewnym stopniu potwierdza korzystne obserwacje, że reakcje przeciwciał na niedocelowe antygeny wchodzące w skład pożywienia nie ulegają zwiększeniu przy stosowaniu takich adjuwantów.

    3. Surowicza IgG i śluzówkowa IgA reakcje u zwierząt, którym podano LT tylko raz, czyli będącym po pierwszej ekspozycji na działanie antygenu, były równoważne z reakcjami po 3 immunizacjach OVA/LT, co świadczy o tym, że pojawienie się reaktywności występuje wcześnie i po pierwszej ekspozycji na działanie antygenu. Wykazano także, że kierunek reakcji, przeważające surowiczej IgG lub śluzówkowej IgA, można regulować podając lub nie podając wspomagającej dawki pozajelitowej.

    4. Równoczesne podawanie LT i dwóch rozpuszczalnych antygenów białkowych powoduje pojawienie się surowiczych i śluzówkowych przeciwciał przeciw obydwu antygenom, jeśli zwierzę nie miało z żadnym z nich wcześniejszego kontaktu immunologicznego. Jest to istotne stwierdzenie, gdyż umożliwia zastosowanie LT jako adjuwanta w przypadku pojawiania się śluzówkowych przeciwciał przeciw złożonym antygenom takim jak uśmiercone bakterie lub wirusy, gdy zdolność do reagowania na wielokrotne antygeny może odgrywać znaczenie.

    182 667

    Badania Tamury i innych [Tamura i inni, patent USA nr 5 182 109] wykazały, że LT i/lub CT podawane donosowo zwiększają miano przeciwciała przeciw współpodawanemu antygenowi. Jednakże nigdzie w publikacji Tamury i innych nie podano, że toksyny te mogą wywoływać ochronną reakcję odpornościową przy podawaniu doustnym.

    LT wykazuje wyraźnie znaczące działanie immunoregulacyjne, zarówno jako środek do zapobiegania pojawianiu się tolerancji na specyficzne antygeny, oraz jako adjuwant przy doustnym podawaniu antygenów, a ponadto powoduje wytwarzanie zarówno surowiczego IgG jak i śluzowkowego IgA przeciw antygenom, z którymi jest podawany. Zwiększa to prawdopodobieństwo skutecznego programu immunizacji przeciw różnym zarazkom, obejmującego podawanie uśmierconych lub osłabionych środków lub odpowiednich determinantów wirulencji określonych środków. Jednakże fakt, że toksyna ta może pobudzać netto reakcję wydzielniczą w jelicie, gdy zostanie rozszczepiona proteolitycznie, np. przez proteazy jelitowe, może zahamować badania nad jej skutecznością lub uniemożliwić jej stosowanie w odpowiednich warunkach. Problem ten można by rozwiązać, gdyby udało się odtoksycznić LT bez osłabienia właściwości cząsteczki jako adjuwanta. W celu sprawdzenia, jak można tego dokonać, należy dokładniej zanalizować mechanizm działania LT i CT oraz strukturalne i funkcjonalne zależności w tych cząsteczkach. Jak to zaznaczono uprzednio, LT i CT syntetyzowane są jako składające się z wielu podjednostek toksyny ze składnikami A i B. Po wstępnym oddziaływaniu toksyny z receptorem błony komórki gospodarza obszar B ułatwia penetrację podjednostki A przez błonę komórkową. W wyniku redukcji tiolu składnik A dysocjuje na dwa mniejsze łańcuchy polipeptydowe. Jeden z nich, fragment Ai, katalizuje ADPrybozylowanie pobudzającego białka wiążącego GTP (Gs) w kompleksie enzymu cyklazy adenylanowej na boczno-podstawnej powierzchni komórki nabłonkowej, co w efekcie powoduje wzrost wewnątrzkomórkowych poziomów cAMP. Uzyskany wzrost cAMP powoduje wydzielanie się wody i elektrolitów do jelita cienkiego w wyniku oddziaływania z dwoma wrażliwymi na cAMP mechanizmami transportu jonów, obejmującymi a) współtransport NaCl przez rąbek szczoteczkowy kosmkowych komórek nabłonkowych, oraz 2) uzależnione od elektrogenicznego Na⁺wydzielanie Cl’ przez komórki mieszkowe [Field, 1980, w: Secretory diarrhea, Field i inni (red.), Waverly Press, Baltimore, str. 21-30]. Podjednostka A stanowi również podstawową część związaną ze wzmacnianiem odporności przez te toksyny. W związku z tym podjednostka ta staje się celem dla manipulacji, tak aby oddzielić toksyczne i immunologiczne funkcje w cząsteczce. Ostatni raport Lycke'a i innych [Lycke i inni, 1992, Eur. J. Immunol. 22:2277-2281] wyraźnie podaje, że zmiany, które wpływają na enzymatyczną aktywność toksyny w rybozylowaniu ADP lub wpływają na zdolność do zwiększania wewnątrzkomórkowych poziomów cAMP powodują że cząsteczka przestaje również działać jako adjuwant. W związku z tym należy zbadać inne podejście do detoksyfikacji.

    Streszczenie wynalazku

    Wynalazek oparty jest na zaskakującej obserwacji, że mutantowa forma LT, która utraciła swoje działanie toksyczne i pozbawiona jest aktywności ADP-rybozylotransferazowej, w dalszym ciągu zachowuje swą aktywność jako adjuwant immunologiczny. Forma mutantowa LT różni się od dzikiego typu podstawieniem pojedynczego aminokwasu, Argi92-Glyi92, co powoduje, że miejsce wrażliwe na trypsynę staje się niewrażliwe. Utrata proteolitycznego miejsca zapobiega proteolitycznej obróbce podjednostki A do jej formy toksycznej. Natywny LT nie jest toksyczny po pierwotnym wydzieleniu z bakterii, z tym że może stać się w pełni toksyczny, gdy zostaje wystawiony na działanie proteaz, np. tych, które występują w jelicie ssaków. Mutantowa forma LT nie może już stać się toksyczna w wyniku uaktywniania proteolitycznego. Taki mutant LT (poniżej określany jako mLT) zachowuje zdolność do wzmacniania reakcji odpornościowej zwierzęcia (np. IgG, IgA) na antygen nie spokrewniony z LT lub mLT bez toksycznych efektów ubocznych. Doświadczenia potwierdziły, że mLT wykazuje przydatność jako adjuwant dla doustnie podawanych antygenów; podawanie takie powoduje wytwarzanie surowiczych IgG i/lub śluzówkowych IgA przeciw antygenowi, z którym mLT podaje się. Wynalazek dostarcza sposobu wywoływania surowiczej i/lub śluzówkowej reakcji odpornościowej u gospodarza na dowolny doustnie podawany antygen, polegającego na tym, że podaje się gospodarzowi skuteczną ilość mLT w połączeniu z doustnym podawa

    182 667 niem skutecznej ilości antygenu. Korzystnie antygen i mLT podaje się wstępnie we wspólnej dawce.

    Sposób i kompozycje według wynalazku dostarczają ulepszonego sposobu doustnej immunizacji do pojawienia się surowiczych i śluzówkowych przeciwciał przeciw patogenicznym drobnoustrojom. Wytwarzanie przeciwciała Ig A reagującego przeciw patogenicznym drobnoustrojom, które penetrują lub dokonują inwazji powierzchni śluzówkowych można ukierunkować na tą powierzchnię, a znaczącą surowiczą reakcję przeciwciał można osiągnąć, tak aby zapobiec infekcji przez patogeniczne drobnoustroje, przed którymi chroni surowicze przeciwciało. Wynalazek znajduje zastosowanie w odniesieniu do dowolnego specyficznego antygenu, gdy specyficzna reakcja neutralizującego przeciwciała będzie przydatna w usuwaniu fizjologicznego lub chorobowego stanu związanego z tym antygenem.